Method Article

Hepatit B Virüsü DNA'sının Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Tabanlı Tespiti ve Miktar Tayini

DOI:

10.3791/66249

⸱

December 15th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
13B BlackBio Biotech India Limited

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit B virüsü (HBV) DNA'sının gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı tespiti ve miktarının belirlenmesi, HBV enfeksiyonunun teşhisi ve izlenmesi için hassas ve doğru bir yöntemdir. Burada, HBV DNA tespiti ve bir numunenin viral yük ölçümü için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit B virüsü (HBV), dünya çapında karaciğer hastalığının önemli bir nedenidir. Akut veya kronik enfeksiyonlara yol açarak bireyleri ölümcül siroz ve karaciğer kanserine karşı oldukça duyarlı hale getirebilir. Kandaki HBV DNA'sının doğru tespiti ve miktarının belirlenmesi, HBV enfeksiyonunun teşhisi ve izlenmesi için gereklidir. HBV DNA'yı tespit etmek için en yaygın yöntem, virüsü tespit etmek ve antiviral tedaviye yanıtı izlemek için viral yükü değerlendirmek için kullanılabilen gerçek zamanlı PCR'dir. Burada, IVD işaretli gerçek zamanlı PCR tabanlı bir kit kullanarak insan serumu veya plazmasında HBV DNA'nın tespiti ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Kit, HBV genomunun yüksek oranda korunmuş çekirdek bölgesini hedefleyen primerler ve problar kullanır ve tüm HBV genotiplerini (A, B, C, D, E, F, G, H, I ve J) doğru bir şekilde ölçebilir. Kit ayrıca olası PCR inhibisyonunu izlemek için endojen bir dahili kontrol içerir. Bu test 40 döngü boyunca çalışır ve kesilmesi 38 Ct'dir. Klinik örneklerde HBV DNA'sının miktar tayini için kit ile birlikte 5 miktar tayini standardı seti sağlanır. Standartlar, nükleik asit testi için 4. DSÖ Uluslararası HBV DNA Standardına (NIBSC kodu 10/266) göre kalibre edilmiş bilinen HBV'ye özgü DNA konsantrasyonlarını içerir. Standartlar, HBV'ye özgü DNA amplifikasyonunun işlevselliğini doğrulamak ve bir numunede HBV DNA'sının miktar tayinine izin veren standart bir eğri oluşturmak için kullanılır. PCR kiti kullanılarak 2.5 IU/mL kadar düşük HBV DNA'sı tespit edildi. Kitin yüksek hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği, onu klinik laboratuvarlarda güçlü bir araç haline getirerek sağlık uzmanlarının HBV enfeksiyonlarını etkili bir şekilde teşhis etmesine ve yönetmesine yardımcı olur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit B virüsü (HBV), Orthohepadnavirus cinsi ve Hepadnaviridae ailesi1'den kısmen çift sarmallı bir DNA virüsüdür. Kişinin yaşamı boyunca devam eden ve potansiyel olarak karaciğer sirozu ve hepatosellüler karsinomayol açan kronik bir enfeksiyonu tetikleyebilir 2,3,4. Dünya Sağlık Örgütü'ne (WHO) göre, 2019 yılında tahmini 296 milyon insan kronik hepatit B enfeksiyonu ile yaşıyordu ve her yıl 1,5 milyon kişi yeni enfekte oldu5.

Serum veya plazma örneklerinde HBV DNA'nın tanımlanması ve ölçümü, devam eden hepatit B enfeksiyonu olan bireyleri tespit etmek, antiviral tedavinin etkinliğini değerlendirmek ve tedavi başarısı olasılığını tahmin etmek için değerli bir yöntem olarak hizmet eder 6,7,8,9,10,11. Yüksek viral yük, siroz ve karaciğer kanseri dahil olmak üzere karaciğer hastalığının ilerlemesi riskinin artmasıyla ilişkilidir12,13. Bu nedenle, HBV enfeksiyonunun ilerlemesini izlemek ve tedavi ile ilgili kararları bildirmek için viral yükün hassas ölçümü çok önemlidir.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR testleri, geleneksel PCR tekniklerine göre daha yüksek duyarlılığa, daha geniş dinamik aralığa ve HBV DNA'sının daha doğru miktar tayinine sahiptir 14,15,16,17. Serum veya plazma örneklerinde HBV DNA'nın miktar tayini için çeşitli ticari gerçek zamanlı PCR tabanlı moleküler tanı kitleri piyasada mevcuttur. Burada, ticari olarak temin edilebilen, IVD işaretli gerçek zamanlı PCR tabanlı bir kit kullanarak insan serumu veya plazmasında HBV DNA'nın tespiti ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir iş akışı açıklıyoruz. Kit, yaygın olarak kullanılan18,19, düşük maliyetli, ancak oldukça hassas bir tahlildir ve performans özellikleri, piyasada bulunan diğer CE işaretli kit(ler)18 ile karşılaştırılabilir. HBV hedef bölge amplifikasyonunun yanı sıra, numunelerin kalitesini, ekstrakte edilen DNA'nın kalitesini, PCR amplifikasyonunu ve olası PCR inhibisyonunu doğrulamak için kite endojen bir dahili kontrol geni de dahil edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma herhangi bir insan katılımcıyı veya klinik örneği içermemiştir. Kullanılan tek biyolojik materyal, nükleik asit testi için HBV DNA'sı için 4. DSÖ Uluslararası Standardı (NIBSC kodu 10/266) idi. Bu standart, herhangi bir kişisel bilgi veya tanımlanabilir veri içermeyen, kamuya açık bir referans materyalidir. Bu nedenle, bu çalışma için herhangi bir etik onay gerekmemiştir.

1. DNA Ekstraksiyonu

  1. Viral DNA'yı insan serumu veya plazma örneğinden çıkarın. Ekstrakte edilen DNA'yı PCR'de daha fazla kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.
    NOT: DNA ekstraksiyonu için önerilen serum veya plazma hacmi 500 μL'dir ve elüsyon hacmi 50 μL'dir. Bu çalışmada, viral DNA, bir viral nükleik asit ekstraksiyon kiti (Malzeme Tablosu) kullanılarak ekstrakte edildi.

2. Gerçek zamanlı PCR

  1. PCR'ye başlamadan önce gerçek zamanlı PCR kitinin tüm reaktiflerini (Tablo 1) oda sıcaklığında (RT; 15-25 °C) çözün. Çözüldüğünde, bileşenleri orta hızda 10 saniye boyunca darbeli girdap ile karıştırın ve RT'de 15 saniye boyunca 8.000 × g'da santrifüjleyin. Çözülen tüm bileşenleri bir soğutma bloğunda tutun.
  2. Reaksiyon hazırlama
    1. Tablo 2'ye göre bir PCR karışımı hazırlayın. Numune sayısına, standartlara ve şablon kontrolüne göre eklenecek reaktiflerin hacmini hesaplayın.
      NOT: PCR karışımını hazırlarken, her bir reaktifin en az %10 ekstra hacmi eklenmelidir (örneğin, 10 reaksiyon gerekiyorsa, 11 reaksiyon için hesaplayın).
    2. Yukarıda hazırlanmış PCR karışımının 15 μL'sini her bir PCR tüpüne pipetleyin. Ardından, ekstrakte edilmiş örnek DNA'dan 15 μL ekleyin. HBV DNA'sını tespit etmek için pozitif kontrol (PC) olarak HBV standartlarından en az birinden (HBV Standardı 1-5) 15 μL ve negatif kontrol (NC) olarak 15 μL PCR dereceli nükleaz içermeyen su ekleyin. HBV DNA'nın kantitasyonu için gerekli standart bir eğri oluşturmak için, her PCR çalıştırması için kit ile birlikte verilen 5 kantitasyon standardının tümünü (HBV Standardı 1-5) kullanın.
    3. Tüpleri kapatın, bileşenleri orta hızda 10 saniye boyunca darbeli girdapla karıştırın ve termal döngüleyiciye geçmeden önce RT'de 15 saniye boyunca 8.000 × g'da santrifüjleyin. Floresan algılamayı engelleyebileceğinden, reaksiyon karışımında kabarcık olmadığından emin olun.
  3. Program kurulumu
    1. Termal döngüleyiciyi Tablo 3'te önerildiği gibi döngü koşullarını kullanarak programlayın.
  4. Kanal/Florofor Seçimi
    1. Tablo 4'te belirtildiği gibi, yaygın olarak kullanılan gerçek zamanlı PCR platformları için floresan boyaları seçin.
  5. Veri analizi
    1. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, amplifikasyon grafiğini doğrusal bir ölçekte analiz edin.
    2. Eşik ayarı
      1. Bir PCR reaksiyonunun üstel fazı içindeki eşiği ayarlayın. Kit için önerilen eşik değerleri Tablo 5'te belirtilmiştir. Eşik ayarıyla tutarlı olun. Test için en uygun eşik belirlendikten sonra, belirli bir PCR makinesi için tüm numuneler için tutarlı bir şekilde kullanın. Bu, sonuçların doğru ve tekrarlanabilir olmasını sağlamaya yardımcı olacaktır.
        NOT: Eşik çok düşük ayarlanırsa, sinyal gürültü seviyesinin altında olabilir ve Ct değeri güvenilmez olacaktır. Eşik çok yükseğe ayarlanırsa, sinyal, amplifikasyonun o kadar verimli olmadığı ve Ct değerinin yanlış olabileceği reaksiyonun plato fazında olabilir.
    3. Kesme
      1. Kiti 40 amplifikasyon döngüsü için çalıştırın. Herhangi bir yorumlama için 38 döngünün ötesinde herhangi bir amplifikasyon düşünmeyin.
    4. Nitel sonuç analizi
      1. HBV DNA'nın kalitatif tespiti için kiti kullanın. Standart 2'yi HBV için 20 ± 2'de ve IC için 24 ± 3'te beklenen Ct değerleriyle PC olarak kullanın.
      2. Hiçbir şablon kontrolünün (NTC) hem HBV hem de dahili kontrol (IC) hedefleri için herhangi bir amplifikasyon göstermediğinden emin olun. NTC reaksiyonunda bir amplifikasyon reaksiyonu meydana gelirse, numune kontaminasyonu meydana gelmiş olabilir.
      3. Test sınırı 38 olduğundan, HBV hedefi için 38 Ct'den önceki herhangi bir amplifikasyonu HBV pozitif bir numune olarak düşünün. Tüm kontroller yukarıda belirtilen gereksinimleri karşıladığında, Tablo 6'da belirtilen yorumları izleyen bir örnek düşünün.
    5. Nicel sonuç analizi
      1. Nükleik asit amplifikasyon teknikleri (NAT) için HBV DNA için 4. DSÖ Uluslararası standardına göre kalibre edilmiş HBV'ye özgü DNA için bilinen konsantrasyonların 5 miktar tayini standardı setini kullanın (NAT)20 (Tablo 7).
      2. Standart bir eğri oluşturmak için bu standartları kullanın. Bilinmeyen bir numunenin HBV DNA'sını ölçmek için standart eğriyi kullanın.
        NOT: Gerçek zamanlı PCR yazılımı, 5 standardın tümünün HBV hedefleri için elde edilen Ct değerlerini ve bunların mikrolitre başına uluslararası birimlerde (IU/μL) karşılık gelen konsantrasyonlarını kullanarak standart bir eğri oluşturacaktır.
      3. Bilinmeyen numuneler için değerleri yalnızca standartların eğimi -3.1 ile -3.6 arasındaysa,R2 değeri 0.99 ile 1.0 arasındaysa, PCR verimliliği %90-%110 (0.9-1.1) arasındaysa ve negatif kontrolde amplifikasyon yoksa yorumlayın.
      4. Yazılım, her HBV pozitif numunenin konsantrasyonunu mikrolitre başına uluslararası birimlerde (IU/μL) hesaplayacaktır. Viral yükü hesaplamak için (IU/μL'nin mililitre başına uluslararası birimlere [IU/mL]), aşağıdaki denklemi kullanın:
        Sonuç (IU/mL) = (Sonuç [IU/μL] x Elüsyon Hacmi [μL])/ Numune Hacmi (mL)
        NOT: HBV DNA için 4. DSÖ Uluslararası Standardı, NIBSC kodu 10/266, 0.5 mL plazmadan viral DNA saflaştırması için ekstrakte edildi, saflaştırılmış viral DNA'yı 50 μL elüsyon tamponuna ayrıştırdı ve PCR kiti ile birlikte 5 HBV standardı ve NTC ile birlikte referans numune olarak kullanıldı. Referans numunenin (NIBSC kodu 10/266) HBV viral yükü (6659 IU/μL x 50 μL)/0.5 mL = 6,65,900 IU/mL olarak hesaplandı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan plazmasından/serumundan HBV DNA'sını tespit etmek ve ölçmek için iş akışının şematik bir diyagramı Şekil 1'de gösterilmektedir. Hem HBV hem de IC için Standart 2 (PC olarak kullanılır) ve NTC'nin bir amplifikasyon grafiği Şekil 2'de gösterilmektedir. Şekil 3 , bir HBV-pozitif numune, bir HBV-negatif numune ve PCR inhibisyonu olan bir numune için amplifikasyon eğrilerini göstermektedir. NIBSC kodu 10/266 için amplifikasyon eğri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIBSC kodu 10/266, tedarikçi bilgilerine göre 9,55,000 mL nükleaz içermeyen suda sulandırıldığında 0.5 IU/mL'lik bir birim olarak atanmıştır21. Bu, yüksek yüklü bir HBV pozitif numune olarak kabul edilebilir. Bu çalışmada kullanılan viral yük kiti ile belirlenen HBV viral yükü 6,65,900 IU/mL idi (Şekil 4). Herhangi bir DNA ekstraksiyon kitinin DNA ekstraksiyon verimliliği %100 olmadığından, saflaştırma işlemi sırasında genellikle bir miktar DNA kaybolur. Kit tarafında...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmada kullanılan HBV viral yük kitinin üreticisi olan Kilpest India Limited ile ilişkilidir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita ve Shikha'ya teknik yardımları için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4th Hepatit B virüsü için DSÖ Uluslararası Standardı NIBSCNIBSCkodu: 10/266Hepatit B virüsü (HBV) DNA'sı için 4. DSÖ Uluslararası Standardı, NIBSC kodu 10/266, HBV nükleik asit amplifikasyon tekniklerinde (NAT) kullanılan ikincil referans reaktiflerinin kalibrasyonu için kullanılmak üzere tasarlanmıştır.
ABI gerçek zamanlı PCR makineleri ThermoFisher BilimselABI 7500; QuantStudio 5Bu gerçek zamanlı bir PCR makinesidir 
HBV, HCV ve HIV Multipleks 14/198NIBSC NIBSCkodu: 14/198Bu, hepatit B (HBV), hepatit C (HCV) ve insan immün yetmezlik virüsü-1 (HIV-1) içeren NAT testleri için çok düşük pozitif bir tripleks reaktiftir
QIAGEN gerçek zamanlı PCR makinesiQiagenRotor-Gene QBu gerçek zamanlı bir PCR makinesidir 
TRUPCR HBV Viral Yük kiti Kilpest India Limited3B294Bu, HBV DNA tespiti ve viral yük tayini için bu çalışmada kullanılan gerçek zamanlı PCR tabanlı bir kittir
TRUPCR Viral Nükleik Asit Ekstraksiyon KitiKilpest India Limited3B214Bu, NIBSC:10/266 ve NIBSC:14/198'den HBV viral DNA'sının ekstraksiyonu için kullanılan bir DNA ekstraksiyon kitidir
. .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
  2. Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
  3. Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
  4. Huang, Y. -T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643(2011).
  5. World Health Organization. World Health Organization fact sheet. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023).
  6. Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143(2023).
  7. Chan, H. L. -Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
  8. Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
  9. Liu, C. -J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
  10. Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
  11. Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
  12. Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231(2016).
  13. Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
  14. Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
  15. Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
  16. Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
  17. Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
  18. Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
  19. Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795(2022).
  20. NIBSC-Code:10/266. Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , 4th ed, National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Potters Bar, UK. NIBSC Code: 10/266 (2016).
  21. Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
  22. Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189(2020).
  23. Nibsc-14/198. , National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). At: HBV, HCV and HIV multiplex 14/198 https://www.nibsc.org/ (2023).
  24. Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis B VirusHBV DNAReal Time PCRViral Load QuantificationPCR KitDNA DetectionClinical SamplesStandard CurvePCR EfficiencySerological Tests

Related Articles