Method Article

Hepatit B Virüsü DNA'sının Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Tabanlı Tespiti ve Miktar Tayini

DOI:

10.3791/66249

⸱

December 15th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
13B BlackBio Biotech India Limited

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit B virüsü (HBV) DNA'sının gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı tespiti ve miktarının belirlenmesi, HBV enfeksiyonunun teşhisi ve izlenmesi için hassas ve doğru bir yöntemdir. Burada, HBV DNA tespiti ve bir numunenin viral yük ölçümü için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit B virüsü (HBV), dünya çapında karaciğer hastalığının önemli bir nedenidir. Akut veya kronik enfeksiyonlara yol açarak bireyleri ölümcül siroz ve karaciğer kanserine karşı oldukça duyarlı hale getirebilir. Kandaki HBV DNA'sının doğru tespiti ve miktarının belirlenmesi, HBV enfeksiyonunun teşhisi ve izlenmesi için gereklidir. HBV DNA'yı tespit etmek için en yaygın yöntem, virüsü tespit etmek ve antiviral tedaviye yanıtı izlemek için viral yükü değerlendirmek için kullanılabilen gerçek zamanlı PCR'dir. Burada, IVD işaretli gerçek zamanlı PCR tabanlı bir kit kullanarak insan serumu veya plazmasında HBV DNA'nın tespiti ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Kit, HBV genomunun yüksek oranda korunmuş çekirdek bölgesini hedefleyen primerler ve problar kullanır ve tüm HBV genotiplerini (A, B, C, D, E, F, G, H, I ve J) doğru bir şekilde ölçebilir. Kit ayrıca olası PCR inhibisyonunu izlemek için endojen bir dahili kontrol içerir. Bu test 40 döngü boyunca çalışır ve kesilmesi 38 Ct'dir. Klinik örneklerde HBV DNA'sının miktar tayini için kit ile birlikte 5 miktar tayini standardı seti sağlanır. Standartlar, nükleik asit testi için 4. DSÖ Uluslararası HBV DNA Standardına (NIBSC kodu 10/266) göre kalibre edilmiş bilinen HBV'ye özgü DNA konsantrasyonlarını içerir. Standartlar, HBV'ye özgü DNA amplifikasyonunun işlevselliğini doğrulamak ve bir numunede HBV DNA'sının miktar tayinine izin veren standart bir eğri oluşturmak için kullanılır. PCR kiti kullanılarak 2.5 IU/mL kadar düşük HBV DNA'sı tespit edildi. Kitin yüksek hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği, onu klinik laboratuvarlarda güçlü bir araç haline getirerek sağlık uzmanlarının HBV enfeksiyonlarını etkili bir şekilde teşhis etmesine ve yönetmesine yardımcı olur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit B virüsü (HBV), Orthohepadnavirus cinsi ve Hepadnaviridae ailesi1'den kısmen çift sarmallı bir DNA virüsüdür. Kişinin yaşamı boyunca devam eden ve potansiyel olarak karaciğer sirozu ve hepatosellüler karsinomayol açan kronik bir enfeksiyonu tetikleyebilir 2,3,4. Dünya Sağlık Örgütü'ne (WHO) göre, 2019 yılında tahmini 296 milyon insan kronik hepatit B enfeksiyonu ile yaşıyordu ve her yıl 1,5 milyon kişi yeni enfekte oldu5.

Serum veya plazma örneklerinde HBV DNA'nın tanımlanmas....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma herhangi bir insan katılımcıyı veya klinik örneği içermemiştir. Kullanılan tek biyolojik materyal, nükleik asit testi için HBV DNA'sı için 4. DSÖ Uluslararası Standardı (NIBSC kodu 10/266) idi. Bu standart, herhangi bir kişisel bilgi veya tanımlanabilir veri içermeyen, kamuya açık bir referans materyalidir. Bu nedenle, bu çalışma için herhangi bir etik onay gerekmemiştir.

1. DNA Ekstraksiyonu

  1. Viral DNA'yı insan serumu veya plazma örneğinden çıkarın. Ekstrakte edilen DNA'yı PCR'de daha fazla kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.
    NOT: DNA ekstraksiyonu için önerilen serum veya plazma hacmi 5....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan plazmasından/serumundan HBV DNA'sını tespit etmek ve ölçmek için iş akışının şematik bir diyagramı Şekil 1'de gösterilmektedir. Hem HBV hem de IC için Standart 2 (PC olarak kullanılır) ve NTC'nin bir amplifikasyon grafiği Şekil 2'de gösterilmektedir. Şekil 3 , bir HBV-pozitif numune, bir HBV-negatif numune ve PCR inhibisyonu olan bir numune için amplifikasyon eğrilerini göstermektedir. NIBSC kodu 10/266 için amplifikasyon eğri.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIBSC kodu 10/266, tedarikçi bilgilerine göre 9,55,000 mL nükleaz içermeyen suda sulandırıldığında 0.5 IU/mL'lik bir birim olarak atanmıştır21. Bu, yüksek yüklü bir HBV pozitif numune olarak kabul edilebilir. Bu çalışmada kullanılan viral yük kiti ile belirlenen HBV viral yükü 6,65,900 IU/mL idi (Şekil 4). Herhangi bir DNA ekstraksiyon kitinin DNA ekstraksiyon verimliliği %100 olmadığından, saflaştırma işlemi sırasında genellikle bir miktar DNA kaybolur. Kit tarafında.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmada kullanılan HBV viral yük kitinin üreticisi olan Kilpest India Limited ile ilişkilidir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita ve Shikha'ya teknik yardımları için teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4th Hepatit B virüsü için DSÖ Uluslararası Standardı NIBSCNIBSCkodu: 10/266Hepatit B virüsü (HBV) DNA'sı için 4. DSÖ Uluslararası Standardı, NIBSC kodu 10/266, HBV nükleik asit amplifikasyon tekniklerinde (NAT) kullanılan ikincil referans reaktiflerinin kalibrasyonu için kullanılmak üzere tasarlanmıştır.
ABI gerçek zamanlı PCR makineleri ThermoFisher BilimselABI 7500; QuantStudio 5Bu gerçek zamanlı bir PCR makinesidir 
HBV, HCV ve HIV Multipleks 14/198NIBSC NIBSCkodu: 14/198Bu, hepatit B (HBV), hepatit C (HCV) ve insan immün yetmezlik virüsü-1 (HIV-1) içeren NAT testleri için çok düşük pozitif bir tripleks reaktiftir
QIAGEN gerçek zamanlı PCR makinesiQiagenRotor-Gene QBu gerçek zamanlı bir PCR makinesidir 
TRUPCR HBV Viral Yük kiti Kilpest India Limited3B294Bu, HBV DNA tespiti ve viral yük tayini için bu çalışmada kullanılan gerçek zamanlı PCR tabanlı bir kittir
TRUPCR Viral Nükleik Asit Ekstraksiyon KitiKilpest India Limited3B214Bu, NIBSC:10/266 ve NIBSC:14/198'den HBV viral DNA'sının ekstraksiyonu için kullanılan bir DNA ekstraksiyon kitidir
. .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
  2. Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis B VirusHBV DNAReal Time PCRViral Load QuantificationPCR KitDNA DetectionClinical SamplesStandard CurvePCR EfficiencySerological Tests

Related Articles