Bu protokol, zebra balığı larvalarında kardiyak kasılma fonksiyonunu araştırmak ve hücre izleme ve etkileşimli analiz yoluyla kalp mekaniği hakkında bilgi edinmek için ışık tabakası görüntülemeyi kullanır.
Yöntem makalesi
Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Zebra balığı, olağanüstü kardiyak rejenerasyon kapasitesi ile bilinen ilgi çekici bir model organizmadır. Kasılan kalbi in vivo olarak incelemek, yaralanmalara yanıt olarak yapısal ve fonksiyonel değişiklikler hakkında bilgi edinmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, kardiyak mimariyi ve kontraktiliteyi değerlendirmek için zebra balığı kalbinin yüksek çözünürlüklü ve yüksek hızlı 4 boyutlu (4D, 3D uzamsal + 1D zamansal) görüntülerini elde etmek zor olmaya devam etmektedir. Bu bağlamda, bu teknik sınırlamaların üstesinden gelmek için kurum içi bir ışık tabakası mikroskobu (LSM) ve özelleştirilmiş hesaplamalı analiz kullanılmaktadır. LSM sistem yapısı, retrospektif senkronizasyon, tek hücre takibi ve kullanıcı yönelimli analizi içeren bu strateji, transgenik Tg(myl7:nucGFP) zebra balığı larvalarında tek hücreli çözünürlükte tüm kalp boyunca mikro yapı ve kasılma fonksiyonunun araştırılmasını sağlar. Ek olarak, hassas ve kontrollü bir şekilde kalp hasarını indüklemek için küçük moleküllü bileşiklerin mikroenjeksiyonunu daha da dahil edebiliyoruz. Genel olarak, bu çerçeve, kardiyak morfogenez ve rejenerasyon sırasında fizyolojik ve patofizyolojik değişikliklerin yanı sıra tek hücre düzeyinde bölgesel mekaniğin izlenmesine izin verir.
Giriş
Zebra balığı (Danio rerio), optik şeffaflığı, genetik izlenebilirliği ve rejeneratif kapasitesi 1,2,3,4 nedeniyle kardiyak gelişim, fizyoloji ve onarımı incelemek için yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır. Miyokard infarktüsü sonrası, yapısal ve fonksiyonel değişiklikler kardiyak ejeksiyonu ve hemodinamiği etkilerken, teknik kısıtlılıklar yüksek uzay-zamansal rezolüsyon ile kardiyak rejenerasyon sırasındaki dinamik sürecin araştırılmasını engellemeye devam etmektedir. Örneğin, konfokal mikroskopi gibi geleneksel görüntüleme yöntemlerinin, dinamik değişiklikleri yakalamak ve çoklu kardiyak sikluslar sırasında kardiyak kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için görüntüleme derinliği, zamansal çözünürlük veya fototoksisite açısından sınırlamaları vardır5.
Işık tabakası mikroskobu, lazeri kalbin ventrikülü ve atriyumu boyunca hızlı bir şekilde süpürerek, gelişmiş uzay-zamansal çözünürlük ve ihmal edilebilir foto-ağartma ve foto-toksik etkilere sahip ayrıntılı görüntüler elde ederek bu sorunları başarıyla ele alan son teknoloji bir görüntüleme yöntemini temsil eder 6,7,8,9,10,11.
Bu protokol, çoklu kardiyak döngüler sırasında tüm kalp boyunca kardiyomiyositlerin dinamiklerini yakalamak ve analiz etmek için LSM sistem yapımı, 4D görüntü rekonstrüksiyonu, 3D hücre takibi ve etkileşimli analizi içeren kapsamlı bir görüntüleme stratejisi sunar12. Özelleştirilmiş görüntüleme sistemi ve hesaplama metodolojisi, transgenik Tg (myl7: nucGFP) zebra balığı larvalarında miyokardiyal mikro yapının ve kasılma fonksiyonunun tek hücre düzeyinde izlenmesine izin verir. Ayrıca, ilaca bağlı kardiyak hasarı ve müteakip rejenerasyonu değerlendirmek için mikroenjeksiyon kullanılarak embriyolara küçük moleküllü bileşikler verildi. Bu bütünsel strateji, kardiyak gelişim ve rejenerasyon sırasında miyokardın yapısal, fonksiyonel ve mekanik özelliklerini tek hücre düzeyinde in vivo olarak araştırmak için bir giriş noktası sağlar.
Protokol
Bu çalışma için onay, Dallas'taki Texas Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından #20-07 protokol numarası altında verilmiştir. Bu çalışmada Tg(myl7:nucGFP) transgenik zebra balığılarvaları 12 kullanıldı. Tüm veri toplama ve görüntü işleme sonrası, açık kaynaklı yazılımlar veya araştırma veya eğitim lisanslarına sahip platformlar kullanılarak gerçekleştirildi. Kaynaklar, makul talep üzerine yazarlardan temin edilebilir.
1. Zebra balığı yetiştiriciliği ve embriyo mikroenjeksiyonu
Süre: 2 gün
- Yetişkin zebra balıklarını standart bakım ve yetiştirme prosedürleriyle koruyun ve yetiştirin. Ayrıntılı yöntemler için önceki rapor13'e bakın.
- Belirlenen protokole göre mikroenjeksiyon yapın14. Bu çalışmada mikroenjeksiyon 1-2 hücreli (zigot) evrede uygulandı.
NOT: Etkili mikroenjeksiyon için bu aşamanın doğru tanımlanması ve gelişimsel tutarlılığın sağlanması çok önemlidir. Tek hücreli aşamada, yumurta sarısının üzerinde küçük bir kubbe oluşur ve bu aşama tipik olarak yaklaşık 12 dakika sürer. İki hücreli aşamaya ilerledikten sonra, iki bitişik kubbe görünür hale gelir ve bu aşama döllenmeden yaklaşık 45 dakika sonra sürer15. Sistem yapısı hakkında daha ayrıntılı bilgi diğer raporlarda veya protokollerdebulunabilir 12,16,17.
2. Zebra balığı embriyoları/larvaları hazırlama ve montajı
Süre: 7 gün
- Pigment oluşumunu önlemek için döllenmeden 1 gün sonra (dpf) embriyoları 0.2 mM 1-Fenil-2-tiyoüre (PTU) ile E3 suyuna aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Ortamı, LSM görüntülemeye kadar her gün PTU'lu taze E3 suyuyla değiştirin.
- Gelişimlerini 0 ile 7 dpf arasında istenen zaman noktalarında kaydetmek için embriyoları veya larvaları stereo mikroskopla görüntüleyin.
- Zebra balığı larvalarını LSM sistemi12 altına gömmek için 2 mm iç çapa sahip segmentli florlu etilen propilen (FEP) tüpleri hazırlayın.
NOT: FEP tüpü, numuneyi su gibi çevredeki ortama çok benzeyen kırılma indisi eşleşen malzemelerle sabitlemek için kullanılır. - 3 dpf'den başlayarak, görüntülemeden önce balıkları hareketsiz hale getirmek için balıkları 150 mg / L trikain (MS-222) çözeltisine aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- 150 mg/L trikain ile %0,8 düşük erime noktalı agaroz hazırlayın ve anestezi uygulanmış balığı oda sıcaklığına18 soğuduktan sonra agaroza taşımak için bir transfer pipeti kullanın.
- Balığı agarozlu FEP tüplerine monte etmek için başka bir transfer pipeti kullanın (Şekil 1).
NOT: Gelişmekte olan embriyolardaki minimum stresi belirlemek için, kalp atış hızı gibi kardiyak aktivitenin fiksasyon öncesi ve sonrası incelemeleri mikroskobik gözlem altında yapıldı. Bu değerlendirmeler, trikin anestezisi öncesi ve sonrası önemli farklılıkları belirlemeyi amaçladı. Ödem gibi kardiyak yapıdaki düzensizlikler için cilt ve kas sisteminin ek bir muayenesi de fiksasyon sonrası yapılabilir. Trikama konsantrasyonu kardiyak görüntülemede de çok önemli bir rol oynamaktadır19 ve bu nedenle bu projede zebra balığı larvalarında kasılmanın görüntülenmesi için 150 mg/L konsantrasyonlu trikain çözeltisi kullanılmıştır. Mevcut retrospektif senkronizasyon, düzensiz kalp atışlarını20 ele almamıza izin verirken, zebra balıklarında kardiyak aritmilerin 4D görüntülenmesi ve uzun süreli görüntüleme için kapsamlı bir çözüm hala geliştirilme aşamasındadır.
3. Hafif sayfa görüntüleme sistemi kurulumu ve yapılandırması
Süre: 3-14 gün
- Aydınlatma kaynakları olarak 473 nm ve 532 nm gibi belirli dalga boylarında sürekli dalga diyot pompalı katı hal (DPSS) lazer sistemleri kullanarak silindirik bir merceğe dayalı bir şirket içi LSM sistemi oluşturun (Şekil 2A).
- Görüntü dizilerini yakalamak için translasyonel numune aşamasının, ışık tabakası aydınlatmasının ve sCMOS kameranın pozlamasının senkronizasyonu için LabVIEW ( Malzeme Tablosuna bakın) kontrol kodlarını özelleştirin.
NOT: Sistem yapısı hakkında daha ayrıntılı bilgi diğer raporlarda veya protokollerdebulunabilir 12,16,17. Araştırma gruplarını, sistem yapımı sırasında optik görüntüleme konusunda yerleşik uzmanlığa sahip laboratuvarlarla işbirliği fırsatları aramaya teşvik ediyoruz.
4. Zebra balığı görüntüleme hazırlığı ve veri toplama
Süre: 1 gün
- Floresan boncuklarını ölçerek LSM sisteminin uzamsal çözünürlüğünü kalibre edin ve değişen derinliklerde opaklık değişimini en aza indirin.
- İlk olarak, 0,53 μm çapındaki floresan boncukları ( Malzeme Tablosuna bakınız) %0,8 düşük erime noktalı agaroz kullanarak 1: 1,5 x 105 konsantrasyona seyreltin ve çözeltiyi segmentli FEP tüpüne aktarın.
- İkinci olarak, boncukları görüntülemek için LSM sistemini kullanın ve tüm numune boyunca nokta yayılma fonksiyonunu (PSF) ölçün, uzamsal çözünürlüğü ve sistem hizalamasınıdoğrulayın 12.
NOT: Bu sistemde, yarı maksimumda (FWHM) tam genişlik için temsili sonuçların analizi, sırasıyla 1,26 ± 0,15 ve 2,48 ± 0,15 μm (n = 60 boncuk) yanal ve eksenel çözünürlükleri gösterir. Bu, görüntüleme derinliği boyunca tutarlı bir uzamsal çözünürlük önerir.
- Monte edilmiş zebra balığı larvalı FEP tüpünü 6 eksenli (x, y, z, eğim, sapma ve yuvarlanma) motorlu numune tablasına güvenli bir şekilde takın ve tüpleri E3 suyla dolu numune haznesine daldırın. Yumurta sarısı kesesinin ışık saçmasını önlemek ve kalbin konumunu daha iyi bulmak için, zebra balığı larvalarını döndürerek ventral taraftan görüntü alın (Şekil 2B). Bu durumda, yakalanan görüntülerin çoğu hem ventrikülü hem de atriyumu içerecektir (Şekil 2C).
NOT: Mevcut görüntüleme prosedürlerinin tipik olarak balık başına bir saatten az sürdüğü ve kontrollü bir oda sıcaklığı ortamında gerçekleştirildiği göz önüne alındığında, oda sıcaklığı kontrolü ve oksijen seviyesi düzenlemesi bu proje için isteğe bağlı olarak kabul edilir. Bununla birlikte, özellikle gelişimsel süreçlere odaklanan daha uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme çalışmaları için, zebra balığının fizyolojik ortamını sağlamak ve olası gelişimsel anormallikleri önlemek için numune odası içinde 27 ° C'de sürekli sıcaklık izleme ve düzenleme önerilmektedir. - Motorlu numune tablasını iş istasyonuna bağlayın ve istenen hareket modu da dahil olmak üzere gerekli tüm parametreleri yapılandırın.
- sCMOS kamera ile iş istasyonu arasında bir bağlantı kurun. 5 ms'lik pozlama süresi ve istenen ilgi alanı gibi tüm temel ayarları yapın.
- Özelleştirilmiş LabVIEW kontrol programı içindeki görüntü dizilerinin ve karelerin sayısını yapılandırın.
- Lazeri açın ve numunenin LSM görüntülemesini başlatın. Tüm görüntü dizileri başarıyla kaydedilene kadar işlemi sürdürün.
- Larvaların 3-5 kardiyak döngüsünü 200 kare/saniye kare hızıyla kapsayacak şekilde 2D görüntü dizisi olarak 300 kare kaydedin. Kayıt, ışık tabakası tarafından aydınlatılan seçici düzlemde kardiyak kasılmayı yakalar.
- Numuneyi sanal olarak dilimlemek için larvayı ışık tabakası aydınlatması boyunca 1 μm'lik adım boyutunda hareket ettirin.
NOT: Numune aşamasının adım boyutu, Nyquist-Shannon örnekleme teoremi12 izlenerek hafif tabaka sisteminin eksenel çözünürlüğüne göre ayarlanmalıdır. - Tüm kalp kaplanana kadar yeni örnek dilimin başka bir görüntü dizisini kaydetmek için 7. adımı tekrarlayın. Genel olarak, 1 μm adım boyutuna sahip 100-200 görüntü dizisi, bir zebra balığı larvasının tüm kalbinin kapsanmasını sağlar (Şekil 2D).
NOT: Adım 4.7-4.9, LabVIEW programı tarafından kontrol edilir ve LSM sistemi tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir (Şekil 3). Üretilen görüntü verilerinin büyük hacmi göz önüne alındığında, görüntü dizileri için standartlaştırılmış bir adlandırma kuralı önerilir. Örneğin, çeşitli görüntü dizileri arasında verileri kategorilere ayırmak için "z-1", "z-2" vb. adlara sahip klasörler atayın. Her dizide, görüntüler farklı zaman noktalarını belirtmek için sırayla adlandırılmalıdır (örneğin, "1", "2", ...). Bir zebra balığı larvası için balıkların montajı, görüntüleme açısının ayarlanması ve tüm verilerin toplanması için toplam süre yaklaşık 1 saattir.
5. Paralel hesaplama ile 4D görüntü rekonstrüksiyonu
Süre: 1 gün
NOT: Grubumuz tarafından geliştirilen 4D rekonstrüksiyon algoritması ve örnek veriler kamuya açıktır21. Bu yöntem, önceki adımlarda toplanan görüntü dizilerinden 4D kalp görüntüsünün yeniden oluşturulmasına olanak tanır (Tablo 1).
- test_Parallel.m dosyasını MATLAB'da açın (Malzeme Tablosu'na bakın). Ham görüntü dizilerinin saklandığı klasör konumunu "baseDir" değişkeninde belirtin.
- "numOfSlice" değişkenini toplam görüntü dizisi sayısıyla (genellikle 100-150) ve "numOfImage" değişkenini her dizideki görüntü sayısıyla (genellikle 300-500) atayın.
- Zebra balığı kalbinin orta düzlemini gösteren görüntü dizisini inceleyin (örneğin, toplam 101 diziden 51. dizi). Bu dizideki birinci ve dördüncü sistollerin çerçeve numaralarını belirleyin ve bunları systolicPoint_1st ve systolicPoint_4th değişkenlerine atayın.
- İşlemi başlatmak için Çalıştır'a tıklayın.
NOT: Her bir görüntü dizisindeki kardiyak siklusun uzunluğu, ilk olarak MATLAB programı tarafından farklı zaman noktalarındaki görüntüler arasındaki benzerliğin (kare farkların toplamı) karşılaştırılmasıyla tanımlanacaktır. Daha sonra, kardiyak döngü, tüm görüntü dizilerinden döngü uzunluklarının ortalaması kullanılarak tahmin edilecektir. Daha sonra, farklı eksenel konumlardaki görüntü dizilerinin başlangıç noktaları, ilk görüntü dizisinden son görüntü dizisine görüntü benzerliğinin yinelemeli bir karşılaştırması yoluyla program tarafından hizalanacaktır. - Çıktı klasöründeki sonuçları kontrol edin. Program, görüntüleri zaman damgalı ".tif" dosyaları olarak kaydedecektir. Her ".tif" dosyası, belirli bir zaman noktasında bir 3D kalp görüntüsüdür. İki 3D görüntü arasındaki zaman aralığı, ayarlanan pozlama süresine eşittir.
NOT: 4D (3D uzamsal + 1D zamansal) kardiyak kasılmaları tasvir etmek için önceki adımlardan elde edilen görüntüleri yeniden oluşturun. Geriye dönük eşitleme sırasında yüksek verimli araştırmalarda yeterliliği artırmak için bu yaklaşım, MATLAB paralel bilgi işlem araç kutusu aracılığıyla birden çok CPU çekirdeğinden yararlanarak ve görüntüleri gpuArray biçimine dönüştürerek bir GPU üzerinde eşzamanlı hesaplama işlemlerine olanak tanır.
6. 3D hücre segmentasyonu ve hücre takibi
Süre: 1 gün
- 3DeeCellTracker paketini indirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve Python ortamını kurun22.
- ITK-SNAP açıklama yazılımını23 indirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve eğitim ve doğrulama veri kümelerini oluşturmak için 3D kalp görüntüsünü biri ventriküler diyastolde ve diğeri ventriküler sistolde olmak üzere seçilen iki zaman noktasında manuel olarak etiketlemek için kullanın.
NOT: Diğer etiketleme yazılımları da geçerli olabilir. - Python'da, 3DeeCellTracker eğitim programını çalıştırın ve önceden tanımlanmış 3D U-Net modelini ayarlamak için TrainingUNet3D işlevinde noise_level(bu durumda 100), folder_path ve model parametrelerini başlatın.
- MATLAB'da, eğitim ve doğrulama veri kümesini yükleme için uygun biçime dönüştürmek ve yeniden adlandırmak için imageDimConverter.m programını kullanın.
- Python'da trainer.load_dataset() ve trainer.draw_dataset() işlevlerini kullanarak eğitim ve doğrulama veri kümelerini yükleyin.
- Python'da, 3DeeCellTracker izleme programının ilk bölümünü çalıştırın ve parametreleri başlatın.
NOT: Bu, görüntü boyutlarını karakterize etmek için görüntü parametrelerini, hücre segmentasyonu için uygulanan makine öğrenimi modelini seçmek için segmentasyon parametrelerini ve hücre kaydı için kullanılan önceden eğitilmiş derin sinir ağı modellerini seçmek için izleme parametrelerini tanımlamayı içerir. İlk kullanımda, hücre segmentasyonu için U-Net modelinin ve hücre kaydı için FFN+ PR-GLS'nin kullanılması önerilir. Verilerin, modellerin ve sonuçların bu adımda otomatik olarak oluşturulacak klasörlerde saklanması gerekir. - MATLAB'da, tüm 3B kalp görüntülerini uygun formata dönüştürmek ve yeniden adlandırmak ve bunları son adımda oluşturulan veri klasörüne aktarmak için imageDimConverter.m programını kullanın.
- Python'da, segmentasyonu başlatmak için 3DeeCellTracker programının ikinci bölümünü çalıştırın.
- İlk 3D görüntü bölümlere ayrıldıktan sonra, segmentasyon sonucunu ham görüntüyle karşılaştırın ve herhangi bir yanlış segmentasyon bulunursa manuel düzeltme yapın. Düzeltilmiş segmentasyonu oluşturulan "/manual_vol1" klasörüne taşıyın.
- Python'da, tüm görüntüleri bölümlere ayırmak için 3DeeCellTracker programının üçüncü bölümünü çalıştırın.
- İzlenen hücrelerin konumlarını karşılık gelen ham görüntülerle karşılaştırarak izleme sonuçlarının görsel bir değerlendirmesini yapmak için Amira'yı kullanın (Malzeme Tablosuna bakın). Test sonuçları tatmin edici değilse, yordamı adım 6.6'dan yeniden başlatın, segmentasyon veya hücre kaydı için alternatif bir makine öğrenimi modeli kullanın ve ardından izleme işlemini yeniden başlatın.
NOT: Segmentasyondan sonra, hücre etiketlerinin verileri varsayılan olarak 8 bitlik bir görüntü (0 - 255) olarak depolanır, bu da hücre sınıflandırması için etiket olarak yalnızca 256 ölçek sağlandığı anlamına gelir. Ek sınıflara ihtiyaç duyulduğunda bu sorunu çözmek için iki çözüm vardır. Çözümlerden biri, hücre etiketlerinin veri formatını izleme programında 16 bitlik bir görüntü olarak ayarlamaktır, bu da mevcut durumda işlem süresinde iki günden fazla üstel bir artışa neden olacaktır. Diğer çözüm, aynı etiketlere sahip hücreleri fiziksel konumlarına göre ayıracak ve her hücreye farklı bir etiket atayacak olan hücre etiketlerini sonradan işlemek için "separateTrackingResults.py" programını kullanmaktır. Bu durumda bu işlem yaklaşık 10 dakika sürer.
7. Sanal gerçeklik modunda kardiyak kasılma analizi
Süre: 1 gün
- Önceki adımlardan hücre izleme sonucunu alın.
- Verileri manuel olarak doğrulayın ve tüm birimlerde tutarlı görüntü yoğunluğuna sahip hücreleri seçin (yaklaşık 600 hücreden yaklaşık 500'ü).
- 3B Dilimleyici yazılımı 24 aracılığıyla her bir hücre için bir yüzey ağı oluşturmak ve her hücreye benzersiz bir renk kodu atamak için cellLabelsToObj.ipynb komut dosyası21'i kullanın.
- Tek bir zaman noktasındaki tüm hücrelerden oluşan her 3B modeli, hücre etiketini açıklamak için bir .mtl dosyasıyla birlikte birden çok alt nesneden oluşan tek bir .obj dosyası olarak dışa aktarın.
- Genişletilmiş gerçeklik için kullanılan bir geliştirme altyapısı olan eğitim lisansını kullanarak modelleri Unity'ye aktarın.
- 4B görselleştirme ve etkileşimli analize izin vermek için C# ile yazılmış işlevlerden oluşan özelleştirilmiş komut dosyalarını modellere ve kullanıcı arabirimi öğelerine uygulayın. Adım 7.7'yi izleyerek VR etkileşimi gerçekleştirin.
- Aşağıdaki işlevleri kullanarak sanal gerçeklikteki (VR) modellerle etkileşim kurun (Şekil 4):
- Hücre seçimi: Bir seferde en fazla iki hücre seçin ve yörüngelerini, hızlarını, hacimlerini, yüzey alanlarını ve göreli mesafelerini görüntüleyin.
- Zaman noktası seçimi: Seçilen hücrelerin çıktılarını analiz etmek için verilerde belirli bir zaman noktası seçin, örneğin diyastol sırasında t = 0 ms veya sistol sırasında t = 200 ms.
- Zaman duraklatma: Seçili hücrelere ve çıktılarına odaklanmak için dinamik modeli dondurun.
- Kontrast: Modeldeki seçili hücreler ve çevresindeki hücreler arasındaki kontrastı modüle edin.
Sonuçlar
Mevcut protokol üç ana adımdan oluşmaktadır: zebra balığı hazırlama ve mikroenjeksiyon, ışık tabakası görüntüleme ve 4D görüntü rekonstrüksiyonu ve hücre izleme ve VR etkileşimi. Yetişkin zebra balıklarının çiftleşmesine izin verildi, döllenmiş yumurtalar toplandı ve önerilen deneyler için gerektiğinde mikroenjeksiyon yapıldı (Şekil 1). Bu adım, kardiyak gelişim ve rejenerasyonun araştırılmasında zebra balığı uygulamalarını keşfetmek için bir giriş noktası sağlar ve ayrıca sonraki görüntüleme ve analizde çok önemli bir rol oynar. Kasılan kalp, özel yapım LSM sistemi kullanılarak farklı aşamalarda (3 dpf'den 7 dpf'ye) görüntülendi ve 4D zebra balığı kalp modelini yeniden oluşturmak için görüntü dizilerini z ekseni boyunca hizaladı (Şekil 2 ve Şekil 3). Bu modeller, derin fenotipik karakterizasyonlar için bir temel sağlar ve gelişimsel zaman çizelgeleri boyunca kardiyak morfoloji ve fonksiyonun dinamiklerini ortaya çıkarmada çok önemlidir. Zebra balığı kalbindeki tek tek hücreler izlendi ve hareketleri ve etkileşimleri, özelleştirilmiş VR platformu kullanılarak ölçüldü. Bölgesel kontraktiliteyi değerlendirmek ve lokal suşu araştırmak için atriyum ve ventriküldeki bir kardiyak döngü sırasında seçilen hücrelerin hız ve bağıl mesafe değişiklikleri de karşılaştırıldı (Şekil 4). Bölgesel suş, ilgilenilen bölgedeki iki bitişik miyokard hücresi arasındaki yer değiştirmedeki varyasyona göre belirlendi. Fraksiyonel kısalma (FS) ve ejeksiyon fraksiyonu (EF), yayınlanmış literatürde açıklanan metodolojiler kullanılarak tahmin edilmiştir25. FS ve EF denklemleri aşağıdaki gibidir:
burada Dd ve Ds , sırasıyla diyastol sonu ve sistolik son aşamalardaki ventrikül çaplarıdır (kısa eksen, farklı ventrikül hücreleri arasındaki mesafelerle ölçülür) ve Vd ve Vs , sırasıyla diyastol sonu ve sistolik sonu aşamalardaki ventrikül hacimleridir (ventrikülün uzun ve kısa eksen çapları ile hesaplanır).
Toplu olarak, bu sonuçlar, zebra balığı modellerinde hacimsel görüntüleme ve veri yorumlamayı kolaylaştırmak için hem fizyolojiyi hem de mühendisliği entegre eden yeni bir stratejiyi sergiliyor ve kardiyak morfogenez ve mekaniğin keşfini ilerletmek için büyük umut vaat ediyor.
Şekil 1: Zebra balığı yumurtası toplama ve mikroenjeksiyon işlemi. İşlem, yetişkin zebra balıklarının çiftleştirilmesini, döllenmiş yumurtaların toplanmasını ve isteğe bağlı mikroenjeksiyonun gerçekleştirilmesini içerir. Mikroenjeksiyon sırasında önceden çekilmiş cam pipete istenilen malzemeler yüklenir. Döllenmiş yumurtalar, agaroz küf yarıkları içinde düz sıralar halinde dizilir ve iğneye dik olarak konumlandırılır. Mikroenjeksiyon, hem yumurtaların hem de iğne ucunun sürekli mikroskobik gözlemi altında gerçekleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Işık sayfası görüntüleme işlemi ve 4D görüntü rekonstrüksiyonu. (A) Kurum içi ışık sayfası görüntüleme sistemi yapısının şeması. CL: silindirik mercek. EO: uyarma amacı. YAPIN: algılama hedefi. TL: tüp lens. FL: filtre. CAM: sCMOS kamera. (B) FEP tüpüne monte edilmiş ve agaroz ile gömülü bir zebra balığının şeması. (C) 4 dpf zebra balığı larvasından yakalanan ham 2D görüntü dizisi. Her karenin sol üst köşesindeki saat, sistol sonundan başlayarak kardiyak fazı gösterir. (D) 4D zebra balığı görüntü kaydı için geriye dönük senkronizasyon gösterimi. Görüntü dizisi, z ekseni boyunca belirli bir derinlikte sürekli bir kaydı gösterir. Görüntü dizisindeki her kare kırmızı bir nokta ile temsil edilir ve diyastol sonundan sistol sonuna kadar başlangıç ve bitiş aşamaları sarı kutuda vurgulanır. (E) 2D görüntü dizilerinden 4D yeniden yapılandırılmış kalp modelleri. Dpf: döllenmeden sonraki günler. Bu şekil Zhang ve ark.12'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: LabVIEW kontrol paneli. (A) Kontrol panelinde kullanılan ayarlar, lazer, kamera, görüntü yolu ve motor modelinin yapılandırmasını kapsar. (B) LabVIEW programı tarafından yakalanan ham zebra balığı kalp görüntüsüne bir örnek. Ölçek çubuğu: 30 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hücre izleme ve VR etkileşimi, zebra balığı kardiyak kasılmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olur. (A) 3 dpf'de Tg(myl7:nucGFP) zebra balığı kalbinin izlenen hücreleri. (B) VR platformu, kullanıcılara bir 4D zebra balığı kalp modelinin sürükleyici bir görüntüleme ve etkileşimli deneyimini sunarak, kullanıcı tanımlı analiz yoluyla zaman içinde kalp fonksiyonunu görselleştirmeye olanak tanır. (C) VR platformundan ölçümler toplandıktan sonra, 3 dpf ve 7 dpf'de seçilen hücreler arasında bir kardiyak döngü sırasında hız ve bağıl mesafe değişiklikleri karşılaştırıldı. İlk iki şekil, beş ventriküler hücre ve beş atriyal hücredeki ortalama hız değişikliklerini gösterir ve diğerleri, üç hücre grubu, yani iki ventriküler hücre, bir ventriküler hücre ve bir atriyal hücre ve iki atriyal hücre arasındaki bağıl mesafe değişikliklerini göstermektedir. (D) 3 dpf ve 7 dpf zebra balığı kalbinin kardiyak fonksiyon değerlendirmeleri. Zebra balığı kalplerinde 3 dpf'de toplam 370 hücre izlendi ve 7 dpf'de 580 hücre izlendi. Bu şekil Zhang ve ark.12'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| AD | KULLANIM | TANIMLAYICI | |
| Özelleştirilmiş programlar ve algoritmalar | |||
| PSF.m | Floresan boncukların FWHM ölçüm sonuçlarından PSF'yi hesaplamak için. | MATLAB programı | |
| 4D Zebra Balığı Imaging.vi | LSM sistemindeki donanımı kontrol etmek ve senkronize etmek için. | LabVIEW programı | |
| test_Parallel.m, vb. | 2B görüntü dizilerinden 4B görüntüleri yeniden oluşturmak için. | MATLAB programı | |
| imageDimConverter.m | Hücre izleme için görüntü verilerini belirli bir biçimde gizlemek için. | MATLAB programı | |
| separateTrackingResults.py | Aynı etiketlere sahip hücreleri ayırmak için işlem hücresi izleme sonuçlarını deftere nakletmek için. | Python programı | |
| cellTracking_All.py | Tüm birimlerde tutarlı görüntü yoğunluğuna sahip hücreleri seçmek için. | Python programı | |
| cellLabelsToObj.ipynb | 3B dilimleyici aracılığıyla her bir hücre için bir yüzey ağı oluşturmak için. | Python programı | |
| DynamicHeartModel.cs vb. | Bir VR ortamı oluşturmak ve nesnelerle etkileşim kurmak için. | C# programı | |
| Özelleştirilmiş donanım tasarımı | |||
| 3D baskılı numune haznesi | Suya daldırma hedefleriyle kullanmak için. | SolidWorks tasarımı | |
| 3D baskılı numune tutucu | Numune aşamasına uyum sağlamak ve numuneyi tutmak. | SolidWorks tasarımı | |
Tablo 1: Özelleştirilmiş kaynaklar tablosu. Örnek kodlar ve veriler Zenodo21'e yüklenir.
Tartışma
Zebra balığı modelinin mühendislik yöntemleriyle entegrasyonu, miyokard enfarktüsü, aritmiler ve konjenital kalp kusurlarının in vivo araştırılması için büyük bir potansiyele sahiptir. Optik şeffaflığından, rejeneratif kapasitesinden ve insanlarla genetik ve fizyolojik benzerliklerinden yararlanarak, zebra balığı embriyoları ve larvaları araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır 1,2,4. Işık tabakası görüntülemenin üstün uzay-zamansal çözünürlüğü, minimum foto hasarı ve optik kesitleme yetenekleri, onu zebra balığı larvalarında kardiyak morfoloji ve kasılma fonksiyonunun 4D araştırması için ayırır 12,26,27,28. Bu protokol, kantitatif değerlendirmeler için ışık sayfası görüntüleme, geriye dönük senkronizasyon, 3B hücre izleme ve etkileşimli bir sanal gerçeklik (VR) platformunu entegre eden kapsamlı bir yaklaşım sunar. Kardiyak kasılmayı yakalamak ve yeniden yapılandırmak, hücresel dinamikleri izlemek ve ölçmek ve kardiyak gelişim ve rejenerasyon sırasında yapısal, fonksiyonel ve mekanik değişiklikleri değerlendirmek için bir giriş noktası sağlar. Bu yöntem, hücresel heterojenliği ve hücreler arası etkileşimi araştırmak için çeşitli hücre tiplerini ve soylarını izlemek için çok kanallı floresan görüntüleme ile de güçlendirilebilir. Zebra balığı modelinin memeli sistemlerinden ayrılması ve akut bir model olarak sınırlandırılması dikkatli bir değerlendirmeyi gerektirse de, genetik mühendisliğindeki ilerlemeler, insan hastalık durumlarına daha çok benzeyen transgenik zebra balığı hatlarının geliştirilmesine izin verebilir ve böylece zebra balığı çalışmalarından elde edilen bulguların translasyonel değerini artırabilir29.
Periyodik kardiyak siklus varsayımına dayanan bu retrospektif senkronizasyon, kasılan zebra balığı kalbinin ışık tabakası görüntülerini yeniden oluşturmak için kullanılır. Bu yöntemin ışık tabakası görüntülemede uygulanması, kasılan kalbin saniyede 200 hacimden fazla görselleştirilmesini ve analiz edilmesini sağlar. Mevcut analizdeki büyük veri hacminin ortaya çıkardığı zorluğun üstesinden gelmek için, çok çekirdekli CPU ve GPU ile paralel hesaplama kullanıldı ve bu da görüntü yeniden yapılandırma verimliliğinde on kattan fazla iyileşme sağladı. Retrospektif senkronizasyon sırasında, kardiyomiyositlerin her kalp atışında başlangıç pozisyonlarına geri döndüğü varsayılmıştır. Şekil 4C'de gösterildiği gibi zebra balığı26'da görülen kalp atışlarındaki düşük değişkenlik göz önüne alındığında bu varsayım nispeten güvenli olsa da, tüm biyolojik nüansları hesaba katmayabilecek bir basitleştirme olmaya devam etmektedir. Basınçlı floresan ve ışık alanı mikroskobu gibi görüntülemedeki yenilikler, dilim fazlalığını azaltarak bu varsayımdan kaynaklanan etkileri azaltabilir.
Karmaşık 4D kalp modelinde derinlemesine analiz sağlamak için, hem 3DeeCellTracker tabanlı hücre segmentasyonu hem de kullanıcı tarafından yönlendirilen araştırmalar için VR platformunu içeren bir hesaplama çerçevesi geliştirildi. Yüksek verimlilik ve etkileşimli manipülasyon da dahil olmak üzere bu çerçevenin doğal yetenekleri, hücresel hız değişimini ölçmeye, hücre-hücre etkileşimlerini araştırmaya ve fraksiyonel kısalma, ejeksiyon fraksiyonu ve bölgesel gerinim gibi bölgesel ve küresel miyokard mekaniğini değerlendirmeye olanak tanır30 (Şekil 4). Mevcut literatürde 7 dpf'de zebra balığı kalp fonksiyonunun önceden değerlendirilmediği not edilmiştir. Bununla birlikte, diğer araştırmacılar tarafından sağlanan 3 dpf'deki verilerle karşılaştırıldığında, mevcut sonuçlar, 3 dpf ila 7 dpf25,31 aralığında hem ejeksiyon fraksiyonunda (EF) hem de fraksiyonel kısalmada (FS) bir düşüşün önceki göstergeleriyle tutarlıdır. Bu analitik yöntemler, zebra balığı kardiyak yaralanma modellerinde kardiyak dinamikleri aydınlatmak için önemli bir potansiyele sahiptir12,25.
VR teknolojisi ve yazılımı, stereoskopik görüş ve hücre konumlarının otomatik kaydı gibi benzersiz özellikler içerdiğinden, bu platform, belirli hücreleri seçmek ve kalp döngüsü boyunca yörüngelerini analiz etmek için sürükleyici ve akıcı bir yönteme izin verir. VR kullanımı, hücre segmentasyonu ve açıklama gibi karmaşık görevleri daha yüksek verimlilik ve doğrulukla gerçekleştirmek için sezgisel bir yol sağlar 32,33,34. Ayrıca, birden fazla kullanıcının büyük, karmaşık veri kümeleri üzerinde birlikte çalışırken benzersiz araçları kullanmasını destekler34. Uzun süreli VR kullanımı baş dönmesi gibi yan etkilere neden olsa da, bu, geliştirilmiş ergonomik tasarımlar ve bağlı olmayan kulaklıklarla hafifletilebilir. Ayrıca, karmaşık biyolojik yapıları gerçek zamanlı olarak işlemek için gereken önemli hesaplama gücünü ele almak için, yazılımı anlık işleme için optimize etmek ve bulut tabanlı bilgi işlem çözümlerinden yararlanmak, sistemin karmaşık görselleştirmeleri yönetme yeteneğini artırabilir.
Donanım cihazları ve hesaplama gücü ilerlemeye devam ettikçe, bu strateji miyokarddaki kardiyak aritmileri hem hücresel hem de doku seviyelerinde araştırmak için genişletilebilir ve sonuçta kardiyak morfogenezin altında yatan mekanizmayı çözme ve terapötik müdahalelerin gelişimini ilerletme potansiyeline sahiptir.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Boston Çocuk Hastanesi'nden Dr. Caroline Burns'e transgenik zebra balığını cömertçe paylaştığı için minnettarlığımızı ifade ediyoruz. UT Dallas'ta zebra balığı yetiştiriciliğindeki yardımları için Bayan Elizabeth Ibanez'e teşekkür ederiz. UT Dallas'taki D-incubator üyeleri tarafından sağlanan tüm yapıcı yorumları da takdir ediyoruz. Bu çalışma NIH R00HL148493 (YD), R01HL162635 (YD) ve UT Dallas STARS programı (YD) tarafından desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
| Animal models | |||
| Tg(myl7:nucGFP) transgenik zebra balığı | Boston Çocuk Hastanesi Yanık Laboratuvarı | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| Yazılım ve algoritmalar | |||
| MATLAB | MathWorks Inc. | R2023a | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
| Unity | Unity Yazılım A.Ş. | 2020.3.2f1 | |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| 3D Dilimleyici | Andriy Fedorov ve diğerleri17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich ve diğerleri16< sup> | 4 | |
| Hafif levha sistemi< > | |||
| güçlü silindirik lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| 4X Aydınlatma objektifi | Nikon | MRH00045 | |
| 20X Algılama objektifi | Olympus | 1-U2M585 | |
| sCMOS kamera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Motorlu XYZ tablası | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
| İki eksenli eğim kademesi | Thorlabs | GN2/M | |
| Rotasyon step motoru | Pololu | 1474 | |
| Floresan boncuk | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473nm DPSS Lazer | Lazer Kızdırma | R471003GX | |
| 532nm DPSS lazer | Laserglow | R531003FX | |
| Mikroenjektör ve vakum pompası< / güçlü > | |||
| Mikroenjektör | WPI | PV850 | |
| Vakum pompası | Welch | 2522B-01 | |
| Önceden Çekilmiş Cam Pipetler | WPI | TIP10LT | |
| Jel yükleme için kılcal uç | Bio-Rad | 2239912 | |
| Sanal gerçeklik donanımı | |||
| VR kulaklık | Meta | Quest 2 | |
| 30mg/L PTU çözümü | |||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 1X E3 çalışma çözümü | - | < | |
| güçlü>% 1 agaroz< / güçlü> | - | ||
| Düşük eriyik agaroz | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deiyonize su | - | ||
| güçlü>10g / L Trikain stok çözeltisi< / güçlü> | |||
| Trikain | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
| Deiyonize su | - | ||
| Sodyum bikarbonat | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| < güçlü > 150mg / L Trikain çalışma çözeltisi< / güçlü > | |||
| 10g / L Trikain stok çözeltisi | - | ||
| Deiyonize su | - | < | |
| güçlü > 60X E3 stok çözeltisi< / güçlü > | |||
| Sodyum Klorür | Laboratuvarı Hayvan Kaynak Merkezi (LARC), Dallas'taki Texas Üniversitesi | NaCl | |
| Potasyum | Klorür-KCL | ||
| Kalsiyum Klorür Dihidrat-CaCL | alt >2 < / alt > x 2H < alt > 2 < / alt >O | ||
| Magnezyum Sülfat Heptahidrat-MgSO | sub>4 < / sub>x 7H2< / sub>O | ||
| RO Su | - | -< | |
| güçlü>1X E3 çalışma çözümü | |||
| 60X E3 stok çözümü | Lab Animal Resource Center (LARC), Dallas'taki Texas Üniversitesi | - | |
| RO Su | - | % | |
| 1 Metilen Mavisi (isteğe bağlı) | - | C16H<>sub18ClN3S |
Kaynaklar
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ. Res. 110 (6), 870(2012).
- Ding, Y., Bu, H., Xu, X. Modeling inherited cardiomyopathies in adult zebrafish for precision medicine. Front. Physiol. 11, 599244(2020).
- Giardoglou, P., Beis, D. On zebrafish disease models and matters of the heart. Biomedicines. 7 (1), 15(2019).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational analysis of cardiac contractile function. Curr. Cardiol. Rep. 24 (12), 1983-1994 (2022).
- Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Med. Wkly. 145 (51), w14227(2015).
- Vedula, V., et al. A method to quantify mechanobiologic forces during zebrafish cardiac development using 4-D light sheet imaging and computational modeling. PLOS Comput. Biol. 13 (10), e1005828(2017).
- Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Dev. Dyn. 246 (11), 868-880 (2017).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog. Biophys. Mol. Biol. 138, 105-115 (2018).
- Salman, H. E., Yalcin, H. C. Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling. Micron. 130, 102801(2020).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J. Biophotonics. 16 (5), e202200278(2023).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7 (2), 026112(2023).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. Eugene. , University of Oregon Press. (2000).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. 25, e1115(2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J. Opt. 20 (5), 053002(2018).
- Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart. J Vis Exp. 138, e57763(2018).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in Zebrafish larvae. Zenodo. , (2023).
- Wen, C., et al. 3deecelltracker, a deep learning-based pipeline for segmenting and tracking cells in 3d time lapse images. Elife. 10, e59187(2021).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Fedorov, A., et al. 3D Slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magn. Reson. Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
- Naderi, A. M., et al. Deep learning-based framework for cardiac function assessment in embryonic zebrafish from heart beating videos. Comput. Biol. Med. 135, 104565(2021).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat. Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J. Clin. Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3 (16), e121396(2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab. Anim. Res. 37 (1), 1-29 (2021).
- Coelho-Filho, O. R., et al. Quantification of cardiomyocyte hypertrophy by cardiac magnetic resonance: implications on early cardiac remodeling. Circulation. 128 (11), 1225(2013).
- Zhang, B., et al. Automatic segmentation and cardiac mechanics analysis of evolving zebrafish using deep learning. Front. Cardiovasc. Med. 8, 675291(2021).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), e97180(2017).
- Koger, C. R., Hassan, S. S., Yuan, J., Ding, Y. Virtual reality for interactive medical analysis. Front. Virtual Real. 3, 782854(2022).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat. Rev. Methods Prim. 3 (1), 1-1 (2023).
Yeniden basım ve izinler
