Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Farelerde Uçuş Davranışlarını İndüklemek için Değiştirilmiş Korku Koşullandırması

1.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66266

⸱

15 Aralık 2023

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Uçuş davranışlarını korkulu bir bağlamda incelemek için, değiştirilmiş bir korku koşullandırma protokolü sunuyoruz. Bu protokol, farelerin korku koşullandırmasında işaret sunumu sırasında sürekli olarak uçuş davranışları sergilemesini sağlar.

Özet

Tehdit edici bir durumda savunma davranışının uygun şekilde tezahür etmesi, hayatta kalmak için kritik öneme sahiptir. Hakim teori, zıplama veya hızlı dalma gibi aktif bir savunma davranışının yüksek tehdit yakınlığı veya gerçek tehdit altında ifade edildiğini, donma gibi pasif savunma davranışının ise tehdit tahmin edildiğinde ifade edildiğini, ancak tehdidin yakınlığının nispeten düşük olduğunu öne sürmektedir. Klasik korku koşullandırmasında, denekler tipik olarak şartlı bir savunma tepkisi olarak donma sergilerler ve çoğu durumda aktif savunma davranışının çok az ifadesi vardır. Burada, farelerin donmadan uçuşa geçişi gözlemlemeleri için değiştirilmiş bir korku koşullandırma prosedürü sunuyoruz ve bunun tersi, koşullu uyaranların (CS; sürekli ton, 8 kHz, 95 dB SPL (ses basıncı seviyeleri)) ve koşulsuz uyaranların (US; ayak şoku, 0.9 mA, 1.0 s) iki gün boyunca. Bu değiştirilmiş korku koşullandırma prosedürü, nispeten çok sayıda koşullandırma seansı ve koşullandırma günü gerektirir, ancak uçuş davranışının mütevazı ifadesi için yüksek yoğunluklu bir ayak şoku gerektirmez. Koşullandırma ve göze çarpan CS sunumları için aynı bağlamı kullanmak, uçuş davranışlarını ortaya çıkarmak için çok önemlidir. Bu değiştirilmiş korku koşullandırma prosedürü, farelerde aktif savunma davranışlarını gözlemlemek için güvenilir bir yöntemdir ve bu tür davranışların ince mekanizmalarını ve özelliklerini korkulu bir bağlamda aydınlatmak için bir fırsat sağlar.

Giriş

Tehdit edici koşullar altında savunma davranışlarının uygun seçimi, tüm hayvanların hayatta kalması için çok önemlidir. Savunma davranışları, donma ve uçuş davranışlarıarasındaki geçiş gibi tehdit yakınlığına bağlı olarak kademeli olarak birinden diğerine geçer 1,2,3. Bu davranışların düzensizliği genellikle çeşitli ruhsal bozukluklarda gözlenir4. Travma sonrası stres bozukluğu (TSSB), tehdit edici olmayan uyaranlara verilen panik tepkiler gibi abartılı savunma davranışlarıyla karakterize edilen böyle bir bozukluktur4.

Kemirgenlerde klasik korku koşullandırması yaygın olarak TSSB 5,6,7 için bir model olarak kullanılır, ancak kemirgenler bu modelde uçuş (panik benzeri) davranışlar göstermezler8. Sonuç olarak, genellikle 'kemirgen TSSB modeli' olarak adlandırılan klasik korku koşullandırma modeli, insanlarda, özellikle de iyi çalışılmamış uçuş veya panik benzeri semptomları yakalamada TSSB için yüz geçerliliğinden yoksundur.

Son zamanlarda, birkaç değiştirilmiş korku koşullandırma protokolü, kemirgen deneklerin bu prosedürler sırasında uçuş davranışı sergilediğini başarıyla göstermiştir. Örneğin, koşullu bir uyaranın (CS) ve koşulsuz bir uyaranın (US) günde yedi kez tekrarlanan ilişkileri, dişi sıçanların uçuş davranışlarına benzer davranışlar sergilemesine izin verdi9. Seri bileşik uyaranlar (SCS; ses tonu ve ardından gürültüden oluşan) kullanan iki günlük korku koşullandırmalarında, fareler SCS sunumlarının gürültü bölümünde uçuş davranışları göstermeye başladı10,11,12. SCS yönteminin ayrıntılı açıklaması bir protokol raporundasağlanır 13. SCS ile üç günlük bir korku koşullandırması, sıçanların uçuş davranışlarını indüklemesi için de işe yaradı14. Ancak, bu yeni protokollerin bazı sınırlamaları vardır. Örneğin, seri ipucu sunumunun kullanılması, yakınlık tahmininin savunma davranışı üzerindeki etkisinin dışlanmasına izin vermez. Sıçanlarda yedi kez CS-US birlikteliği durumunda, uçuş tepkilerinin çoğunluğu erkeklerden ziyade kadınlarda gözlendi.

Bu düşünceler ışığında, farelerin uçuş davranışlarını korkulu bir bağlamda araştırmaları için değiştirilmiş bir korku koşullandırma protokolü sunuyoruz. Erkek fareler, değiştirilmiş korku koşullandırmamız sırasında sürekli olarak uçuş davranışı sergilerler. Bu protokolde, göze çarpan ton SCS yerine CS olarak kullanılır. Ek olarak, en az iki gün boyunca günde en az beş CS-US eşleşmesi ve koşullu bağlam tarafından korkunun güçlendirilmesi gereklidir. Protokol, araştırma amacına bağlı olarak önceki protokolleri tamamlayarak uçuş davranışlarını araştırmak için başka bir seçenek sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, Japonya Fizyoloji Derneği'nin yol gösterici ilkelerine uygun olarak yürütülmüş ve Kanazawa Tıp Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi'nden (2021-32) onay almıştır. Tüm prosedürler ARRIVE yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. Çalışma için yetişkin erkek C57BL / 6J fareleri (3-6 aylık) kullanıldı ve daha önce bu farelerin bu makalede açıklanan uçuş davranışlarını sergilediğidoğrulandı 15.

1. Hayvan hazırlama

  1. Deneylerin başlangıcına kadar grup ev fareleri (kafes başına 3-4; 23-27 °C'de tutulur; 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü altında; yiyecek ve suya ad libitum erişimi sağlanır).
  2. Bu değiştirilmiş korku koşullandırmasına girmeden önce her fareyi en az 3 gün boyunca bir pleksiglas kafeste (14 cm × 21 cm × 12 cm) ayrı ayrı barındırın.

2. Araçların/ekipmanların kurulması

  1. Korku koşullandırma kutusu (Şekil 1A)
    1. Ses azaltıcı bir kutu (67 cm × 53 cm × 55 cm) içine yerleştirilmiş bir korku koşullandırma odası (25 cm 25 cm ×× 25 cm) kullanın (bkz.
    2. İki bağlam (A ve B) gereklidir. Bağlam A için, beyaz plastik kartonu siyah bantlarla (3 cm genişliğinde, bir tahta üzerinde 4) yapıştırarak duvarlarda siyah beyaz çizgiler oluşturun. Zemin için beyaz pürüzsüz plastik bir tahta kullanın.
    3. Her seanstan önce duvarları ve zemini Heptanol (% 1) ile silin.
      NOT: Aktif havalandırma sistemi kullanılmamaktadır. Seans bitiminde alkol ile temizlik Heptanol kokusunu azaltır.
    4. B bağlamı için, A bağlamında kullanılan tahtayı kaldırarak duvarların görünümünü tamamen siyah yapın. Zemin bir ızgara zemindir.
      NOT: Temizlik için hafif bir alkol kokusu dışında özel bir koku sunulmaz.
    5. Deney kutusunu tepeden beyaz ışık yayan bir diyot (LED, 240 lux) kullanarak aydınlatın (bkz.
  2. Şok
    1. Paslanmaz çelik çubuklardan oluşan bir ızgara zeminine bir karıştırma şoklayıcısı (Malzeme Tablosuna bakın) bağlayın. Bu, ayak şokları sağlamak için kullanılır. Ayak şoku yoğunluğu, yaygın korku koşullandırma yöntemleri10,11,12,13 izlenerek 0.9 mA olarak ayarlandı.
  3. Ses üreteci
    1. Tavana bir hoparlör yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). Tüm akustik uyaranlar güçlendirilir.
    2. 1/4 inç mikrofonla hoparlörün 5 cm önünde ses basıncı seviyeleri (SPL, re: 20 μ Pa) elde etmek için her bir uyaranın genel genliklerini dijital olarak değiştirin ve kalibre edin. Bu hoparlörden sürekli bir ton patlaması sunun.
      NOT: Ses hoparlörünü kalibre etmek, bu değiştirilmiş korku koşullandırması sırasında ses uyaranının savunma davranışları üzerindeki ince etkisini incelemek için çok önemlidir.
  4. Dönüştürücü
    1. Titreşimin algılanması için test odasının zeminini bir dönüştürücü üzerine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). Dönüştürücüden gelen sinyal, davranışsal titreşimleri kaydetmek için 8 kHz örnekleme frekansına sahip bir ses kartına iletilir.
  5. Video kamera
    1. Nesnenin hareketlerini izlemek ve sesi koşullandırma kutusuna kaydetmek için tavana bir CMOS kamera yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
  6. Tetikleme sistemi
    1. Planlanan zamanlamalarda tonları veya ayak şoklarını tetiklemek için ses yazılımı ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın.
      NOT: Piyasada bulunan herhangi bir stimülatör bunun için çalışacaktır.

3. Davranışsal deney

  1. Dört günlük korku koşullandırma prosedürleri için plan yapın: alışkanlık (1 gün, 5 deneme), koşullandırma (2 gün, her biri 5 deneme) ve test / yok olma seansları (1 gün, 5 veya 15 deneme). Denemeler arası aralıklar 60-75 s arasında değişmekteydi (Şekil 1B).
    NOT: Tercihen, güvenilir davranış eğilimleri elde etmek için bir gruba on veya daha fazla denek ekleyin. Çalışmanın amacına bağlı olarak iki veya üç grup gereklidir.
    1. Koşullandırma seansı sırasında, koşulsuz uyaranı (US) (1 s, 0.9 mA) koşullu uyaranın (CS) sonlandırılmasından hemen sonra (sürekli ton patlaması, 8 kHz, 20 s, 95 dB SPL) Şekil 1B'de gösterildiği gibi sunun. Bir kondisyon gününde beş CS-US çifti teslim edin.
    2. 5. ayak şokunun sona ermesinden sonra, konuyu ev kafesine geri koymadan önce 1 dakika bağlam içinde bırakın. Her davranış testinden sonra temizlik için hazneyi %70 alkolle silin.
      NOT: CS ve US yoğunluğu, çalışmanın amacına bağlı olarak değiştirilebilir. Önceki raporlar, daha güçlü CS yoğunluğunun daha yumuşak olanlardan daha aktif savunma davranışlarını tetiklediğini göstermiştir15. Şartlandırma günleri de uzatılabilir.
  2. Aşağıda belirtilen programı takip ederek CS sunumları sırasında uçuş davranışlarını teşvik edin.
    NOT: Bu deneyde bir CS (95 dB SPL) ve bir US (0.9 mA) kullanılmıştır.
    1. 1. günde, denekleri A bağlamında tek başına 5 CS denemesine maruz bırakın.
    2. 2. ve 3. günlerde, B bağlamında 5 CS-US ilişkilendirme denemesi olan denekler koşullandırılır.
    3. 4. günde, B bağlamındaki geri çağırma oturumu için denekleri tek başına 5 CS denemesine maruz bırakın. Bellek yok oluşunun test edilmesi durumunda, denekleri tek başına 15 CS denemesine maruz bırakın.
      NOT: Bellek kararlılığını test etmek için, sönme oturumlarını 2-3 gün uzatmak yardımcı olacaktır. Ayrıca, belleği 4. gün yerine bir hafta sonra test etmek, bellek kararlılığının ek onayını sağlayabilir.

4. Savunma davranışlarının analizi

NOT: CS sunumları sırasında hareket, donma yüzdesi ve atlama sayısı analiz edilir. Ayrıntılar aşağıda açıklanmıştır. Mümkünse, çift kör bir şekilde analiz etmek daha iyi olacaktır.

  1. Videoda kaydedilen ton başlangıcını kullanarak videodaki olayların zamanlamalarını ve uyaranların zamanlamalarını (CS ve US) senkronize edin.
  2. Çerçeveler arasında nesne siluetinin kütle merkezindeki farka dayalı olarak farelerin hem ortalama hem de toplam hareketlerini hesaplamak için özel yapım bir kod kullanın.
    NOT: Hareket hızı filmin örnekleme hızına bağlı olduğundan, bu ölçüm için rastgele bir birim kullanılır.
  3. Donma yüzdesini ölçmek için, dönüştürücü sinyalini zamanında kullanın.
    1. 20-500 Hz bant geçiren filtre kullanarak dönüştürücü sinyallerini önceden işleyin.
    2. Her 50 ms'lik bölme için zaman içinde dönüştürücü sinyalinin kök ortalama kare genliğini hesaplayın.
    3. Hareketsizlik süresini algılamak için sinyal genliği için bir eşik ayarlayın. Hareketsizlik süresi, 1 saniyeden fazla eşikten daha düşük sinyal periyodudur.
    4. Videoyu izleyerek donma süresini manuel olarak ölçün.
    5. Manuel olarak ölçülen donma yüzdesini ve dönüştürücü sinyalinden hesaplanan yüzdeyi karşılaştırarak donma için sinyal genliği eşiğini ayarlayın.
  4. Video dosyalarından atlama sayısını manuel olarak sayın.
    NOT: Dart sayısını saymak, uçuş tepkisini değerlendirmede de faydalı olacaktır.

5. İstatistiksel analiz

  1. İstatistiksel anlamlılığı p < 0.05 olarak ayarlayın.
  2. Birden fazla grup ve birden çok faktör arasındaki karşılaştırmalar için, çok yönlü bir ANOVA ve ardından post-hoc testler yapın. Koşullandırma programının belirli bir günü test edilirse, çoklu karşılaştırma testleri veya permütasyon testleri gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Erkek farelerde (C57BL / 6J; 3-6 aylık) değiştirilmiş korku koşullandırması ile elde edilen sonuçlar, Şekil 1C'de gösterilen programa göre sunulmuştur. Deney, koşullu bağlamın uçuş davranışlarının ifadesini nasıl etkilediğini araştırmak için tasarlanmıştır. Grup 1 (n=10) ve Grup 2 (n=10) olmak üzere iki grup belirlendi. Bu deneyde bir CS (95 dB SPL) ve bir US (0.9 mA) kullanıldı.

1. günde, tüm fareler A bağlamında tek başına 5 koşullu uyarana (CS) maruz bırakıldı....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makalede tanıtılan değiştirilmiş korku koşullandırma protokolü, korku dolu bir bağlamda uçuş davranışlarını araştırmak için kararlı bir yöntemdir. Bu protokolü kullanarak, korkulu bağlamdaki farelerin uçuş davranışlarının göze çarpan uyaranlar tarafından tetiklendiğini ve bağlama bağlı olduğunu bulduk. Uçuş davranışlarını gözlemlemek için uygun bir protokol olmadığı için uçuş davranışının özellikleri iyi araştırılmamıştır. Bu protokol, korkulu bir bağlamda aktif savunma davranışlarını incelemek için uygun yöntemlerden...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen KAKENHI Hibeleri JP22K15795 (T.F.'ye), JP22K09734 (N.K.'ye), JP21K07489 (R.Y.'ye), Kanazawa Tıp Üniversitesi (C2022-3, D2021-4, R.Y.'ye) ve Naito Vakfı (T.F.'ye) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ses hoparlörüFostexFT17H
AmplifikatörSonyTA-F500
CMOS kameraSanwa Tedarik A.Ş.CMS-V43BK
Korku koşullandırma odasıPanlab S.L.U.LE116
Gıda peletleriNosanLabo MR standart
LEDYamazenLT-B05N
MikrofonACOtipi 4156N
Karıştırma şok ediciPanlab SLULE 100-26
Ses kartıBehringerUMC202
Ses yazılımıSyntrillium YazılımıCool Edit 2000
DönüştürücüPanlab S.L.U.LE 111

Kaynaklar

  1. Fanselow, M. S., Lester, L. S. Evolution and learning. , Psychology Press. 185-212 (1988).
  2. Fanselow, M. S. Neural organization of the defensive behavior system responsible for fear. Psychonomic Bulletin & Review. 1 (4), 429-438 (1994).
  3. Mobbs, D., Headley, D. B., Ding, W., Dayan, P. Space, time, and fear: Survival computations along defensive circuits. Trends in Cognitive Sciences. 24 (3), 228-241 (2020).
  4. Black, D. W., Grant, J. E. Dsm-5 guidebook: The essential companion to the diagnostic and statistical manual of mental disorders. American Psychiatric Pub. , (2014).
  5. Bienvenu, T. C., et al. The advent of fear conditioning as an animal model of post-traumatic stress disorder: Learning from the past to shape the future of ptsd research. Neuron. 109 (15), 2380-2397 (2021).
  6. Johnson, L. R., Mcguire, J., Lazarus, R., Palmer, A. A. Pavlovian fear memory circuits and phenotype models of ptsd. Neuropharmacology. 62 (2), 638-646 (2012).
  7. Yehuda, R., Ledoux, J. Response variation following trauma: A translational neuroscience approach to understanding ptsd. Neuron. 56 (1), 19-32 (2007).
  8. Ledoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23 (1), 155-184 (2000).
  9. Gruene, T. M., Flick, K., Stefano, A., Shea, S. D., Shansky, R. M. Sexually divergent expression of active and passive conditioned fear responses in rats. Elife. 4, e11352(2015).
  10. Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-100 (2017).
  11. Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. Elife. 9, e53803(2020).
  12. Trott, J. M., Hoffman, A. N., Zhuravka, I., Fanselow, M. S. Conditional and unconditional components of aversively motivated freezing, flight and darting in mice. Elife. 11, e75663(2022).
  13. Borkar, C. D., Fadok, J. P. A novel pavlovian fear conditioning paradigm to study freezing and flight behavior. Journal of Visualized Experiments. 167, e61536(2021).
  14. Totty, M. S., et al. Behavioral and brain mechanisms mediating conditioned flight behavior in rats. Scientific Reports. 11 (1), 8215(2021).
  15. Furuyama, T., et al. Multiple factors contribute to flight behaviors during fear conditioning. Scientific Reports. 13 (1), 10402(2023).
  16. Cain, C. K. Avoidance problems reconsidered. Current Opinion in Behavioral Sciences. 26, 9-17 (2019).
  17. Ledoux, J. E., Moscarello, J., Sears, R., Campese, V. The birth, death and resurrection of avoidance: A reconceptualization of a troubled paradigm. Molecular Psychiatry. 22 (1), 24-36 (2017).
  18. Bouchekioua, Y., et al. Serotonin 5-ht2c receptor knockout in mice attenuates fear responses in contextual or cued but not compound context-cue fear conditioning. Translational Psychiatry. 12 (1), 58(2022).
  19. Bouchekioua, Y., Nishitani, N., Ohmura, Y. Conditioned lick suppression: Assessing contextual, cued, and context-cue compound fear responses independently of locomotor activity in mice. Bio-Protocol. 12 (23), e4568(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 5/17/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66266

Etiketler

Savunma DavranDonma DavranFare DavranKo ullu UyaranlarKo ulsuz UyaranlarAnksiyete Bozuklu uPTSD ModeliDavran sal N robilim
Farelerde Uçuş Davranışlarını İndüklemek için Değiştirilmiş Korku Koşullandırması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.