Method Article

İnsan Kök Hücre Bakımı ve Bağırsak Organoid Üretimi için Bazal Membran Matrislerinin Karşılaştırmalı Çalışması

DOI:

10.3791/66277

⸱

March 15th, 2024

 ,  ,  , 
1Center for Pharmacometrics & Systems Pharmacology, Department of Pharmaceutics, University of Florida, 2TheWell Bioscience, Inc

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidler, hastalık modellemesi için değerli araçlar haline geldi. Hücre dışı matris (ECM), organoid üretimi sırasında hücre kaderini yönlendirir ve doğal dokuya benzeyen bir sistem kullanmak model doğruluğunu artırabilir. Bu çalışma, hayvan kaynaklı ECM ve kseno içermeyen hidrojellerde indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilmiş insan bağırsak organoidlerinin üretimini karşılaştırmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı matriks (ECM), hücre davranışı ve gelişiminde kritik bir rol oynar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) üretilen organoidler birçok araştırma alanının ilgi odağındadır. Bununla birlikte, klasik hücre kültürü materyallerinde fizyolojik ipuçlarının olmaması, verimli iPSC farklılaşmasını engellemektedir. Ticari olarak temin edilebilen ECM'nin kök hücre kültürüne dahil edilmesi, hücre bakımı için faydalı fiziksel ve kimyasal ipuçları sağlar. Hayvansal kaynaklı ticari olarak temin edilebilen bazal membran ürünleri, hücre bakımını destekleyen ECM proteinleri ve büyüme faktörlerinden oluşur. ECM, hücre kaderini modüle edebilen dokuya özgü özelliklere sahip olduğundan, klinik çalışmalara translasyonu sağlamak için kseno içermeyen matrisler kullanılır. Ticari olarak temin edilebilen matrisler hiPSC ve organoid çalışmalarında yaygın olarak kullanılırken, bu matrislerin eşdeğerliği henüz değerlendirilmemiştir. Burada, dört farklı matriste hiPSC idame ve insan bağırsak organoidleri (hIO) oluşumunun karşılaştırmalı bir çalışması yapılmıştır: Matrigel (Matris 1-AB), Geltrex (Matris 2-AB), Cultrex (Matris 3-AB) ve VitroGel (Matris 4-XF). Koloniler mükemmel yuvarlak bir şekle sahip olmasalar da, hücrelerin %85'inden fazlasının kök hücre markörü SSEA-4'ü eksprese etmesiyle minimal spontan farklılaşma vardı. Matrix 4-XF, 3D yuvarlak kümelerin oluşumuna yol açtı. Ayrıca, Matrix 4-XF hidrojel çözeltisini yapmak için kullanılan ortamdaki takviye ve büyüme faktörlerinin konsantrasyonunun arttırılması, SSEA-4'ün hiPSC ekspresyonunu 1.3 kat iyileştirdi. Matris 2-AB ile korunan hiPSC'nin farklılaşması, diğer hayvan türevli bazal membranlara kıyasla orta/arka bağırsak aşamasında daha az sferoid salınımına yol açtı. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, kseno içermeyen organoid matris (Matris 4-O3) daha büyük ve daha olgun hIO'ya yol açar, bu da kseno içermeyen hidrojellerin fiziksel özelliklerinin organoid oluşumunu optimize etmek için kullanılabileceğini düşündürür. Toplamda, sonuçlar, farklı matrislerin bileşimindeki varyasyonların IO farklılaşmasının aşamalarını etkilediğini göstermektedir. Bu çalışma, ticari olarak temin edilebilen matrislerdeki farklılıklar hakkında farkındalık yaratır ve iPSC ve IO çalışmaları sırasında matris optimizasyonu için bir kılavuz sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı matriks (ECM), hücre davranışını ve gelişimini düzenlemede merkezi bir rol oynayan dokuların dinamik ve çok işlevli bir bileşenidir. Karmaşık bir ağ olarak, yapısal destek, hücre yapışkan ligandları1 ve hücre sinyallemesini düzenleyen büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin depolanmasını sağlar. Örneğin, yara iyileşmesi sırasında, ECM, göç eden hücreler için bir iskele görevi görür ve doku onarımında yer alan büyüme faktörlerinin bir rezervuarı olarak işlev görür2. Benzer şekilde, ECM'deki düzensizlik, fibroz ve kanser gibi çeşitli hastalıkların şiddetinde bir artışa yol açabilir 3,4. Embriyonik gelişim sırasında, ECM doku morfogenezine rehberlik eder. Örneğin, kalbin gelişiminde, ECM bileşenleri kalp dokusunun doğru mimarisini ve işlevini oluşturmada rol oynar5. On yıldan fazla bir süredir yapılan araştırmalar, mikro çevrenin sertliğinintek başına 6,7'nin kök hücre soy spesifikasyonunu kontrol edebileceğini göstermiştir. Bu nedenle, in vitro hücre farklılaşması sırasında ECM'nin farklılaşma için sinyaller sağlayarak kök hücre kaderini etkilemesi şaşırtıcı değildir.

Organoidler, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) üretilebilir. Organoidleri başarılı bir şekilde oluşturmak için uygun şekilde karakterize edilmiş bir iPSC hattı ile başlamak gerekir. Bununla birlikte, klasik hücre kültürü materyallerinde fizyolojik ipuçlarının eksikliği, verimli iPSC farklılaşmasını ve organoid oluşumunu engeller. Ayrıca, son araştırmalar, organoid genişleme ve farklılaşma 12 bağlamında hücre dışı matrisin (ECM) bileşiminin, hücreler ve ECM8 arasındaki etkileşimlerin yanı sıra mekanik ve geometrik ipuçlarının 9,10,11 önemini vurgulamıştır. Tekrarlanabilirliği artırarak organoid teknolojisini ilerletmek, dokuya özgü fiziksel ve kimyasal ipuçlarının dahil edilmesini içerecektir.

Organoidler, doğal dokuyu fizyolojik olarak benzer bir mikro çevre içinde özetlemeyi amaçlar. Doğal doku ECM'sini yakından taklit eden bir ECM sistemi seçmek, hücre davranışı, işlevi ve uyaranlara yanıt ile ilgili fizyolojik alaka düzeyini elde etmek için çok önemlidir13. ECM bileşenlerinin seçimi, kök hücrelerin organoid içindeki belirli hücre tiplerine farklılaşmasını etkileyebilir. Farklı ECM proteinleri ve bunların kombinasyonları, hücre kaderini yönlendiren ipuçları sağlayabilir14. Örneğin, çalışmalar, spesifik ECM bileşenlerinin kullanılmasının, bağırsak kök hücrelerinin olgun bağırsak hücre tiplerine farklılaşmasını teşvik edebileceğini ve bunun fizyolojik olarak ilgili bağırsak organoidleri ile sonuçlanabileceğini göstermiştir15. Organoidler, hastalık modellemesi ve ilaç testi sırasında değerli bir araç olsa da, uygun bir ECM sisteminin seçilmesi bu uygulama için çok önemlidir. Uygun bir ECM sistemi, etkilenen dokuya benzeyen bir mikro çevre yaratarak hastalık modellemesinin doğruluğunu artırabilir16. Ayrıca, dokuya özgü ECM, hastalıkla ilişkili fenotipleri ve ilaç yanıtlarını daha iyi özetleyen organoidlerin üretilmesine yardımcı olabilir17. Organoid farklılaşmasında kullanılan ECM sisteminin optimize edilmesi, istenen farklılaşma sonuçlarının elde edilmesi için kritik öneme sahiptir.

Hayvansal ECM kaynaklarından (örneğin, Matrigel, Cultrex) ve kseno içermeyen hidrojelden (örneğin, VitroGel) türetilen ticari olarak temin edilebilen bazal membran sistemleri, iPSC ve organoid araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunları ticarileştiren şirketler ve bunları kullanan araştırmacılar, yıllar boyunca kendi özel ürünleri ve uygulamaları için birçok talimat ortaya koymuşlardır. Bu talimatların çoğu, bu protokolün oluşturulması için bir rehber görevi gördü. Ayrıca, içsel özellikleriyle ilişkili faydalar ve aksilikler birçok 18,19,20,21 tarafından ayrı ayrı belirtilmiştir. Bununla birlikte, iPSC ve organoid çalışmaları için en uygun sistemlerin seçimine rehberlik edecek sistematik bir iş akışı yoktur. Burada, iPSC ve organoid çalışmaları için çeşitli kaynaklardan ECM sistemlerinin eşdeğerliğini sistematik olarak değerlendirmek için bir iş akışı sağlanmaktadır. Bu, dört farklı matriste iki farklı insan iPSC hattının (hiPSC) ve insan bağırsak organoidlerinin (hIO) oluşumunun sürdürülmesinin karşılaştırmalı bir çalışmasıdır: Matrigel (Matris 1-AB), Geltrex (Matris 2-AB), Cultrex (Matris 3-AB) ve VitroGel (Matris 4-XF). Organoid kültür için, daha önce organoid kültür için optimize edilmiş kseno içermeyen matris VitroGel'in dört versiyonu kullanıldı: ORGANOID 1 (Matris 4-O1), ORGANOID 2 (Matris 4-O2), ORGANOID 3 (Matris 4-O3), ORGANOID 4 (Matris 4-O4). Ayrıca, organoidler için optimize edilmiş hayvan türevli matrisler kullanıldı: Matrigel Yüksek Konsantrasyon (Matris 1-ABO) ve Cultrex Tip 2 (Matris 3-ABO). Piyasada bulunan kök hücre kültür ortamı (mTeSR Plus) ve organoid farklılaşma kiti (STEMdiff intestinal organoid kit) kullanıldı. Bu protokol, okuyucuyu belirli iPSC ve organoid çalışmaları için ECM'nin başarılı bir şekilde optimizasyonuna yönlendirmek için ürün üreticilerinin bireysel talimatlarını laboratuvar deneyimleriyle birleştirir. Toplamda, bu protokol ve temsili sonuçlar, kök hücre çalışması ve organoid farklılaşması için en uygun mikro ortamın seçilmesinin önemini vurgulamaktadır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hiPSC bakımı

DİKKAT: Tüm çalışmalar, standart aseptik teknikler izlenerek bir Biyogüvenlik Kabininde (BSC) yapılır. Laboratuvar önlükleri, eldivenler ve gözlükler gibi kişisel koruyucu ekipmanların uygun kullanımı da dahil olmak üzere laboratuvarlar için OSHA güvenlik standartlarına uymalıdır.

  1. Matrislerin, alikotların ve hücre kültürü ortamlarının hazırlanması
    1. Ticari olarak temin edilebilen hayvan kaynaklı bazal membranlar (BM'ler; Matris 1-AB, Matris 2-AB, Matris 3-AB), Tablo 1'de özetlenen üreticinin tavsiyesine göre çalışma hacimlerinin alikotlarını hazırlayın ve uzun süreli depolama için -20 °C veya -80 °C'de saklayın. Kabarcık oluşumundan kaçının. Bazı kabarcıklar oluşursa, saklamadan önce, köpüğü yüzeye çıkmaya zorlamak için numuneleri 4 °C'de, <200 x g'da ~1-2 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Tek kullanımlık alikotlar yapmak, ECM mimarisini bozan tekrarlanan donma-çözülme döngülerinin önlenmesine yardımcı olur. BM konsantrasyonu lot numarasına göre değiştiğinden, tek kullanımlık alikotlar hazırlamak ve kaplama çözeltileri yapmak için üreticinin tavsiyesine uyduğunuzdan emin olun. Yüksek konsantrasyonlu BM'ler viskozdur ve pipetlenmesi zordur; daha önce -20 °C'de saklanmış soğuk uçları kullanın.
    2. Üreticinin tavsiyesine göre kök hücre kültürü ortamını hazırlayın. Bu protokolde kullanılan ticari olarak temin edilebilen spesifik komple besiyerini hazırlamak için, 400 mL bazal besiyerine 100 mL 5x takviye kokteyli ekleyin. Daha sonra, bu ortamı iyice karıştırın ve 20 ° C'de saklanan 40 mL'lik hacimlere ayırın. Kullanım için, tam ortamın her bir alikotunu çözün, alıntılanan tam ortamı hemen kullanın veya 2 - 8 ° C'de 2 haftaya kadar saklayın. Tekrar dondurmayın.
    3. Matrix 4-XE Hidrojeli hazırlamak için takviye kokteylinin konsantrasyonunun 3 katını içeren kök hücre tam ortamının alikotlarını hazırlayın, yani 5x takviyeyi 3x'e seyreltin.
  2. Doku kültürü plastiğinin hayvansal kaynaklı BM'lerle kaplanması (Matrix 1-3AB)
    1. Başlamadan önce aşağıdakileri hazırlayın: Jelleşmelerini önlemek için matrisleri çözdürürken ve tutarken daima buzda tutun. Seyreltilmiş matrisleri hazırlamak için soğuk ortam kullanın. Başlamadan önce ve hiPSC farklılaşma sürecinin ve hIO organoid oluşumunun her aşamasında hücreleri test etmek için koşul başına yeterli sayıda çoğaltma kuyusu hazırlayın.
      NOT: Burada, bu çalışma için 24 oyuklu plakalar kullanılmıştır. Diğer plaka boyutları için önerilen kaplama hacimleri için Tablo 2'ye bakın.
    2. Her matris tipi için, 50 mL'lik konik bir tüpte 15 mM HEPES içeren 25 mL soğuk avans DMEM / F-12 hazırlayın. Bunları buz üzerinde tutun.
    3. Çözülmüş matrisleri ilgili soğuk avans DMEM / F-12'ye ekleyin ve iyice karıştırın. Karıştırma işlemi sırasında ortamı soğuk tutun. Topak olmadığından emin olarak homojen karışım olup olmadığını görsel olarak kontrol edin.
    4. Kullanım için seçilen her bir kuyuyu kaplamak için hemen seyreltilmiş matris çözeltilerini kullanın (24 oyuklu plaka kullanılıyorsa 250 μL/kuyu).
    5. Kaplama solüsyonunu yüzeye eşit şekilde yaymak için kültür kabını hafifçe eğin. Kullanmadan önce oda sıcaklığında (15 - 25 °C) en az 1 saat inkübe edin.
      NOT: Hemen kullanılmazsa, plaka kaplamadan sonra 2 - 8 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir, ancak buharlaşmayı önlemek için şeffaf bir film ile kapatılmalıdır. Saklanan plakaları kullanırken, bir sonraki adıma geçmeden önce 30 dakika oda sıcaklığına (15 - 25 °C) ulaşmalarına izin verin.
    6. Fazla çözeltiyi serolojik bir pipet kullanarak veya aspirasyonla nazikçe çıkarın. Kaplanmış yüzeyin çizilmediğinden emin olun.
    7. Hemen ılık tam kök hücre ortamını ekleyin (belirli bir kuyucuk için gereken toplam hacmin% 50'si, ör. 24 oyuklu bir plaka kullanılıyorsa 250 μL / kuyu).
  3. Doku kültürü plastiğinin Matrix 4-XE hidrojel ile kaplanması
    1. Başlamadan önce aşağıdakileri hazırlayın: Matrix 4-XE hidrojeli buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına (25 °C) ısınmaya bırakın. Başlamadan önce ve hiPSC farklılaşma sürecinin ve hIO organoid oluşumunun her aşamasında hücreleri test etmek için koşul başına yeterli sayıda çoğaltma kuyusu hazırlayın.
      NOT: Burada, bu çalışma için 24 oyuklu plakalar kullanılmıştır. Diğer plaka boyutları için önerilen kaplama hacimleri için Tablo 3'e bakın.
    2. Kök hücre kültürü için standart formülasyona (3x kök hücre ortamı) kıyasla 3x büyüme faktörü konsantrasyonu içeren eksiksiz bir kök hücre kültürü ortamı hazırlayın.
    3. Matrix 4-XE hidrojel ve 3x kök hücre ortamını 2:1 v/v karıştırma oranında karıştırın ve iyice karıştırmak için 5x-10x yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin.
    4. Hidrojel karışımını bir kuyu plakasına aktarın ve karışımı yüzeye eşit şekilde yaymak için kültür kabını dikkatlice eğin. 24 oyuklu bir plaka kullanıyorsanız 250 μL/kuyu kullanın. Önerilen hacimler için Tablo 3'e bakın.
    5. Yumuşak jel oluşumu için oda sıcaklığında 10-15 dakika bekleyin. Hidrojel oluşturma işlemi sırasında, plakayı eğerek veya sallayarak hidrojeli bozmayın.
  4. hiPSC enzim içermeyen küme geçişi ve tohumlama
    1. Başlamadan önce aşağıdakileri hazırlayın: geçmeden en az 1 saat önce, istenen plastik malzemeleri matrislerle kaplayın. Yeterli miktarda tam kök hücre besiyeri bulundurun ve oda sıcaklığına (15 - 25 °C) ısıtın. Tüm ortam için birden fazla ısıtma döngüsünden kaçının.
      NOT: Aşağıdaki adımlar, halihazırda kurulmuş ve% >90 birleşik bir iPSC kültürünün 6 oyuklu bir plaka üzerinde geçişini ve bağırsak organoidlerinin farklılaşması için bunların 24 oyuklu plakalara tohumlanmasını açıklamaktadır.
    2. Hücreleri 1 mL D-PBS (Ca++ ve Mg++ olmadan) ile durulayın ve aspire edin. 1 mL enzim içermeyen insan pluripotent kök hücre seçimi reaktifi ekleyin, eşit şekilde yaymak için dikkatlice döndürün ve 1 dakika içinde aspire edin. Kolonilerin sadece ince bir sıvı tabakasına maruz bırakılması gerekir.
    3. Koloniler daha az sıkıştırılmış görünmeye başlayana kadar 37 °C'de inkübe edin, bu ~ 3-8 dakika sürecektir.
      NOT: Optimum inkübasyon süresi, kullanılan hücre hattına bağlı olarak değişebilir. En uygun inkübasyon süresi, her bir hücre hattını enzim içermeyen insan pluripotent kök hücre seçim reaktifi ile ilk kez geçirirken belirlenmelidir.
    4. 1 mL tam kök hücre besiyeri ekleyin. Plakanın yan tarafına dikkatlice vurarak kolonileri ayırın. Plakayı diğer elinizle tuttuğunuzdan emin olun.
    5. 1 mL veya daha büyük bir pipetle, hücre kümeleri süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Parlak alan mikroskobu kullanarak kümelerin boyutunu değerlendirin ve hücre kümesinin boyutunun 50-200 μm arasında olduğundan emin olun; Daha büyüklerse, parçalamak için konik boruyu hafifçe sallayın.
    6. Yığın sayımı için kullanılacak düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun dibine bir xy ızgarası çizin ve kuyucukların her birine 50 μL D-PBS ekleyin. 3 kuyudan sayılan kümelerin ortalamasının alınması tavsiye edilir.
    7. Tüpü hafifçe sallayarak hücre kümelerinin eşit olarak dağıldığından emin olun ve ardından düz tabanlı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 5 μL küme süspansiyonu aktarın.
      NOT: Kümeleri saymak için otomatik hücre sayacı kullanılması önerilmez. Manuel sayım önerilir.
    8. Çapı 50 - 200 μm olan her kuyucuğun toplam küme sayısını sayın. Çoğu hücre kümesinin çapı > 200 μm ise (bkz. Şekil 1), 1.4.5 - 1.4.7 adımlarını tekrarlayın.
    9. 6.000 kümeyi tohumlamak için gereken yığın süspansiyonunun hacmini (μL cinsinden) aşağıdaki gibi hesaplayın:
      figure-protocol-1



figure-protocol-2

















figure-protocol-3


Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolü takiben, hiPSC hücrelerini yetiştirmek ve bunları hIO'ya farklılaştırmak için ticari olarak temin edilebilen bazal membranlar ve kseno içermeyen bir hidrojel sistemi başarıyla kullanıldı. Bu deneylerin temel amacı, hiPSC ve hIO çalışmaları için çeşitli kaynaklardan alınan matrislerin eşdeğerliğini sistematik olarak değerlendirmekti. Bu protokolün ilk bölümü, verimli bir bağırsak organoid üretimi sağlayan sağlıklı bir iPSC kültürünün sürdürülmesi ve karakterizasyonuna odaklandı. Kültür kabının hayvansal türevli matrisler Matrix 1-AB, Matrix 2-AB ve Matrix 3-AB ile kaplanması işlemi tarif edildi ve kseno içermeyen bir hidrojel sistemi Matrix 4-XF ile karşılaştırıldı.

Şekil 3A'da gösterildiği gibi, hiPSC'ler BXS 0116 (CD34 + türetilmiş), üç hayvan türevli matris üzerinde kültürlendiğinde karşılaştırılabilir morfoloji gösterir. Bununla birlikte, BXS 0116 hücre hattının Matris 003-AB kaplı kuyucuklarda kültürlenen SCTi1-A (PBMC türevi) ile karşılaştırılması, hücre hatları arasındaki içsel farklılıkların (Tablo 6'da gösterilmiştir) hücre çoğalması, farklılaşması ve morfolojisi ile ilgili varyasyonlara yol açabileceğini vurgulamaktadır. Örneğin, SCTi003-A hücre hatları için DE oluşturmak 3 gün sürerken, BXS0116 hattı için 5 gün sürdü. Ayrıca, Şekil 3B-C'de gösterildiği gibi, hiPSC'lerin Matrix 4-XF hidrojel sistemlerinde kültürlenmesi, Matris 1-AB veya eşdeğer sistemlerle kaplanmış plakalar üzerindeki hiPSC kültürünün düz morfolojisinden büyük ölçüde farklı olan kısmen gömülü bir 3D kolonide kolonilerin oluşmasına yol açar. Ayrıca, bu deneylerden dikkat edilmesi gereken en önemli hususlardan biri, 3x büyüme faktörü kullanarak kseno içermeyen bir hidrojel sistemi yapmanın, hücre canlılığını ve kök hücre belirteçlerinin ekspresyonunu önemli ölçüde iyileştirebilmesidir. Toplamda, hayvan türevli matrisler ve 3x büyüme faktörü konsantrasyonu ile yapılan kseno içermeyen Matrix 4-XF üzerindeki hiPSC kültürleri, eşdeğer bir SSEA-4 (kök hücre markörü) ekspresyonuna yol açmıştır22; bununla birlikte, hidrojel sistemi, kısmen gömülü 3D kolonilerin oluşumunu teşvik eder.

Bu protokolün ikinci bölümü, hIO oluşturmak için hiPSC'lerin farklılaşmasına odaklanmaktadır. Burada, Spence ve ark.23'e dayalı olarak geliştirilen ticari olarak temin edilebilen bir kit, belirli endoderm (DE), daha sonra orta bağırsak/arka bağırsak (MH) olarak farklılaşmak ve son olarak IO'ya olgunlaşmak için sferoid toplamak için kullanıldı (Şekil 4C). Verimli bir IO üretimi için, farklılaşma protokolüne başlamadan önce hiPSC kültürünün minimum spontan farklılaşmaya sahip olduğunu incelemek çok önemlidir. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, DE farklılaşmasına başlarken SSEA-4 gibi kök hücre belirteçlerinin ekspresyonu ne kadar düşükse, süreç her aşamada o kadar az verimli olacaktır (yani, MH markörlerinin daha düşük ekspresyonu) ve ardından zayıf hIO üretimi. Kompakt bir tezgah üstü akış sitometri cihazının kullanılması, akış sitometrisi sonuçlarına hızlı erişimi ve bir sonraki aşamaya geçmeden önce farklılaşma kalitesi hakkında karar vermeyi kolaylaştırdı. Tuhaf bir gözlem, Matrix 2-AB tarafından sürdürülen hiPSC'nin, diğer hayvan kaynaklı sistemlere kıyasla orta bağırsak / arka bağırsak aşamasında daha az küresel salınımla sonuçlanmasıydı. Dikkat edilmesi gereken bir diğer önemli husus, Matrix 4-XF'de tutulan hiPSC kolonilerinin, farklılaşmanın başlangıcında zaten 3 boyutlu bir yapıya sahip olması nedeniyle, bu sistemlerin daha büyük sferoidlere yol açmasıdır.

Sferoidler Matris 1-ABO, Matris 3-ABO ve Matris 4-XFO1-Matris 4-XFO4'e gömüldü ve bir kit kullanılarak hIO'ya olgunlaştırıldı. 7 gün boyunca olgunlaşan sferoidlerden sonra, bunlar geçirildi ve ilgili matris sistemlerine gömüldü. Her sistemdeki organoidin büyümesi, parlak alan görüntülerinden 7 gün boyunca izlendi. Kültür, nispeten benzer büyüklükteki organoidlerle başlarken, 5 gün sonra, hIO boyutu, içine gömüldükleri matrisin bir fonksiyonu olarak değişti (Şekil 5). Dört Matrix 4-XFO'dan, daha büyük organoidlerle sonuçlanan formülasyon Matrix 4-XFO3 idi. Matrix 4-XFO sistemleri, çeşitli uygulamalara uyacak şekilde farklı ligandlar ve mekanik özelliklerle formüle edilmiştir24. Spesifik olarak, Matrix 4-XFO3 sertliği25, insan bağırsak sertliğine26 diğer Matrix 4-XFO formülasyonlarından daha yakındır, bu da ECM mekanik özelliklerinin organoid genişleme 12,27,28 üzerindeki rolü hakkındaki son bulguları destekler. Temsili sonuçlarımız, Matris 1-ABO ve Matris 3-ABO'nun bağırsak organoidlerinin büyümesini ve genişlemesini eşit derecede kolaylaştırdığını göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 3: iPSC bakımı için matris sisteminin seçilmesi. (A) Hayvanlardan elde edilen üç farklı matris sistemi ile kültür eşyası kaplaması üzerinde büyütülen iki hücre hattının temsili görüntüleri. (B) Matris 4-XF'nin kullanımını 1x ve 3x büyüme faktörü takviyesi ile karşılaştıran temsili görüntüler, artan büyüme faktörü takviyelerinin, Matris 4-XF hidrojel üzerindeki hiPSC'nin canlılığını artırdığını göstermektedir. (C) Matris 1-AB, Matris 3-AB, Matris 4-XF'nin (3X) SSEA-4 ekspresyonunun akış sitometrisi karşılaştırması eşdeğer ekspresyon gösterirken, Matrix 4-XF (1X) SSEA-4'ün daha düşük ekspresyonuna yol açmıştır. Çubuklar, n = 5'in ortalama ± SD'sini temsil eder; anlamlılık testi için iki yönlü varyans analizi ve nonparametrik Wilcoxon yöntemi ile post-hoc test kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 4: iPSC'yi belirli endoderm (DE) ve orta bağırsak/arka bağırsak (MH) olarak farklılaştırın . (A) Farklı SSEA4 markörü seviyeleriyle başlayan DE'ye iPSC farklılaşmasının temsili görüntüleri, yüksek kök hücre markörü ekspresyonuna sahip bir hiPSC popülasyonu ile farklılaşmaya başlamanın önemini vurgulamaktadır. Kırmızı oklar, DE'ye başlamadan önce kendiliğinden farklılaşma alanlarını gösterir. (B) Kötü bir DE farklılaşması (solda) ve iyi bir farklılaşma (sağda) için farklılaşmaya başlamadan önce kök hücre belirteci SSEA4 ekspresyonunun ve 3 günlük DE farklılaşmasından sonra DE belirteci FOXA2'nin akış sitometrisi analizi örneği. Her grafik, 1'den çıkarılan hücrelerin analizini temsil eder; İstatistiksel analiz için, en az 3 akış sitometrisi çalışmasından elde edilen sonuçların ortalamasının alınması önerilir. (C) İncelenen tüm matrislerde hIO'ya iPSC farklılaşmasının temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 5: Küresel gömme ve hIO olgunlaşması için matris sisteminin seçilmesi. (A) Matris 4-XFO 1-4'e gömülü hIO'nun olgunlaşmasının örnek görüntüleri. Matrix 4-XFO sistemlerinin elastik modülü 50-300 Pa civarındadır ve en yüksek olanı Matrix 4-XFO3 > Matrix 4-XFO4 > Matrix 4-XFO2 > Matrix 4-XFO1 için geçerlidir. Matris 1-ABO ve Matris 3-ABO sertliği, partiye bağlı olarak 440-800 Pa arasında değişir. (B) hIO'nun olgunlaşmasının örnek görüntüleri, gömme gününde (Gün 0) ve kültürden 1 hafta sonra (Gün 7) Matris 1-ABO, Matris 3-ABO ve Matris 4-XFO3'e gömüldü. (C) Farklı matris sistemlerinde olgunlaşan hIO'nun boyut karşılaştırmasını gösteren veriler. Çubuklar, n = 7'nin ortalama ± SD'sini temsil eder; anlamlılık testi için iki yönlü varyans analizi ve nonparametrik Wilcoxon yöntemi ile post-hoc test kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 6: Farklı matrislerde yetiştirilen bağırsak organoidlerinin temsili immünofloresan görüntüleri, epitel hücre popülasyonunu doğrulamaktadır. Farklı matrislerde büyütülen tüm bağırsak organoidleri, epitel hücre adezyon molekülü (EpCAM) (yeşil) ile sabitlendi ve boyandı ve hücre çekirdeği DAPI (mavi) için karşı boyandı. Tüm organoidler, organoidlerin dış yüzeyinde lokalize olan epitel hücre popülasyonunu doğrulayan EpCAM pozitif hücreler gösterir. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: iPSC için kullanılan kültür malzemelerini kaplamak için kullanılan matrislerin alikot hazırlanması, depolanması ve seyreltilmesinin özeti. * Doğru seyreltme faktörü için, her partinin Analiz Sertifikasındaki önerilen Seyreltme faktörünü ve/veya protein konsantrasyonlarını kontrol edin. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Kültür eşyası ve mTeSR Plus Medium'un yüzey alanı başına kaplama çözeltilerinin hacminin referans tablosu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Kültür kabının ve tam kök hücre ortamının yüzey alanı başına Matrix 4-XF öncü çözeltilerinin hacminin referans tablosu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 4: İşlem sırasında hiPSC ve hIO'yu karakterize etmek için önerilen yaygın belirteçlerin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 5: Bağırsak Organoidlerine hiPSC farklılaşması sırasında ihtiyaç duyulan ortamın özeti. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 6: Bu çalışmada kullanılan iki hiPSC hattı hakkında özel ayrıntılar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Belirli bir görüntü türüne göre değiştirmek için genel MATLAB Kodu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kök hücre ve organoid çalışmaları için en uygun mikro ortamın seçilmesi, bu platformları çok çeşitli uygulamalar için kullanırken çok önemli bir erken adımdır. Temsili sonuçlarımız, Matrix 4-XFO3'ün daha yüksek konsantrasyonda büyüme faktörleri ile kombinasyon halinde daha büyük organoidlere yol açtığını göstermektedir, bu da kseno içermeyen hidrojellerin fiziksel özelliklerinin bu sistemler kullanılarak organoid üretimini optimize etmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir. Hücre dışı matrisin (ECM) benzersiz özelliklerinin, organ12 içindeki hücrelerin kimliği ile yakından iç içe geçtiği daha önce gösterilmiştir. Hücreler integrinler ve diğer reseptörler aracılığıyla dış kuvvetleri algıladığından, ECM'nin mekanik özellikleri kök hücreleri derinden etkiler ve buna karşılık kök hücreler iç kuvvetler üretebilir12. Kök hücreler ve mikro çevreleri arasındaki etkileşimler, çeşitli sinyal yollarının başlatılmasında anahtardır12. Ek olarak, ECM'nin, hücre davranışını etkileyen büyüme faktörlerini ve diğer sinyal moleküllerini depolamak ve serbest bırakmak için bir rezervuar görevi görebileceği gösterilmiştir. Bu nedenle, temsili sonuçlarımız ve onlarca yıllık araştırmalarımız, in vitro araştırmalar için matris sistemlerini seçerken doğal hücre mikro çevresinin ve doku özelliklerinin biyokimyasal ve fiziksel yönlerini dikkate almanın önemini vurgulamaktadır29,30.

Kullanıcılara olası sorunlar ve bunlardan kaçınmanın yolları hakkında tavsiyelerde bulunmak için protokol aracılığıyla birkaç kritik adım ve öneri açıklandı. Bununla birlikte, bu yöntemlerde, bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için çok önemli olan iki kritik adım sunulmaktadır. İlk olarak, kök hücre popülasyonu ile ilişkili spesifik belirteçlerin kontrol edilmesi, kök hücre popülasyonunu verimli kontrollü farklılaşmaya hazır tutmak için en uygun kaplama sistemini belirlemek için çok önemlidir. Benzer şekilde, her bir farklılaşma adımıyla ilişkili belirteçlerin ifadesini doğrulamak, bir sonraki aşamaya ne zaman geçileceğine karar vermek için çok önemlidir. Bu protokol, her aşamada gereken minimum süre ile ilgili genel bir kılavuz sağlar. Bununla birlikte, her aşamadaki en uygun zaman, farklı hücre hatları ve deneysel koşullar (örneğin, genotip, sertlik) için değişecektir. Bu nedenle, birden fazla aşamaya özgü belirteçin karakterize edilmesi, hIO üretiminin verimliliğini artırmak için en iyi yaklaşımdır.

İkinci kritik adım, son derece önemli olan kseno içermeyen Matrix 4-XF sistemini kullanırken daha yüksek konsantrasyonda büyüme faktörleri eklemekti. Kseno içermeyen biyomateryal sistemlerinin sıklıkla vurgulanan bir sınırlaması, büyüme faktörlerinin eksikliğidir31. Bununla birlikte, bu zayıflık bir güç haline gelebilir: tekrarlanabilirliği artırmak için sistemlerdeki büyüme faktörlerinin tam kontrolü. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen bir medya ve büyüme faktörü takviye kitinin kullanılmasını açıklarken, aynı mantık, tüm medyayı ayrı bileşenlerle şirket içinde yaparken de kullanılabilir. Spesifik hidrojel/ortam oranı, büyüme faktörlerinin konsantrasyonunun ne kadar yüksek olması gerektiğine rehberlik eder; Örneğin, 2:1'lik bir oran, kullanılan standart tam ortamın temsil eden bir konsantrasyonu ile sonuçlanmak için 3x konsantrasyon büyüme faktörü gerektirebilir. Sistemde bulunan büyüme faktörlerinin tam kontrolü, mekanik soruları yanıtlamak ve birçok uygulama için düzenleyici sorunlardan kaçınmak için faydalıdır.

3. adımda açıklanan görüntü işleme adımları, görüntülerin kalitesi ve çekilen görüntülerin türü ile sınırlıdır. Her görüntü türünün ve kalitesinin özel gereksinimlerine uyacak şekilde iyileştirme gerektirebilir. Bununla birlikte, sürecin genel adımları ve parlak alan görüntülerinden organoid boyut analizi için temel çerçevenin bir MATLAB kodu örneği, daha da optimize edilebilecek ve genişletilebilecek bir iş akışının tanımlanmasına yardımcı olur. Ayrıca, parlak alan mikroskobuna erişim, diğer mikroskop türlerinden daha yaygındır. MATLAB'a erişim ve aşinalık eksikliği bu kodun kullanımını sınırlayabilse de, sürecin genel adımları, Image J. Organoid boyutu tek başına olgunlaşmayı değerlendirmek için önerilen bir metrik değildir; hedef organı temsil eden spesifik belirteçlerin değerlendirilmesi ile takip edilmesi teşvik edilir; Bağırsak dokusu için bu belirteçlerden bazıları Tablo 4'te yer almaktadır. Şekil 6 , organoidlerin dış yüzeyine (bazolateral) lokalize olan epitel hücre adezyon molekülü (EpCAM) ile tüm organoidlerin immünofloresan boyanmasının bir örneğini göstermektedir. EpCAM, tüm ECM sistemlerinde kültürlenen organoidlerde görselleştirilirken, bu organoidlerin boyutlarında farklılıklar vardı. Bu nedenle, organoid boyutu hakkındaki bilgiler, kültür koşullarının optimize edilmesine yardımcı olur. Ayrıca, ilaç yanıt çalışmalarında, organoid boyutu, test edilen bileşiğe verilen yanıtın bir ölçüsü olarak hizmet eder; Boyuttaki değişiklikler, test edilen bileşiklerin etkinliğini veya toksisitesini yansıtabilir. Daha da önemlisi, standartlaştırılmış boyuta sahip birden fazla organoid partisi üretmek, bu alanda güncel bir zorluktur, ancak sonuçların farklı deneyler veya laboratuvarlar arasında karşılaştırılabilmesi için deneysel tekrarlanabilirliğin önemli bir ölçüsüdür. Toplamda, parlak alan görüntülerinden organoidler hakkında önemli bilgilerin çıkarılmasına izin veren otomatik bir iş akışı, birçok araştırmacı için faydalı bir araçtır.

Her iki sistemin, hayvan kaynaklı matrislerin ve kseno içermeyen hidrojellerin avantajları ve dezavantajları vardır. MH aşamasında diğer hayvan türevli matrislere göre daha az küresel salınıma yol açan Matris 2-AB, ticari olarak temin edilebilen hayvan türevli matrislerin yaygın olarak bilinen bir özelliği olan partiden partiye varyasyonlardan kaynaklanabilir. Ticari olarak temin edilebilen ECM sistemlerinin konsantrasyonunun değiştiğine dikkat etmek önemlidir; Örneğin, ürün spesifikasyon formlarındaki seyreltme faktörleri, hayvan kaynaklı matrisler söz konusu olduğunda biraz farklı konsantrasyonlara yol açabilecek kaplama çözeltilerini hazırlamak için kullanılmıştır. Protein konsantrasyonundaki bu farklılıklar, farklılaşmayı önemli ölçüde etkileyebilir ve aynı ürünü farklı partilerden kullanırken farklılaşma verimliliğinde değişikliğe yol açabilir. Bu sistemler arasında seçim yapmak için belirli deneysel hedefler, etik hususlar ve yasal gereklilikler gibi faktörleri göz önünde bulundurun. Örneğin, tümör ve kanser biyolojisi sorularını yanıtlamak için in vitro deneysel sonuçların bir fare hayvan modeliyle karşılaştırılması durumunda, Engelbreth-Holm Swarm EHS faresinden türetilen matrisleri kullanmak harika bir seçim olabilir. Ayrıca, Matrigel gibi ürünler onlarca yıldır kullanıldığından, birçok protokol, veri ve referans vardır. Bununla birlikte, fiziksel ve kimyasal özelliklerin özelleştirilmesine izin veren iyi tanımlanmış kseno içermeyen matrislerin kullanılması, araştırma sorusu insan hastalıkları veya tedavileri ile ilişkili olduğunda daha uygun bir seçenek olabilir. Ayrıca, çoğu kseno içermeyen hidrojel sistemi, düzenleyici standartları karşılayacak şekilde tasarlanmıştır, bu da onları iyi üretim uygulamalarına (GMP) veya diğer düzenleyici yönergelere uygunluk gerektiren araştırmalar için uygun bir seçim haline getirir.

Özetle, hayvan kaynaklı matrisler, biyouyumlulukları nedeniyle iPSC bakımı ve organoid üretimi için yaygın olarak kullanılırken, kseno içermeyen hidrojel sistemleri tekrarlanabilirlik, maliyet etkinliği, mevzuata uygunluk ve etik hususlar açısından avantajlar sunar. İkisi arasındaki seçim, araştırmanın veya klinik uygulamanın özel ihtiyaçlarına bağlıdır. Kseno içermeyen hidrojel sistemleri, klinik öncesi terapötik adaylar kısa listesi için organoidlerin ve mikrofizyolojik sistemlerin kullanımını destekleyebilen daha çok yönlü ve sürdürülebilir bir alternatif olarak popülerlik kazanmaktadır. Bu uygulama, erken ilaç geliştirmeyi önemli ölçüde iyileştirebilir ve ilaç endüstrisindeki mevcut klinik çeviri zorluklarının üstesinden gelmeye yardımcı olabilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. John Huang, TheWell Bioscience'ın kurucusu ve CEO'sudur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Dr. Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano ve Russell D'Souza'dan hiPSC ve organoid çalışmalarına başlama ile ilgili önceki eğitimleri ve genel önerileri kabul etmektedir. İn vitro hücre kültürü çalışmaları için hidrojel sistemlerini kullanma konusundaki rehberliği için Dr. Chelsey Simmons'a teşekkür ederler. Ayrıca yazarlar, STEMCELL Technologies'den Dr. Christine Rodriguez ve Thomas Allison'a hiPSC kültürü konusundaki rehberlikleri için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca yayın maliyetlerini karşıladığı için TheWell Bioscience'a teşekkür eder.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24 Kuyulu Plaka (Kültürle işlenmiş, steril)Falcon353504
37 & derece; C su banyosuVWR
96 kuyulu plaka Fisher ScientificFB012931
İleri DMEM/F12Yaşam Teknolojileri12634
Yapışma Önleyici Durulama ÇözümüSTEMCELL Teknolojileri7010
Biyolojik güvenlik kabini (BSC)Labconco Mantık
Parlak Alan MikroskobuEcho RebelREB-01-E2
BXS0116ATCCACS-1030
Sıcaklık kontrollü Santrifüj (4 &�; C yetenekleri)ThermoScientific75002441
Konik tüpler, 15 mL, sterilThermo Fisher Scientific339650
Konik tüpler, 50 mL, sterilThermo Fisher Scientific339652
Cultrex RGF BME, Tip 2Bio-techne3533-005-02
Cultrex Kök Hücre Nitelikli RGF BME Bio-techne3434-010-02
D-PBS (Ca++ ve Mg++ olmadan)Thermo Fisher Scientific14190144
GeltrexLDEV İçermeyen, hESC Nitelikli Büyüme Faktörünü AzaltGibco A14133-02
GlutaMAX TakviyesiThermo Fischer Scientific35050-061
Guava Muse Hücre Analiz Cihazı veya başka bir akış sitometri ekipmanı (isteğe bağlı)Luminex0500-3115
HEPES tampon çözeltisiThermo Fischer Scientific15630-056
Heralcell Vios Hücre kültürü inkübatörü (37 &derece; C, %5 CO2)Thermo Scientific 
JMP SoftwareSAS InstituteJMP 16
MATLABMathWorks, IncR2022b
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bodrum Membran Matrisi LDEV içermezCorning 
Matrigel Matrisi Yüksek Konsantrasyon (HC), Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) LDEV'sizCorning 
mTeSR Plus OrtaKÖK HÜCRE Teknolojileri100-0276
Nunclon Delta yüzey işlem görmüş 24 oyuklu plakaThermo Scientific144530
PE Fare Anti-insan CD326 (EpCAM)BD Pharmingen566841
PE Fare Anti-insan CDX2 BD Pharmingen563428
PE Fare Anti-insan FOXA2BD Pharmingen561589
PerCP-Cy 5.5 Fare Anti-insan SSEA4 BD Pharmingen561565
ReLeSRSTEMCELL5872
SCTi003-ASTEMCELL Technologies200-0510
Serolojik pipetler (10 mL) Fisher Scientific13-678-11E
Serolojik pipetler (5 mL) Fisher Scientific13-678-11D
STEMdiff Bağırsak Organoid Büyüme OrtamıKÖK HÜCRE Teknolojileri5145
STEMdiff Bağırsak Organoid KitiKÖK HÜCRE Teknolojileri5140
Vitrojel Hidrojel MatrisiTheWell BioscienceVHM01
VitroGel ORGANOID Keşif KitiTheWell BioscienceVHM04-K
51033775356231354263

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hynes, R. O. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, Pt 24 4195-4200 (2010).
  3. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biol Rep. 2, 78(2010).
  4. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).
  5. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  6. Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
  7. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  8. Tran, O. N., et al. Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306(2022).
  9. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  10. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  11. Gjorevski, N., et al. Tissue geometry drives deterministic organoid patterning. Science. 375 (6576), (2022).
  12. Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. Engineering the extracellular matrix for organoid culture. Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).
  13. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  16. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  17. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  18. Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing. Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).
  19. Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf (2024).
  20. biotechne R&D Systems. Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor. biotechne R&D Systems. , (2024).
  21. VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience. , Available from: https://www.thewellbio.com/video-protocols (2024).
  22. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  23. Henderson, J. K., et al. Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens. Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).
  24. Haruna, N. F., Huang, J. Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture. J Cytol Tissue Biol. 7, 30(2020).
  25. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891(2021).
  26. Stewart, D. C., et al. Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease. PLoS One. 13, e0200377(2018).
  27. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125(2020).
  28. Broguiere, N., et al. Growth of epithelial organoids in a defined hydrogel. Adv Mater. 30, 1801621(2018).
  29. Barthes, J., et al. Cell microenvironment engineering and monitoring for tissue engineering and regenerative medicine: The recent advances. BioMed Res Int. 2014, 921905(2014).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  31. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Basement Membrane MatricesHuman Stem CellsIntestinal OrganoidsXeno Free HydrogelOrganoid GenerationStem Cell MaintenanceExtracellular MatrixOrganoid CultureInduced Pluripotent Stem CellsOrganoid Differentiation

Related Articles