Bu protokol, zebra balığı larvalarında kardiyak kasılma fonksiyonunu araştırmak ve hücre izleme ve etkileşimli analiz yoluyla kalp mekaniği hakkında bilgi edinmek için ışık tabakası görüntülemeyi kullanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Zebra balığı, olağanüstü kardiyak rejenerasyon kapasitesi ile bilinen ilgi çekici bir model organizmadır. Kasılan kalbi in vivo olarak incelemek, yaralanmalara yanıt olarak yapısal ve fonksiyonel değişiklikler hakkında bilgi edinmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, kardiyak mimariyi ve kontraktiliteyi değerlendirmek için zebra balığı kalbinin yüksek çözünürlüklü ve yüksek hızlı 4 boyutlu (4D, 3D uzamsal + 1D zamansal) görüntülerini elde etmek zor olmaya devam etmektedir. Bu bağlamda, bu teknik sınırlamaların üstesinden gelmek için kurum içi bir ışık tabakası mikroskobu (LSM) ve özelleştirilmiş hesaplamalı analiz kullanılmaktadır. LSM sistem yapısı, retrospektif senkronizasyon, tek hücre takibi ve kullanıcı yönelimli analizi içeren bu strateji, transgenik Tg(myl7:nucGFP) zebra balığı larvalarında tek hücreli çözünürlükte tüm kalp boyunca mikro yapı ve kasılma fonksiyonunun araştırılmasını sağlar. Ek olarak, hassas ve kontrollü bir şekilde kalp hasarını indüklemek için küçük moleküllü bileşiklerin mikroenjeksiyonunu daha da dahil edebiliyoruz. Genel olarak, bu çerçeve, kardiyak morfogenez ve rejenerasyon sırasında fizyolojik ve patofizyolojik değişikliklerin yanı sıra tek hücre düzeyinde bölgesel mekaniğin izlenmesine izin verir.
Giriş
Zebra balığı (Danio rerio), optik şeffaflığı, genetik izlenebilirliği ve rejeneratif kapasitesi 1,2,3,4 nedeniyle kardiyak gelişim, fizyoloji ve onarımı incelemek için yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır. Miyokard infarktüsü sonrası, yapısal ve fonksiyonel değişiklikler kardiyak ejeksiyonu ve hemodinamiği etkilerken, teknik kısıtlılıklar yüksek uzay-zamansal rezolüsyon ile kardiyak rejenerasyon sırasındaki dinamik sürecin araştırılmasını engellemeye devam etmektedir. Örneğin, konfokal mikroskopi gibi geleneksel görüntüle....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma için onay, Dallas'taki Texas Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından #20-07 protokol numarası altında verilmiştir. Bu çalışmada Tg(myl7:nucGFP) transgenik zebra balığılarvaları 12 kullanıldı. Tüm veri toplama ve görüntü işleme sonrası, açık kaynaklı yazılımlar veya araştırma veya eğitim lisanslarına sahip platformlar kullanılarak gerçekleştirildi. Kaynaklar, makul talep üzerine yazarlardan temin edilebilir.
1. Zebra balığı yetiştiriciliği ve embriyo mikroenjeksiyonu
Süre: 2 gün
- Yetişkin zebra balıkların....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Mevcut protokol üç ana adımdan oluşmaktadır: zebra balığı hazırlama ve mikroenjeksiyon, ışık tabakası görüntüleme ve 4D görüntü rekonstrüksiyonu ve hücre izleme ve VR etkileşimi. Yetişkin zebra balıklarının çiftleşmesine izin verildi, döllenmiş yumurtalar toplandı ve önerilen deneyler için gerektiğinde mikroenjeksiyon yapıldı (Şekil 1). Bu adım, kardiyak gelişim ve rejenerasyonun araştırılmasında zebra balığı uygulamalarını keşfetmek için bir giriş noktası sağlar ve ayrıca sonraki görüntülem.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Zebra balığı modelinin mühendislik yöntemleriyle entegrasyonu, miyokard enfarktüsü, aritmiler ve konjenital kalp kusurlarının in vivo araştırılması için büyük bir potansiyele sahiptir. Optik şeffaflığından, rejeneratif kapasitesinden ve insanlarla genetik ve fizyolojik benzerliklerinden yararlanarak, zebra balığı embriyoları ve larvaları araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır 1,2,4. Işık tabakası görüntü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Boston Çocuk Hastanesi'nden Dr. Caroline Burns'e transgenik zebra balığını cömertçe paylaştığı için minnettarlığımızı ifade ediyoruz. UT Dallas'ta zebra balığı yetiştiriciliğindeki yardımları için Bayan Elizabeth Ibanez'e teşekkür ederiz. UT Dallas'taki D-incubator üyeleri tarafından sağlanan tüm yapıcı yorumları da takdir ediyoruz. Bu çalışma NIH R00HL148493 (YD), R01HL162635 (YD) ve UT Dallas STARS programı (YD) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
| Animal models | |||
| Tg(myl7:nucGFP) transgenik zebra balığı | Boston Çocuk Hastanesi Yanık Laboratuvarı | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| Yazılım ve algoritmalar | |||
| MATLAB | MathWorks Inc. | R2023a | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
| Unity | Unity Yazılım A.Ş. | 2020.3.2f1 | |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| 3D Dilimleyici | Andriy Fedorov ve diğerleri17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich ve diğerleri16< sup> | 4 | |
| Hafif levha sistemi< > | |||
| güçlü silindirik lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| 4X Aydınlatma objektifi | Nikon | MRH00045 | |
| 20X Algılama objektifi | Olympus | 1-U2M585 | |
| sCMOS kamera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Motorlu XYZ tablası | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
| İki eksenli eğim kademesi | Thorlabs | GN2/M | |
| Rotasyon step motoru | Pololu | 1474 | |
| Floresan boncuk | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473nm DPSS Lazer | Lazer Kızdırma | R471003GX | |
| 532nm DPSS lazer | Laserglow | R531003FX | |
| Mikroenjektör ve vakum pompası< / güçlü > | |||
| Mikroenjektör | WPI | PV850 | |
| Vakum pompası | Welch | 2522B-01 | |
| Önceden Çekilmiş Cam Pipetler | WPI | TIP10LT | |
| Jel yükleme için kılcal uç | Bio-Rad | 2239912 | |
| Sanal gerçeklik donanımı | |||
| VR kulaklık | Meta | Quest 2 | |
| 30mg/L PTU çözümü | |||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 1X E3 çalışma çözümü | - | < | |
| güçlü>% 1 agaroz< / güçlü> | - | ||
| Düşük eriyik agaroz | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deiyonize su | - | ||
| güçlü>10g / L Trikain stok çözeltisi< / güçlü> | |||
| Trikain | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
| Deiyonize su | - | ||
| Sodyum bikarbonat | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| < güçlü > 150mg / L Trikain çalışma çözeltisi< / güçlü > | |||
| 10g / L Trikain stok çözeltisi | - | ||
| Deiyonize su | - | < | |
| güçlü > 60X E3 stok çözeltisi< / güçlü > | |||
| Sodyum Klorür | Laboratuvarı Hayvan Kaynak Merkezi (LARC), Dallas'taki Texas Üniversitesi | NaCl | |
| Potasyum | Klorür-KCL | ||
| Kalsiyum Klorür Dihidrat-CaCL | alt >2 < / alt > x 2H < alt > 2 < / alt >O | ||
| Magnezyum Sülfat Heptahidrat-MgSO | sub>4 < / sub>x 7H2< / sub>O | ||
| RO Su | - | -< | |
| güçlü>1X E3 çalışma çözümü | |||
| 60X E3 stok çözümü | Lab Animal Resource Center (LARC), Dallas'taki Texas Üniversitesi | - | |
| RO Su | - | % | |
| 1 Metilen Mavisi (isteğe bağlı) | - | C16H<>sub18ClN3S |
Kaynaklar
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ. Res. 110 (6), 870(2012).
- Ding, Y., Bu, ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
