Yumurta Parazitoidinde RNA Girişimi, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Trichogramma spp. dünya çapında tarım ve orman ekosistemlerinde geniş bir yelpazede lepidopteran zararlılarına karşı yüksek verimli biyolojik kontrol ajanları olarak yaygın olarak kullanılan bir yumurta parazitoidleri grubudur 1,2,3,4. Kitlesel olarak yetiştirilen Trichogramma uygulaması, zararlıların sürdürülebilir yönetimi için çevre dostu bir yaklaşım sağlar ^5,6,7. Trichogramma yaban arılarının moleküler biyolojisini anlamak, gen düzenleme ve genom düzenleme metodolojisini^{araştırarak bu biyolojik} kontrol ajanlarının ^8,9 kütle yetiştirme verimliliğini ve saha performansını^{artırmaya yönelik} değerli bilgiler sağlar 10.

1998'de Caenorhabditis elegans'ta çift sarmallı RNA (dsRNA) aracılı spesifik genetik girişimin keşfinden bu yana, RNA-girişim (RNAi) yöntemi, hedef genlerin ekspresyonunu baskılayarak organizmaların düzenleyici mekanizmalarını keşfetmek için hayati bir genetik araç setine dönüşmüştür¹¹. RNAi deneyleri, çok sayıda böcek türünde gen fonksiyonunu incelemek için yaygın olarak uygulanan standart bir metodoloji haline gelmiştir ^12,13. Bununla birlikte, RNAi'nin manipülasyonu, birçok parazitoid türde, özellikle endoparazitik Chalcidoidea ailesine ait olanlar arasında zorlu bir zorluk teşkil etmektedir 14,15,16. RNAi yöntemi en az 13 parazitoid türde^{belgelenmiştir} 14,15,16,17,18,19. Bunlar arasında, RNAi yaklaşımı Nasonia yaban arılarında kapsamlı bir şekilde yürütülmüştür ve embriyolar, larvalar, pupa ve yetişkinler dahil olmak üzere gelişim aşamaları boyunca uygulanabilir 14,15,16. Nasonia yaban arılarının ektoparazitoidler olması, yavrularının konakçı pupa ve puparium arasındaki interstisyel boşlukta gelişmesi, in vitro olarak yetiştirilmelerini sağlayan ve mikro enjeksiyon gibi belirli tedavileri tolere etmelerini sağlayan dikkat çekicidir. Nasonia yaban arılarının aksine, Trichogramma bireyleri tüm embriyonik, larva ve pupa gelişimlerini konakçı yumurtanın içinde geçirirler. Embriyo ve larva aşamalarındaki tabaka (dsRNA geçirgenliğini engelleyebilir), hasara karşı savunmasızlık ve in vitro hayatta kalma zorluğu zorlu engeller sunar 20,21,22. Ek olarak, yetişkin veya pupa uzunluğunda yaklaşık ~ 0.5 mm olan Trichogramma bireylerinin küçültülmüş boyutu, onları^20,21,22'yi manipüle etmek için son derece karmaşık hale getirir.

Bu çalışmada, Trichogramma denrolimi Matsumura'da RNA interferansı (RNAi) deneyleri yürütmek için kapsamlı bir prosedürün ana hatlarını çiziyoruz. Bu prosedür aşağıdaki prosedürleri kapsar: (1) çift sarmallı RNA'nın (dsRNA) tasarımı ve sentezi, (2) T. denrolimi pupalarının mikroenjeksiyonu, (3) bu pupaların transplantasyonu ve in vitro inkübasyonu ve (4) RT-qPCR analizi ile hedef gen yıkımının tespiti. RNAi deneyi için seçilen hedef gen, ferritin ağır zincir homolojisidir (Ferhch). Demir bağlayıcı bir protein olan FerHCH, Fe^{2 +} 'nın Fe^{3 +} 'ya oksidasyonunu kolaylaştıran, antioksidan yeteneklere sahip bir ferroksidaz merkezi içerir. Redoks dengesini ve demir homeostazını koruyarak çeşitli organizmaların büyümesinde ve gelişmesinde vazgeçilmez bir rol oynar. FerHCH'nin tükenmesi, aşırı demir birikimine neden olabilir, bu da geri dönüşü olmayan doku hasarına yol açar ve genellikle büyüme kusurları, deformiteler ve mortalite dahil olmak üzere önemli fenotipik değişikliklerle sonuçlanabilir^23,24. Bu çalışma, T. denrolimi'de RNAi'yi yürütmek için adım adım bir kılavuz sunmaktadır ve bu, Trichogramma yaban arılarının daha geniş bağlamında gen fonksiyonlarını araştırmak için paha biçilmez olacaktır.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, aletler, yazılımlar ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Böcek kültürünün toplanması ve bakımı

1. ~5.000 yumurtadan oluşan bir grubu Corcyra cephalonica (Stainton) 9:5 (h/h) arap zamkı tozu ve su 25,26 çözeltisi kullanarak 16 cm'ye^25,26 cm'lik bir karta yapıştırın.
   NOT: Karta çok fazla konakçı yumurta takmaktan kaçının, çünkü aşırı kalabalık sonraki transfer ve diseksiyon prosedürleri için pratik değildir.
2. Konakçı yumurtaların çatlamasını önlemek için, konakçı yumurta kartlarını 30 dakikalık ultraviyole (UV) ışınlamasına maruz bırakın (Şekil 1-i). Daha sonra, inaktif yumurta içeren kağıdı, her biri yaklaşık 300-500 yumurta içeren 1 cm kalınlığında ve 8 cm çapında yumurta kartlarına kesin (Şekil 1-ii)25,26,27.
3. 80-120 T. denrolimi yaban arısı kohortunu 2 cm çapında ve 8 cm uzunluğunda bir cam tüpe yerleştirin. Tüpü pamukla kapatın.
   NOT: Yaban arılarını 25 ± 1 °C sıcaklıkta, 16 saat aydınlık ve 8 saat karanlık aydınlık/karanlık döngüsü ile tutun ve yaklaşık %75 bağıl nemi koruyun.
4. Parazitleştirme için eşekarısına bir konakçı yumurta kartı sunun (Şekil 1-ii). Yaban arılarının yumurtalarını 6 saat boyunca konakçı yumurtalara bırakmalarına izin verin, ardından eşekarısı derhal çıkarın.
   NOT: Parazitleşme süresini aşırı uzatmaktan kaçının, çünkü bu, bir konakçı yumurta içinde T. denrolimi yavrularının aşırı kalabalıklaşmasına neden olabilir ve bu da yavru yaban arısı ölümlerinin artmasına neden olabilir^28,29.

2. dsRNA'nın sentezi

1. Çift sarmallı RNA'nın (dsRNA) sentezi için bir T7 promotörü içeren primer setleri tasarlayın. dsRNA sentezi için hedeflenen genden (Ferhch) 300-400 bp'lik bir segment seçin.
2. Hedeflenen gen için dsRNA üretimi için ticari olarak sentezlenmiş primer setleri ve negatif kontrol olarak kullanılmak üzere dsGFP edinin.
3. Üreticinin protokolünü izleyerek referans kiti kullanarak 100 T. denrolimi yaban arısından^RNA içeriğini çıkarın 9. RNA içeriğinin kalitesini kontrol edin; OD260/OD280 değeri 1.8 ile 2.0⁹ arasında değişiyorsa devam edin.
4. RNA içeriğini 2 μL 5x tampon (1 U/50 μL), 1 μL DNAse (1 U/50 μL) ve 6.5 μL RNA (~100 ng/μL), 0.5 μL_H2Oile 42 °C'de 2 dakika boyunca saflaştırın.
5. 10 μL saflaştırılmış RNA (~100 ng/μL), 4 μL 5x tampon (1 U/50 μL), 1 μL Enzim Karışımı I (1 U/50 μL) ve 4 μL_H2Oiçeren bir cDNA şablonu oluşturmak için ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gerçekleştirin. Aşağıdaki ayarları kullanarak RT-PCR gerçekleştirin: 15 dakika boyunca 37 °C, 5 saniye boyunca 85 °C. cDNA ürününü kullanana kadar -4 °C'de saklayın.
6. dsRNA dizilerini referans alınan ana karışıma göre amplifiye etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin (10 μL Taq II [1 U/50 μL], 0.8 μL ileri primer [0.4 μM], 0.8 μL ters primer [0.4 μM], 0.8 μL DNA şablonu [40 ng/μL] ve 7.6 μL_H2O). Aşağıdaki ayarları kullanarak PCR gerçekleştirin: 94 dakika boyunca 2 °C; 30 sn için 94 °C, 30 sn için 60 °C, 30 için 72 °C ile 35 döngü; 72 °C'de 2 dk.
7. PCR ürünlerinin kalitesini %2.0 agaroz jel ^5,9 üzerinde elektroforez ile değerlendirin ve Sanger dizilimi ile hedef diziyi onaylayın.
8. PCR ürününü Jel Ekstraksiyon Kitini kullanarak üreticinin yönergelerine^{göre saflaştırın 9,23}.
9. 10 μL 2x tampon (0.02 U/μL), 8 μL DNA şablonu (75 ng/μL) ve 2 μL enzim karışımı (1 U/50 μL) ile hedef gen için dsRNA'yı sentezlemek için bir RNAi Sistemi kullanın aşağıdaki ayarlarla: 30 dakika boyunca 37 °C, 10 dakika boyunca 70 °C ve 20 dakika boyunca 25 °C. Sentezlenen dsRNA'yı 30 μL Nükleaz İçermeyen Su ile elute edin.
10. dsRNA ürününün kalitesini% 1.0 agaroz jeli ^5,9 üzerinde görselleştirerek değerlendirin. dsRNA'yı 7.000 ng/μL'ye seyreltin. dsRNA ürününün kalitesini kontrol edin; OD260/OD280 değeri 1.8 ile 2.0⁹ arasında değişiyorsa devam edin. dsRNA ürününü kullanana kadar -20 °C'de saklayın.

3. T. denrolimi pupalarının nakli

1. Parazitlenmiş konukçu yumurtaları yaklaşık 8 gün boyunca 25 ± 1°C'de, 16 saat aydınlık/8 saat karanlık döngü ve ~%75 bağıl nem koruyarak yetiştirin. Parazitlenmiş konakçı yumurtalar 5 gün^{sonra kararacaktır 30} (Şekil 1-iv,v).
2. Ev sahibi yumurta kartını bir diseksiyon mikroskobuna aktarın. Koryonu konakçı yumurtalardan titizlikle çıkarmak için bir çift tungsten iğnesi (Şekil 1-vi) kullanın (Şekil 1-vii) ve pupayı içeriden alın (Şekil 1-viii)^5,17,18.
   NOT: Diseksiyon iğnesinin ucu 0,05 mm'den az olmalıdır.
3. Alt tabaka için temiz bir plaka hazırlayın. 15 g/L'lik bir agar çözeltisinden 10-15 mL dökün ve doğal olarak soğumasını sağlayın (Şekil 2-i).
   NOT: İn vitro kirleticilerin büyümesini engellemek için agar solüsyonunu 0,5 g streptomisin ile karıştırın.
4. 0.2-0.3 mm derinliğinde ve 0.4-0.8 mm genişliğinde birkaç oluğu aşındırmak için dezenfekte edilmiş bir çakıl taşı kullanın (Şekil 2-ii).
5. Kesilen konakçı yumurtadan bir pupayı agar substratındaki oluklardan birine nakletmek için küçük bir fırça (Şekil 2-iii) kullanın (Şekil 2-iv).
6. 3.4 ve 3.5 adımlarını tekrarlayın, 100-300 pupa tek tek oluklara tek tek nakledin (Şekil 2-v).

4. dsRNA'nın T. denrolimi pupa'ya mikro enjeksiyonu

1. Bir cam kılcal damarı çekmek için bir cam iğne çektirmesi kullanın (Şekil 3-i,ii). Bir iğne çektirmede Isıyı 280'e, Hızı 170'e, Gecikmeyi 250'ye ve Çekmeyi 30'a ayarlayın (Şekil 3-iii). Mikroenjeksiyon için birden fazla kılcal cam iğnesi hazırlayın (Şekil 3-iv,v).
2. Aşındırıcı bir plaka kullanarak cam iğnenin ucunu eğimlendirin (Şekil 3-vi).
   NOT: Enjeksiyon iğnesinin ucunun keskin kaldığından emin olun; aksi takdirde pupa mortalitesine neden olabilir veya iğneden reaktif akışını engelleyebilir (Şekil 3-vii).
3. Bir mikro enjeksiyon pompası kullanarak hazırlanan enjeksiyon iğnesine 7.000 ng/μL ile yaklaşık 2 μL dsRNA enjeksiyon solüsyonu yükleyin (Şekil 3-vii).
4. Yüzlerce pupa içeren agar substratını bir bileşik mikroskop platformuna aktarın (Şekil 3-viii).
5. Enjeksiyon iğnesini dikkatlice bir T. denrolimi pupa'nın karnına, lensin altındaki karına ~30° açıyla yerleştirin (Şekil 3-ix).
6. Enjeksiyon çözeltisinin ~ 5 nL'sini (adım 4.3) kademeli olarak T. denrolimi pupa'ya mümkün olduğunca nazikçe enjekte edin.
   NOT: T. denrolimi pupa, dsRNA çözeltisi enjekte edildiğinde hafifçe şişebilir. Pupaya aşırı miktarda solüsyon enjekte etmek veya aşırı büyük açıklıklara sahip iğneler kullanmak erken pupa ölümüne neden olabilir. Birkaç ila onlarca pupa enjekte ettikten sonra tıkandıklarında iğneleri değiştirin.
7. 4.5 ve 4.6 adımlarını tekrarlayın, dsRNA'yı tek tek 600 pupaya enjekte edin.
   NOT: Güvenilir RT-qPCR analizi için RNA içeriği en az 100 pupadan izole edilmelidir. DsRNA tedavisinde üç kopya ve dsGFP negatif kontrolünde^{üç kopya için} en az 600 pupa enjekte edin 9.

5. T. denrolimi pupaların inkübasyonu

1. Enjekte edilen pupa içeren substratı, 16 saat/8 saat aydınlık/karanlık döngüsü ve ~%75 bağıl nem ile 25 ± 1 °C'de bir inkübatöre aktarın.
2. Yaklaşık 700 T. denrolimi pupa'yı tedavi başına 24 saat veya 48 saat inkübe edin. Replikasyon başına 100 pupalık bir gruptan RNA içeriğini çıkarın⁹.
   NOT: Büzülmüş pupaları (ölü pupalar) örneklerden çıkarın; Aksi takdirde, gen ekspresyonunun tespitinde hatalara neden olabilir.
3. Yaban arıları ortaya çıkana kadar tedavi başına ~ 50 T. denrolimi pupa'yı inkübe edin (Şekil 3-x). Ortaya çıkma oranını ve deformite oranını kaydedin.

6. Hedeflenen gen ekspresyonunun tespiti

1. Bir tasarım aracı kullanarak RT-qPCR için hedef gen ve referans genler için primer setini tasarlayın.
   NOT: RT-qPCR primerlerinin dizilerinin, dsRNA'nın hedeflenen bölgesi ile örtüşmediğinden emin olun.
2. RT-qPCR analizinde referans gen olarak gen çatal başı kutusu O (FoxO) kullanın; FoxO'nun primerleri daha önce^{bildirilmiştir 9}.
3. Ticari olarak sentezlenmiş primer setleri elde edin. 10 μL Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL ileri primer (0,4 μM), 0,8 μL ters primer (0,4 μM), 0,8 μL şablon (10 ng/μL) ve 7,6 μL H₂O ile RT-qPCR gerçekleştirin. Aşağıdaki ayarları kullanarak RT-qPCR gerçekleştirin: 30 saniye boyunca 95 °C; 5 sn için 95 °C, 30 sn için 57 °C, 30 için 72 °C ile 35 döngü; 10 saniye boyunca 95 °C; 5 sn boyunca 60 °C ve 5 sn boyunca 95 °C.
4. ^2-ΔΔCt yöntemini kullanarak hedeflenen genin ekspresyon değerini hesaplayın ^9,25.
5. Farklı tedavilerin (dsFerhch, dsGFP, enjeksiyonsuz) etkisi altında hedef genin ekspresyonunu analiz etmek için Kruskal-Wallis testini kullanın.
   NOT: Verilerin heteroskedastisitesi ve normal olmaması hatalı sonuçlara yol açabileceğinden, post-hoc karşılaştırmalar için parametrik testler (örneğin, t-testi) kullanmaktan kaçının²⁵.

dsFerhch enjekte edilen T. denrolimi pupalarının ortaya çıkma oranı, dsGFP enjekte edilenlere veya enjeksiyonsuz olanlara göre anlamlı derecede düşüktü (Tablo 1). Ortaya çıkan yaban arıları arasında, dsFerhch'e maruz kalan T. denrolimi yaban arılarının% 51.85'inde deforme olmuş küçük kanatlar gelişmiştir. DsGFP enjekte edilen veya herhangi bir enjeksiyon yapılmayan yaban arılarında deforme olmuş yaban arıları gözlenmedi (Tablo 1). Ayrıca, dsFerhch enjekte edilen T. denrolimi pupalarının karınları, anormal demir metabolizmasının fenotipi olan melanizm sergiledi23. Melanizm, dsGFP enjekte edilen veya herhangi bir enjeksiyon yapılmayan T. denrolimi pupalarda gözlenmedi (Şekil 4).

RT-qPCR analizi, dsFerhch enjeksiyonundan (0.6460 ± 0.0056) 24 saat sonra T. denrolimi pupae'de Ferhch ekspresyonunun dsGFP enjekte edilenlere (1.4514 ± 0.5402; P = 0.0415). Bununla birlikte, herhangi bir enjeksiyon yapılmadan pupalardaki ekspresyondan önemli ölçüde farklı değildi (1.0000 ± 0.1953; P = 0.8725). DsFerhch enjeksiyonundan (0.5170 ± 0.0575) 48 saat sonra T. denrolimi pupae'deki Ferhch ekspresyonu, dsGFP (0.8515 ± 0.0233; P = 0.0182) ve herhangi bir enjeksiyon yapılmamış olanlar (1.0548 ± 0.3006; P = 0.0113) (Şekil 5).

Şekil 1: Trichogramma denrolimi kültürünün toplanması ve bakımı. (i) Ev sahibi yumurta kartlarını ultraviyole (UV) ışınlamasına maruz bırakın. (ii) İnaktif hale getirilmiş yumurtaların bulunduğu kağıdı yumurta kartlarına kesin. (iii) Parazitleme için eşekarısına bir konakçı yumurta kartı sunun. (iv) Parazitlenmiş konakçı yumurtaları 8 gün boyunca yetiştirin. (v) Parazitlenmiş konakçı yumurtalar 5 gün sonra kararır. (vi) 0,04 mm uçlu diseksiyon iğnesi. (vii) Koryonu konakçı yumurtalardan çıkarın. (viii) T. denrolimi pupa. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Trichogramma denrolimi pupaların transplantasyonu ve inkübasyonu. (i) Agar substratı. (ii) Alt tabaka üzerinde birkaç oluk açmak için dezenfekte edilmiş bir çakıl taşı kullanın. (iii) (iv) pupayı disseke edilmiş konakçı yumurtadan alt tabaka üzerindeki bir oyuğa nakletmek için küçük bir fırça kullanın. (v) 100-300 pupanın tek tek oluklara tek tek nakledilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Mikro enjeksiyon prosedürü. (i) Cam kılcal. (ii) Cam iğne çektirmesi. (iii) İğne çektirmesi ayarları. (iv) Mikroenjeksiyon için birden fazla kılcal cam iğnesi hazırlayın. (v) Kılcal cam iğnenin ucu. (vi) Aşındırıcı bir plaka kullanarak cam iğnenin ucunu eğimlendirin. (vii) Yaklaşık 2 μL dsRNA enjeksiyon solüsyonu yükleyin. (viii) Bileşik mikroskop. (ix) Enjeksiyon iğnesini karın içine sokun ve enjeksiyon solüsyonunu enjekte edin. (x) Yaban arılarının ortaya çıkışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Trichogramma denrolimi pupa ve yaban arısının morfolojik özellikleri. DsFerhch enjekte edilen pupa ve yaban arısı, kararmış vücut rengiyle melanizm sergiler. DsFerhch ile enjekte edilen yaban arısı, bir çift deforme olmuş küçük kanat gösterir. Melanizm ve deforme olmuş kanatlar, dsGFP enjekte edilen veya herhangi bir enjeksiyon yapılmayan pupa ve yaban arılarında gözlenmez. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: ds Ferhch veya dsGFP enjeksiyonundan 24 saat ve 48 saat sonra veya enjeksiyonsuz olarak FoxO'ya göre hedef gen Ferhch'in ekspresyonu. Hata çubukları standart hataları gösterir. Farklı küçük harfler, P < 0.05'te önemli bir farkı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

<<

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.