RNA girişiminin (RNAi) manipülasyonu, Trichogramma yaban arıları gibi küçücük boyuta sahip birçok parazitoid türünde zorlu bir zorluk teşkil eder. Bu çalışma, Trichogramma denrolimi'de etkili bir RNAi yöntemini tanımlamıştır. Mevcut metodoloji, Trichogramma yaban arılarında gen regülasyonunu araştırmak için sağlam bir model sunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yumurta Parazitoidinde RNA Girişimi, Trichogramma dendrolimi Matsumura
Bu makalede
Özet
Özet
Yumurta parazitoitleri, Trichogramma spp, tarım ve ormanlarda çeşitli lepidopteran zararlılarına karşı etkili biyolojik kontrol ajanları olarak kabul edilmektedir. Trichogramma yavrularının olgunlaşmamış aşamaları, konukçu yumurta içinde gelişir ve dikkate değer bir küçülme sergiler (yetişkin uzunluğunda yaklaşık 0,5 mm). RNA-interferans (RNAi) metodolojisi, çok sayıda organizmada gen fonksiyonlarını aydınlatmak için çok önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, Trichogramma gibi bazı küçük parazitoid türlerde RNAi'yi manipüle etmek genellikle önemli zorluklar ortaya çıkarmıştır. Bu çalışmada, Trichogramma denrolimi'de etkili bir RNAi yöntemi sunuyoruz. Ana hatlarıyla belirtilen prosedür, konakçı yumurtalardan bireysel T. dendrolimi örneklerinin elde edilmesini ve izolasyonunu, çift sarmallı RNA'nın (dsRNA) tasarımını ve sentezini, T. dendrolimi pupa'nın in vitro transplantasyonunu ve kültivasyonunu, dsRNA'nın mikro enjeksiyonunu ve ardından RT-qPCR analizi yoluyla hedef gen yıkımının değerlendirilmesini kapsar. Bu çalışma, T. dendrolimi'de RNAi deneyleri yapmak için kapsamlı, görsel olarak ayrıntılı bir prosedür sağlar ve böylece araştırmacıların bu türdeki gen regülasyonunu araştırmasını sağlar. Ayrıca, bu metodoloji, küçük ayarlamalarla diğer Trichogramma türlerinde RNAi çalışmaları veya mikro enjeksiyonlar için uyarlanabilir ve bu da onu diğer endoparazitik türlerde RNAi deneyleri yapmak için değerli bir referans haline getirir.
Giriş
Trichogramma spp. dünya çapında tarım ve orman ekosistemlerinde geniş bir yelpazede lepidopteran zararlılarına karşı yüksek verimli biyolojik kontrol ajanları olarak yaygın olarak kullanılan bir yumurta parazitoidleri grubudur 1,2,3,4. Kitlesel olarak yetiştirilen Trichogramma uygulaması, zararlıların sürdürülebilir yönetimi için çevre dostu bir yaklaşım sağlar 5,6,7. Trichogramma yaban arılarının moleküler biyolojisini an....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, aletler, yazılımlar ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Böcek kültürünün toplanması ve bakımı
- ~5.000 yumurtadan oluşan bir grubu Corcyra cephalonica (Stainton) 9:5 (h/h) arap zamkı tozu ve su 25,26 çözeltisi kullanarak 16 cm'ye25,26 cm'lik bir karta yapıştırın.
NOT: Karta çok fazla konakçı yumurta takmaktan kaçının, çünkü aşırı kalabalık sonraki transfer ve diseksiyon prosedürleri için pratik değildir. - Konakçı yumurtaların çatlamasını önlemek....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
dsFerhch enjekte edilen T. denrolimi pupalarının ortaya çıkma oranı, dsGFP enjekte edilenlere veya enjeksiyonsuz olanlara göre anlamlı derecede düşüktü (Tablo 1). Ortaya çıkan yaban arıları arasında, dsFerhch'e maruz kalan T. denrolimi yaban arılarının% 51.85'inde deforme olmuş küçük kanatlar gelişmiştir. DsGFP enjekte edilen veya herhangi bir enjeksiyon yapılmayan yaban arılarında deforme olmuş yaban arıları gözlenmedi (Tablo 1). Ayr.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Trichogramma yaban arıları, özellikle tarım ve ormancılıkta bir dizi lepidopteran zararlısını hedef alan etkili biyolojik kontrol ajanları olarak kabul edilmektedir1. Bu küçücük yaban arıları, RNAi deneylerinin yürütülmesinde zorluklar sunan bir özellikolan konakçı yumurta içinde olgunlaşmamış aşamalarından geçerler 5,18. Bu çalışma, T. denrolimi'de RNAi deneyleri yapmak için kapsamlı bir görsel rehber sunmaktadır. Tr.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32172476, 32102275), Tarım Bilimi ve Teknoloji İnovasyon Programı (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) ve Yerel Bilim ve Teknoloji Gelişimine Rehberlik Eden Merkezi Fonlar (XZ202301YD0042C) tarafından finanse edilmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Ferhch
çıkarmak için Arapça astarı (İleri)emFerhch qPCR için Kantitatif Gerçek Zamanlı çıkarmak için
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2x ES Taq MasterMix (Boya) | Cowin Biotech, Çin | CW0690H | dsRNA dizilerini çoğaltmak için |
| 20x PBS Tamponu, DEPC ile tedavi edildi (7.2-7.6) | Sangon Biotech, Çin | B540627-0500 | dsRNA'yı seyreltmek için |
| Agar şeridi | Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, Çin | n/a | Kültür ortamı yapmak için |
| Ampisilin sodyum | Sangon Biotech, Çin | A610028 | yapmak kültür ortamı |
| Bioer Sabit sıcaklık metal banyosu & nbsp; | BIOER, Çin | MB-102 | dsRNA |
| Borosilikat cam kılcal sentezi için | WPI, ABD | 1B100-4 | Kılcal cam iğnesini çekmek için |
| Temiz tezgah | Airtech, Çin | SW-CJ-1FD | RNA'yı çıkarmak için |
| Çift damıtılmış su | Sangon Biotech, Çin | A500197-0500 | cDNA Çevresel Test odasını seyreltmek için |
| Panasonic, Japonya | MLR-352H-PC | Kültür T. denrolimi | |
| Eppendorf Santrifüjü | Eppendrof, Almanya | 5418R | RNA içeriğini depolamak için |
| Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendrof, Almanya | FemtoJet 4i | T. denrolimi |
| Eppendorf Soğutmalı Santrifüj | Eppendrof, Almanya | 5810R | Santrifüj |
| Etanol çözeltisi (u, RNaz içermez) | Aladdin, Çin | M052131-500ml | RNA'yı çıkarmak için |
| Jel Ekstraksiyon Kiti | Omega, ABD | D25000-02 | cDNA |
| GUM | Solarbio, Çin | CG5991-500g | Yumurta kartı yapmak için |
| İzopropil alkolhol | Aladdin, Çin | 80109218 | RNA'yı çıkarmak için |
| Lazer Tabanlı Mikropipet Çektirme | SUTTER, ABD | P-2000 | Kılcal cam iğnesini çekmek için |
| Microloader | Eppendrof, Almanya | 20 & L | dsRNA'yı yüklemek için |
| Çok örnekli doku öğütücü | LICHEN, Çin | LC-TG-24 | T. denrolimi |
| >İğne Öğütücü ve nbsp; | SUTTER, ABD | BV-10-E | Kılcal cam iğneyi öğütmek için |
| Nükleaz İçermeyen Su | Sangon Biotech, Çin | RNA'yı seyreltmek için | |
| OLYMPUS Mikroskop | OLYMPUS, Japonya | XZX16 | T. denrolimi |
| PCR makinesini gözlemlemek için | Bio-rad, USA | S-1000 | DNA amplifikasyonu için |
| PowerPac Basic | Bio-rad, USA | PowerPacTM Basic | dsRNA kalitesini tespit etmek için; |
| dsGFP (İleri) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA | ||
| dsGFP (Ters) | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG | ||
| Ferhch qPCR için astarı (İleri) | TGAAGAGATTCTGCTTCTGCT | ||
| Astarı ( Ters) | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
| Ferhch RNAi için astar (Ters) | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC | ||
| Ferhch RNAi(İleri) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG | ||
| FoxO qPCR için astar (İleri) | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
| qPCR için FoxO Primer (Ters) | TGCTGTCGCCTTGTCCT | ||
| gDNA Silgili PrimeScript RT reaktif Kiti (Mükemmel Gerçek Zamanlı) | TaKaRa, Japonya | RR047A | |
| PCR | Bio-rad, ABD | CFX 96 Touch | Ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gerçekleştirmek için |
| Gerçek Zamanlı PCR (TaqMan) Primer ve Problar Tasarım Aracı | https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ | ||
| T7 RiBoMAX Express RNAi Sistemi | Promega, ABD | P1700 | dsRNA sentezlemek için & nbsp; in Vitro |
TB Yeşil Premiks Ex TaqTM  (Til RnaseH Plus) | TaKaRa, Japonya | RR820A | RT-qPCR gerçekleştirmek için |
| Triklorometan | KESHI, Çin | GB/T682-2002 | RNA |
| TRIzol Reaktifini | Ambion, ABD | 15596018 | Örneklerden toplam RNA içeriğini çıkarmak için |
| Ultra Düşük Sıcaklıklı Dondurucu | Termo, ABD | Forma 911 |
Kaynaklar
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
- Zhou, J. C., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
