PH'ın, Afrika tripanozomlarının kan dolaşımı formunun glikozomlarındaki çevresel ipuçlarına nasıl tepki verdiğini incelemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yaklaşım, pH dinamiklerini ölçmek için akış sitometrisi ile birlikte pH'a duyarlı kalıtsal bir protein sensörünü hem zaman seyri tahlili olarak hem de yüksek verimli bir ekran formatında içerir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Glikoz metabolizması, Afrika tripanozomu, Trypanosoma brucei, temel bir metabolik süreç ve parazit gelişiminin düzenleyicisi olarak kritik öneme sahiptir. Çevresel glikoz seviyeleri değiştiğinde oluşan hücresel tepkiler hakkında çok az şey bilinmektedir. Hem kan dolaşımında hem de prosiklik formda (böcek evresi) parazitlerde, glikozomlar glikolizin çoğunu barındırır. Bu organeller, glikoz yoksunluğuna yanıt olarak hızla asitleştirilir, bu da muhtemelen hekzokinaz gibi glikolitik enzimlerin allosterik regülasyonuna neden olur. Önceki çalışmalarda, pH ölçümleri yapmak için kullanılan kimyasal probun lokalizasyonu zordu ve diğer uygulamalardaki kullanımını sınırlıyordu.
Bu makale, kalıtsal bir protein pH biyosensörü olan glikozomal olarak lokalize pHluorin2'yi eksprese eden parazitlerin gelişimini ve kullanımını açıklamaktadır. pHluorin2, 395 nm'de uyarmada pH'a (asit) bağlı bir azalma gösteren ve aynı anda 475 nm'de uyarmada bir artış sağlayan bir oransal pHluorin varyantıdır. Transgenik parazitler, pHluorin2 açık okuma çerçevesinin tripanozom ekspresyon vektörü pLEW100v5'e klonlanmasıyla üretildi ve her iki yaşam döngüsü aşamasında da indüklenebilir protein ekspresyonu sağlandı. pHluorin2 biyosensörünün glikozomal lokalizasyonunu doğrulamak için immünofloresan kullanıldı ve biyosensörün lokalizasyonunu glikozomal yerleşik protein aldolaz ile karşılaştırdı. Sensörün yanıt verme hızı, daha önce floresein bazlı bir pH sensörünü kalibre etmek için kullandığımız bir yaklaşım olan pH değeri 4 ile 8 arasında değişen bir dizi tamponda hücrelerin inkübe edilmesiyle farklı pH seviyelerinde kalibre edildi. Daha sonra glikozomal pH'ı belirlemek için akış sitometrisi kullanarak 405 nm ve 488 nm'de pHluorin2 floresansını ölçtük. PF parazitlerinde bilinen bir glikozomal asitleşme tetikleyicisi olan glikoz yoksunluğuna yanıt olarak zaman içinde pH'ı izleyerek canlı transgenik pHluorin2 eksprese eden parazitlerin performansını doğruladık. Bu araç, potansiyel olarak yüksek verimli ilaç taramasında kullanılmak da dahil olmak üzere bir dizi potansiyel uygulamaya sahiptir. Sensör, glikozomal pH'ın ötesinde, canlı hücre ortamındaki pH dinamiklerini anlamak için diğer organellere uyarlanabilir veya diğer tripanosomatidlerde kullanılabilir.
Giriş
Parazitik kinetoplastidler, çoğu canlı organizma gibi, merkezi karbon metabolizmasının temel bir bileşeni olarak glikoza güvenir. Bu grup, Afrika tripanozomu, Trypanosoma brucei gibi tıbbi açıdan önemli organizmaları içerir;Amerikan tripanozomu, T. cruzi; ve Leishmania cinsinin parazitleri. Glikoz metabolizması, patojenik yaşam döngüsü aşamalarında parazit büyümesi için kritik öneme sahiptir. Örneğin, glikozdan yoksun bırakıldığında, Afrika tripanozomunun kan dolaşımı formu (BSF) hızla ölür. Özellikle, glikoliz, enfeksiyonun bu aşamasında ATP'nin tek kaynağı olarak hizmet eder1. Leishmania parazitleri de aynı şekilde....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Monomorfik bir parazit hattı olan T. brucei brucei 90-13 BSF tripanozomlarının kullanılması, biyogüvenlik seviyesi 2 tesislerinde ele alınması gereken Risk Grubu 2 organizmaları olarak kabul edildiğinden güvenliğin dikkate alınmasını gerektirir.
1. Tripanozom kültürü ve transfeksiyonu
- Kültür T. brucei brucei 90-13 BSF tripanozomları, HMI-9 ortamında% 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS ve% 10 Nu-Serum ile% 5 CO210 içinde 37 ° C'de.
NOT: Kültürü sağlıklı tutmak için hücre yoğunluğunu 2 × 104 ve 5 × 106 hücre/mL arasında tutun. - pHluor....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
BSF T. brucei'de glikozomlara pHLuorin2-PTS1 lokalizasyonu
pHluorin2-PTS1'in hücre altı lokalizasyonunu değerlendirmek için parazitler immünofloresan testlerine tabi tutuldu. Glikozomda yerleşik bir protein olan aldolaza (TbAldolaz) karşı yükselen anti-serumlarla birlikte lokalize olan transgenden gelen sinyal (Şekil 2A). Anti-TbAldolaz ve pHluorin2-PTS1 arasındaki ortalama Pearson korelasyon katsayısı 0.895 idi, bu da pHluorin2-PTS1'in öncelikle glikozomlara lok.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Afrika tripanozomundaki çevresel algı ve tepki mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. Besin mevcudiyetindeki değişikliklerin, glikozomların asitlenmesi de dahil olmak üzere parazitte çeşitli tepkileri tetiklediği bilinmektedir. Burada, kalıtsal bir protein sensörü, pHluorin2 ve akış sitometrisi kullanarak canlı hücrelerdeki çevresel bozulmalara glikozomal pH tepkisini incelemek için bir yöntem tanımladık.
Sensörün kullanımında birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, transgeni eksprese eden .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Teşekkürler
pHluorin2-PTS1, yapıyı yüksek kopyalı bir klonlama vektöründe sağlayan Twist Bioscience tarafından pLEW100v5'e klonlandı; pLEW100v5, Dr. George Cross'un hediyesiydi. T. brucei aldolase'ye karşı yetiştirilen antiserum, talep üzerine Clemson Üniversitesi'nden Dr. Meredith T. Morris'ten temin edilebilir. JCM ve KAC laboratuvarlarından yapılan çalışmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R01AI156382) bir ödülle kısmen desteklenmiştir. SSP, NIH 3R01AI156382 tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 50 mL Doku Kültürü Şişeleri (İşlem görmemiş, steril) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Doku Kültürü Şişesi (İşlem görmemiş, steril) | Corning | 431464U | |
| 80 &; mikro; L düz tabanlı 384 kuyulu plaka | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa İnsan T Hücresi Nükleofektoru Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Thermo Fisher Scientific tarafından | Attune NxT Akış Sitometresi | A24858 | FlowJo yazılımı |
| BRANDplates 96-Well, düz tabanlı plaka | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 ImageJ | eklentisi https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| Scientific tarafından CytKick Max Otomatik Örnekleyici | canlandırıcısı | A42973 | |
| CytoFLEX Akış Sitometresi | Beckman-Coulter | ||
| Elektron Mikroskobu Bilimleri% 16 Paraformaldehit Sulu Çözelti, EM Sınıfı, 10 mL Ampul | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | istatistik yazılımı | ||
| Nigericin (sodyum tuzu) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nükleofektör 2b | Lonza | Üretimi Durdurulan Ürün | |
| OP2 Sıvı İşleyici | opentronları | OP2 | |
| poli-L-lizin, H2O Sigma | Life Science | CAS:25988-63-0 | HTS testi için pipetleme robotu |
| Tiazol Kırmızısı (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | marka plakanın algılanabilmesi ve CytKick Max Auto'muzda kullanılabilmesi için özel bir akrilik plaka standı işledik. Bu marka plakanın algılanabilmesi ve CytKick Max Auto'muzda kullanılabilmesi için özel bir akrilik plaka standı işledik HTS testi için örnekleyici |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetleme robotu |
| pH kalibrasyonu için | |||
| pH kalibrasyonu için |
Kaynaklar
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
