Yöntem makalesi

Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu

3.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66237

⸱

30 Ağustos 2024

 ,  ,  ,  , 
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine

Bu makalede

Özet

Bu el yazması, fare gözlerinden retinal glial Müller hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonu ve diseksiyonu ile başlar, ardından Müller hücrelerinin izolasyonu, tohumlanması ve kültürlenmesi ile devam eder.

Özet

Retinanın birincil destek hücresi retinal glial Müller hücresidir. Tüm retina yüzeyini kaplarlar ve hem retina kan damarlarına hem de retina nöronlarına yakındırlar. Büyümeleri nedeniyle Müller hücreleri, sağlıklı bir retinada nörotransmiterlerin, retinoik asit bileşiklerinin ve iyonların (potasyum K+ gibi) alımı ve geri dönüşümü dahil olmak üzere birçok önemli görevi yerine getirir. Kan akışını düzenlemenin ve kan-retina bariyerini korumanın yanı sıra, metabolizmayı ve retinaya besin tedarikini de düzenlerler. Birincil fare Müller hücrelerini izole etmek için yerleşik bir prosedür bu el yazmasında sunulmuştur. Oküler bozuklukların çeşitli fare modellerinde yer alan altta yatan moleküler süreçleri daha iyi anlamak için Müller hücre izolasyonu mükemmel bir yaklaşımdır. Bu el yazması, farelerden Müller hücre izolasyonu için ayrıntılı bir prosedürü özetlemektedir. Enükleasyondan tohumlamaya kadar tüm süreç yaklaşık birkaç saat sürer. Tohumlamadan sonraki 5-7 gün boyunca, izole edilen hücrelerin engellenmeden büyümesine izin vermek için ortam değiştirilmemelidir. Morfoloji ve farklı immünofloresan belirteçler kullanılarak hücre karakterizasyonu süreçte daha sonra gelir. Hücreler için maksimum geçişler 3-4 katıdır.

Giriş

Müller hücreleri (MC'ler), retina dokusunda bulunan ana ve en bol bulunan glial hücrelerdir. Retina içinde yapısal bütünlük ve metabolik fonksiyonların sağlanmasında kilit oyunculardırlar1. MC'lerin stratejik yapısı tüm retina kalınlığına yayılır ve böylece retinaya destek sağlar. İskele benzeri özelliklerine ek olarak, retinal nöronlar için metabolik işlevlere sahiptirler ve onlara glikoz ve laktat dahil olmak üzere enerji substratları sağlarlar. Bu işlevler, sağlıklı nöronal işlevi sürdürmek için çok önemlidir. Bozulmuş MC'lerin yaşa bağlı makula dejenerasyonu, diyabetik retinopati ve glokom 2,3 dahil olmak üzere çeşitli retina hastalıklarına katkıda bulunduğu bildirilmiştir. MC'ler retinada rejeneratif tedavi için endojen hücresel kaynaklar olabilir1. Ayrıca retinanın önemli bir bölümünü oluştururlar ve güçlü kanıtlar, bazı türlerde bu hücrelerin eksik nöronların yerine geçecek şekilde uyarılabileceğini göstermektedir2. Nöronlarla faydalı bir şekilde işbirliği yaparlar ve konik olarak dallanan Müller hücrelerinin uç ayakları, kan damarlarını yoğun bir şekilde kınından çıkarır ve retinanın nöral bileşenlerini birbirine bağlar. Nöronal gelişimi ve nöronal plastisiteyi korumak için Müller hücreleri, nöronlar için yumuşak bir substrat görevi görür ve onları mekanik travmadankorur 3. Ek olarak, patolojik koşullar altında, Müller hücreleri, kayıp fotoreseptörleri ve nöronları kopyalayan veya yeniden üreten nöral progenitörlere veya kök hücrelere farklılaşabilir 2,3,4. Müller hücreleri, kendini yenileme ve farklılaşma için farklı potansiyel seviyeleri de dahil olmak üzere retinal kök hücrelerin özelliklerini korur 5,6. Müller glial hücresi, retinayı homeostazda tutmak için nörotrofik faktörler üreten, nörotransmiterleri alan ve geri dönüştüren, iyonları uzamsal olarak tamponlayan ve kan-retina bariyerini koruyan önemli bir retina soyuna sahiptir 7,8,9. Bu, Müller hücrelerinin retina dejenerasyonu ile ilgili hastalıkların tedavisinde hücre bazlı tedavilerde umut verici bir araç olarak potansiyelini vurgulamaktadır. Müller hücreleri, retina boyunca dağılan ve hem nöronlara hem de kan damarlarına bağlanan birincil gliadır. Retina hücrelerinin canlılığını ve stabilitesini korumak için gerekli yapısal ve metabolik desteği sağlayarak çok önemli bir koruyucu rol oynarlar. Ne yazık ki, literatürde retinadan primer Müller hücre izolasyonu için çok az protokol bulunmaktadır10,11.

Fare birincil Müller hücrelerini güvenilir bir şekilde izole etmek ve kültürlemek için gelişmiş bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol grubumuzda Müller hücrelerini vahşi tip C57BL/6 farelerden ve transgenik farelerden izole etmek için kullanıldı12,13. Bu protokol için 5 ila 11 günlük yaşları arasında, cinsiyet tercihi olmayan fareler kullanılır. Hücreler 4 defaya kadar geçilmiştir; bununla birlikte, P4'te şişeye yapışmayı bırakırlar ve sağlıklı bir kültür yetiştirmek zorlaşır. Kültür genellikle Retina Pigmentli Epitel (RPE) hücreleri ile kontamine olur, bu nedenle hücre hattı üzerinde herhangi bir ek deney yapmadan önce hücreler en az bir kez geçilmelidir. Geçiş, kirleticilerden daha fazla izolasyon sağlar. Bu nedenle, sunulan protokol, fare Müller hücrelerini izole etmek için hızlı ve etkili bir yol sunar, bu da daha sonra terapötik hedefleri araştırmak ve retina hastalıkları için potansiyel tedavileri değerlendirmek için güvenilir bir platform olarak kullanılabilir14.

Protokol

Hayvanlarla yapılan tüm deneyler, Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO beyanına uygundur ve Hayvan Bakımı ve Kullanımı Enstitüsü Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan hayvan protokolümüze ve Oakland Üniversitesi politikalarına (protokol numarası 2022-1160) göre yapılmıştır

1. Besiyeri ve çözelti hazırlama

  1. Dulbecco Modifiye Eagle Medium'u (DMEM, detaylar malzeme tablosunda) 1:1000 seyreltmede penisilin / streptomisin ile destekleyerek Müller hücre gözü solüsyonunu hazırlayın. Örneğin, 10 mL DMEM için 10 μL penisilin / streptomisin ekleyin.
    NOT: Bu, hazırlanmış basit bir serumsuz ortamdır. Ayrıca, hücre kültürü çalışması için kullanmadan önce tüm ortamı 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.
  2. DMEM'i %10 Fetal Sığır Serumu (FBS, ısıyla inaktive edilmiş) ve %1 penisilin / streptomisin ile destekleyerek tam birincil Müller hücre büyüme ortamını hazırlayın. Örneğin (500 mL DMEM ortamı + 50 mL FBS + 5 mL penisilin / streptomisin).
  3. 200 U/mL konsantrasyonda Kollajenaz IV ile% 0.05'lik bir Tripsin-EDTA çözeltisi hazırlayın (Tripsin-EDTA, gerekli konsantrasyona ulaşmak için hesaplanan Kollajenaz IV tozu miktarını çözmek için kullanılır).

2. Enükleasyon

  1. IACUC yönergelerini izleyerek CO2 inhalasyonu kullanarak fareyi etik olarak ötenazi yapın.
    1. Kısaca, farelere minimum sıkıntı ile 2-3 dakika içinde hızlı bilinç kaybı hedefine ulaşmak için CO2 ile oda hacminin / dakikasının% 30-70'i doluluk oranında% 100 CO2 vermek için hayvanları CO 2 odasına yerleştirin.
    2. Fareler genç yaşta (~ 10 gün) olduğundan, uygun ötenaziyi sağlamak için ikincil bir yöntem olarak servikal çıkık yapın.
  2. Çalışma alanını %70 etanol ile sterilize ettikten sonra, fareyi steril bir alt ped üzerine yerleştirin.
  3. Cımbızın kollarını gözün arkasına yerleştirerek, orbital bölgeden nazikçe çekerek ve proptoza neden olmak için orbital alana 5/45 tarzı cımbızla baskı uygulayarak gözleri enükleize ederek gözleri çıkarın.
    NOT: Diseksiyondan önce diseksiyon aletlerini %70 etanol ve ardından fosfat tampon salin ile sterilize edin.
  4. Gözü yavaşça enüklee ederek optik sinirin hala göze bağlı olduğundan emin olun. Optik siniri (görsel olarak beyaz kordon olarak tanımlanır) gözün arkasına çektiğinizden emin olun.
    NOT: Bu adımın mikroskop altında gerçekleştirilmesine gerek yoktur ve sterilize edilmiş bir tezgahta gerçekleştirilebilir.

3. Enükleasyonlu gözlerin tedavisi

  1. 15 mL'lik bir santrifüj tüpünü alüminyum folyo ile örtün ve tüpü 10 mL Müller hücre gözü solüsyonu ile doldurun.
  2. Diseke edilmiş gözleri Müller hücre göz solüsyonu içeren 15 mL'lik tüpe yerleştirin ve gece boyunca veya yaklaşık 18 saat oda sıcaklığında bekletin.
  3. 18 saat sonra, göz solüsyonunu boşaltın ve gözleri 2-3 mL ısıtılmış (37 ° C) fosfat tamponlu salin (PBS) ile kısa bir süre durulayın.
  4. PBS'yi boşaltın ve gözleri 10 mL tripsin çözeltisi içeren 100 mm'lik bir Petri kabına taşıyın. (adım 1.3'te hazırlanmıştır).
    NOT: Tripsin, diseksiyon sırasında retina katmanlarından hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için dissosiyatif bir ajan olarak işlev gören tüm enükleasyonlu gözde kullanılır. Diseke retina, yapışkan olan ve Müller hücre kültürünü kontamine etme olasılığı en yüksek olan RPE hücreleri de dahil olmak üzere birçok hücreye sahiptir14. Mikroskobik inceleme, 5 günlük izolasyondan sonra (ilk ortam değişikliği sırasında), RPE hücrelerinin plakadan ayrıldığını ve13 öldüğünü açıkça gösterdi. RPE izolasyonu için kullanılan ortam, sodyum piruvat ve düşük glikoz içeren DMEM'den (Müller hücre izolasyonunda kullanılan) farklı bir bileşime sahip DMEM/F-12'dir.
  5. Çanağı bir kuluçka makinesine koyun ve 37 ° C ve% 5 CO2'de 1,5 ila 2 saat inkübe edin.
  6. İnkübe ettikten sonra, gözleri yaklaşık 5 mL tam primer Müller hücre büyüme ortamı içeren 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın.

4. Diseksiyon

NOT: Bu prosedür, kültür başlığının steril ortamında gerçekleştirilmelidir. Bu nedenle, davlumbaz yüzeylerinin tüm aletler ve diseksiyon mikroskobu ile birlikte %70 alkol ile iyice sterilize edilmesi önemlidir. Videonun daha iyi görünürlük ve daha net gösterim amaçları için kaputun dışında kaydedildiğini belirtmekte fayda var.

  1. Diseksiyon sırasında gözleri stabilize etmeye yardımcı olmak için tabağa küçük bir parça sterilize edilmiş laboratuvar sınıfı doku yerleştirin. Diseksiyonu başlatmak için gözleri diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
    NOT: Laboratuvar sınıfı doku kullanımı, gözlerin sıvı dolu bir kapta (tam ortam) manevra yapmasını kolaylaştırarak hassas diseksiyon sağlar.
  2. Bağ dokusunu, göz dışı kasları ve optik siniri çıkarmak için Vannas makası ve M5S tarzı cımbız kullanın.
    1. M5S tarzı cımbızla gözü kavrayın ve Vannas makas veya şırınga iğnesi ile ora serrata bölümünde bir kesi yapın.
      NOT: Gözün ön ve arka kısmı arasında ora serrata adı verilen açık mavi dairesel bir çizgi vardır ve bu, diseksiyon sırasında doğru yönlendirme için bir yer işareti olarak kullanılabilir.
    2. Kesi aletini M5S tarzı cımbızla kavrayın ve korneayı gözün arka kısmından çekin veya yırtın. Retinanın bütünlüğünün bozulmadan kalmasını sağlamak için küçük artışlarla çekin.
      NOT: Bu adımlar, gözün ön kısmını (Kornea, İris ve Lens) göz kabının arka kısmından (nöral ve pigmentli retinalar) çıkarmak içindir.
    3. Retina katmanlarının bütünlüğünü korumak için, retina pigmentli epiteli nazikçe çekin ve nöral retinadan çıkarın. RPE tabakası genellikle yapışkan olduğundan ve nöronal retinaya bağlı olduğundan, izolasyonun saflığını mümkün olduğunca sağlamak için nöral retinada herhangi bir siyah leke bulunmamalıdır.
    4. Hücrelerin plaka üzerinde homojen bir şekilde yayılmasını sağlamak için diseke edilen nöral retinayı bir plakada toplamadan önce küçük parçalara ayırın.
  3. Nöral retinaları, 4 mL tam primer Müller hücre büyüme ortamı içeren bir T25 şişesinde plakalayın.
  4. Son olarak, şişeyi bir inkübatöre yerleştirin ve 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.

5. Primer Müller glial hücrelerinin kültürlenmesi

  1. Hücre büyümesini teşvik etmek için şişeyi 3-5 gün boyunca hareket ettirmeyin.
  2. Beşinci günden sonra ve daha sonra hücreler% 90 birleşene kadar her gün ortamı değiştirin.

6. Primer Müller glial hücrelerinin pasajı

  1. Müller hücre kültürü ortamını aspire edin, ardından PBS'de 2 mL yıkayın ve PBS'yi aspire edin. 2 mL% 0.25 Tripsin-EDTA (1x) veya plakayı kaplayacak kadar ekleyin.
  2. Oda sıcaklığında 5-10 dakika inkübe edin.
  3. Hücrelerin mikroskop altında plakadan ayrıldığından emin olun. Daha sonra, hücre süspansiyonunu toplayın ve toplama tüpüne 4 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) tam birincil Müller hücre büyüme ortamı (adım 1.2'de hazırlanmıştır) ekleyin.
  4. 300 x g'da 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire ettikten sonra, peleti 10 mL tam birincil Müller hücre büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Hücre sayısı diseke edilen göz sayısına göre değişebildiğinden, tohumlama ve inkübasyondan önce hücreleri saymak daha iyidir. Önerilen tohumlama yoğunluğu, bir T75 şişesinde 3.0 x10 6 hücredir.
    NOT: Hücreler 4-5 defaya kadar geçirilebilir. Bununla birlikte, en tutarlı deney sonuçları 1-2 pasajdan sonra bulunur.

7. İmmünofloresan

NOT: Müller hücre özgüllüğünü boyamak ve doğrulamak için immünofloresan protokolünü kullanın. İşte immünofloresan protokolüne kısa bir genel bakış. Bu adım, ilk pasajdan12 sonra gerçekleştirilir.

  1. Hücreleri bir Hücre Kültürü Odası Slaytına tohumlayın (8 oyuklu bir oda slaytı için oyuk başına 30.000 hücre).
  2. İzole edilen hücreleri 24-48 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de tam bir Müller hücre kültürü ortamında (adım 1.2'de hazırlanan) kültürleyin.
  3. Ortamı aspire edin ve hücreler% 80-90 birleştiğinde hazne slaytını her bir kuyucukta 250-300 μL 1x PBS ile yıkayın.
  4. Slaytı her bir oyukta 250-300 μL% 4 paraformaldehit içinde 10 ila 15 dakika sabitleyin, ardından PBS / TX-100 (her biri 5 dakika / 3x) ile yıkayın.
  5. 37 ° C'de 1 saat boyunca engelleme tamponu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
  6. Bloke edici çözeltiyi aspire edin, ardından glutamin sentetaz ve vimentin 5,12 kullanarak izole edilen hücrelerin saflığını doğrulamak için Müller hücrelerine özgü birincil antikorları ekleyin. 37 ° C'de 3 saat inkübe edin (150-200 μL / slayt hacminde bloke edici tamponda 1: 100-1: 200 antikor konsantrasyonu kullanılarak). Slaytı PBS/TX-100 yıkamalarla yıkayın (her biri 5 ve 10 dakika).
    NOT: Bu antikorlar, Müller hücrelerini tanımlamak ve Müller hücre kültürünün başarısını ve saflığını sağlamak için ayırt edici özellikler oldukları için seçilmiştir.
  7. İkincil antikoru ekleyin (150-200 μL/slaytta bloke edici tamponda 1:1000 arasında değişen bir antikor konsantrasyonu ile) ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Daha sonra PBS / Triton X-100 ile üç kez (her biri 5-10 dakika) yıkayın.
  8. Slaytı bir lamel ile kaplamadan önce çekirdekleri etiketlemek için bir damla DAPI montaj ortamı uygulayın. Lameli yerleştirirken hava kabarcıklarından kaçının.
  9. Slaytı kontrol etmek ve görüntüleri yakalamak için bir floresan mikroskobu kullanın (bkz.
    NOT: Hücreler, hücreleri bulmak için 10x büyütmede ex/em 359/461'de DAPI ile yerleştirilmiştir; Daha yüksek büyütme hücreleri yakalayabilir. Diğer dalga boyları seçilen renge bağlı olacaktır. Yeşil renk (GFP) - eski / em 488/510. Kırmızı renk (Cy3)- ex/em 555/569.

Sonuçlar

İzole edilmiş Müller hücrelerinin özgüllüğünün, saflığının ve bariyer fonksiyonunun doğrulanması
İzole edilen Müller hücrelerinin canlılığını, morfolojisini ve ayırt edici niteliklerini doğrulamak için, hücreler bir ışık mikroskobu altında incelendi. P0 ve P1 görüntüleri kaydedildi (Şekil 1A). İzole Müller hücrelerinin RPE hücreleri ile kontaminasyonunu kontrol etmek ve saflığını doğrulamak için, RPE hücre markörü RPE65'e özgü antikorlar kullanılarak immünofloresan boyama (IF) gerçekleştirildi. İnsan retinal pigmente hücreleri (ARPE -19) pozitif kontrol olarak kullanıldı. RPE65 lekeli RPE hücreleri (nükleer boyama için kırmızı ve mavi) Şekil 1B'de (alt panel) gösterilmiştir. RPE65 spesifik antikorları izole edilen Müller hücrelerini boyamadı (Şekil 1B, üst panel). RPE65'in ARPE-19 hücrelerini (kırmızı) boyaması ve izole edilen hücreleri lekelememesi, izole edilen hücrelerin RPE hücreleri olmadığını gösterir. Ortamda piruvat ve düşük glikoz varlığı, RPE hücrelerinin büyümesi için elverişsiz koşullar oluşturur. Sonuç olarak, RPE hücre kontaminasyonu durumunda bile, sonunda şişeden ayrılacaklardır.

Ayrıca, izole edilmiş hücrelerin kimliğini doğrulamak için, Müller hücrelerinin başarılı bir şekilde izole edildiğini doğrulamak için Müller hücreleri için bir Müller hücreleri immünofloresan boyaması özel belirteçler kullanıldı. Vimentin adı verilen hücre iskeleti ara filament proteini kullanıldı12,13. Ek olarak, retinal glial Müller hücrelerinin önemli bir işlevi olarak glutamin ve amonyağın glutamin oluşturmak üzere yoğunlaşmasının reaksiyonunu katalize eden glutamin sentetaz (GS) da kullanılmıştır5.

Toplu olarak, İzole edilmiş hücreler RPE65 (kırmızı, Şekil 1B) için negatif, vimentin (yeşil, Şekil 1C) ve GS (yeşil, Şekil 1D) için pozitif boyandı. IF boyama, izole edilmiş Müller hücrelerinin başarılı izolasyonunu (saflık ve özgüllük) doğrular. Şekil 1E, antikorların özgüllüğünü doğrulayan vimentin (üst panel) ve GS (alt panel) için negatif bir kontroldür.

figure-results-1
Şekil 1: Müller hücre izolasyonunun doğrulanması (saflık ve özgüllük). (A) Pasajlar için ışık mikroskobu görüntüsü: pasaj sıfır(P0) ve(P1)morfolojisi. (B) DAPI nükleer boyama ile birlikte RPE65 immün boyama. (C) Yüksek büyütmede DAPI nükleer boyama ile vimentin immün boyama. (D) Aynı yüksek büyütmede GS immün boyama. (E) vimentin ve GS antikor boyamasının özgüllüğünü doğrulamak için negatif kontroller. ölçek çubuğu = sırasıyla 300 μm, 300 μm, 50 μm, 20 μm, 20 μm, 50 μm, 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Primer retinal pigmente epitelin (RPE) farelerden izolasyonu daha önce laboratuvarımız tarafından belgelenmiştir. Bu el yazması, birincil Müller hücrelerinin izolasyonu için ayrıntılı bir gösteri protokolünü açıklamaktadır. Bu prosedür, fare gözlerinden izole edilen Müller hücrelerinin enükleasyonu, tedavisi, diseksiyonu, toplanması, tohumlanması, kültürü ve karakterizasyonunu içerir. Daha önceki yayınlarda bulunan daha önce başarılı bir protokole ve yakın tarihli bir yayındakullandığımız değiştirilmiş protokolümüz 1 2,13'e dayanmaktadır. Adımlar basit olsa da, başarılı Müller hücre izolasyonu, belirli kısıtlamalara ve temel gereksinimlere uyulmasını gerektirir. Bu protokolü optimize etmek için çok sayıda deneme yanılma girişiminden sonra, başarısını etkileyen birçok faktör tespit edildi.

Deneylerimizde gözlemlendiği gibi ideal fare yaşı, izole edilen hücreleri dört pasaja kadar büyütmek için 5-11 gün arasında bulundu. Kültür aynı zamanda kaç gözün izole ve kültürlü olduğundan da etkilenir. Tek izolasyon için, büyüyebilmek ve çoğalabilmek için yeterli sayıda hücre elde etmek için en az iki göz gereklidir. Bir diğer önemli husus, enükleasyon ve kaplama arasındaki süredir; Bu nedenle, bu adımın nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir. Göz dokusunun uzun süre manipüle edilmesinin, hücrelerin şişeye yapışma ve çoğalma yeteneği üzerinde zararlı bir etkiye sahip olduğu gözlendi. İzole edilmiş hücrelerin yakınlığının proliferasyonu teşvik edecek kadar yakın olduğundan emin olmak için bir T25 şişesi kullanmanızı öneririz. İlk geçiş yapıldıktan sonra, hücreler bir T75 üzerine kaplanabilir. Ayrıca, doku kültürü şişesi inkübatörden çıkarılarak veya en az 5 gün boyunca besiyeri değiştirilerek izolasyon ve tohumlama sonrasında hücreler rahatsız edilmemelidir. Son olarak, hücreler yapışmayı bırakmadan önce sadece yaklaşık dört kez geçirilebilir. Bu prosedür basit ve gerçekleştirilmesi kolay olsa da, farelerin yaşları, sınırlı sayıda hücre geçişi vb. dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır.

Müller hücre izolasyonu için çok fazla protokol yoktur, ancak bu protokolden mevcut protokollere göre bazı önemli farklılıklar vardır 5,14. İlk olarak, enükleasyon ve izolasyon arasındaki süre önemli ölçüde farklıdır. Diğer protokoller, enükleasyondan hemen sonra, tipik olarak 10 dakika içinde diseksiyon önermektedir. Mevcut protokol, bu protokolde izolasyon için en iyi sonuçları sağladığı için en az 18 saatlik bir dinlenme süresi önermektedir. Bu protokol ile diğer protokoller arasındaki bir diğer önemli fark, gözlerin enzimlerle tedavi edildiği noktadır. Bu protokolde gözler herhangi bir diseksiyon yapılmadan, hatta bağ dokusu ve göz dışı kaslar çıkarılmadan önce tedavi edilir. Diğer protokoller enzim tedavisinden önce retinaları gözden izole eder. Ayrıca, enzim tarifi de farklıdır. Bu protokolde enzim çözeltisi tripsin ve kollajenaz tip IV'ten oluşur. Benzer protokollerde, doku sindirimi için papain ve DNaz kullanılır. Ek olarak, kültür kabı farklıdır, bu protokol ilk geçişten sonra bir T25 üzerinde ve ardından bir T75 üzerinde kültürlemeyi önerir. Diğer protokoller Petri kapları veya çok kuyulu plakalar kullanırken. Son olarak, bu protokol, hücre büyümesini teşvik etmek için şişenin rahatsız edilmemesi (5-7 gün boyunca) gerektiğini önermektedir. Diğer protokollerde ise ortam değişimi bir gün sonra yapılır.

Açıklamalar

Yazarların bu makalenin içeriğiyle ilgili olduğunu beyan etmek için herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Göz Enstitüsü (NEI), Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) fonu R01 EY029751-04 tarafından desteklenmiştir. Dr. Sylvia B. Smith'e teşekkür ederiz, çünkü bu protokol Müller hücre izolasyonu protokolüne dayalı olarak değiştirilmiş versiyondur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Beher : 100mLKIMAX14000
Kollajenaz IV Worthington 
Tek Kullanımlık Dereceli Transfer Pipetleri: 3.2 mL Steril13-711-20
DMEM (1X)  Thermo Scientific11885084Media, Mü'u büyütmek için; ller hücreleri 
Fetal Sığır Serumu (FBS)gibco26140079Tam Muller hücre kültürü ortamı için
Glutamin sentazHücre sinyali80636
Heracell VISO 160i CO2 İnkübatörThermo Scientific50144906
KimwipesKimberly-Clark34155
Luer-Lok Şırınga, ekli iğne ile 21 G x 1 1/2 inç, steril, tek kullanımlık, 3 mLBD
Mikro Santrifüj Tüpü: 2 mLGrainger11L819
Kalem Strepgibco15140-122Komple Mü için; ller hücre kültürü ortamı
Fosfat Tampon salin (PBS)Thermo ScientificJ62851.
Pozitif Aksiyon Cımbız, Stil 5/45Dumont72703-DZ
Makas İris Standart Düz 11,5 cmGARANA INDUSTRIES2595
Sorvall St8 SantrifüjThermoScientific75007200
Stemi 305 MikroskopZeissN/A
Cerrahi Bıçak, #11, Paslanmaz ÇelikBard-Parker371211
Süspansiyon Kültür Kabı 60mm x 15mm StilCorning430589
Doku Kültürü Tabağı: 100x20mm stilCorning353003
Kasırga Tüpleri: 15mLMidsciC15B
Kasırga Tüpleri: 50mLMidsciC50R Cımbız
5MS, 8.2cm, Düz, 0.09x0.05mm UçlarDumont501764
Cımbız Pozitif Eylem Stili 5, Biyolojik, Dumostar, Cilalı Kaplama, 110 mm OALElektron Mikroskobu Sciences Dumont50-241-57
Alt Pedler, Orta : 23" X 36"McKesson4033
Vannas Yaylı Makas - 2.5mm Kesici KenarFST15000-08
Yenisin invitrogenMA5-11883
Zeiss AxioImager Z2Zeissn/a
Zeiss Zen Blue 2.6Zeissn/a
LS004188309577AP

Kaynaklar

  1. Liu, Y., Wang, C., Su, G. Cellular signaling in müller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration. J Ophth. 2019, 5743109(2019).
  2. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).
  3. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).
  4. Kobat, S. G., Turgut, B. Importance of Müller cells. Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).
  5. Liu, X., Tang, L., Liu, Y. Mouse Müller cell isolation and culture. Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).
  6. Bringmann, A., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
  7. de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).
  8. Fischer, A. J., Reh, T. A. Müller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina. Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).
  9. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  10. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. J of Vis Exp. (133), 56997(2018).
  11. Sarthy, P. V., Bunt, A. H. The ultrastructure of isolated glial (Müller) cells from the turtle retina. Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).
  12. Shanmugam, A. K., et al. Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina. Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).
  13. Moustafa, M., et al. 12-HETE activates Müller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29. Prostag Oth Lipid M. 171, 106805(2024).
  14. Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice müller glia in order to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 14, 7(2020).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

M ller H cresi zolasyonuRetinal Glial H crelerFare RetinasPrimer M ller H creleriRetinal Hastal k Modellerimm nofloresan Mark rlerLaminer Ak l KabinDiseksiyon MikroskobuN ral RetinaH cre K lt r
Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.