Yaşamın Uç Noktalarında Adaptasyon: Ekstremofil Archaeon Sulfolobus acidocaldarius ile Deneysel Evrim

Özet

Burada, inkübatör olarak düşük maliyetli, enerji verimli tezgah üstü termomikserler kullanan termofillerde adaptasyon için deneysel bir evrim protokolü sunuyoruz. Teknik, 75 °C'lik optimum büyüme sıcaklığına sahip bir arkeon olan Sulfolobus acidocaldarius'ta sıcaklık adaptasyonunun karakterizasyonu yoluyla gösterilmiştir.

Özet

Arkeon Sulfolobus acidocaldarius , umut verici bir termofilik model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Termofillerin değişen sıcaklıklara nasıl adapte olduklarını araştırmak, yalnızca temel evrimsel süreçleri anlamak için değil, aynı zamanda S. acidocaldarius'u biyomühendislik için bir şasi olarak geliştirmek için de önemli bir gerekliliktir. Termofillerle deneysel evrim yürütmenin önündeki en büyük engellerden biri, yüksek sıcaklıkta büyüme için geleneksel inkübatörlerin ekipman bakımı ve enerji kullanımı masraflarıdır. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, S. acidocaldarius'ta deneysel evrim yürütmek için düşük maliyetli ve enerji açısından verimli tezgah üstü termomikserler kullanan kapsamlı bir deneysel protokol sunulmuştur. Protokol, nispeten küçük hacimli (1.5 mL) bir toplu kültür tekniğini içerir ve birden fazla bağımsız soyda adaptasyonun izlenmesini sağlar. Bu yöntem, ek termomikserler kullanılarak kolayca ölçeklenebilir. Böyle bir yaklaşım, hem ilk yatırımı hem de deneysel araştırmalarla ilişkili devam eden maliyetleri azaltarak S. acidocaldarius'un bir model sistem olarak erişilebilirliğini arttırır. Ayrıca, teknik, çeşitli çevresel koşullara adaptasyonu keşfetmek için diğer mikrobiyal sistemlere aktarılabilir.

Giriş

Dünyadaki erken yaşam, aşırı yüksek sıcaklıklar ve asitlik¹ ile karakterize edilen hidrotermal menfezler gibi aşırı ortamlarda ortaya çıkmış olabilir. Mikroplar, kaplıcalar ve volkanik solfatara da dahil olmak üzere aşırı ortamlarda yaşamaya devam ediyor. Bu aşırı koşullar altında meydana gelen evrimsel dinamikleri karakterize etmek, bu koşullar altında hayatta kalmayı sağlayan özel fizyolojik süreçlere ışık tutabilir. Bunun, biyolojik çeşitliliğin kökenlerini anlamamızdan, biyoteknolojik uygulamalarla yeni yüksek sıcaklık enzimlerinin geliştirilmesine kadar geniş kapsamlı etkileri olabilir.

Aşırı ortamlarda mikrobiyal evrimsel dinamiklerin anlaşılması, kritik önemine rağmen sınırlı kalmaktadır. Buna karşılık, mezofilik ortamlarda evrim hakkında önemli bir bilgi birikimi, deneysel evrim olarak bilinen bir tekniğin uygulanmasıyla elde edilmiştir. Deneysel evrim, laboratuvar koşulları^{altında evrimsel} değişimi gözlemlemeyi içerir 2,3,4,5. Genellikle bu, tanımlanmış bir değişim ortamını içerir (örneğin, sıcaklık, tuzluluk, bir toksinin veya rakip bir organizmanın eklenmesi)^7,8,9. Tüm genom dizilimi ile birleştirildiğinde, deneysel evrim, paralellik, tekrarlanabilirlik ve adaptasyon için genomik temel dahil olmak üzere evrimsel süreçlerin temel yönlerini test etmemizi sağlamıştır. Bununla birlikte, bugüne kadar, deneysel evrimin büyük kısmı mezofilik mikroplarla (bakteriler, mantarlar ve virüsler 2,3,4,5 dahil, ancak büyük ölçüde arkeler hariç) gerçekleştirilmiştir. Termofilik mikroplara uygulanabilen bir deneysel evrim yöntemi, onların nasıl evrimleştiklerini daha iyi anlamamızı sağlayacak ve daha kapsamlı bir evrim anlayışına katkıda bulunacaktır. Bunun, Dünya'daki termofilik yaşamın kökenlerini deşifre etmekten, yüksek sıcaklıktaki biyoproseslerde¹⁰ ve astrobiyolojik araştırmalarda¹¹ kullanılan 'ekstremozimleri' içeren biyoteknolojik uygulamalara kadar potansiyel olarak geniş kapsamlı etkileri vardır.

Archaeon Sulfolobus acidocaldarius, termofiller için deneysel evrim teknikleri geliştirmek için model organizma olarak ideal bir adaydır. S. acidocaldarius, 75 °C'de (aralık 55 °C ila 85 °C) optimum büyüme sıcaklığı ve yüksek asitlik (pH 2-3) ile aerobik olarak çoğalır4,6,12,13,14. Dikkat çekici bir şekilde, aşırı büyüme koşullarına rağmen, S. acidocaldarius, mezofiller ^{7,15,16,17,18} ile karşılaştırılabilir popülasyon yoğunluklarını ve mutasyon oranlarını korur. Ek olarak, nispeten küçük, iyi açıklamalı bir genoma sahiptir (DSM639 türü: 2.2 Mb, %36.7 GC, 2.347 gen)¹²; S. acidocaldarius ayrıca, hedeflenen gen nakavtları yoluyla evrimsel sürecin doğrudan değerlendirilmesine olanak tanıyan sağlam genom mühendisliği araçlarından da yararlanır¹⁹. Bunun dikkate değer bir örneği, seçilebilir belirteçler olarak işlev görebilen MW001¹⁹ ve SK-1^20'nin urasil oksotrofik suşları gibi genetik olarak değiştirilmiş S. acidocaldarius suşlarının mevcudiyetidir.

S. acidocaldarius gibi termofillerle deneysel evrim yürütmede önemli zorluklar vardır. Bu çalışmalar için gerekli olan yüksek sıcaklıklarda uzun süreli inkübasyon, hem sıvı hem de katı kültür teknikleri için önemli ölçüde buharlaşma gerektirir. Yüksek sıcaklıklarda uzun süreli çalışma, sıvı ortamda deneysel evrimde yaygın olarak kullanılan geleneksel çalkalama inkübatörlerine de zarar verebilir. Birden fazla sıcaklığı keşfetmek, birkaç inkübatörün satın alınması ve bakımı için önemli bir finansal yatırım gerektirir. Ayrıca, gereken yüksek enerji tüketimi, önemli çevresel ve finansal kaygıları da beraberinde getirmektedir.

Bu çalışma, S. acidocaldarius gibi termofillerle deneysel evrim gerçekleştirirken karşılaşılan zorlukları ele almak için bir yöntem sunmaktadır. Baes ve ark. ısı şoku tepkisi ^14,21'i araştırmak için, burada geliştirilen yöntem, tutarlı ve güvenilir yüksek sıcaklıkta inkübasyon için tezgah üstü termomikserleri kullanır. Ölçeklenebilirliği, ek inkübasyon ekipmanı edinme maliyetlerinin azalmasıyla birden fazla sıcaklık işleminin aynı anda değerlendirilmesine olanak tanır. Bu, termofillerde evrimsel dinamikleri etkileyen faktörlerin sağlam istatistiksel analizine ve kapsamlı bir şekilde araştırılmasına olanak tanıyarak deneysel verimliliği artırır²². Ayrıca bu yaklaşım, geleneksel kuluçka makinelerine kıyasla finansal ilk yatırımı ve enerji tüketimini önemli ölçüde azaltarak daha sürdürülebilir ve çevre dostu bir alternatif sunar.

Yöntemimiz, Dünya'daki yaşamın çeşitlenmesinin ilk aşamalarında kilit bir rol oynamış olabilecek aşırı sıcaklıklarla karakterize edilen ortamlarda evrimsel dinamikleri deneysel olarak araştırmak için zemin hazırlamaktadır. Termofilik organizmalar benzersiz özelliklere sahiptir, ancak aşırı büyüme koşulları ve özel gereksinimleri genellikle bir model sistem olarak erişilebilirliklerini sınırlamıştır. Bu engellerin üstesinden gelmek, yalnızca evrimsel dinamikleri araştırmak için araştırma fırsatlarını genişletmekle kalmaz, aynı zamanda termofillerin bilimsel araştırmalarda model sistemler olarak daha geniş kullanımını da artırır.

Protokol

1. S. acidocaldarius büyüme ortamının (BBM ⁺) hazırlanması

NOT: S. acidocaldarius'u yetiştirmek için bu protokol Bazal Brock Ortamı (BBM⁺)²³ kullanır. Bu, öncelikle önceden hazırlanabilecek BBM⁻ oluşturmak için aşağıda özetlenen inorganik stok çözeltilerinin birleştirilmesiyle hazırlanır. BBM⁺ daha sonra organik stok çözeltileri ^BBM'ye eklenerek gerektiği gibi hazırlanır. Stok çözelti tarifleri de Tablo 1'de sunulmuştur. Tüm medya ve stok çözeltileri çift damıtılmış H₂O (ddH₂O) olarak hazırlanmalıdır.

1. Büyüme ortamı için inorganik stok çözeltilerinin hazırlanması
   1. Eser element stok çözeltisini hazırlayın.
      1. ddH₂O'ya 9 g / L sodyum tetraborat dekahidrat (Na₂B₄O₇ · 10H₂O) ekleyerek ve ardından çözünene kadar damla damla 1: 1 H_2S04 ekleyerek İz Element Stok Çözeltisini hazırlayın.
      2. Sırayla 0.44 g / L çinko sülfat heptahidrat (ZnSO₄ · 7H₂O), 0.1 g / L bakır (II) klorür dihidrat (CuCl₂ · 2H₂O), 0.06 g / L sodyum molibdat dihidrat (Na₂MoO₄ · 2H₂O), 0.06 g / L vanadyum (IV) sülfat dihidrat (VOSO_{4.2H 2}O), 0.02 g / L kobalt (II) sülfat heptahidrat (CoSO₄ · 7H₂O), ve 3.6 g / L manganez (II) klorür tetrahidrat (MnCl₂ · 4H₂O). Solüsyonu otoklavlayın ve 4 °C'de saklayın.
   2. 20 g / L ferrik klorür hekzahidrat (FeCl₃ · 6H₂O) ddH₂O içinde çözerek Fe Stok Çözeltisini (1000x) hazırlayın. Çözeltiyi 0.22 μm filtreden süzülerek sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın.
   3. 70 g/L kalsiyum klorürü (CaCl₂·2H₂O) çift damıtılmış suda (ddH₂O) çözerek Brock Çözeltisi I'i (1000x) hazırlayın. Otoklavlayın ve 4 °C'de saklayın.
      DİKKAT: CaCl₂·2H 2O'nunsuda çözülmesi ekzotermik bir işlemdir. Bu adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Yaralanmalara karşı korunmak için EN407 dereceli termal tehlike eldivenleri giyin. Basınç oluşabileceğinden kabı sıkıca kapatmayın.
   4. 130 g / L amonyum sülfat ((NH₄) _2S04), 25 g / L magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO₄ · 7H₂O), 28 g / L potasyum dihidrojen fosfat (KH₂PO₄) ve 50 mL önceden hazırlanmış İz Element Stok Çözeltisi. 1:1 H_2S04 kullanarak, stok çözeltisinin pH'ını 2-3'e ayarlayın. Çözeltiyi otoklavlayın ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
2. Büyüme ortamı için organik stok çözeltilerinin hazırlanması
   1. 300 g / L (% 30 w / v) D-glikozu ddH₂O'da çözerek D-Glikoz Stok Çözeltisini (100x) hazırlayın ve filtreyi sterilize edin (0.22 μm filtreden). 4 °C'de saklayın.
      NOT: Deneysel gereksinimlere göre D-glikoz yerine başka karbon kaynakları da kullanılabilir (örneğin, D-ksiloz).
   2. Stok çözeltisini RT'de sterilize etmek ve saklamak için otoklavda kazeinden peptonu kazeinden 100 g / L'de çözerek KazeinStok Çözeltisinden (100x) Pepton hazırlayın.
   3. 2 g/L urasili ddH₂O'da çözerek Urasil Stok Çözeltisini (100x) hazırlayın ve filtre sterilize edin (0,22 μm'lik bir filtreden); -20 °C'de saklayın.
3. 1x çalışma konsantrasyonunda BBM ⁺ büyüme ortamının hazırlanması
   1. İlk olarak, otoklavlama ile 988 mL steril ddH₂O hazırlayın.
   2. Daha önce otoklavlanmış 988 mL steril ddH₂O'ya 1 mL Brock Stok Çözeltisi I, 10 mL Brock Stok Çözeltisi II / III ve 1 mL Fe stok çözeltisi ekleyerek 1 L ^{BBM -} hazırlayın. Orta pH'ı 1:1 H₂SO₄ ile 2-3 aralığına ayarlayın.
      NOT: BBM⁻ önceden yapılabilir ve 1 aya kadar RT'de saklanabilir.
   3. Son olarak, 1 L BBM ⁺ üretmek için, 10 mL D-Glikoz Stok Çözeltisi, Kazein Stok Çözeltisinden Pepton ve Urasil Stok Çözeltisini 985 mL BBM^-'lik bir çözelti ile birleştirin. İyice karıştırın ve ortam pH'ını 1:1 H₂S2_S4 ile 2-3'e ayarlayın.
      NOT: BBM⁺ gerektiği gibi taze yapılmalıdır.
4. BBM ⁺ katı ortamın hazırlanması
   1. MgCl₂ ve CaCl_2'nin 1 M stok çözeltilerini hazırlayın; bunlar BBM katı ortamının katılaşmasına yardımcı olacaktır. 1 M MgCl₂ için, 100 mL ddH₂O 'ya 9.5 g ekleyin. 1 M CaCl₂ için, sterilize etmek için 100 mL ddH₂O'ya 11 g ekleyin.
      DİKKAT: CaCl₂·2H 2O'nunsuda çözülmesi ekzotermik bir işlemdir. Bu adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Yaralanmalara karşı korunmak için EN407 dereceli termal tehlike eldivenleri giyin. Basınç oluşabileceğinden kabı sıkıca kapatmayın.
   2. %3 (a/h) gellan sakızı (örn., 30 g/L) ddH₂O içinde karıştırın ve sterilize etmek için otoklavlayın.
      NOT: Standart bakteriyolojik agar 75 °C'de katılaşamadığından, jelleştirici ajan olarak Gellan zamkı (örneğin Gelrite) kullanılır.
   3. Ayrı olarak, adım 1.4.1'de hazırlanan steril gellan sakızı ile 1:1 oranında karıştırılacak olan katı ortam için BBM⁺ 'yı hazırlayın.
      1. İlk olarak, adım 1.3.2'deki gibi 1 L BBM⁻ hazırlayın. 887 mL BBM^-' yi 1 mL Fe Stok Çözeltisi ve her biri 20 mL D-Glikoz Stok Çözeltisi, Kazein Stok Çözeltisinden Pepton ve Urasil Stok Çözeltisi ile birleştirin.
      2. 40 mL 1 M MgCl₂ ve 12 mL 1 M CaCl₂ ekleyin. İyice karıştırın ve ortam pH'ını 1:1 H₂S2_S4 ile 2-3'e ayarlayın.
         NOT: Buraya eklenen stok çözeltilerinin hacimleri, adım 1.3'teki sıvı BBM⁺ 'nın hazırlanmasından kasıtlı olarak daha büyüktür. Bu, bir sonraki adımda erimiş gellan sakızı ile 1:1 oranında karıştırmayı hesaba katmak içindir.
   4. BBM⁺ 'ı katı ortam için yaklaşık 75 °C'ye önceden ısıtın ve ddH₂O'da erimiş gellan sakızı ile 1:1 oranında karıştırın. İyice karıştırın ve ısıya dayanıklı plastiğe (örneğin polipropilen), cam Petrikaplarına veya S. acidocaldarius'un büyümesi için altı kuyulu plakalara dökün. Agarı karıştırıldıktan hemen sonra kullanın, çünkü hızlı bir şekilde sertleşecektir.
      NOT: Mikrobiyoloji için yaygın olarak kullanılan bazı polistiren 90 mm Petri kapları, yüksek sıcaklıklarda uzun süre inkübe edilirse deforme olur.
      DİKKAT: Sıcak sıvılarla uğraşırken uygun güvenlik önlemlerini alın; Yaralanmalara karşı korumak için EN407 dereceli termal tehlike eldivenleri giyin.

2. S. acidocaldarius'u bir dondurucu stok kültüründen canlandırmak

1. Yeterli havalandırma ve oksijen mevcudiyetini sağlamak için havalandırmalı büyüme tüplerinin hazırlanması.
   1. Önceden, Sulfolobus büyümesi için delinmiş 2 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. Bir Bunsen brülör alevi kullanarak kör teli (>0,7 mm, düzleştirilmiş bir ataş gibi) dikkatlice ısıtın ve borunun kapağını delerek yaklaşık 1 mm'lik küçük bir delik oluşturun.
   2. Delinmiş tüpleri otoklavlanabilir bir kaba (örn. boş pipet ucu kutusu) yerleştirin ve sterilize etmek için otoklavlayın.
      DİKKAT: Isıtılmış metalden ellerin termal yaralanmasına karşı korunmak için EN407 dereceli termal tehlike eldivenleri giyin. Aşırı ısınmayı önlemek için teli yalnızca kısa bir süre (1-2 s) ısıtın. Sadece yüksek erime sıcaklığına sahip metaller (çelik) kullanılmalıdır.
2. S. acidocaldarius'un başlangıç kültürlerini aşılayın.
   1. Otoklavlanmış delinmiş 2 mL'lik tüpleri 1,5 mL önceden ısıtılmış BBM⁺ ile doldurun (bölüm 1'de hazırlandığı gibi, 75 °C'de en az 15 dakika önceden inkübe edilmiştir).
   2. BBM ⁺ dolgulu tüpleri bir gliserol stoğundan (% 25 v / v gliserol, -80 ° C'de saklanır) bir kazıma (50 - 60 mg'a eşdeğer) ile aşılayın. Burada S. acidocaldarius suşu DSM639 kullanılmaktadır. Negatif kontrol olarak ek bir tüpü 1,5 mL BBM+ ile doldurun.
3. Herhangi bir aerosolün delinmiş 2 mL tüp kapağından kaçmasını ve büyüme ortamını (ve diğer numuneleri) kirletmesini önlemek ve tüpler içindeki kültür buharlaşmasının değişkenliğini azaltmak için, kapağın üzerine yüksek sıcaklıklara (65-85 °C) dayanabilen ve mikrobiyal kaçışı/sızmayı engelleyebilen gaz geçirgen bir zar yerleştirin.
   NOT: Tüplerin sızdırmazlığı için gaz geçirgen membranların kullanılması buharlaşmayı önemli ölçüde azaltır. 75 ° C'de 48 saatlik bir süre boyunca, mühürsüz tüpler için% 25.05'in aksine (aralık: %3.29-16.45, n = 24 teknik tekrar, iki kez tekrarlanan) ortalama% 8.63'lük bir hacim kaybı sergiler (aralık: %11.92-62.91, n = 24 teknik tekrar, iki kez tekrarlanır).
4. Aşılanmış tüpleri 75 ° C'de bir termomikserde, dakikada 400 devirde (RPM) sürekli çalkalama ile 48-72 saat boyunca veya spektrofotometre ile ölçüldüğü gibi 0,3 - 0,8 OD_600nm'ye ulaşılana kadar inkübe edin.
   NOT: 2 mL'lik tüplerin delinmiş kapağı ve çalkalama, optimum büyüme için uygun havalandırmaya izin verir. Tutarlı bir sıcaklığın korunmasını sağlamak ve buharlaşmayı azaltmak için termomikserin kapağı yerinde olmalıdır.
5. Kuluçka döneminden sonra, canlanan kültürlere ikinci bir büyüme aşaması (ön koşullandırma) verin.
   1. Tüpleri RT'de 2 dakika boyunca 5000 x g'da döndürerek kültürleri peletleyin. Ardından, süpernatanı atın ve hücre peletini taze 1,5 mL ılık BBM ⁺ içinde yeniden süspanse edin.
      NOT: Bu deney, S. acidocaldarius vahşi tip suşu DSM639'u kullanır, ancak bu büyüme ve deneysel evrim yöntemleri, herhangi bir Sulfolobus suşuna ve potansiyel olarak diğer termofillere uygulanabilir.

3. S. acidocaldarius için popülasyon yoğunluğunun, iki katına çıkma süresinin ve üstel büyüme fazının belirlenmesi

1. Seçilen seçim koşulları için popülasyon yoğunluğunu ve üstel büyüme aşamasına kadar geçen süreyi belirleyin. Test edilecek her çevresel koşul için, 2.1-2.5 adımlarını izleyerek üç başlangıç kültürü hazırlayın.
2. BBM ⁺ 'daki üç kültürü 0.01'lik bir OD_600nm'ye seyreltin. Her kültürden en az 20 mL yapın. Bu üç kültür teknik kopyaları temsil eder.
3. Yıkıcı örnekleme kullanarak zaman içinde OD_600nm'nin büyüme eğrilerini çoğaltın.
   1. Adım 2.1'den itibaren 24 adet delinmiş 2 mL tüp hazırlayın, bunları sekizli üç sete ayırın ve bu teknik kopyaları 1, 2 ve 3 olarak etiketleyin (örneğin, kopya 1 vb. olarak etiketlenmiş sekiz tüp).
   2. Adım 3.2'deki üç seyreltilmiş kültürün her birinden, 1.5 mL'yi hazırlanmış yedi tüpe pipetleyin. Kalan tüpü negatif kontrol olarak 1,5 mL BBM+ ile doldurun.
4. 24 tüpün tümünü bir termomikserde 75 °C ve 400 RPM'de inkübe edin. Gaz geçirgen bir membran ile kapatın. Düzenli aralıklarla (0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 saat gibi), üç kopyanın her birinden bir tüp çıkarın ve bir spektrofotometre kullanarak OD_600nm'yi ölçün, ardından tüpü atın. Bir tüpü çıkardıktan sonra gaz geçirgen zarı değiştirin.
5. Paralel olarak, OD_600nm ile nüfus yoğunluğu arasındaki ilişkiyi belirleyin. BBM⁺ ortamında en az üç zaman noktası (ideal olarak başlangıç, orta ve bitiş) için seri seyreltmeler (1 x ^10-1 ila 1 x ^10-6) gerçekleştirin. Her seyreltmenin 100 μL'sini katı BBM ⁺ ortamına aşılayın (adım 1.4'teki gibi hazırlanır).
   NOT: Tutarlı koloni büyümesi ve doğru sayımlar elde etmek için, seyreltik kültürü, L şeklinde bir yayıcı veya cam boncuklar kullanmak gibi mekanik yayma işlemi yapmadan bir noktada katı ortama pipetlemek en iyisidir. Mekanik yayılmanın koloni oluşumunu olumsuz etkilediği görülmektedir.
6. Plakaları statik bir inkübatörde 75 ° C'de koloniler görünene kadar (5-7 gün) inkübe edin.
   1. Bu süre zarfında, plakaların aşırı kurumasını önlemek için inkübatörü nemli tutun, aksi takdirde koloniler oluşmaz.
   2. Bunu, plakaları nemli bir bezle kaplı kapalı bir polipropilen kutuya yerleştirerek başarın. Havalandırmayı sağlamak için kutunun kapağını en az üç kez delin.
   3. Nemi artırmak için kuluçka makinesine kova kova su koyun. Kovaları her gün yeniden doldurun.
7. Tüm OD_600nm ölçümleri toplandıktan sonra, OD_600nm ile zaman arasındaki ilişkiye bir lojistik eğri uydurarak, örneğin R'deki growthcurver paketinden SummarizeGrowth'u kullanarak, üstel büyüme aşamasına ulaşmak için iki katına çıkma süresini ve süresini belirleyin.
8. Katı ortamda görünür koloniler oluştuktan sonra, seyreltme faktöründen saymayı hedefleyerek koloni oluşturan birimleri (CFU'lar) sayın ve en iyi doğruluk için 50-100 koloni üretin.
9. Aşağıdaki formülü kullanarak kültür ortamındaki hücre yoğunluğunu hesaplayın: CFU/mL = koloni sayısı/(seyreltme faktörü × hacim kaplaması).
10. log10(CFU) ve log10(OD_600nm) arasındaki ilişkiyi belirlemek için log-log doğrusal regresyon gerçekleştirin. Bu nedenle, regresyon modelinin eğiminden ve kesişim noktasından belirli bir OD için tahmin edilen CFU/mL'yi hesaplayın: tahmini CFU = 10^{[eğim × log10(OD600nm) + kesişme]}.
11. (İsteğe bağlı) Ayrıca, termomikserlerde karşılaştırılabilir bir büyümenin elde edilip edilmediğini belirlemek için çalkalama inkübatörde 3.1-3.10 adımlarını gerçekleştirin.

4. Deneysel evrim için bağımsız soyların başlatılması

1. 1. Gün: Tek koloniler oluşturmak için, önce bir başlangıç kültürü oluşturmak için yukarıdaki bölüm 2'deki tüm adımları gerçekleştirin.
2. 3. Gün: Üstel fazda yeterli yoğunluğa ulaştığından emin olmak için kültürün OD_600nm'sini ölçün (spektrofotometre ile OD_600nm 0.3-0.8).
3. 1 x ^10-1-1 x ^10-6'dan S. acidocaldarius DSM639 kültürünün seri dilüsyonlarını oluşturun ve her 1 x ^10-5 ve 1 x ^10-6 seyreltmeden 100 μL'yi birkaç kopyada katı BBM ⁺ ortamı (Bölüm 1 ve Tablo 1) içeren 6 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yayın. Plakaları 75 ° C'de statik bir inkübatörde adım 3.5'teki gibi 5-7 gün boyunca tek kolonilerin çıkması için inkübe edin.
4. 8-10. Gün (kuluçkadan 5-7 gün sonra):
   1. Tek kolonilerden gelişen soyların sayısını belirleyin. Her soy için, bir aşılama döngüsü kullanarak plakalardan rastgele bir koloni seçin. Koloniyi, 1.5 mL önceden ısıtılmış BBM ⁺ ortamı içeren delinmiş 2 mL'lik bir tüpte yeniden süspanse edin. Tüpü uygun şekilde etiketleyin.
   2. İstenilen soy sayısı için tekrarlayın; burada yedi soy kuruldu ve SA1-7 olarak etiketlendi. Negatif kontrol olarak ek bir tüpü 1,5 mL BBM+ ile doldurun.
   3. Tüplerin üst kısımlarını nefes alabilen bir zarla kapatın ve kültürler bulanıklaşana kadar (spektrofotometre ile OD_600nm 0.3-0.8'e eşdeğer) 75 ° C, 400 rpm'de 48-72 saat boyunca bir termomikserde inkübe edin.
5. 10-12. gün (aşılamadan 7-9 gün sonra):
   1. Tezgah üstü bir santrifüjde, klonal kültürleri RT'de 1 dakika boyunca 5.000 x g'da döndürün. Süpernatanı atın ve peleti 200 μL sıvı BBM ⁺ ile yeniden süspanse edin.
   2. 200 μL hücre süspansiyonlarını 200 μL %50 gliserol (%25 h/v gliserol) ile karıştırarak yedi bağımsız soyun gliserol stoklarını oluşturun ve -80 °C'de saklayın. Bunlar evrim deneyleri için ataların popülasyonlarıdır.

5. Sıcaklık evrimi deneyinin gerçekleştirilmesi

NOT: Deney protokolünün ana yönlerini özetleyen kavramsal bir diyagram Şekil 1'de verilmiştir.

1. Evrim deneyi için bölüm 4'te oluşturulan yedi atasal popülasyonu kullanın.
   1. Tüm deneysel evrim tahlillerini, geçirgen bir zarla kapatılmış steril, delinmiş 2 mL'lik tüplerde gerçekleştirin (yukarıda açıklanmıştır, bölüm 2).
   2. Bu popülasyonların yanı sıra, (çapraz) kontaminasyonu izlemek ve kültür büyümesi olmadığını gösteren OD için bir eşik ayarlamak için kültürden arındırılmış negatif kontroller olarak 1.5 mL BBM ⁺ ile ayrı delinmiş 2 mL tüpleri koruyun.
2. Sıcaklık işlemleri oluşturun: Termomikserlerin kullanılması, birden fazla sıcaklık işleminin oluşturulmasına izin verir. Burada, aşağıdaki sıcaklık işlemlerini kullanın: sabit 75 °C, sabit 65 °C ve sıcaklığı her 4 günde bir 1 °C azaltarak 75-65 °C'den kademeli olarak düşme ('sıcaklık düşüşü tedavisi').
   NOT: Bu tedaviler belirli deneysel gereksinimlere göre uyarlanabilir. Her sıcaklık işlemi için ayrı bir termomikser gereklidir.
3. 1. Gün: Bölüm 2'de belirtilen adımları izleyerek ataların popülasyonlarını gliserol stoklarından (adım 4.5'te hazırlanmıştır) canlandırın.
4. 3. Gün:
   1. Bu kültürleri_600nm'lik bir OD 0.01'e (spektrofotometre ile ölçülür) en az 6 mL önceden ısıtılmış BBM ⁺ toplam hacmine seyreltin. Yedi seyreltik atasal popülasyon kültürünün her birinden 1.5 mL'yi, adım 5.2'de belirlenen her sıcaklık işlemi için bir tane olmak üzere üç ayrı delinmiş 2 mL tüpe alikot edin.
      NOT: Bu açıklama adımı, her bir atasal popülasyonda mevcut olan herhangi bir genetik varyasyonun, evrim deneyinin başlangıcındaki tüm sıcaklık işlemlerinde mevcut olmasını sağlar. Bu kültürler, sıcaklık evrimi deneyine başlamak için transfer 0 (Tx0) görevi görecektir.
   2. Tüpleri nefes alabilen zarla kapatın ve yedi atadan kalma popülasyonun her bir setini ayrı termomikserlere yerleştirin. Evrim deneyine başlamak için her bir termomikseri gerekli sıcaklığa ve 400 rpm'ye ayarlayın.
5. 5. Gün:
   1. 48 saat sonra, Tx0 kültürlerinin her birinden (1:100 seyreltme) 15 μL kültür ile delinmiş 2 mL'lik bir tüpte 1.5 mL ısıtılmış BBM ⁺ ortamını aşılayarak transfer 1'i (Tx1) gerçekleştirin. Hız için, tek bir deneyden birden fazla aktarımı birlikte tamamlamak için bu adımı değişken genişlikli çok kanallı bir pipetle gerçekleştirin ve kültürlerin termomikserden çıkma süresini azaltın.
   2. Daha önce olduğu gibi, tüpleri rastgele konumlara kendi termomikserlerine geri koymadan önce kapatın. Randomizasyonu manuel olarak veya iMetaLab 96 kuyu randomizörleri aracılığıyla gerçekleştirin.
6. Bağımsız soyların büyümesini izlemek için plaka bazlı bir spektrofotometrede (96 oyuklu plakada 200 μL; boşluk olarak aynı hacimde BBM⁺ kullanılır) Tx0'ın OD 600nm'sini ölçün.
   NOT: Kontaminasyonu önlemek için yeni bir ortama aktarım yapıldıktan sonra OD_600nm ölçülmelidir. Optik yoğunluk, standart bir spektrofotometre gibi başka yollarla da ölçülebilir. Plaka bazlı bir spektrofotometrenin kullanılması, birden fazla kültürün aynı anda ölçülmesini sağlayarak süreci kolaylaştırır.
7. 5.5 ve 5.6 adımlarını, Tx2, Tx3, Tx4 vb.'ye karşılık gelen 7, 9, 11 vb. günlerde tekrarlayın. 75 °C ve 65 °C tedavileri için sıcaklığı sabit tutun. Sıcaklık düşüşü işlemi için, sıcaklığı her saniye 1 °C azaltın (yani Tx2, Tx4, Tx6, vb.).
8. Her 10^{. transferden} sonra popülasyonların gliserol stoklarını (adım 3.2.3) hazırlayın (yani, Tx10, Tx20, vb.), Tüpü ataların popülasyon tanımlayıcısı ile etiketleyin (örneğin, 1^{. bağımsız popülasyon} için SA1) ve transfer numarası (örneğin, 10^{. transfer için} Tx10). Bu gliserol stoklarını daha sonra popülasyonları canlandırmak, popülasyonların zaman içinde nasıl değiştiğini incelemek veya gerekirse deneyi yeniden başlatmak için kullanın (örneğin, kültür kaybıyla sonuçlanan kontaminasyon veya beklenmedik olaylar nedeniyle).
9. Deneyin ya önceden belirlenmiş sayıda transfer için ya da önceden belirlenmiş sayıda nesil geçene kadar devam etmesine izin verin. Son transferde, tüm soy soylarının gliserol stoklarını hazırlayın.
   NOT: Burada deney, Tx22'de meydana gelen sıcaklık düşüşü işlemi 65 °C'ye ulaşana kadar devam etti. Bu, yaklaşık 150 üretime karşılık gelir (4,6'da 100'lük seyreltme faktörüne göre hesaplanır: günlük₂(100) = transfer başına 6,64 nesil). Evrim deneylerinin uzunluğu, deney gereksinimlerine göre ayarlanabilir.

6. Evrim sonrası deney büyüme tahlilleri: atalara karşı evrimleşmiş soylar

NOT: Büyüme/zindelik tahlil protokolünü özetleyen kavramsal bir diyagram Şekil 2'de verilmiştir.

1. 1,5 mL BBM⁺ ile delinmiş 2 mL'lik tüpler hazırlayın. Tüm soy soylarını ve ataların her bir suşunu büyütmek için yeterli tüp hazırlayın.
2. Adım 2.2-2.5'te özetlenen yöntemi kullanarak evrim deneyinin son transferinden sonra 5.9. adımda depolanan atasal popülasyonları ve her bir soy popülasyonunu canlandırın, ancak her popülasyonun evrim deneyinin son iki transferi için deneyimlediği sıcaklıkta inkübasyon ile, yani 75 °C sabit tedavi için 75 °C ve 65 °C sabit ve sıcaklık düşüşü deneyleri için 65 °C. Karşılaştırılabilir popülasyon yoğunlukları elde etmek için, 75 °C inkübasyonu 72 saat ve 65 °C inkübasyonu 120 saat boyunca gerçekleştirin.
3. Plaka bazlı bir spektrofotometre ile yetiştirilen kültürlerin OD_600nm'sini ölçün.
4. Her soydan gelen popülasyonun ve her atadan kalma suşun her iki sıcaklıkta (yani 75 ° C ve 65 ° C) üç kopyada büyüme tahlillerini gerçekleştirin. 1,5 mL BBM⁺ ile delinmiş 2 mL santrifüj tüplerini hazırlayın. Her evrimleşmiş soy ve her atadan kalma suş için altı tüp hazırlayın. Tüpleri köken adı (SA1-7 veya ata), büyüme sıcaklığı (75 °C veya 65 °C) ve çoğaltma kimliği (1, 2 veya 3) ile etiketleyin.
   NOT: Altıdan az termomikser mevcutsa, büyüme tahlili birkaç deney bloğunda birkaç gün boyunca tekrarlanabilir. Bu durumda, blok etkilerinin istatistiksel olarak tahmin edilebilmesi ve açıklanabilmesi için her deneysel bloktaki her soy ve atayı ölçmek önemlidir.
5. Hazırlanan altı tüpteki taze ortamı, her bir soy soyundan ve atalardan kalma suştan 15 μL kültür ile aşılayın.
6. Üç termomikseri 75 °C'ye ve üç termomikseri 65 °C'ye ayarlayın, her bir termomikseri bir kopya ID'ye atayın. Tüpleri sıcaklığa karşılık gelen termomiksere yerleştirin ve ID'yi çoğaltın. Her termomikser içinde, heterojenliği kontrol etmek için soyların ve ataların rastgele yerleştirildiğinden emin olun.
7. Her bir 24 tüp setini geçirgen bir zarla kapatın. 48 saat kuluçkaya yatırın.
8. Her kültürden 200 μL'yi 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Bir spektrofotometre kullanarak OD_600nm'yi ölçün.
   NOT: Mikrosantrifüj tüpleri ve 96 oyuklu plakalar arasında transferi kolaylaştırmak için değişken genişlikli çok kanallı bir pipet kullanılabilir.
9. İstatistiksel yazılım (örneğin, R) kullanarak verileri çizin ve analiz edin.

7. Evrimleşmiş soyların tüm genom dizilimi ve mutasyonların tanımlanması

1. Bölüm 2, adım 2.2-2.5'te olduğu gibi her donmuş popülasyondan bir buz sıyrığı BBM⁺'ya 48-72 saat arasında 75 °C'de önceden ısıtılmış BBM⁺'da adım 5.9'da depolanan soy soylarını canlandırın. Yeterli miktarda genomik DNA elde etmek için 1-10 mL kültür hacmi hazırlayın. Gereken tam hacim, adım 7.2 veya 7.3'te (aşağıda) sıralama için seçilen seçeneğe bağlıdır.
   NOT: Ataların popülasyonlarını başlatmak için kullanılan suşu da sıralamak iyi bir uygulamadır. Bu, soydan gelen soylarda tespit edilen herhangi bir mutasyonun daha önce değil, evrim deneyi sırasında ortaya çıkıp çıkmadığını doğru bir şekilde belirlemek içindir.
2. (Seçenek 1) Genomik DNA'yı çıkarın ve Illumina dizilimi için Illumina dizileme kitaplıklarını hazırlayın.
   1. Bakteriler için ticari bir genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak genomik DNA'yı ekstrakte edin ve saflaştırın.
   2. Ekstrakte edilen genomik DNA'nın, sağlayıcı tarafından önerilen ticari kitleri kullanarak dizileme sağlayıcısının miktar ve kalite gereksinimlerini karşıladığından emin olun.
   3. Üreticinin protokolüne göre ticari bir kit kullanarak genomik DNA kütüphanesi hazırlığı gerçekleştirin. 250 bp çift uçlu bir protokol önerilir. Ekstrakte edilen genomik DNA'yı, numuneleri dizileme sağlayıcısına göndermeye hazır olana kadar -20 °C'de saklayın.
3. (Seçenek 2) Alternatif olarak, örnekleri DNA ekstraksiyonu, genomik DNA kalite kontrolleri, Illumina kütüphane hazırlığı ve Illumina dizilemesini birleşik bir hizmet olarak gerçekleştiren ticari bir sağlayıcıya gönderin.
4. Mutasyonları tanımlamak için dizilenmiş genomları analiz edin.
   1. FASTQ dosyalarını alın ve sıralama sağlayıcısı tarafından henüz gerçekleştirilmediyse, Q15'lik bir kayar pencere kalitesi kesme ile Trimmomatic kullanarak adaptör kırpma işlemini gerçekleştirin.
   2. Kırpılmış FASTQ dosyalarını kullanarak, mutasyonları tespit etmek için breseq ardışık düzenini (sürüm 0.38.1) çalıştırın ve genomik DNA okumalarını seçilen suş için referans dizisiyle karşılaştırın. S. acidocaldarius DSM639 için bu, RefSeq ID NC_007181'dir.

8. (İsteğe bağlı) Termomikser ve inkübatör enerji tüketiminin değerlendirilmesi

1. Bir inkübatör ile büyüme için bir termomikser kullanmanın enerji tüketimini karşılaştırmak için, bir enerji izleme fişi kullanarak her bir cihazın enerji tüketimini 24 saatin üzerinde ölçün.
2. Her iki cihazın enerji tüketimini aynı anda ölçmek için iki fiş kullanın. Alternatif olarak, birbirini izleyen günlerde enerji tüketimini ölçün.
3. İnkübatörü veya termomikseri elektrik prizinden çıkarın. Enerji izleme fişini prize takın ve izleme ve kontrol yazılımının kurulumu da dahil olmak üzere üreticinin talimatlarına göre başlatın.
4. Tipik enerji tüketiminin iyi bir tahminini elde etmek için inkübatörü veya termomikseri enerji izleme fişine takın ve en az 2 saat (ancak ideal olarak 24 saat veya daha uzun) çalışmasına izin verin. Her cihazın enerji tüketimini kaydedin.

Sonuçlar

Büyüme eğrisi ölçümleri
S. acidocaldarius DSM639 için büyüme eğrileri Şekil 3A'da gösterilmiştir. Termomikserler kullanılarak yapılan inkübasyon ile geleneksel inkübatörlerdeki inkübasyon karşılaştırıldığında büyümenin benzer olduğu bulundu. Ortalama büyüme hızı parametreleri, tekrarlanan her bir büyüme eğrisine bir lojistik eğri uydurularak ve ortalama ve standart hata hesaplanarak tahmin edildi. Termomikser ve inkübatörde orta üstel faza kadar geçen süreler sırasıyla 27.2 saat ± 1.1 saat ve 31.1 saat ± 1.9 saat idi. Termomikser ve inkübatör için 75 ° C'de tahmini ilk ikiye katlama süreleri sırasıyla 4.29 saat ± 0.28 saat ve 4.19 saat ± 0.44 saat idi, bu da daha önce yayınlanan değerlerle^{tutarlıdır 24}. Günlük₁₀ (OD_600nm) ve günlük₁₀ (CFU) arasındaki ilişki, doğrusal bir model ile iyi bir şekilde karakterize edildi (düzeltilmiş R² = 0.82, F (1,22) = 104, p < 0.00001, eğim = 1.73 ± 0.17, kesişme = 9.73 ± 0.14). OD_600nm ve CFU arasındaki ilişki böylece CFU = 10^{(1.73 × log10(OD600nm) + 9.73)} formülü ile verilir. Bu nedenle 0.3'lük bir OD_600nm, yaklaşık 6.7 × 10⁸ CFU/mL'ye karşılık gelir (Şekil 3B).

Sıcaklık evrimi deneyi
Sabit 75 °C, sabit 65 °C ve sıcaklık düşüşü (75-65 °C, her iki transferde 1 °C azalan) olmak üzere üç sıcaklık koşulu, S. acidocaldarius DSM639'dan türetilen yedi bağımsız soy kullanılarak başlatıldı. OD_{600nm ölçümleri,} deneyin 45 günü boyunca (75 ° C'de yaklaşık 150 nesil) her transferin ardından alınmıştır ve Şekil 4'te gösterilmiştir. Günler boyunca alınan OD_600nm ölçümleri, örneğin büyüme periyodu, sıcaklık vb. gibi ince farklılıklara maruz kalabileceklerinden, doğası gereği gürültülüdür. Bununla birlikte, günler boyunca yapılan ölçümler, popülasyonun yaşayabilirliğini değerlendirmek ve zindeliğin zaman içinde iyileşip iyileşmediğine dair bir gösterge vermek için hala yararlı olabilir. Sabit 75 ° C koşulundan gelen soylar_{, OD 600nm'de} deneyin sonunda 0.125-0.3 başlangıç aralığından 0.248-0.471 aralığına yükseldi. Bu, bu tedavi ile zindeliğin arttığını göstermektedir. Buna karşılık, sabit 65 ° C işleminden elde edilen soylar, OD_600nm'de, son zaman noktasında 0.018-0.087 ila 0.008-0.04 başlangıç aralığından bir düşüş gösterdi. Bu, popülasyonların sabit 65 ° C sıcaklığa uyum sağlayamadıklarını göstermektedir, ancak canlı organizmaların geri kazanılabileceği gerçeği, popülasyonların ardışık seyreltmeler yoluyla yıkanmadığını ve bir dereceye kadar adaptasyon olduğunu göstermektedir. Son olarak, sıcaklık düşüşü muamelesindeki popülasyonlar, başlangıçtaki OD_600nm aralığından 0.099-0.279'dan Tx6'da 0.3-0.39'a yükselmiştir (bu tedavide 288 saat ve 73 ° C'ye karşılık gelir), ardından son zaman noktasında 0.003-0.024 aralığına sabit bir düşüş olmuştur.

Büyüme/zindelik testleri
Evrim deneylerini takiben her bir soydan gelen popülasyon için uygunluk testleri yapıldı. OD_600nm , yedi bağımsız soyun tümü için 48 saatlik büyümeden sonra test edildi, ardından her bir test sıcaklığı için R'de doğrusal modellerin takılması, ana etki olarak 'seçim ortamı' ve bir blok etkisi olarak 'çoğaltma / termokarıştırıcı' ile test edildi. Atasal suşun büyümesi, tedavi kontrastları için referans seviye olarak kullanıldı. Veriler Şekil 5'te gösterilmiştir.

75 ° C'de test edildiğinde, sabit 75 ° C (t-testi: t₂₁₀ = 3.64, p = 0.0003) ve sabit 65 ° C (t-testi: t₂₁₀ = 2.8, p = 0.005) tedavilerinden elde edilen soylar için ataların suşuna göre uygunlukta ortalama olarak önemli artışlar olmuştur, ancak sıcaklık düşüşü işleminden değil (t-testi: t₂₁₀ = −0.87, p=0,38). Ortalama olarak 65 ° C'de test edildiğinde, tüm tedavilerden elde edilen soylar uygunlukta bir artış gösterdi (sabit 75 ° C soylar; t-testi: t₂₁₀=4.68, p<0.0001, sabit 65 °C soylar; t-testi: T₂₁₀,=4.24, p<0.0001, sıcaklık düşüşü soyları; t-testi: t₂₁₀=3.15, p=0.002). Bununla birlikte, her iki tahlil sıcaklığı için, uygunluklarında soylar arasında önemli farklılıklar vardı (Şekil 5). Bazı soylar, ataların soyundan önemli ölçüde farklı değildi veya uygunlukları azalmıştı; Bu, özellikle sıcaklık düşüşü işleminden kaynaklanan soylar için belirgindi.

OD_600nm ve CFU/mL arasındaki ilişkinin evrim deneyi sırasında değişmiş olabileceğini belirtmekte fayda var. Bu, evrimleşmiş soylar için büyüme parametrelerinin belirlenmesiyle değerlendirilebilir (3.1-3.10 adımlarını izleyerek).

Tüm genom dizileme sonuçları
Tüm genom analizi, S. acidocaldarius DSM639'un referans genomu kullanılarak sabit 75 ° C durumundan yedi soy üzerinde breseq (sürüm 0.38.1)²⁵ kullanılarak gerçekleştirildi (RefSeq katılımı NC_007181.1). Tüm soy soylarının genomları boyunca eklemeler, silmeler ve tek nükleotid polimorfizmini (SNP) içeren çeşitli mutasyonlar ortaya çıktı (Tablo 2). Çoklu yerleştirme ve eşanlamlı olmayan mutasyonlar, protein kodlayan genlerde ve ayrıca genlerin promotör bölgelerindeki çerçeve kaymaları nedeniyle gen ekspresyonunu etkileyebilecek intergenik bölgelerdeydi. Mutasyonların bazıları, hücre duvarı biyosentezi, transkripsiyon, metabolizma, hücresel taşıma ve katalitik aktivite gibi çeşitli işlevlerde yer alan genlerdeki çoklu soy boyunca tutarlıydı (Tablo 2). Bu mutasyonlar arasında, yedi soydan beşinde 54.667 baz çiftinin büyük bir silinmesi vardı; Bu, her popülasyon için eksik bir kapsama kanıt grafiği ile doğrulandı (sıklık% 93.2 ile% 100 arasında değişen). Silinen bölge 53 gen kaybına eşittir; Bu genlerin adaptasyondaki rolleri gelecekteki çalışmalarda araştırılacaktır. DSM639'un kullanılan izolatı ile yayınlanan referans dizisi arasında bazı farklılıklar kaydedilmiştir (Ek Tablo 1'de gösterilmiştir).

Çalkalama inkübatörünün termomiksere karşı enerji tüketimi
Çalkalama inkübatörünün enerji tüketimi, bir dizi yaygın inkübasyon sıcaklığında ve burada kullanılan 75 °C sıcaklıkta ticari olarak temin edilebilen bir enerji izleme akıllı fişi kullanan bir termomikser ile karşılaştırıldı. 75 ° C'de, termomikser, geleneksel bir çalkalama inkübatörünün enerjisinin yaklaşık 1/^40'ını tüketti (Şekil 6), bu da termomikserlerin deneysel evrimle ilişkili karbon ayak izini azaltmanın potansiyel bir yolu olduğunu düşündürüyor.

Şekil 1: Üç sıcaklık işleminde evrim deneyi protokolünü gösteren akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Büyüme/uygunluk testi protokolünün adımlarını gösteren akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: S. acidocaldarius DSM639 için temel büyüme parametrelerinin belirlenmesi ve inkübasyon cihazlarının karşılaştırılması. Üç kopya kültür, 7 ayrı tüpte 75 ° C'de büyütüldü. (A) OD_600nm'yi ölçmek için yıkıcı örnekleme kullanıldı ( n = 3 teknik kopyanın standart ± hatası anlamına gelir; bazı hata çubukları çizim sembollerinden daha küçüktür); eğriler, uygun lojistik büyüme modellerini ve (B) koloni oluşturan birimleri (CFU'lar) temsil eder; Satırlar, takılan log-log doğrusal regresyon modellerini temsil eder). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Evrim deneyleri sırasında elde edilen optik yoğunluklar (OD_600nm) için temsili sonuçlar. Yaklaşık 150 nesil boyunca gerçekleştirilen üç sıcaklık tedavisi (sabit 65 °C, sabit 75 °C, damla 75 °C-65 °C) altında evrim deneyleri sırasında ölçülen bağımsız soyların optik yoğunlukları. Eğriler, Loess'in her bağımsız soy için zaman içinde pürüzsüzleştiğini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Büyüme deneyleri için temsili sonuçlar. Ata suşuna kıyasla sıcaklık evrimi deneylerini (sabit 65 °C, sabit 75 °C, damla 75 °C-65 °C) takiben S. acidocaldarius DSM639'dan türetilen bağımsız soylar için büyüme deneyleri. Tüm soylar için büyüme 65 °C ve 75 °C'de test edildi. Renkli noktalar, teknik kopyaların ortalama ± standart hatasını gösterir (gri renkle gösterilir, ata için n = 12 ve her evrimleşmiş soy için n = 3). Gri çubuk, atalardan kalma uygunluğun ortalama ± standart hatasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Geleneksel inkübatörün termomikser cihazlarına karşı enerji tüketimi. Enerji tüketimi, 2 saat boyunca piyasada bulunan bir enerji izleme akıllı fişi kullanılarak kaydedilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: S. acidocaldarius'u yetiştirmek için gerekli ortam tarifleri ve stok çözeltileri. Tüm ortam ve stok çözeltileri, çift damıtılmış H₂O (ddH₂O) ile yapılmalı ve daha sonra belirtildiği gibi otoklavlama veya 0.22 μm'lik bir filtreden filtre sterilizasyonu ile sterilize edilmelidir. Tüm medya ve stok çözümlerinin nasıl hazırlanacağına dair ayrıntılı bir açıklama için lütfen protokolün 1. bölümüne bakın. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Torun soylarının tüm genom dizilimi için temsili sonuçlar . Sabit 75 °C tedavisinden S. acidocaldarius DSM639'un soyundan gelen soylarda bulunan mutasyonlar. Mutasyonlar, S. acidocaldarius DSM639 için referans dizisine göre birkaç değişikliğe sahip olan soyun doğrudan atasına göre değişiklikleri gösterir (RefSeq NC_007181; atadaki mutasyonlar Ek Tablo 1'de gösterilmiştir). n , bir mutasyonun bulunduğu soyların sayısını gösterir. 'İleri okuma çerçevesi' üzerindeki → geni; ← geni 'ters okuma çerçevesinde' bulunur. †Bu değişiklikler, S. acidocaldarius DSM639'un izolatında bulunan (A)10→11 çerçeve kaymasına göredir (Ek Tablo 1). Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Referans dizisine göre S. acidocaldarius DSM639 izolatında bulunan mutasyonlar (RefSeq katılımı NC_007181.1). → 'ileri okuma çerçevesi' üzerindeki gen; ← geni 'ters okuma çerçevesinde' bulunur. ‡SACI_RS04020, NC_007181.1'de bir sözde gen olarak açıklanır, ancak burada gözlemlenen Δ1 bp çerçeve kayması mutasyonu, mutasyonda olduğu gibi işlevini varsayılan olarak geri yükler, 0 özdeşliğe sahip bir proteini rgy ters giraz genine kodlar (RefSeq katılımı WP_176586667.1). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışma, termofiller için deneysel bir evrim protokolü geliştirdi, burada archaeon S. acidocaldarius için uyarlanmış, ancak yüksek sıcaklıkta büyüme gereksinimleri olan diğer mikroplara uyarlanabilir. Bu protokol, başlangıçta mezofilik bakteriler için tasarlanmış teknikler üzerine kuruludur, ancak yüksek sıcaklıkta aerobik büyüme ile ilişkili teknik zorlukların üstesinden gelmek için özel olarak modifiye edilmiştir 2,4,5,24. Bu yöntemin oluşturulması, yaşamın evriminin en erken aşamalarında potansiyel olarak var olan koşullara benzeyen, aşırı sıcaklık koşulları altında meydana gelen, daha önce karakterize edilmemiş evrimsel dinamiklerin araştırılmasını sağlayacaktır¹.

Evrim deneylerinden güvenilir sonuçlar elde etmek için protokolün gözlemlenmesi gereken birkaç kritik yönü vardır. Birincisi, deneyi başlatmadan önce tek kolonilere ayrılarak elde edilen soylar arasındaki bağımsızlıktır. Bu, ayrı soylarda bulunan herhangi bir ortak mutasyonun bağımsız kökenlere sahip olmasını sağlamak için zorunludur. Bunun yerine, soyları başlatmak için bir toplu sıvı kültür kullanılırsa, ortak genetik varyantlar her popülasyona dağıtılabilir. İkinci önemli husus, kültürden bağımsız bir negatif kontrolün sürdürülmesi ve büyümenin izlenmesi yoluyla elde edilen kontaminasyonun kontrol edilmesidir. Mezofillerle yapılan deneylerin aksine, ekstremofil evrim deneylerinin dış kaynaklardan kontamine olması olası değildir, ancak soylar arasında çapraz kontaminasyon yine de meydana gelebilir. Havalandırma ve buharlaşma arasındaki dengeyi korumak diğer önemli bir husustur. S.acidocaldarius zorunlu bir aeroptur ve bu nedenle büyüme için oksijene ihtiyaç duyar^10,23. Polipropilen mikrosantrifüj tüplerinin manuel olarak delinmesi ve gaz geçirgen membran^21,25 ile kapatılması, aşırı buharlaşma olmadan havalandırmayı sürdürmenin anahtarıydı. Bu azalma muhtemelen sızdırmaz tüpler içinde tek tip bir ortamın korunmasına bağlanabilir (veriler gösterilmemiştir).

Yöntemin iki yönü, evrim deneyi için kullanılan belirli çevresel koşullara göre ayarlama veya sorun giderme gerektirebilir: seyreltme faktörü ve transferler arasındaki süre. Bu yöntemde, her transferde 1:100'lük bir seyreltme gerçekleştirildi ve aynı popülasyon büyüklüğüne dönmek için ortalama_{log 2} (100) = 6.64 ikiye katlama gerekiyordu. Bu, adaptasyon potansiyeli (optimal bir seyreltme faktörü Wahl ve Gerrish²⁶ tarafından hesaplanır) ve deneysel izlenebilirlik arasında iyi bir denge sağlar. Prensip olarak, güçlü bir seyreltme faktörü, aynı popülasyon yoğunluğuna geri dönmek için daha fazla ikiye katlama gerektirdiğinden, günde daha fazla neslin gerçekleşmesini sağlayacaktır (örneğin, 1:1000, günlük₂(1000) = ortalama 9,97 ikiye katlama gerektirir). Bununla birlikte, transferler arasında gerekenden daha az ikiye katlama elde edilirse, ikiye katlama süresini azaltan faydalı bir mutasyon meydana gelmedikçe, popülasyonlar seyreltme yoluyla yavaş yavaş yıkanacaktır. her 48 saatte bir transfer edilen popülasyonlarla, ikiye katlama sürelerinin 8 saatten az olması gerekir, bu da tahmini ikiye katlama süresi ve S. acidocaldarius'ta 75 °C'de (4-6 saat)^23,27 heterotrofik büyüme için daha önce yayınlanan değerlerle uyumludur. Bununla birlikte, sabit 65 ° C ve sıcaklık düşüşü işlemleri için zaman içinde OD_600nm'deki kademeli azalma, bunun gerekli sayıda ikiye katlama elde etmek için yeterince uzun bir süre olmayabileceğini ve daha uzun bir transfer süresinin faydalı olacağını düşündürmektedir.

Deneysel evrim için termomikserlerin geleneksel çalkalama inkübatörlerine göre kullanılmasının, özellikle sıcaklığa adaptasyonu araştırırken birkaç önemli avantajı not edilmiştir. Termomikserler, azaltılmış uzamsal ayak izinin ek avantajı ile sallanan inkübatörlere uygun maliyetli bir alternatif sunar. Bu özellikler, birden fazla sıcaklık işleminin paralel olarak verimli bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Termomikserler ayrıca çalkalama inkübatörlerinden daha düşük enerji tüketimi sergiler, bu nedenle kullanımları, mütevazı sayıda tüp inkübe edildiğinde (örneğin, 100'den az) çevresel etkiyi potansiyel olarak azaltabilir. Enerji tüketimindeki bu eşitsizlik, özellikle termofillerle ilgili sıcaklıklarda belirgindir, ancak aynı zamanda daha ılımlı sıcaklık aralıkları spektrumunda da uygulanabilir (Şekil 6), yani mezofil deneysel evriminin çevresel etkisini azaltmak için termomikserler de benimsenebilir. Toplu olarak, bu özellikler, deneysel evrimde termomikserlerin kullanılmasının, özellikle gelişmekte olan ülkelerdeki laboratuvarlar ve ilk ve orta öğretimdeki kaynaklar gibi kaynakların kısıtlı olduğu ortamlarda, bu araştırma metodolojisinin erişilebilirliğini iyileştirme potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir.

Termofil deneysel evrimi için ileriye dönük bir yol sağlamasına rağmen, mevcut yöntemin mezofil deneysel evrimine göre bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, termomikserler kullanılarak kurulabilen replike bağımsız soyların sayısı, mezofiller için yaygın olarak kullanılan mikrotitre plakalarını içeren yüksek verimli yöntemlere göre küçüktür⁴. Yüksek sıcaklıklarda buharlaşma şu anda üstel büyümeye ulaşmak için gereken zaman penceresi boyunca mikrotitre plakalarının kullanılmasını engellemektedir. İkinci olarak, yüksek sıcaklıklarda (>45 °C) çalışabilen plaka tabanlı spektrofotometreler şu anda satın alınamadığından, büyüme hızı, iki katına çıkma süresi ve gecikme süresi gibi temel büyüme eğrisi parametrelerinin tahmin edilmesi zorlaşmaktadır. Burada özetlenen yöntemle, şu anda büyüme eğrisi karakterizasyonu emek yoğun yıkıcı örnekleme gerektirir ve bu nedenle verimi sınırlar. Son olarak, uyarlanmış izolatların rekabetçi uygunluğunu değerlendirmek için yüksek verimli teknikler, termofiller için henüz tam olarak geliştirilmemiştir. Özellikle, suşlar arasında ayrım yapmak için kullanılabilecek termostabil bir floresan proteinin geliştirilmesi, yüksek verimli akış sitometrisi tabanlı uygunluk testlerini mümkün kılacaktır^28,29; Farklı spektrumlara sahip termostabil floresan proteinlerin son gelişmeleri, bunu gelecekteki potansiyel bir gelişme olarak gündeme getirmektedir^30,31,32. Verimdeki artışlar, evrimsel süreçlerin daha eksiksiz bir şekilde tanımlanmasını sağlayacağından, termofiller için deneysel evrim tekniklerinin daha da geliştirilmesi için mantıklı bir sonraki adımdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.22 μ m şırınga tahrikli membran filtreler	StarLab	E4780-1226	Otoklavlanamayan filtre sterilizasyon ortamı bileşenleri için.
1 μ L aşılama döngüleri	Greiner	731161, 731165 veya 731101	Kültürleri aşılamak için. Diğer döngüler kullanılabilir.
1000 μ L pipet uçları	StarLab	S1111-6811	Diğer pipet uçları kullanılabilir.
2 mL mikrosantrifüj tüpleri	StarLab	S1620-2700	Termomikserlerde S. acidocaldarius kültürü için.
200 μ L pipet uçları	StarLab	S1111-0816	Diğer pipet uçları kullanılabilir.
Konik tabanlı 50 mL polistiren tüpler	Corning	430828 veya 430829	Diğer tüpler kullanılabilir. 75 ° C'de performansı kontrol edin. Tapa contalı kapaklı tüpler yeterli havalandırmaya izin vermeyebilir; Kullanmadan önce kontrol edin.
50 mL şırınga	BD plastipak	300865	Şırınga tahrikli filtrelerle kullanım içindir.
96 kuyulu mikrotitre plakası (işlenmemiş, düz tabanlı)	Nunc	260860	Spektrofotometrede 600 nm'de OD ölçümü için.
Ayarlanabilir genişlikte çok kanallı pipet	Pipet-Lite	LA8-300XLS	İsteğe bağlıdır, ancak mikrosantrifüj ve 96 oyuklu plakalar arasında aktarım yaparken zaman kazandırır.
Amonyum sülfat ((NH4< / sub>)2< / sub>SO4< / sub>)		Brock stok çözeltisi için Milipore 168355 I.
Otoklav	Priorclave	B60-SMART veya SV100-BASE	Diğer otoklavlar da kullanılabilir.
Breathe-EASY gaz geçirgen sızdırmazlık membranı	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Delinmiş mikrosantrifüj tüplerinde kullanmak için boyuta göre kesin. Diğer gaz geçirgen memrbanları değiştiriyorsanız, performansın 75 ° C'de yeterli olduğundan emin olun; C
Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2 ve orta nokta; 2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Brock stok çözümü I için.
CELLSTAR Altı kuyulu plakalar (süspansiyon/işlenmemiş)	Greiner	M9062	Diğer üreticilerin altı kuyulu plakaları muhtemelen ikame edilebilir. Yüksek sıcaklıklarda performansı kontrol edin.
Kobalt (II) sülfat heptahidrat (CoSO4· 7H2O)	Supelco	1025560100	Eser element stok çözeltisi için.
Bakır (II) klorür dihidrat (CuCl < alt > 2 < / alt > ve orta nokta; 2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	Eser element stok çözümü için.
D- (+) - glikoz susuz (C < alt > 6 < / alt >H < alt > 12 < / alt > O < alt > 6 < / alt >)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Diğer pentoz ve heksoz şekerleri de kullanılabilir (örn. D-ksiloz, D-arabinoz). Glikoz, S. acidocaldarius (SV Albers, kişisel iletişim)
Çift damıtılmış su (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Jelrit (gellan gum), daha yüksek erime noktası nedeniyle katı ortam yapmak için agar yerine kullanılır.
Cam 100 mm Petri kapları	Marka	BR455742	Cam Petri kapları kullanılır, çünkü çoğu standart polistiren 90 mm Petri kabı 75 ° C'de deforme olur; C (markaya bağlı). Alternatif olarak, yüksek sıcaklıklarda deforme olmadıkları için altı kuyulu plaka kullanılabilir.
Kuluçka makinesi	New Brunswick	Innnova 42R	Diğer kuluçka makineleri de kullanılabilir. Birçok inkübatör 65 ° C'den daha yüksek sıcaklıklara sahip olmadığından, satın almadan / kullanmadan önce ekipmanın çalışma sıcaklığını kontrol edin.
Demir (III) klorür hekzahidrat (FeCl < alt > 3< / alt > ve orta nokta; 6H < alt > 2 < / alt > Fe	Stok Çözeltisi için	Supelco
103943 Magnezyum sülfat heptahidrat (Epsom tuzu) (MgSO< alt > 4 < / alt > ve orta nokta; 7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	Brock stok çözümü için I.
Manganez (II) klorür tetrahidrat (MnCl < alt > 2 < / alt > ve orta nokta; 4H < sub > 2 < / sub > O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	Eser element stok çözümü için.
Mini Akıllı Wi-Fi Soketi, Enerji İzleme	Tapo	Tapo P110	Enerji tüketimini izlemek için
N-Z-Amin A - Kazein enzimatik hidrolizat	Sigma-Aldrich	C0626-500G	NZ-Amin-Amin, amino asit kaynağı olarak kullanılır.
Ataş (veya başka bir sağlam tel)	yok		2 mL mikrosantrifüj tüplerini delmek için.
Potasyum dihidrojen fosfat (Monopotasyum fosfat) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	Brock stok çözeltisi I için.
Promega Sihirbazı Genomik DNA Saflaştırma Kiti	Promega	A1120	İsteğe bağlı, laboratuvarda genomik DNA'yı çıkarmak için
Sodyum molibdat dihidrat (Na2MoO4· 2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	Eser element stok çözümü için.
Sodyum tetraborat dekahidrat (Boraks) (Na2B4O7· 10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	Eser element stok çözümü için.
Spektrofotometre	BMG	SPECTROstar OMEGA	600 nm'de OD ölçümü için. 600 nm'de OD okuyabilen diğer spektrofotometreler kullanılabilir.
Sülfürik asit (Su ile 1:1 oranında seyreltilmiş) (H2SO4)	Thermo Scientific Chemicals	11337588	Brock stok çözeltisi II/III'ün pH'ını 2–3'lük bir nihai pH'a ayarlamak için kullanılır.
Termomikser	DLab	HM100-Pro	Diğer termomikserler de kullanılabilir; Önemli husus, 65&ndash'ı koruma yeteneğidir; 75 & derece; C sıcaklıkları ve 400 RPM
Urasil (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	PyrE'nin silinmesi, S. acidocaldarius'da kullanılan yaygın bir genetik belirteçtir. Delesyon suşları büyüme için urasil ile desteklenmelidir. DSM639 vahşi tip suş için takviye kesinlikle gerekli değildir, ancak gelecekteki deneyler delesyon suşlarını içerebileceğinden buraya dahil edilmiştir.
Vanadil sülfat dihidrat (VOSO4· 2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	Eser element stok çözümü için.
Çinko sülfat heptahidrat (ZnSO4 ve orta nokta; 7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	Eser element stok çözümü için.