Bu el yazması, fare gözlerinden retinal glial Müller hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonu ve diseksiyonu ile başlar, ardından Müller hücrelerinin izolasyonu, tohumlanması ve kültürlenmesi ile devam eder.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Retinanın birincil destek hücresi retinal glial Müller hücresidir. Tüm retina yüzeyini kaplarlar ve hem retina kan damarlarına hem de retina nöronlarına yakındırlar. Büyümeleri nedeniyle Müller hücreleri, sağlıklı bir retinada nörotransmiterlerin, retinoik asit bileşiklerinin ve iyonların (potasyum K+ gibi) alımı ve geri dönüşümü dahil olmak üzere birçok önemli görevi yerine getirir. Kan akışını düzenlemenin ve kan-retina bariyerini korumanın yanı sıra, metabolizmayı ve retinaya besin tedarikini de düzenlerler. Birincil fare Müller hücrelerini izole etmek için yerleşik bir prosedür bu el yazmasında sunulmuştur. Oküler bozuklukların çeşitli fare modellerinde yer alan altta yatan moleküler süreçleri daha iyi anlamak için Müller hücre izolasyonu mükemmel bir yaklaşımdır. Bu el yazması, farelerden Müller hücre izolasyonu için ayrıntılı bir prosedürü özetlemektedir. Enükleasyondan tohumlamaya kadar tüm süreç yaklaşık birkaç saat sürer. Tohumlamadan sonraki 5-7 gün boyunca, izole edilen hücrelerin engellenmeden büyümesine izin vermek için ortam değiştirilmemelidir. Morfoloji ve farklı immünofloresan belirteçler kullanılarak hücre karakterizasyonu süreçte daha sonra gelir. Hücreler için maksimum geçişler 3-4 katıdır.
Giriş
Müller hücreleri (MC'ler), retina dokusunda bulunan ana ve en bol bulunan glial hücrelerdir. Retina içinde yapısal bütünlük ve metabolik fonksiyonların sağlanmasında kilit oyunculardırlar1. MC'lerin stratejik yapısı tüm retina kalınlığına yayılır ve böylece retinaya destek sağlar. İskele benzeri özelliklerine ek olarak, retinal nöronlar için metabolik işlevlere sahiptirler ve onlara glikoz ve laktat dahil olmak üzere enerji substratları sağlarlar. Bu işlevler, sağlıklı nöronal işlevi sürdürmek için çok önemlidir. Bozulmuş MC'lerin yaşa bağlı makula dejenerasyonu, diyabetik retinopati ve glokom 2,3
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanlarla yapılan tüm deneyler, Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO beyanına uygundur ve Hayvan Bakımı ve Kullanımı Enstitüsü Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan hayvan protokolümüze ve Oakland Üniversitesi politikalarına (protokol numarası 2022-1160) göre yapılmıştır
1. Besiyeri ve çözelti hazırlama
- Dulbecco Modifiye Eagle Medium'u (DMEM, detaylar malzeme tablosunda) 1:1000 seyreltmede penisilin / streptomisin ile destekleyerek Müller hücre gözü solüsyonunu hazırlayın. Örneğin, 10 mL DMEM için 10 μL penisilin / streptomisin ekleyin.
NOT: Bu, hazırlanmış basit bir serumsuz ort....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İzole edilmiş Müller hücrelerinin özgüllüğünün, saflığının ve bariyer fonksiyonunun doğrulanması
İzole edilen Müller hücrelerinin canlılığını, morfolojisini ve ayırt edici niteliklerini doğrulamak için, hücreler bir ışık mikroskobu altında incelendi. P0 ve P1 görüntüleri kaydedildi (Şekil 1A). İzole Müller hücrelerinin RPE hücreleri ile kontaminasyonunu kontrol etmek ve saflığını doğrulamak için, RPE hücre markörü RPE65'e özgü antikorlar kullanılarak immünofloresan boyama.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Primer retinal pigmente epitelin (RPE) farelerden izolasyonu daha önce laboratuvarımız tarafından belgelenmiştir. Bu el yazması, birincil Müller hücrelerinin izolasyonu için ayrıntılı bir gösteri protokolünü açıklamaktadır. Bu prosedür, fare gözlerinden izole edilen Müller hücrelerinin enükleasyonu, tedavisi, diseksiyonu, toplanması, tohumlanması, kültürü ve karakterizasyonunu içerir. Daha önceki yayınlarda bulunan daha önce başarılı bir protokole ve yakın tarihli bir yayındakullandığımız değiştirilmiş<.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların bu makalenin içeriğiyle ilgili olduğunu beyan etmek için herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma Ulusal Göz Enstitüsü (NEI), Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) fonu R01 EY029751-04 tarafından desteklenmiştir. Dr. Sylvia B. Smith'e teşekkür ederiz, çünkü bu protokol Müller hücre izolasyonu protokolüne dayalı olarak değiştirilmiş versiyondur.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Beher : 100mL | KIMAX | 14000 | |
| Kollajenaz IV | Worthington | ||
| Tek Kullanımlık Dereceli Transfer Pipetleri: 3.2 mL Steril | 13-711-20 | ||
| DMEM (1X) | Thermo Scientific | 11885084 | Media, Mü'u büyütmek için; ller hücreleri |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | gibco | 26140079 | Tam Muller hücre kültürü ortamı için |
| Glutamin sentaz | Hücre sinyali | 80636 | |
| Heracell VISO 160i CO2 İnkübatör | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Luer-Lok Şırınga, ekli iğne ile 21 G x 1 1/2 inç, steril, tek kullanımlık, 3 mL | BD | ||
| Mikro Santrifüj Tüpü: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
| Kalem Strep | gibco | 15140-122 | Komple Mü için; ller hücre kültürü ortamı |
| Fosfat Tampon salin (PBS) | Thermo Scientific | J62851. | |
| Pozitif Aksiyon Cımbız, Stil 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
| Makas İris Standart Düz 11,5 cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
| Sorvall St8 Santrifüj | ThermoScientific | 75007200 | |
| Stemi 305 Mikroskop | Zeiss | N/A | |
| Cerrahi Bıçak, #11, Paslanmaz Çelik | Bard-Parker | 371211 | |
| Süspansiyon Kültür Kabı 60mm x 15mm Stil | Corning | 430589 | |
| Doku Kültürü Tabağı: 100x20mm stil | Corning | 353003 | |
| Kasırga Tüpleri: 15mL | Midsci | C15B | |
| Kasırga Tüpleri: 50mL | Midsci | C50R Cımbız | |
| 5MS, 8.2cm, Düz, 0.09x0.05mm Uçlar | Dumont | 501764 | |
| Cımbız Pozitif Eylem Stili 5, Biyolojik, Dumostar, Cilalı Kaplama, 110 mm OAL | Elektron Mikroskobu Sciences Dumont | 50-241-57 | |
| Alt Pedler, Orta : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
| Vannas Yaylı Makas - 2.5mm Kesici Kenar | FST | 15000-08 | |
| Yenisin | invitrogen | MA5-11883 | |
| Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
| Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |
Kaynaklar
- Liu, Y., Wang, C., Su, G. Cellular signaling in müller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration. J Ophth. 2019, 5743109(2019).
- Goldman, D.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
