Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Kök Hücre Bakımı ve Bağırsak Organoid Üretimi için Bazal Membran Matrislerinin Karşılaştırmalı Çalışması

3.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66277

⸱

15 Mart 2024

 ,  ,  , 
1Center for Pharmacometrics & Systems Pharmacology, Department of Pharmaceutics, University of Florida, 2TheWell Bioscience, Inc

Bu makalede

Özet

Organoidler, hastalık modellemesi için değerli araçlar haline geldi. Hücre dışı matris (ECM), organoid üretimi sırasında hücre kaderini yönlendirir ve doğal dokuya benzeyen bir sistem kullanmak model doğruluğunu artırabilir. Bu çalışma, hayvan kaynaklı ECM ve kseno içermeyen hidrojellerde indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilmiş insan bağırsak organoidlerinin üretimini karşılaştırmaktadır.

Özet

Hücre dışı matriks (ECM), hücre davranışı ve gelişiminde kritik bir rol oynar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) üretilen organoidler birçok araştırma alanının ilgi odağındadır. Bununla birlikte, klasik hücre kültürü materyallerinde fizyolojik ipuçlarının olmaması, verimli iPSC farklılaşmasını engellemektedir. Ticari olarak temin edilebilen ECM'nin kök hücre kültürüne dahil edilmesi, hücre bakımı için faydalı fiziksel ve kimyasal ipuçları sağlar. Hayvansal kaynaklı ticari olarak temin edilebilen bazal membran ürünleri, hücre bakımını destekleyen ECM proteinleri ve büyüme faktörlerinden oluşur. ECM, hücre kaderini modüle edebilen dokuya özgü özelliklere sahip olduğundan, klinik çalışmalara translasyonu sağlamak için kseno içermeyen matrisler kullanılır. Ticari olarak temin edilebilen matrisler hiPSC ve organoid çalışmalarında yaygın olarak kullanılırken, bu matrislerin eşdeğerliği henüz değerlendirilmemiştir. Burada, dört farklı matriste hiPSC idame ve insan bağırsak organoidleri (hIO) oluşumunun karşılaştırmalı bir çalışması yapılmıştır: Matrigel (Matris 1-AB), Geltrex (Matris 2-AB), Cultrex (Matris 3-AB) ve VitroGel (Matris 4-XF). Koloniler mükemmel yuvarlak bir şekle sahip olmasalar da, hücrelerin %85'inden fazlasının kök hücre markörü SSEA-4'ü eksprese etmesiyle minimal spontan farklılaşma vardı. Matrix 4-XF, 3D yuvarlak kümelerin oluşumuna yol açtı. Ayrıca, Matrix 4-XF hidrojel çözeltisini yapmak için kullanılan ortamdaki takviye ve büyüme faktörlerinin konsantrasyonunun arttırılması, SSEA-4'ün hiPSC ekspresyonunu 1.3 kat iyileştirdi. Matris 2-AB ile korunan hiPSC'nin farklılaşması, diğer hayvan türevli bazal membranlara kıyasla orta/arka bağırsak aşamasında daha az sferoid salınımına yol açtı. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, kseno içermeyen organoid matris (Matris 4-O3) daha büyük ve daha olgun hIO'ya yol açar, bu da kseno içermeyen hidrojellerin fiziksel özelliklerinin organoid oluşumunu optimize etmek için kullanılabileceğini düşündürür. Toplamda, sonuçlar, farklı matrislerin bileşimindeki varyasyonların IO farklılaşmasının aşamalarını etkilediğini göstermektedir. Bu çalışma, ticari olarak temin edilebilen matrislerdeki farklılıklar hakkında farkındalık yaratır ve iPSC ve IO çalışmaları sırasında matris optimizasyonu için bir kılavuz sağlar.

Giriş

Hücre dışı matriks (ECM), hücre davranışını ve gelişimini düzenlemede merkezi bir rol oynayan dokuların dinamik ve çok işlevli bir bileşenidir. Karmaşık bir ağ olarak, yapısal destek, hücre yapışkan ligandları1 ve hücre sinyallemesini düzenleyen büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin depolanmasını sağlar. Örneğin, yara iyileşmesi sırasında, ECM, göç eden hücreler için bir iskele görevi görür ve doku onarımında yer alan büyüme faktörlerinin bir rezervuarı olarak işlev görür2. Benzer şekilde, ECM'deki düzensizlik, fibroz ve kanser gibi çeşitli hastalıkların şiddetinde bir artışa yol açabilir 3,4. Embriyonik gelişim sırasında, ECM doku morfogenezine rehberlik eder. Örneğin, kalbin gelişiminde, ECM bileşenleri kalp dokusunun doğru mimarisini ve işlevini oluşturmada rol oynar5. On yıldan fazla bir süredir yapılan araştırmalar, mikro çevrenin sertliğinintek başına 6,7'nin kök hücre soy spesifikasyonunu kontrol edebileceğini göstermiştir. Bu nedenle, in vitro hücre farklılaşması sırasında ECM'nin farklılaşma için sinyaller sağlayarak kök hücre kaderini etkilemesi şaşırtıcı değildir.

Organoidler, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) üretilebilir. Organoidleri başarılı bir şekilde oluşturmak için uygun şekilde karakterize edilmiş bir iPSC hattı ile başlamak gerekir. Bununla birlikte, klasik hücre kültürü materyallerinde fizyolojik ipuçlarının eksikliği, verimli iPSC farklılaşmasını ve organoid oluşumunu engeller. Ayrıca, son araştırmalar, organoid genişleme ve farklılaşma 12 bağlamında hücre dışı matrisin (ECM) bileşiminin, hücreler ve ECM8 arasındaki etkileşimlerin yanı sıra mekanik ve geometrik ipuçlarının 9,10,11 önemini vurgulamıştır. Tekrarlanabilirliği artırarak organoid teknolojisini ilerletmek, dokuya özgü fiziksel ve kimyasal ipuçlarının dahil edilmesini içerecektir.

Organoidler, doğal dokuyu fizyolojik olarak benzer bir mikro çevre içinde özetlemeyi amaçlar. Doğal doku ECM'sini yakından taklit eden bir ECM sistemi seçmek, hücre davranışı, işlevi ve uyaranlara yanıt ile ilgili fizyolojik alaka düzeyini elde etmek için çok önemlidir13. ECM bileşenlerinin seçimi, kök hücrelerin organoid içindeki belirli hücre tiplerine farklılaşmasını etkileyebilir. Farklı ECM proteinleri ve bunların kombinasyonları, hücre kaderini yönlendiren ipuçları sağlayabilir14. Örneğin, çalışmalar, spesifik ECM bileşenlerinin kullanılmasının, bağırsak kök hücrelerinin olgun bağırsak hücre tiplerine farklılaşmasını teşvik edebileceğini ve bunun fizyolojik olarak ilgili bağırsak organoidleri ile sonuçlanabileceğini göstermiştir15. Organoidler, hastalık modellemesi ve ilaç testi sırasında değerli bir araç olsa da, uygun bir ECM sisteminin seçilmesi bu uygulama için çok önemlidir. Uygun bir ECM sistemi, etkilenen dokuya benzeyen bir mikro çevre yaratarak hastalık modellemesinin doğruluğunu artırabilir16. Ayrıca, dokuya özgü ECM, hastalıkla ilişkili fenotipleri ve ilaç yanıtlarını daha iyi özetleyen organoidlerin üretilmesine yardımcı olabilir17. Organoid farklılaşmasında kullanılan ECM sisteminin optimize edilmesi, istenen farklılaşma sonuçlarının elde edilmesi için kritik öneme sahiptir.

Hayvansal ECM kaynaklarından (örneğin, Matrigel, Cultrex) ve kseno içermeyen hidrojelden (örneğin, VitroGel) türetilen ticari olarak temin edilebilen bazal membran sistemleri, iPSC ve organoid araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunları ticarileştiren şirketler ve bunları kullanan araştırmacılar, yıllar boyunca kendi özel ürünleri ve uygulamaları için birçok talimat ortaya koymuşlardır. Bu talimatların çoğu, bu protokolün oluşturulması için bir rehber görevi gördü. Ayrıca, içsel özellikleriyle ilişkili faydalar ve aksilikler birçok 18,19,20,21 tarafından ayrı ayrı belirtilmiştir. Bununla birlikte, iPSC ve organoid çalışmaları için en uygun sistemlerin seçimine rehberlik edecek sistematik bir iş akışı yoktur. Burada, iPSC ve organoid çalışmaları için çeşitli kaynaklardan ECM sistemlerinin eşdeğerliğini sistematik olarak değerlendirmek için bir iş akışı sağlanmaktadır. Bu, dört farklı matriste iki farklı insan iPSC hattının (hiPSC) ve insan bağırsak organoidlerinin (hIO) oluşumunun sürdürülmesinin karşılaştırmalı bir çalışmasıdır: Matrigel (Matris 1-AB), Geltrex (Matris 2-AB), Cultrex (Matris 3-AB) ve VitroGel (Matris 4-XF). Organoid kültür için, daha önce organoid kültür için optimize edilmiş kseno içermeyen matris VitroGel'in dört versiyonu kullanıldı: ORGANOID 1 (Matris 4-O1), ORGANOID 2 (Matris 4-O2), ORGANOID 3 (Matris 4-O3), ORGANOID 4 (Matris 4-O4). Ayrıca, organoidler için optimize edilmiş hayvan türevli matrisler kullanıldı: Matrigel Yüksek Konsantrasyon (Matris 1-ABO) ve Cultrex Tip 2 (Matris 3-ABO). Piyasada bulunan kök hücre kültür ortamı (mTeSR Plus) ve organoid farklılaşma kiti (STEMdiff intestinal organoid kit) kullanıldı. Bu protokol, okuyucuyu belirli iPSC ve organoid çalışmaları için ECM'nin başarılı bir şekilde optimizasyonuna yönlendirmek için ürün üreticilerinin bireysel talimatlarını laboratuvar deneyimleriyle birleştirir. Toplamda, bu protokol ve temsili sonuçlar, kök hücre çalışması ve organoid farklılaşması için en uygun mikro ortamın seçilmesinin önemini vurgulamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. hiPSC bakımı

DİKKAT: Tüm çalışmalar, standart aseptik teknikler izlenerek bir Biyogüvenlik Kabininde (BSC) yapılır. Laboratuvar önlükleri, eldivenler ve gözlükler gibi kişisel koruyucu ekipmanların uygun kullanımı da dahil olmak üzere laboratuvarlar için OSHA güvenlik standartlarına uymalıdır.

  1. Matrislerin, alikotların ve hücre kültürü ortamlarının hazırlanması
    1. Ticari olarak temin edilebilen hayvan kaynaklı bazal membranlar (BM'ler; Matris 1-AB, Matris 2-AB, Matris 3-AB), Tablo 1'de özetlenen üreticinin tavsiyesine göre çalışma hacimlerinin alikotlarını hazırlayın ve uzun süreli depolama için -20 °C veya -80 °C'de saklayın. Kabarcık oluşumundan kaçının. Bazı kabarcıklar oluşursa, saklamadan önce, köpüğü yüzeye çıkmaya zorlamak için numuneleri 4 °C'de, <200 x g'da ~1-2 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Tek kullanımlık alikotlar yapmak, ECM mimarisini bozan tekrarlanan donma-çözülme döngülerinin önlenmesine yardımcı olur. BM konsantrasyonu lot numarasına göre değiştiğinden, tek kullanımlık alikotlar hazırlamak ve kaplama çözeltileri yapmak için üreticinin tavsiyesine uyduğunuzdan emin olun. Yüksek konsantrasyonlu BM'ler viskozdur ve pipetlenmesi zordur; daha önce -20 °C'de saklanmış soğuk uçları kullanın.
    2. Üreticinin tavsiyesine göre kök hücre kültürü ortamını hazırlayın. Bu protokolde kullanılan ticari olarak temin edilebilen spesifik komple besiyerini hazırlamak için, 400 mL bazal besiyerine 100 mL 5x takviye kokteyli ekleyin. Daha sonra, bu ortamı iyice karıştırın ve 20 ° C'de saklanan 40 mL'lik hacimlere ayırın. Kullanım için, tam ortamın her bir alikotunu çözün, alıntılanan tam ortamı hemen kullanın veya 2 - 8 ° C'de 2 haftaya kadar saklayın. Tekrar dondurmayın.
    3. Matrix 4-XE Hidrojeli hazırlamak için takviye kokteylinin konsantrasyonunun 3 katını içeren kök hücre tam ortamının alikotlarını hazırlayın, yani 5x takviyeyi 3x'e seyreltin.
  2. Doku kültürü plastiğinin hayvansal kaynaklı BM'lerle kaplanması (Matrix 1-3AB)
    1. Başlamadan önce aşağıdakileri hazırlayın: Jelleşmelerini önlemek için matrisleri çözdürürken ve tutarken daima buzda tutun. Seyreltilmiş matrisleri hazırlamak için soğuk ortam kullanın. Başlamadan önce ve hiPSC farklılaşma sürecinin ve hIO organoid oluşumunun her aşamasında hücreleri test etmek için koşul başına yeterli sayıda çoğaltma kuyusu hazırlayın.
      NOT: Burada, bu çalışma için 24 oyuklu plakalar kullanılmıştır. Diğer plaka boyutları için önerilen kaplama hacimleri için Tablo 2'ye bakın.
    2. Her matris tipi için, 50 mL'lik konik bir tüpte 15 mM HEPES içeren 25 mL soğuk avans DMEM / F-12 hazırlayın. Bunları buz üzerinde tutun.
    3. Çözülmüş matrisleri ilgili soğuk avans DMEM / F-12'ye ekleyin ve iyice karıştırın. Karıştırma işlemi sırasında ortamı soğuk tutun. Topak olmadığından emin olarak homojen karışım olup olmadığını görsel olarak kontrol edin.
    4. Kullanım için seçilen her bir kuyuyu kaplamak için hemen seyreltilmiş matris çözeltilerini kullanın (24 oyuklu plaka kullanılıyorsa 250 μL/kuyu).
    5. Kaplama solüsyonunu yüzeye eşit şekilde yaymak için kültür kabını hafifçe eğin. Kullanmadan önce oda sıcaklığında (15 - 25 °C) en az 1 saat inkübe edin.
      NOT: Hemen kullanılmazsa, plaka kaplamadan sonra 2 - 8 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir, ancak buharlaşmayı önlemek için şeffaf bir film ile kapatılmalıdır. Saklanan plakaları kullanırken, bir sonraki adıma geçmeden önce 30 dakika oda sıcaklığına (15 - 25 °C) ulaşmalarına izin verin.
    6. Fazla çözeltiyi serolojik bir pipet kullanarak veya aspirasyonla nazikçe çıkarın. Kaplanmış yüzeyin çizilmediğinden emin olun.
    7. Hemen ılık tam kök hücre ortamını ekleyin (belirli bir kuyucuk için gereken toplam hacmin% 50'si, ör. 24 oyuklu bir plaka kullanılıyorsa 250 μL / kuyu).
  3. Doku kültürü plastiğinin Matrix 4-XE hidrojel ile kaplanması
    1. Başlamadan önce aşağıdakileri hazırlayın: Matrix 4-XE hidrojeli buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına (25 °C) ısınmaya bırakın. Başlamadan önce ve hiPSC farklılaşma sürecinin ve hIO organoid oluşumunun her aşamasında hücreleri test etmek için koşul başına yeterli sayıda çoğaltma kuyusu hazırlayın.
      NOT: Burada, bu çalışma için 24 oyuklu plakalar kullanılmıştır. Diğer plaka boyutları için önerilen kaplama hacimleri için Tablo 3'e bakın.
    2. Kök hücre kültürü için standart formülasyona (3x kök hücre ortamı) kıyasla 3x büyüme faktörü konsantrasyonu içeren eksiksiz bir kök hücre kültürü ortamı hazırlayın.
    3. Matrix 4-XE hidrojel ve 3x kök hücre ortamını 2:1 v/v karıştırma oranında karıştırın ve iyice karıştırmak için 5x-10x yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin.
    4. Hidrojel karışımını bir kuyu plakasına aktarın ve karışımı yüzeye eşit şekilde yaymak için kültür kabını dikkatlice eğin. 24 oyuklu bir plaka kullanıyorsanız 250 μL/kuyu kullanın. Önerilen hacimler için Tablo 3'e bakın.
    5. Yumuşak jel oluşumu için oda sıcaklığında 10-15 dakika bekleyin. Hidrojel oluşturma işlemi sırasında, plakayı eğerek veya sallayarak hidrojeli bozmayın.
  4. hiPSC enzim içermeyen küme geçişi ve tohumlama
    1. Başlamadan önce aşağıdakileri hazırlayın: geçmeden en az 1 saat önce, istenen plastik malzemeleri matrislerle kaplayın. Yeterli miktarda tam kök hücre besiyeri bulundurun ve oda sıcaklığına (15 - 25 °C) ısıtın. Tüm ortam için birden fazla ısıtma döngüsünden kaçının.
      NOT: Aşağıdaki adımlar, halihazırda kurulmuş ve% >90 birleşik bir iPSC kültürünün 6 oyuklu bir plaka üzerinde geçişini ve bağırsak organoidlerinin farklılaşması için bunların 24 oyuklu plakalara tohumlanmasını açıklamaktadır.
    2. Hücreleri 1 mL D-PBS (Ca++ ve Mg++ olmadan) ile durulayın ve aspire edin. 1 mL enzim içermeyen insan pluripotent kök hücre seçimi reaktifi ekleyin, eşit şekilde yaymak için dikkatlice döndürün ve 1 dakika içinde aspire edin. Kolonilerin sadece ince bir sıvı tabakasına maruz bırakılması gerekir.
    3. Koloniler daha az sıkıştırılmış görünmeye başlayana kadar 37 °C'de inkübe edin, bu ~ 3-8 dakika sürecektir.
      NOT: Optimum inkübasyon süresi, kullanılan hücre hattına bağlı olarak değişebilir. En uygun inkübasyon süresi, her bir hücre hattını enzim içermeyen insan pluripotent kök hücre seçim reaktifi ile ilk kez geçirirken belirlenmelidir.
    4. 1 mL tam kök hücre besiyeri ekleyin. Plakanın yan tarafına dikkatlice vurarak kolonileri ayırın. Plakayı diğer elinizle tuttuğunuzdan emin olun.
    5. 1 mL veya daha büyük bir pipetle, hücre kümeleri süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Parlak alan mikroskobu kullanarak kümelerin boyutunu değerlendirin ve hücre kümesinin boyutunun 50-200 μm arasında olduğundan emin olun; Daha büyüklerse, parçalamak için konik boruyu hafifçe sallayın.
    6. Yığın sayımı için kullanılacak düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun dibine bir xy ızgarası çizin ve kuyucukların her birine 50 μL D-PBS ekleyin. 3 kuyudan sayılan kümelerin ortalamasının alınması tavsiye edilir.
    7. Tüpü hafifçe sallayarak hücre kümelerinin eşit olarak dağıldığından emin olun ve ardından düz tabanlı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 5 μL küme süspansiyonu aktarın.
      NOT: Kümeleri saymak için otomatik hücre sayacı kullanılması önerilmez. Manuel sayım önerilir.
    8. Çapı 50 - 200 μm olan her kuyucuğun toplam küme sayısını sayın. Çoğu hücre kümesinin çapı > 200 μm ise (bkz. Şekil 1), 1.4.5 - 1.4.7 adımlarını tekrarlayın.
    9. 6.000 kümeyi tohumlamak için gereken yığın süspansiyonunun hacmini (μL cinsinden) aşağıdaki gibi hesaplayın:
      figure-protocol-1



figure-protocol-2

















figure-protocol-3


Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolü takiben, hiPSC hücrelerini yetiştirmek ve bunları hIO'ya farklılaştırmak için ticari olarak temin edilebilen bazal membranlar ve kseno içermeyen bir hidrojel sistemi başarıyla kullanıldı. Bu deneylerin temel amacı, hiPSC ve hIO çalışmaları için çeşitli kaynaklardan alınan matrislerin eşdeğerliğini sistematik olarak değerlendirmekti. Bu protokolün ilk bölümü, verimli bir bağırsak organoid üretimi sağlayan sağlıklı bir iPSC kültürünün sürdürülmesi ve karakterizasyonuna odaklandı. Kültür kabının hayvansal türev...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kök hücre ve organoid çalışmaları için en uygun mikro ortamın seçilmesi, bu platformları çok çeşitli uygulamalar için kullanırken çok önemli bir erken adımdır. Temsili sonuçlarımız, Matrix 4-XFO3'ün daha yüksek konsantrasyonda büyüme faktörleri ile kombinasyon halinde daha büyük organoidlere yol açtığını göstermektedir, bu da kseno içermeyen hidrojellerin fiziksel özelliklerinin bu sistemler kullanılarak organoid üretimini optimize etmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir. Hücre dışı matrisin (ECM) benzersiz özell...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Dr. John Huang, TheWell Bioscience'ın kurucusu ve CEO'sudur.

Teşekkürler

Yazarlar, Dr. Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano ve Russell D'Souza'dan hiPSC ve organoid çalışmalarına başlama ile ilgili önceki eğitimleri ve genel önerileri kabul etmektedir. İn vitro hücre kültürü çalışmaları için hidrojel sistemlerini kullanma konusundaki rehberliği için Dr. Chelsey Simmons'a teşekkür ederler. Ayrıca yazarlar, STEMCELL Technologies'den Dr. Christine Rodriguez ve Thomas Allison'a hiPSC kültürü konusundaki rehberlikleri için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca yayın maliyetlerini karşıladığı için TheWell Bioscience'a teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 Kuyulu Plaka (Kültürle işlenmiş, steril)Falcon353504
37 & derece; C su banyosuVWR
96 kuyulu plaka Fisher ScientificFB012931
İleri DMEM/F12Yaşam Teknolojileri12634
Yapışma Önleyici Durulama ÇözümüSTEMCELL Teknolojileri7010
Biyolojik güvenlik kabini (BSC)Labconco Mantık
Parlak Alan MikroskobuEcho RebelREB-01-E2
BXS0116ATCCACS-1030
Sıcaklık kontrollü Santrifüj (4 &�; C yetenekleri)ThermoScientific75002441
Konik tüpler, 15 mL, sterilThermo Fisher Scientific339650
Konik tüpler, 50 mL, sterilThermo Fisher Scientific339652
Cultrex RGF BME, Tip 2Bio-techne3533-005-02
Cultrex Kök Hücre Nitelikli RGF BME Bio-techne3434-010-02
D-PBS (Ca++ ve Mg++ olmadan)Thermo Fisher Scientific14190144
GeltrexLDEV İçermeyen, hESC Nitelikli Büyüme Faktörünü AzaltGibco A14133-02
GlutaMAX TakviyesiThermo Fischer Scientific35050-061
Guava Muse Hücre Analiz Cihazı veya başka bir akış sitometri ekipmanı (isteğe bağlı)Luminex0500-3115
HEPES tampon çözeltisiThermo Fischer Scientific15630-056
Heralcell Vios Hücre kültürü inkübatörü (37 &derece; C, %5 CO2)Thermo Scientific 
JMP SoftwareSAS InstituteJMP 16
MATLABMathWorks, IncR2022b
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bodrum Membran Matrisi LDEV içermezCorning 
Matrigel Matrisi Yüksek Konsantrasyon (HC), Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) LDEV'sizCorning 
mTeSR Plus OrtaKÖK HÜCRE Teknolojileri100-0276
Nunclon Delta yüzey işlem görmüş 24 oyuklu plakaThermo Scientific144530
PE Fare Anti-insan CD326 (EpCAM)BD Pharmingen566841
PE Fare Anti-insan CDX2 BD Pharmingen563428
PE Fare Anti-insan FOXA2BD Pharmingen561589
PerCP-Cy 5.5 Fare Anti-insan SSEA4 BD Pharmingen561565
ReLeSRSTEMCELL5872
SCTi003-ASTEMCELL Technologies200-0510
Serolojik pipetler (10 mL) Fisher Scientific13-678-11E
Serolojik pipetler (5 mL) Fisher Scientific13-678-11D
STEMdiff Bağırsak Organoid Büyüme OrtamıKÖK HÜCRE Teknolojileri5145
STEMdiff Bağırsak Organoid KitiKÖK HÜCRE Teknolojileri5140
Vitrojel Hidrojel MatrisiTheWell BioscienceVHM01
VitroGel ORGANOID Keşif KitiTheWell BioscienceVHM04-K
51033775356231354263

Kaynaklar

  1. Hynes, R. O. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, Pt 24 4195-4200 (2010).
  3. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biol Rep. 2, 78(2010).
  4. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).
  5. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  6. Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
  7. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  8. Tran, O. N., et al. Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306(2022).
  9. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  10. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  11. Gjorevski, N., et al. Tissue geometry drives deterministic organoid patterning. Science. 375 (6576), (2022).
  12. Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. Engineering the extracellular matrix for organoid culture. Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).
  13. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  16. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  17. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  18. Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing. Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).
  19. Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf (2024).
  20. biotechne R&D Systems. Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor. biotechne R&D Systems. , (2024).
  21. VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience. , Available from: https://www.thewellbio.com/video-protocols (2024).
  22. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  23. Henderson, J. K., et al. Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens. Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).
  24. Haruna, N. F., Huang, J. Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture. J Cytol Tissue Biol. 7, 30(2020).
  25. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891(2021).
  26. Stewart, D. C., et al. Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease. PLoS One. 13, e0200377(2018).
  27. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125(2020).
  28. Broguiere, N., et al. Growth of epithelial organoids in a defined hydrogel. Adv Mater. 30, 1801621(2018).
  29. Barthes, J., et al. Cell microenvironment engineering and monitoring for tissue engineering and regenerative medicine: The recent advances. BioMed Res Int. 2014, 921905(2014).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  31. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

İnsan Kök HücreleriBağırsak OrganoidleriXenogen-Free HidrojelHücre Dışı MatriksOrganoid Kültürüİndüklenmiş Pluripotent Kök HücrelerOrganoid Diferansiyasyonu
İnsan Kök Hücre Bakımı ve Bağırsak Organoid Üretimi için Bazal Membran Matrislerinin Karşılaştırmalı Çalışması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.