$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Düşük hızlı Brown hareketindenetkilenmeyen yapışık mikroskobik organizmalar olan Acanthamoeba gibi amiplerin hareketliliğini izleyebilmek ve ölçebilmek 9,10, amip davranışı hakkında önemli miktarda bilgi ortaya koymakta ve AK önleme yöntemlerine ilişkin aydınlanmayı büyük ölçüde artırabilir. Bu protokol son yayınlarda detaylandırılmıştır ve veriler diğer benzer veri analizleri ile doğrulanmıştır veya birleştirilmiştir18,19. Burada, bu yöntem kullanılarak detaylandırılan amipin hızının diğer gruplar tarafından yayınlananlara benzer olduğunu not ediyoruz. Bu protokol, temel olarak ışığa karşı şeffaf olan herhangi bir yüzey veya amip tedavisinde kullanılabilme kabiliyeti ile dikkat çekicidir, ancak bu protokolün potansiyel olarak diğer organizmalarla çalışacak şekilde değiştirilebilmesine rağmen, yalnızca şu ana kadar optimize edildiğini belirtmek önemlidir. Yukarıdaki protokol laboratuvarda sürekli olarak iyi çalışmıştır, ancak yöntemi diğer ihtiyaçlara uyacak şekilde değiştirmek veya zor durumları gidermek için aşağıdaki değişiklikler sağlanmıştır.
İzleme parametrelerinin belirlenmesi: Yukarıdaki protokolde, son yayınlar için en uygun olan kareden kareye bağlantı, boşluk kapatma, maksimum çerçeve boşluğu ve yoldaki nokta sayısı listelenmiştir. Bununla birlikte, diğer parametrelerin diğer ihtiyaçlar için daha uygun olması mümkündür. Ayrıca, başkalarının kullanmak isteyeceği ancak burada kullanılmayan parametreler olabilir (örneğin, pist filtreleri altındaki bir parkurun Maksimum Mesafesi). Her bir parametre ve ne tanımladıkları hakkında daha fazla bilgiye web sitesinde erişilebilir (bkz. referans21). Hangi parametrelerin ve filtrelerin diğer deneylerle en alakalı olduğuna ve bunların nasıl ayarlanması gerektiğine karar verirken, belirli bir proje için istatistiksel olarak neyin rasyonel olduğunu düşünün; Örneğin, bir amipten çıkan ve sonra görüş alanına geri dönen bir amipten veri ister mi? Ya da hiç hareket etmeyen ama yine de bir parça olarak etiketlenen bir amipin verilerini saklamak ister mi? ve görüntülerin kaydedildiği kare sayısı ve kareler arasındaki sürenin uzunluğu için neyin anlamlı olduğu.
Blob boyutunu değiştirme: Herhangi bir yazılım veya herhangi bir mikroskop kurulumuyla - standart laboratuvarlarda bulunan mevcut teknolojilere ve yazılımlara dayalı olarak - zaman içinde değiştikçe bir toplamdaki amip sayısını doğru bir şekilde izlemenin son derece zor olduğunu gördük. Bir blobun boyutunu izliyor ve bu boyutu içindeki organizma sayısıyla ilişkilendirmeye çalışıyorsanız, bir toplamın boyutunu matematiksel olarak tahmin etmek için tekrarlanan deneylerden sonra oluşturulan standart bir eğri kullanın. Örneğin, agregalar, kuyu başına 8, 16, 32, 125, 250, 500, 1.000 ve 2.000 hücre gibi çeşitli amip sayılarına sahip kuyuların tohumlanmasıyla oluşturuldu. 24 saat boyunca her kuyucuğun çeşitli zaman noktalarında hızlandırılmış görüntüler oluşturuldu. Her bir sferoid (bilinen bir amip sayısından olan) iki boyutlu bir alan için analiz edildi ve zaman içinde amip sayısına karşı sferoid boyutunun bir fonksiyonu olarak standart bir eğri oluşturuldu. Bu deney, üretilen herhangi bir eğrinin uygun bir standart sapmasını bize vermek için en az üç kopya halinde tekrarlandı.
Amipin yönlülüğünün belirlenmesi: Bu, belirli çalışmalar için gerekli olmasa da, amipin yönlülüğünü anlamak yardımcı olabilir. Bu, tedavinin veya deneyin kemotaktik etkileri hakkında veri sağlayacaktır. Bu veriler hem görsel (grafik) hem de nicel veriler oluşturmak için de kullanılabilir. Bu, görüntüleme yazılımı için ücretsiz bir eklenti olan Kemotaksis ve Geçiş Aracı aracılığıyla kullanılabilir. Başvuru kılavuzu ve örnek resimler ve filmler ile birlikte web sitesinde mevcuttur (bkz.
Ayrıntılı hareket dinamikleri: diğer gruplar, burada tartışılanların ötesinde son derece gelişmiş ve gelişmiş istatistiksel analizlerle yayılma dinamiklerini ve yayılma yörüngelerini incelemişlerdir 9,10,22. Bunlar, kullanıcının ihtiyaçlarına göre düşünülebilir.
Herhangi bir başarılı yöntemde olduğu gibi, bu el yazmasında ayrıntılı olarak açıklanan protokol, tutarlılık sağlamak için birçok sorun giderme turundan geçmiştir. Her saniye bir görüntü çekerek (veya mikroskobun yapabildiği kadar hızlı, bir saniyeden az olabilir) mükemmel yüksek kaliteli izlenebilir videolar oluşturulabilirken, bu, üzerinde çalışılması zor olabilen son derece büyük dosyalar oluşturur. Bu, yalnızca en fazla birkaç dakika boyunca kaydedilen çok kısa süreli videolar için gerçekçi bir şekilde uygundur. Tersine, birkaç saniyede bir görüntü çekerek, amip davranışının bu türün hızına bağlı olarak hala çok izlenebilir olduğunu ve saatler veya günler boyunca uygulanabilir videolar oluşturmanın mümkün olduğunu bulduk. Görüntüler arasındaki maksimum sürenin, amipin görüntüleme yazılımı tarafından doğru bir şekilde izlenmesi için gereken süre olan 30 s olduğunu bulduk. Kullanıcının seçtiği zaman aralığı, mikroskobun görüntüleri ne kadar hızlı kaydedebileceği, kuyu başına kaç görüntüye ihtiyaç duyulduğu ve her aralıkta kaç kuyu kaydedildiği gibi bilinen kısıtlamalar kullanılarak düşünülmelidir. Benzer şekilde, bu protokolde bahsedilen maksimum yer değiştirme, izin verilen çerçeve boşlukları, gereken minimum kareler vb. ile ilgili parametreler, en eksiksiz amip izlerini içeren iz bilgilerini oluşturmak ve tamamlanmamış izlerin yarattığı gürültüyü, videonun ortasında sahneye katılan veya sahneyi terk eden amipleri veya iki amipin parçanın ortasında buluşup sonra ayrılması gibi görüntüleme yazılımı karışıklığının yarattığı hataları göz ardı etmek için bu laboratuvar tarafından deneme yanılma yoluyla belirlenmiştir. Bu tür hatalar ve eksik parçalar, sürekli olarak birbirleriyle etkileşime giren mikroskobik biyolojik organizmaların son derece uzun (saatler ila günler) videolarını oluştururken anlaşılır bir şekilde yüksektir ve hatalı izlerin çok büyük bir bölümünün reddedilmesinin nedenidir. Protokoldeki doldurma delikleri adımının, bu laboratuvarın deneyimine göre, görüntüleme yazılımının amipleri nasıl izlediğine dair hatayı azaltmak için önemli olduğuna dikkat edilmelidir. Her amipin bazen bir çörek veya c şekli yerine katı bir daire olduğundan emin olarak, yazılımın her amip'i başarılı bir şekilde izleyebilme olasılığı çok daha yüksektir.
Ayrıca, tartışıldığı gibi, bir görüntüyü veya videoyu analiz etmek için bir kullanıcının kullanabileceği birçok parametre vardır. Deneysel ihtiyaçlara dayanarak, toplam mesafe, maksimum mesafe, hız ve yer değiştirmeyi analiz etmekten sürekli olarak en fazla faydayı sağladık. Bunlar, önceki yayınlardagrafiksel yorumlarla (farklı gerinimler ve yüzeyler kullanılması dahil) derinlemesine tartışılmaktadır 18,19. Bu dört parametre, bir kullanıcının bir amipin doğrusal mesafeler kat etme yeteneğini ve bunu yapmanın ne kadar sürdüğünü tahmin etmesine olanak tanır, bu da kontakt lens kontaminasyonu ile ilgili davranışlarını anlamaya yardımcı olur. Bu parametreleri almak ve analiz etmek, şekillerimizde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi büyük bir iştir. Görüntüleme yazılımı çıktısından elde edilen büyük ve çok sayıda elektronik tabloyla çalışırken, gerekli tüm analizleri otomatik olarak hesaplayan kilitli elektronik tablo şablonları oluşturarak kasıtsız hataları sınırladık. Bununla birlikte, bu yöntemde olası bir iyileştirme, bu verileri işleyebilecek ve sıralayıp analiz edebilecek bir komut dosyası yazmak olacaktır.
Sonuç olarak, birçok farklı koşulda Acanthamoeba boyutunu ve motilitesini ölçmek için erişilebilir ve doğru bir yöntem burada açıklanmaktadır. Bu yöntemin birçok farklı amip suşuna uygulanabileceğini gösterdik ve motilite bilgisi elde etmek için basit parametreler olsa da, bu deney düzeneğinin herhangi bir özel ihtiyaca göre yüksek oranda uyarlanabileceğini belirttik.
