Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Ligandların Elektron Kriyomikroskopisinden Türetilen Haritalara Modellenmesi

3.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66310

⸱

19 Temmuz 2024

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, makromoleküllerin kriyoEM haritalarında küçük moleküllü ligandları modellemek için mevcut araçları tanıtır.

Özet

Bir makromoleküler kompleksteki protein-ligand etkileşimlerinin deşifre edilmesi, moleküler mekanizmayı, altta yatan biyolojik süreçleri ve ilaç geliştirmeyi anlamak için çok önemlidir. Son yıllarda, kriyojenik örnek elektron mikroskobu (cryoEM), makromoleküllerin yapılarını belirlemek ve atoma yakın çözünürlükte ligand bağlanma modunu araştırmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. CryoEM haritalarında protein olmayan moleküllerin tanımlanması ve modellenmesi, ilgilenilen molekül boyunca anizotropik çözünürlük ve verilerdeki doğal gürültü nedeniyle genellikle zordur. Bu makalede, okuyuculara, seçilen makromolekülleri kullanarak ligand tanımlaması, model oluşturma ve atomik koordinatların iyileştirilmesi için şu anda kullanılan çeşitli yazılım ve yöntemler tanıtılmaktadır. Enolaz enzimi ile gösterildiği gibi bir ligandın varlığını tanımlamanın en basit yollarından biri, ligandlı ve ligandsız elde edilen iki haritayı çıkarmaktır. Ligandın ekstra yoğunluğunun, daha yüksek bir eşikte bile fark haritasında öne çıkması muhtemeldir. Metabotropik Glutamat reseptörü mGlu5 durumunda gösterildiği gibi, bu kadar basit fark haritalarının oluşturulamadığı durumlar vardır. Yakın zamanda tanıtılan Fo-Fc atlama haritasını türetme yöntemi, ligandın varlığını doğrulamak ve göstermek için bir araç olarak hizmet edebilir. Son olarak, iyi çalışılmış β-galaktosidaz örnek olarak, çözünürlüğün cryoEM haritalarında ligandların ve çözücü moleküllerinin modellenmesi üzerindeki etkisi analiz edilmekte ve cryoEM'nin ilaç keşfinde nasıl kullanılabileceğine dair bir bakış sunulmaktadır.

Giriş

Hücreler, sayısız kimyasal reaksiyonu aynı anda ve bağımsız olarak gerçekleştirerek işlevlerini yerine getirirler, her biri çevresel ipuçlarına yanıt olarak hayatta kalmalarını ve uyum sağlamalarını sağlamak için titizlikle düzenlenir. Bu, biyomoleküllerin, özellikle proteinlerin, diğer makromoleküllerin yanı sıra küçük moleküller veya ligandlar ile geçici veya kararlı kompleksler oluşturmasını sağlayan moleküler tanıma ile elde edilir1. Bu nedenle, protein-ligand etkileşimleri, protein ekspresyonunun ve aktivitesinin düzenlenmesini, substratların ve kofaktörlerin enzimler tarafından tanınmasını ve ayrıca hücrelerin sinyalleri nasıl algıladığını ve ilettiğiniiçeren biyolojideki tüm süreçler için temeldir 1,2. Protein-ligand kompleksinin kinetik, termodinamik ve yapısal özelliklerinin daha iyi anlaşılması, ligand etkileşiminin moleküler temelini ortaya çıkarır ve ayrıca ilaç etkileşimini ve özgüllüğünü optimize ederek rasyonel ilaç tasarımını kolaylaştırır. Protein-ligand etkileşimini incelemek için ekonomik ve daha hızlı bir yaklaşım, çok çeşitli küçük molekülleri sanal olarak tarayan ve bu ligandların hedef proteinlere bağlanma modunu ve afinitesini tahmin eden bir hesaplama yöntemi olan moleküler yerleştirmeyi kullanmaktır3. Bununla birlikte, X-ışını Kırınımı (XRD), Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) veya elektron kriyomikroskopisi (cryoEM) ile belirlenen yüksek çözünürlüklü yapılardan elde edilen deneysel kanıtlar, bu tür tahminler için temel kanıtı sağlar ve belirli bir hedef için daha yeni ve daha etkili aktivatörlerin veya inhibitörlerin geliştirilmesine yardımcı olur. Bu makale, tekniğe yaygın olarak atıfta bulunulduğu için 'cryoEM' kısaltmasını kullanır. Bununla birlikte, doğru isimlendirmenin seçilmesi konusunda devam eden bir tartışma vardır ve son zamanlarda, numunenin kriyojenik sıcaklıkta olduğunu ve elektronlarlagörüntülendiğini belirtmek için kriyojeniknumune Elektron Mikroskopisi (cryoEM) terimi önerilmiştir. Benzer şekilde, cryoEM'den türetilen haritalar elektron potansiyeli, elektrostatik potansiyel veya Coulomb potansiyeli olarak adlandırılmıştır ve basitlik için burada cryoEM haritaları 5,6,7,8,9,10 kullanıyoruz.

XRD, protein-ligand komplekslerinin yüksek çözünürlüklü yapı tayininde altın standart teknik olmasına rağmen, son birkaç yılda Elektron Mikroskobu Veritabanında (EMDB)12,13 biriken Coulomb potansiyel haritalarının veya kriyoEM haritalarının dalgalanmasıyla gösterildiği gibi, çözünürlük devrimisonrası 11 kriyoEM ivme kazanmıştır14. Numune hazırlama, görüntüleme ve veri işleme yöntemlerindeki ilerlemeler sayesinde, kriyoEM kullanan Protein Veri Bankası (PDB)14 birikimlerinin sayısı 2010 ve 2020 yılları arasında %0,7'den %17'ye yükselmiştir ve 2020'de rapor edilen yapıların yaklaşık %50'si 3,5 şveya daha iyi çözünürlükte belirlenmiştir15,16. CryoEM, farmasötik endüstrisi de dahil olmak üzere yapısal biyoloji topluluğu tarafından hızla benimsenmiştir, çünkü esnek ve kristal olmayan biyolojik makromoleküllerin, özellikle membran proteinlerinin ve çoklu protein komplekslerinin, atoma yakın çözünürlükte çalışılmasına izin verir, kristalleşme sürecinin üstesinden gelir ve XRD ile yüksek çözünürlüklü yapı tayini için gerekli olan iyi kırınım kristalleri elde eder.

CryoEM haritasındaki ligandın doğru modellenmesi, moleküler düzeyde protein-ligand kompleksinin bir planı olarak hizmet ettiği için çok önemlidir. X-ışını kristalografisinde kullanılan, ligandı elektron yoğunluğu 17,18,19,20'ye sığdırmak veya inşa etmek için ligand yoğunluğunun şekline ve topolojisine bağlı olan birkaç otomatik ligand oluşturma aracı vardır. Bununla birlikte, çözünürlük 3 Å'den düşükse, bu yaklaşımlar daha az arzu edilen sonuçlar üretme eğilimindedir, çünkü tanıma ve oluşturma için bağlı oldukları topolojik özellikler daha az tanımlanmış hale gelir. Birçok durumda, bu haritalar düşük-orta çözünürlük aralığında, tipik olarak 3.5 Å-5 Å17 arasında belirlendiğinden, bu yöntemlerin ligandları cryoEM haritalarına doğru bir şekilde modellemede etkisiz olduğu kanıtlanmıştır.

CryoEM ile bir protein-ligand kompleksinin 3D yapı tayinindeki ilk adım, ligandın protein ile birlikte saflaştırılmasını (ligandın proteine yüksek bir bağlanma afinitesine sahip olduğunda) veya protein çözeltisinin ızgara hazırlığından önce belirli bir süre ligand ile inkübe edilmesini içerir. Daha sonra, plazma ile temizlenmiş delikli bir TEM ızgarasına küçük bir numune hacmi yerleştirilir, ardından sıvı etan içinde hızlı dondurma ve son olarak bir kriyo-TEM ile görüntüleme yapılır. Yüz binlerce ila milyonlarca bireysel parçacıktan gelen 2D projeksiyon görüntülerinin ortalaması, makromolekülün 3 boyutlu (3D) Coulomb potansiyel haritasını yeniden oluşturmak için alınır. Bu haritalardaki ligandların ve çözücü moleküllerinin tanımlanması ve modellenmesi, harita boyunca anizotropik çözünürlük (yani, çözünürlük makromolekül boyunca aynı değildir), ligandın bağlı olduğu bölgedeki esneklik ve verilerdeki gürültü nedeniyle birçok durumda önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. XRD için geliştirilen modelleme, iyileştirme ve görselleştirme araçlarının çoğu şimdi aynı amaçlar için cryoEM'de kullanılmak üzere uyarlanmaktadır 18,19,20,21. Bu makalede, ligandları tanımlamak, modeller oluşturmak ve cryoEM'den türetilen koordinatları iyileştirmek için şu anda kullanılan çeşitli yöntemlere ve yazılımlara genel bir bakış sunulmaktadır. Değişen çözünürlük ve karmaşıklığa sahip spesifik protein-ligand kompleksleri kullanılarak ligandların modellenmesinde yer alan süreçleri göstermek için adım adım bir protokol sağlanmıştır.

CryoEM haritalarında ligandların modellenmesindeki ilk adım, haritadaki ligand yoğunluğunun (protein olmayan) tanımlanmasını içerir. Ligand bağlanması proteinde herhangi bir konformasyonel değişikliğe neden olmazsa, protein-ligand kompleksi ile apo-protein arasındaki basit bir fark haritasının hesaplanması, ligandın varlığını düşündüren ekstra yoğunluk bölgelerini esasen vurgular. Bu tür farklılıklar hemen gözlemlenebilir, çünkü sadece iki harita gerektirir ve hatta ligandın mevcut olup olmadığını kontrol etmek için 3D iyileştirme işlemi sırasında ara haritalar bile kullanılabilir. Ek olarak, çözünürlük yeterince yüksekse (<3.0 Å), fark haritası, su moleküllerinin yanı sıra ligand ve protein kalıntıları ile etkileşime giren iyonların konumu hakkında da bilgi sağlayabilir.

Apo-protein haritasının yokluğunda, bağımsız bir araç olarak mevcut olan ve ayrıca Refmac iyileştirmesinin bir parçası olarak CCP-EM yazılım paketi 23,24'e ve CCP4 8.0 sürüm 25,26'ya entegre edilmiş olan Servalcat22'yi kullanmak artık mümkün. Servalcat, keskinleştirilmemiş yarım haritaları ve apoprotein modelini girdi olarak kullanarak bir FSC ağırlıklı fark (Fo-Fc) haritasının hesaplanmasına izin verir. Fo-Fc atlama haritası, deneysel harita (Fo) ile modelden türetilen harita (Fc) arasındaki eşitsizliği temsil eder. Modelde bir ligandın yokluğunda, deneysel EM haritasıyla örtüşen bir Fo-Fc haritasındaki pozitif bir yoğunluk tipik olarak ligandın varlığını gösterir. Buradaki varsayım, protein zincirinin haritaya iyi bir şekilde oturduğu ve kalan pozitif yoğunluğun ligandın yerini gösterdiğidir. Bununla birlikte, pozitif yoğunluğun, bir protein yan zincirinin yanlış döndürücüsü gibi modelleme hatalarından kaynaklanıp kaynaklanmadığını titizlikle incelemek önemlidir.

İkinci adım, mevcut kimyasal bilgilerden iyi tanımlanmış geometriye sahip ligandın kartezyen koordinat dosyasının elde edilmesini veya oluşturulmasını içerir. CCP4 monomer kütüphanesinde zaten mevcut olan standart ligandlar (örneğin, ATP ve NADP+), koordinat ve geometri dosyalarını monomer erişim kodları aracılığıyla alarak iyileştirme için kullanılabilir. Bununla birlikte, bilinmeyen veya standart olmayan ligandlar için, geometri dosyalarını oluşturmak için çeşitli araçlar mevcuttur. Örneklerden bazıları arasında Phenix28'deki eLBOW27 - (elektronik ligand oluşturucu ve optimizasyon tezgahı), Lidia - Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Schrödinger paketi içindeki Glide'ın Ligprep32-a modülünde yerleşik bir araç bulunmaktadır. Ligand koordinat dosyası daha sonra hem deneysel cryoEM haritası hem de Coot'taki fark haritası tarafından yönlendirilen yoğunluğa yerleştirilir. Bunu, Phoenix28'de gerçek alan iyileştirmesi veya Refmac33'te karşılıklı iyileştirme takip eder. İyi bir grafik kartı ve yukarıda belirtilen yazılımla donatılmış bir Linux iş istasyonu veya dizüstü bilgisayar gereklidir. Bu programların çoğu çeşitli süitlere dahil edilmiştir. CCP-EM24 ve Phenix28, akademik kullanıcılar tarafından ücretsiz olarak kullanılabilir ve Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, vb. dahil olmak üzere bu makalede kullanılan çeşitli araçları içerir. Benzer şekilde, Chimera37 ve ChimeraX38 akademik kullanıcılara ücretsiz lisanslar sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Mycobacterium tuberculosis'ten enolazda fosfoenolpiruvat (PEP) modellenmesi

  1. PEP-enolaz kompleksinin kriyoEM haritasında ligand yoğunluğunun tanımlanması
    1. EMDB'deki ek verilerden apo-enolazın keskinleştirilmemiş yarı haritalarını (emd_30988_additional_1.map ve emd_30988_additional_2.map) indirin (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. ChimeraX'ı açın ( Malzeme Tablosu'na bakın). Araç çubuğundan Aç'a tıklayarak ve dosya adlarını seçerek apo-enolase'nin yarı haritalarını açın. Apo-enolase keskinleştirilmemiş haritayı elde etmek için her iki yarım haritayı birleştirmek için komut satırına vop add #1 #2 yazın.
      NOT: #1 ve #2, adım 1.1.1'de belirtildiği gibi apo-enolaz enzimi için iki yarım haritayı gösterir.
    3. Birleştirilmiş haritayı (ChimeraX harita kimliği: #3) rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map yazarak yeniden adlandırın. Model panelinden haritayı griye boyayın. Harita, D4 simetrisi ile çözeltide enolazın oktamerik olduğunu göstermektedir.
    4. PEP-enolase-unsharpened-map (harita ID: #6) elde etmek için aşağıdaki yarım haritaları emd_30989_additional_1.map (harita ID: 4) ve emd_30989_additional_2.map (harita ID:5) kullanarak 1.1.1-1.1.3 adımlarını tekrarlayın.
    5. Bir fark haritası hesaplamak için, önce ChimeraX'taki Harita panelinde (araç çubuğu) Sığdır (haritadaki harita) seçeneğine tıklayarak iki haritayı (adım 1.1.3 ve adım 1.1.4'teki PEP-enolaz ve apo-enolaz keskinleştirilmemiş haritalar) birbirine yerleştirin.
      NOT: İki harita arasında normalleştirme yapılmaz. Bazı durumlarda, haritaları aynı ölçeğe getirmek için normalleştirme gerekebilir.
    6. Komut satırına vop subtract #6 #3 yazarak PEP-enolaz haritasını apo-enolaz haritasından çıkarın.
      NOT: #6 = PEP-enolaz keskinleştirilmemiş harita, #3 = Apo-enolaz keskinleştirilmemiş harita.
    7. Çıkarılan haritayı (harita ID:7) pozitif yoğunluğu gösterecek şekilde yeşile boyayın (X-ışını kristalografisindeki konvansiyona göre)39.
    8. M. tuberculosis oktamerik enolaz (PDB: 7e4x) koordinatlarını Protein Veri Bankası'ndan (PDB) indirin, araç çubuğundan aç'a tıklayın ve dosya adını seçin.
    9. Komut satırına rename #8 Apo_enolase.pdb yazarak 7e4x.pdb modelini yeniden adlandırın. #8, ChimeraX'taki Apo_enolase.pdb'yi belirtir.
    10. Model panelinden modeli seçin. Araç çubuğundan Sağ Fare'ye tıklayın. Modeli PEP-enolaz haritasına (# 6) yakın konumlandırmak ve modeli haritaya göre hizalamak için Molekülü taşı'ya tıklayın. Komut satırına #6 içinde fit #8 yazarak bu modeli PEP-enolase-unsharpened-map'e sığdırın. Burada harita 6, model ise 8 olarak numaralandırılmıştır.
      NOT: Bazı durumlarda, ChimeraX'taki yerel uyum modeli hizalamak için yeterli olmayabilir. Bu durumlarda, Phoenix'te ek bir global fitting adımı (DockinMap, Malzeme Tablosuna bakınız) gerçekleştirilebilir.
    11. Komut satırına save Apo-enolase.pdb #8 yazarak takılan modeli kaydedin.
  2. PEP-enolaz kompleksinin B-faktörü keskinleştirilmiş kriyoEM haritasında PEP'in modellenmesi ve iyileştirilmesi
    1. Terminalden ./Coot & yazarak "coot"u (Malzeme Tablosuna bakın) açın.
    2. Dosya'ya tıklayarak "Apo-enolase.pdb" dosyasını görüntüleyin > Apo-enolase.pdb koordinatlarını açın. Koordinat dosyası bağlarla görüntülenir (atoma göre renk).
    3. EMDB'den PEP'e bağlı Enolase keskinleştirilmiş haritasını, yani emd_30989.map'i indirin. Dosya'ya tıklayarak aynısını görüntüleyin > Haritayı Aç > emd_30989.map . Farenin orta düğmesini kaydırarak eşiği 7,00 σ olarak ayarlayın.
    4. Modellenmemiş blobları doğrula > Blobları Bul'> tıklayarak modellenmemiş blobları bulun.
    5. Enolaz modelinin aktif bölge kalıntıları Ser 42, Lys-386 ve Arg-364'ün yakınında modellenmemiş ligand yoğunluğunu bulun.
    6. Coot monomer kitaplığından File > Get Monomer'a tıklayarak ve 3 Harfli kod olarak PEP girerek PEP monomer model dosyasını alın.
    7. Kenar çubuğu menüsündeki Döndür/Çevir- Bölge/Zincir/Molekül seçeneğini kullanarak PEP molekülünü yoğunluğa taşıyın. Kenar çubuğu menüsündeki Gerçek Alan İyileştirme Bölgesi'ne tıklayarak PEP molekülünü yoğunluğa sığdırmak için Coot'ta gerçek alan iyileştirmeyi kullanın. Düzenle sekmesindeki molekül birleştirme seçeneğini kullanarak takılan ligandı Apo-enolase.pdb ile birleştirin. Modeli PEP-Enolase.pdb olarak kaydedin.
      NOT: Ligandı takmak için ligand> Jiggle-Fit Ligand seçeneği de kullanılabilir.
    8. Koordinat dosyasındaki monomerlerin geri kalanına ligandlar eklemek için, NCS Araçları > NCS ligandları > Hesapla'ya tıklayın. NCS ile İlgili Ligandları Bul adlı ayrı bir pencere görünecektir. NCS'li Protein seçeneği için, Apo-enolase.pdb koordinat dosyasını ve NCS Master Chain olarak Chain ID A'yı seçin.
      1. Ligand içeren molekül için, koordinat dosyası olarak Apo-enolase.pdb'yi ve Zincir Kimliği, J ve Kalıntı Numarası 1'den 1'e kadar seçin. Aday pozisyonlarını bul'a tıklayın. Aday pozisyonlarının bir listesini içeren Takılı Ligandlar adlı bir pencere görünecektir. Bireysel aday ligandlara tıklayarak uyumu değerlendirin ve uyumu görsel olarak analiz edin.
        NOT: Servalcat/Refmac'ta sadece bir monomer modeli sağlanabilir ve rekonstrüksiyonda kullanılan simetri verilmiş bir model elde etmek için verilebilir.
    9. Ligandın yakınında çözücü molekülleri için ek yoğunluk da gözlendi. Çeşitli homologlardan elde edilen yüksek çözünürlüklü enolaz kristal yapıları, muhtemelen reaksiyon ara maddesinin negatif yükünü stabilize eden iki Mg2+ iyonunun40,41 varlığını göstermektedir. İşaretçiye atom yerleştir'e tıklayarak ve İşaretçi Atom türü listesinden MG'yi seçerek aktif bölge yoğunluğunda iki Mg2+ iyonu modelleyin.
      NOT: Bağ geometrisi ve mesafesi, metal iyonunu seçmek için bir kılavuz olarak kullanılabilir. Protein kalıntılarında oksijen atomlarına bağlı Mg2+ durumunda, bağ mesafesi oktahedral geometri ile 2.1 ş-2.4 şarasında değişir. Bununla birlikte, düşük çözünürlüklü haritalar söz konusu olduğunda, koordinasyon alanı genellikle eksiktir ve çözünürlükteki sınırlamalar nedeniyle mesafe de değişebilir.
    10. Simetri ile ilgili monomerlere Mg2+ iyonlarını eklemek için adım 1.2.8'i tekrarlayın.
    11. Dosya > Koordinatları kaydet'e tıklayarak > Dosya Adı > Seç'e tıklayarak ve Enolase+PEP+Mg.pdb yazarak modeli kaydedin.
    12. Phoenix GUI'yi açın (Malzeme Tablosuna bakın). Varsayılan parametreleri kullanarak sırasıyla giriş modeli ve harita olarak Enolase+PEP+Mg.pdb ve emd_30989.map ile gerçek bir alan iyileştirme işi çalıştırın. Bu adım, iyi bir harita modeli uyumu ve geometrisi elde etmek için Coot ile yinelemeli olarak yapılır.
      NOT: Keskinleştirilmemiş fark haritası, bir şekilde olduğu gibi ligandın varlığını göstermek için kullanılır. Modelleme amacıyla, B faktörü keskinleştirilmiş harita kullanılmıştır ve önerilir. B faktörü keskinleştirilmiş harita, keskinleştirilmemiş haritanın aksine, gösteri amaçlı fark haritasını hesaplamak için de kullanılabilir. Bununla birlikte, ligandın bağlı olduğu bölgede çözünürlük daha düşükse, tüm haritayı keskinleştirmek için kullanılan tek B faktörü ligand yoğunluğunu net bir şekilde ortaya çıkarmayabilir.
  3. Modellenen ligandın görselleştirilmesi ve şekil oluşturulması
    1. PyMOL42'deki son Phoenix iyileştirme işinden rafine Enolase + PEP + Mg modelini açın (Malzeme Tablosuna bakın) Dosya > Aç'a tıklayarak ve dosya adını seçerek açın.
    2. Dosya > Aç'a tıklayarak ve dosya adını seçerek emd-30989.map dosyasını (PEP'e bağlı keskinleştirilmiş harita) yükleyin.
    3. Eylemlere tıklayarak haritayı PEP keskinleştirilmiş olarak yeniden adlandırın > emd_30989 nesneye karşı yeniden adlandırın ve PEP keskinleştirilmiş yazın.
      NOT: Çoğu durumda, örneğin enolaz, pymol'de açıldığında haritalar normalleştirilir, çünkü haritayı normalleştir seçeneği pymol'de varsayılan olarak işaretlidir. CryoEM haritaları daha büyük bir kutuya odaklandığından, normalleştirme kutudaki her şeyi içerecektir. Böylece, pymol'de açılmadan önce normalizasyon kapatılabilir.
    4. Dizisini görüntülemek > tıklayarak ligandları seçin.
    5. Komut satırına isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 yazın ve enter tuşuna basın.
    6. mesh_ligand nesnenin yanındaki son kutu olan C'ye tıklayarak mesh_ligand maviye boyayın.
    7. Aktif bölge kalıntılarını, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 ve Lys-386'yı sırasıyla çubuk ve küre temsilinde PEP ve Mg2+ ile etkileşime girerek ve enolaz enzimini çizgi film temsilinde görüntüleyin.
    8. Yayın kalitesinde görüntüler oluşturmak için ray 3600, 3600 yazarak ışın izleme yapın ve Dosya'ya tıklayarak > kaydedin ve dosya adı olarak PEP.png'yi seçerek png dosyası olarak kaydedin.

2. Metabotropik Glutamat reseptörü mGlu 5'teki ligandların modellenmesi

  1. Agonist ve antagoniste bağlı mGlu'nun cryoEM haritasındaki ligand yoğunluğunun belirlenmesi ve modellenmesi5
    1. Agonist bağlı (EMD-31536, 7fd8.pdb) ve antagonist bağlı (EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu5 komplekslerinin her biri için karşılık gelen koordinat dosyalarıyla birlikte iki yarım haritayı indirin.
    2. ChimeraX'i açın
      1. Aç'a tıklayıp 7fd8.pdb'yi seçerek 7fd8.pdb koordinat dosyasını açın.
      2. Komut satırına delete ligand yazın ve Enter'a basın.
      3. Benzer şekilde, B zincirini silmek için delete/B komutunu kullanın.
        NOT: Ligandlar ve zincirler, silmek > atomlar/bağlar > seçme ve eylemler kullanılarak üstteki açılır menü kullanılarak silinebilir.
      4. Komut satırına aşağıdakileri yazarak ligandlanmamış pdb'yi kaydedin: save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 model kimliğini belirtir.
      5. 2.1.2.1-2.1.2.4 adımlarını 7fd9.pdb için tekrarlayın.
    3. CCP-EM'yi açın. mGlu5 adlı yeni bir proje oluşturun ve proje dizinini ve kullanıcı adını belirtin.
      1. Sol paneldeki seçeneklerden Relion'u açın.
        1. Maske Oluşturma sekmesine gidin.
        2. Giriş olarak EMD-31536 için yarım haritalardan birini sağlayın.
          NOT: Relion, son ek olarak .mrc içeren haritaları kabul eder ve EMD haritaları .map sonekine sahiptir. Harita dosyaları incelenmek üzere ChimeraX'ta açılabilir ve .mrc formatında kaydedilebilir.
        3. Maske sekmesinde piksel boyutunu 0,89 Å ve ilk ikili eşiği 0,007 olarak sağlayın.
        4. İşi 31536 diğer adıyla (veya izlemesi kolay başka bir adla) çalıştırın.
        5. Benzer şekilde, EMD - 31537 yarım haritası için bir maske oluşturun.
      2. CCPEM'de sol panelde bulunan seçeneklerden Refmac Servalcat programını açınız.
        1. Adı mGlu5_agonist olarak sağlayın.
        2. 7fd8_noligand_chainA .pdb dosyasını model bölümü 2.1.2.4'te açıklandığı gibi içe aktarın. İki yarım haritanın konumunu ve Relion'da oluşturulan ilgili maskeyi sağlayın.
        3. Çözünürlüğü 3,8 şolarak belirtin.
        4. Katı Simetri > iyileştirme ayarlarına gidin ve Relion nokta grubu simetrisi olarak C2'yi belirtin.
        5. Üst kısımda bulunan başlat düğmesine basarak programı başlatın.
    4. İş bittiğinde, sonucu Coot'ta açın (sonuç bölümünde en üstte bulunan seçenek). Bu, varsayılan olarak Coot'ta bir diffmap.mtz görüntüler, burada kırmızı ve yeşil renkler sırasıyla negatif ve pozitif yoğunlukları gösterir.
      1. Görüntü yöneticisine gidin > DELFWT PHDELWT etiketli fark haritasının özelliklerini seçin ve kontur seviyesini 4.0 (mutlak değer) olarak değiştirin.
        NOT: Eşik seçimi haritaya ve çözünürlüğe bağlıdır.
      2. FWT PHWT etiketli haritayı ve refined.pdb etiketli molekülü gizleyin.
      3. Pozitif yoğunluğu (yeşil renkli) görselleştirmek için fareyi kullanarak haritayı hareket ettirin ve daha büyük blobu merkeze getirin.
      4. Dosya > Monomer Al'a gidin, QUS yazın ve enter tuşuna basın.
      5. Rijit Vücut Uyumu molekülü > Hesaplama > Modelleme bölümüne gidin ve molekülü Fo-Fc yoğunluğuna uyacak şekilde ayarlamak için QUS monomerine çift tıklayın.
      6. QUS molekülünü refined.pdb koordinat dosyasına eklemek için düzenle sekmesindeki molekülü birleştir seçeneğini kullanın.
      7. 2.1.4.3-2.1.4.6 adımlarını, sırasıyla hücre dışı ve transmembran alanının tepesindeki daha küçük blob içine monomer kodu NAG ve CHS ile ligandı sığdırmak için tekrarlayın.
      8. Koordinatı refined_ligands.pdb olarak kaydedin.
        NOT: Transmembran (TM) alanının çözünürlüğü daha düşüktür ve bu nedenle burada tartışılmamıştır.
  2. mGlu5 ligandlı yapının iyileştirilmesi
    1. CCPEM'i açın ve önceki iyileştirme işini kopyalayın (adım 2.1.3.2) ve refined_ligands.pdb ve keskinleştirilmiş harita (emd. 31536.mrc) giriş olarak, varsayılan parametreleri ve C2 simetrisini kullanarak.
      NOT: Program ligandı tanımazsa, CIF dosyalarının sağlanması gerekir. Bu CIF dosyaları PDB'den indirilebilir veya çeşitli programlar kullanılarak oluşturulabilir (ayrıntılar için bkz. adım 3.1.1).
  3. PyMOL'de görselleştirme ve figür oluşturma
    1. PyMOL'deki en son Refmac iyileştirme işinden refined_expanded.pdb modelini açın.
    2. Dosya > Aç'a gidin ve diffmap_normalised_fofc.mrc (adım 2.1.3.2'deki Servalcat işinden fark haritası) dosyasını yüklemek için Refmac iş dizinine göz atın.
      NOT: Tarama sırasında .mrc uzantılı dosyalar görünmüyorsa, dosya türünü tüm dosyalar olarak değiştirin ve göz atın.
    3. Ekran > sırasını kullanarak ligandları seçin.
    4. Eylemler düğmesine gidin ve seçimi ligandlar olarak yeniden adlandırın.
    5. Komut satırına aşağıdakileri yazın ve enter tuşuna basın: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.
      NOT: Ağ genişliği ayarlanabilir. Burada 0,2 ağ genişliği kullanılır ve bu, aşağıdaki komut kullanılarak ayarlanır: mesh_width=0,2 olarak ayarlayın.
    6. Monomerlerden birine sağ tıklayın ve her bir monomerin rengini belirtmek için zincir > rengine gidin. Ligandı ve mesh_ligands nesnelerde c etiketli son kutuyu kullanarak ligandı ve ağı renklendirin. mGlu5 reseptör dimeri çizgi film temsilinde gösterilmiştir ve monomerler deniz mavisi ve buğday rengindedir. Ligandlar çubuk halinde gösterilir ve ligandları şekillendiren ağ yeşil renktedir.
    7. Nesnelere karşı yönlendirme / merkez / yakınlaştırma seçeneği > eylemleri kullanın ve ağı net bir şekilde görselleştirmek için manuel olarak ayarlayın. Ligand ile etkileşime girebilecek yakındaki kalıntıları seçin, örneğin, Tyr64, QUS için Trp100 ve gerektiği gibi, yan zincirlerini veya ana zincirlerini veya her ikisini de çubuk temsili olarak görüntüleyin.
    8. Yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak ve bunları bir png dosyası olarak kaydetmek için ışın izleme.
      NOT: Yukarıdaki adımlar, antagonist bağlı harita EMD-31537 ve karşılık gelen koordinat dosyası PDB-7fd9 için tekrarlanır.

3. İnhibitör, deoksigalakto-nojirimisin (DGN) ve çözücü moleküllerinin yüksek çözünürlüklü keskinleştirilmiş bir β-galaktosidaz haritasında modellenmesi

  1. CryoEM'den alınan yarı haritaları kullanarak ligandın, DGN'nin tanımlanması
    1. Modelleme için bilinmeyen Ligand sözlüğünün hazırlanması [Deoksigalakto-nojirimycin(DGN)]
      NOT: Deoksigalakto-nojirimisin sözlük dosyası, CCP4 monomer kütüphanesine DGJ (3 harfli ligand ID) olarak dahil edilmiştir. Bununla birlikte, burada bilinmeyen ligandlar için sözlük dosyaları oluşturma sürecini göstermek için yeni ve bilinmeyen bir ligand olarak kabul edilir, DGN 3 harfli kod olarak kullanılır.
      1. PubChem web sayfasında deoksigalakto-nojirimisin (DGN) için bileşik özetini açın ve deoksigalakto-nojirimisin bileşiği için gülümseme dizesini kopyalayın.
      2. eLBOW > Phenix > Ligandlarını açın.
      3. Gülümseme dizesini giriş olarak belirtin.
      4. Uygun ligand bina optimizasyon yöntemini belirtin. Burada basit optimizasyon kullanılır.
      5. Ligand tanımı bölümüne kimyasal gülümseme ipini yapıştırın.
      6. Bir iş unvanı, çıktı dosyası öneki ve ligand kimliğini uygun şekilde sağlayın ve çalıştır'a basın.
        Not: İşin çıktısı bir koordinat dosyası (DGN.pdb) ve bir sözlük dosyası (DGN.cif dosyası) içerir. Jligand29 , cif dosyasını oluşturmak için de kullanılabilir.
    2. PDB'den β-galaktosidaz koordinat dosyasını (6tsh.pdb) indirin ve bir metin düzenleyici kullanarak protein zincirleri (B, C, D), ligand, DGN ve diğer çözücü molekülleri için koordinatları kaldırın veya Coot'ta zincir / bölge seçeneğini silin. Koordinat dosyasını apo-betaGal_chainA.pdb olarak kaydedin.
      NOT: ChimeraX veya Pymol, ligand/çözücü molekülünü çıkarmak için de kullanılabilir.
    3. EMDB'den EMD-10563 girişinin ek verilerinden yarım haritaları (emd_10563_half_map_1.map ve emd_10563_half_map_2.map) indirin.
    4. CCPEM'i açın ve 0,01 eşiğinde harita için maske oluşturmak için Relion'u kullanın (2.1.3.1.1-2.1.3.1.4 adımlarında açıklandığı gibi).
    5. Adım 3.1.3'te elde edilen yarım haritalar ve adım 3.1.2'de apo modeli ve D2 simetrisi ile Servalcat'i (adım 2'de açıklandığı gibi CCPEM paketi içinde) çalıştırın.
      NOT: Ligand yoğunluğunu bulmak için modelin yarım haritalardan veya tam haritalardan birine hizalanması gerekir. Bu, modeli ChimeraX kullanarak haritaya sığdırarak ve ardından koordinatları yarım haritaya göre kaydederek yapılabilir. Bu örnekte, yarı haritalar ve EMDB'deki birincil harita farklı kutu boyutlarına/ızgaralara sahiptir ve modelin yarım haritaya yerleştirilmesi gerekir.
    6. Coot'u açın.
      1. Phoenix eLBOW ile adım 3.1.1'de oluşturulan ligand sözlüğü için DGN.cif dosyasını açın. Bu, Dosya > CIF sözlüğünü İçe Aktar'a giderek ve eLBOW iş dizinine göz atarak yapılır.
      2. Protein ve ligand koordinat dosyalarını, sırasıyla adım 3.1.2'den apo-betaGal_chainA.pdb ve adım 3.1.6'dan DGN.pdb'yi açın.
      3. Servalcat işinden diffmap.mtz dosyasını otomatik olarak açın (adım 3.1.5) ve Coot'ta DELFWT PHDELWT etiketli haritayı görselleştirin. Haritayı ~ 4 mutlak değer eşiğinde konturlayın.
        NOT: map.mrc başlığını yazarak veya Chimera'daki araçları kullanarak harita istatistiklerini kontrol etmek önemlidir. Piksel boyutu, kutu boyutu, minimum, ortalama ve maksimum yoğunluk ve ortalama yoğunluktan rms sapması ile ilgili gerekli tüm bilgiler elde edilebilir. CryoEM haritalarının piksel boyutunu ve kutu boyutunu kontrol etmek çok önemlidir. 3B harita, 3B voksellerden oluşan bir ızgarada protein-ligand harita hacmini temsil eder. Her vokselde elektron potansiyel değeri veya o konumda elektronu bulma olasılığı saklanır. Belirli bir eşik seçildiğinde, belirtilen değerden daha düşük bir yoğunluğa sahip olan vokseller sıfıra ayarlanır. Bu, haritadaki deneysel gürültüyü en aza indirmeye ve harita özelliklerini daha iyi görselleştirmeye yardımcı olur43. Bu nedenle, harita, harita özelliklerinin kolayca görülebileceği ve haritadaki gürültünün minimum olduğu bir eşikte konturlanmalıdır.
      4. Ligand'a gidin > Ligandları bulun. Görüntülenen yeni pencerede ligandı, fark haritasını ve apo-betaGal_chainA.pdb modelini seçin. Diğer seçenekleri varsayılan ayarlarında bırakın ve aramayı başlatmak için Ligandları Bul'a tıklayın.
      5. Potansiyel ligand yoğunluğunu gösteren en iyi vuruşların bir listesi, yoğunlukların her birine yerleştirilmiş bir kopya ile görüntülenir. Ligandın yerleştirildiği tüm vuruşları manuel olarak kontrol edin. En olası isabetleri saklayın ve belirsiz olanları kaldırın.
        NOT: Yüksek bir eşikte harita yoğunluğundaki fark, aktif bölgede ligandın varlığını açıkça göstermektedir.
  2. Ligand DGN ve solvent moleküllerinin modellenmesi
    1. Fark yoğunluğu haritasına ligandı (DGN.pdb) sığdırmak için Coot'ta gerçek bir alan iyileştirmesi gerçekleştirin ve ardından ligand koordinatlarını apo-betaGal_chainA.pdb ile birleştirin ve betaGal_chainA+ligand.pdb olarak kaydedin.
      NOT: Diğer zincirlerin bölgelerine yerleştirilmiş olan ligandlar, birleştirilmiş koordinat dosyası kaydedilirken çıkarılabilir ve birleştirilemez. Diğer zincirlerdeki ligandlar, örnek 1, adım 1.2.8'de gösterildiği gibi NCS Ligandları tarafından veya simetri açılımı kullanılarak Refmac / Servalcat'te üretilebilir.
    2. Giriş modeli olarak betaGal_chainA+ligand.pdb ve D2 simetrisi ile yarım haritalar (adım 3.1.3'ten itibaren) ile yukarıdaki gibi (adım 3.1.5) başka bir Servalcat işi çalıştırın.
    3. Modellenen ligandı çevreleyen fark yoğunluğu (adım 3.2.2'deki Servalcat işinden), ligand molekülü ile koordineli olarak çalışan çözücü moleküllerinin varlığını göstermektedir. Ligand'a yakın merkezi yoğunluk, su molekülleri için çok büyük görünmektedir.
    4. Bu konumda Mg2 + 'nın varlığını gösteren önceki biyokimyasal ve yapısal verilere dayanarak, Mg2+ iyonu burada atomu yerleştir seçeneğine tıklanarak ve atomu MG olarak belirterek modellenir.
    5. Çözücü molekülünün varlığını gösteren aktif bölgedeki fark yoğunluğundaki su moleküllerini, işaretçideki atomun yerine tıklayarak ve suyu seçerek modelleyin.
      NOT: Coot ayrıca su moleküllerini otomatik olarak toplama seçeneğine de sahiptir. Burada odak sadece aktif bölge üzerinde olduğu için su molekülleri manuel olarak eklenir.
    6. Mg2+ ve su koordinatlarını betaGal+ligand.pdb dosyasıyla birleştirin ve betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb olarak kaydedin.
    7. betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb ile D2 simetrisi ile Servalcat'te Refmac iyileştirmesi gerçekleştirin.
      NOT: Bu işten elde edilen çıktı farkı haritası, fark haritasının minimum artık pozitif veya negatif yoğunluk göstermesi gerektiğinden, ligandın doğru bir şekilde modellenip modellenmediğini doğrulamak için bir araç görevi görebilir.
  3. PyMOL ile görselleştirme ve figür oluşturma
    NOT: Aşağıda özetlenen adımlar, ligandların ve çözücülerin varlığını göstermek için kullanılabilecek modelleri ve haritaları kullanarak şekil oluşturmaya ilişkin birkaç örnek sağlar.
    1. Son Servalcat işinden (adım 3.2.6) refined_expanded.pdb'yi ligand ve çözücü modellenmiş olarak açın.
    2. Örnek 2'de açıklandığı gibi macenta, sarı, yeşil ve deniz mavisi renklendirmek için farklı zincirleri ayrı ayrı seçin.
    3. Görüntü > Sırası'na gidin, su molekülleri, magnezyum ve DGN için ayrı seçimler yapın ve nesneleri sırasıyla su, MG ve DGN olarak yeniden adlandırın.
    4. Nesneleri seçip sağ tıklayarak MG ve su moleküllerini küre olarak görüntüleyin ve > küre gösterin. Benzer şekilde, ligandı çubuk temsilinde görüntüleyin ve ligandları ve çözücüleri uygun şekilde renklendirin. Bu durumda, ligand bir heteroatom tarafından sarı renktedir, magnezyum iyonu mor renktedir ve su molekülleri kırmızı renktedir.
    5. DGN, MG ve su moleküllerini seçin. Nesneye kopyalamak > eylemleri sağ tıklayın ve seçin ve ligandlar olarak adlandırın.
    6. Adım 3.2.6'daki Servalcat işinden diffmap_normalised_fo.mrc'yi açın ve ligand_fo.mrc olarak yeniden adlandırın. Şu komutu yazın: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligandlar, carve=2.
      NOT: Atomların etrafına 2 şoyma seçeneği uygulanır ve haritaların çözünürlüğüne ve kalitesine bağlı olarak 3-5 değerleri kullanılabilir. Ayrıca, PyMOL'de cryoEM haritalarını açarken normalize_ccp4_maps kapalı olarak ayarlamanız önerilir.
    7. Yönlendirme/yakınlaştırma seçeneklerinin > eylemleri kullanın ve adım 2.3.7'de gösterildiği gibi ligandları ve yakındaki etkileşimli kalıntıları (uygun olan her yerde) görselleştirmek için manuel olarak ayarlayın.
    8. Işın 3600, 3600 komutunu kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntüleri kaydetmek için bu sahneleri ışın izleyin.
    9. Sahneyi .png dosyası olarak kaydedin.
      NOT: Aşağıdaki adımlar isteğe bağlıdır ve (1) modellenmemiş ligand, DGN için fark yoğunluğunu (Fo-Fc), (2) modellenmemiş ligandın yoğunluğunu (Fo), DGN'yi ve modellenmemiş çözücüler için fark yoğunluğunu (Fo-Fc) ve son olarak (3) modellenmiş ligand, DGN ve aktif bölgedeki çözücü molekülleri için yoğunluğu (Fo) görselleştirme sürecini ana hatlarıyla belirtir.
    10. Fark haritasını kullanarak ligand, DGN ve çevresindeki çözücü moleküllerinin varlığını göstermek için, adım 3.1.5'teki Servalcat işinden diffmap_normalised_fofc.mrc'yi açın. Harita nesnesinin yanındaki eylemlere > yeniden adlandır'a tıklayarak harita dosyasını unliganded_fofc.mrc olarak yeniden adlandırın. Komut satırına şunu yazın: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligandlar, level=6, carve=2.
    11. Modellenmiş ligandın, DGN'nin yoğunluğunu ve çevresindeki modellenmemiş çözücü yoğunluğunu göstermek için, adım 3.2.2'deki servalcat işinden diffmap_normalised_fo.mrc'nin yanı sıra diffmap_normalised_fofc.mrc'yi açın. diffmap_normalised_fo.mrc'yi DGN_fo ve diffmap_normalised_fofc.mrc'yi DGN_unmodelled_solvents_fofc olarak yeniden adlandırın.
    12. Display > Sequence'dan MG ve suyu seçin, sağ tıklayın ve nesneye kopyalamak > eylemleri seçin ve bunları çözücü olarak adlandırın.
    13. Komut satırına şunu yazın: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, çözücüler, level=6, carve=2.
      NOT: mesh_DGN_fo, ligandın yoğunluğunu gösterecek ve mesh_solvent_fofc, MG ve su için ihmal yoğunluğunu gösterecektir.
    14. Son olarak, modellenen ligandları ve aktif bölgedeki çevreleyen çözücü moleküllerini görselleştirmek için, adım 3.2.6'daki Servalcat işinden diffmap_normalised_fo.mrc'yi açın ve ligand_fo.mrc olarak yeniden adlandırın.
    15. Komut satırına şunu yazın: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
      NOT: Burada diffmap_normalised_fo.mrc kullandık, ancak son keskinleştirilmiş harita, ligandların ve çevredeki kalıntıların yoğunluğunu göstermek için kullanılabilir. Kullanılan haritanın türünü, B-faktörü keskinleştirme değerlerini şekil açıklamasında belirtmek iyi bir uygulamadır.
    16. Kafes genişliği ve küre boyutu aşağıdaki komutlar yazılarak ayarlanabilir: küre boyutunu küçültmek için mesh_width=0,2 olarak ayarlayın ve sphere_scale=0,25 olarak ayarlayın .
    17. Fo ağını maviye ve fofc ağını yeşile boyayın.
    18. Adım 2.3.7'de gösterildiği gibi, yönlendirme/yakınlaştırma seçeneklerini > eylemleri kullanın ve ligandları ve yakındaki etkileşimli kalıntıları (uygun olan her yerde) görselleştirmek için manuel olarak ayarlayın.
    19. Işın 3600, 3600 komutunu kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntüleri kaydetmek için bu sahneleri ışın izleyin.
    20. Tek tek sahneleri .png dosyaları olarak kaydedin.

4. β-galaktosidazda çözünürlüğün ligand modellemesine etkisi

  1. Terminal'i açın ve iki yarım haritayı içeren dizine gidin.
  2. İki yarım haritayı (adım 3.1.3) .map formatında ChimeraX'ta açın, görselleştirin ve emd10563_half1_1_unfil.mrc ve emd10563_half2_1_unfil.mrc olarak kaydedin.
  3. Adım 3.1.4'te oluşturulan maske bir girdi olarak kullanılabilir.
  4. Varsayılan parametrelerle 4.2-4.3 adımlarındaki yarım haritaları ve maskeleri kullanarak Relion'da bir Son İşleme işi çalıştırın.
  5. Adım 4.4'ü tekrarlayın, şimdi FSC tartımını atla etkinleştirilmiş ve 3 Å'lik geçici bir alçak geçiren filtre belirterek.
  6. Adım 4.4'ü 3.5 Å'lik geçici bir alçak geçiren filtre ile tekrarlayın.
  7. 4.4-4.6 adımlarındaki haritaları (postprocess.mrc) açın, farklı çözünürlüklerde filtreleyin ve PyMOL'deki 3.1.2 adımındaki model koordinatı olan 6tsh.pdb (ChimeraX'teki yarı haritalara hizalanmış) dosyasını açın. Farklı haritaları, çözünürlüklerine göre tanımlandığı şekilde 3.0, 3.5 ve 2.3 olarak yeniden adlandırın.
    NOT: Haritaların alçak geçişli filtrelemesi, onları ChimeraX veya Coot'ta görselleştirerek doğrulanabilir.
  8. Farklı çözünürlüklere filtrelenmiş haritalarla adım 3.3.6'da açıklandığı gibi 6σ eşiğinde ligand ve çözücü molekülleri etrafında 2 Å'lik bir ağ oluşturarak çözünürlüğün ligand ve çözücü moleküllerinin yoğunluğu üzerindeki etkisini görselleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Örnek 1
M. tuberculosis'ten elde edilen enolaz enzimi, glikolizin sondan bir önceki adımını katalize eder ve 2-fosfogliseriatı, çeşitli metabolik yollar için temel bir ara madde olan fosfoenolpiruvata (PEP) dönüştürür44,45. Apo-enolaz ve PEP'e bağlı enolaz örnekleri için CryoEM verileri aynı piksel boyutu olan 1.07 Å'de toplandı ve Relion 3.146,47 ile görüntü işleme gerçekleşt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mikroskop donanım ve yazılımındaki gelişmeler, son yıllarda cryoEM yapılarının sayısında artışa neden olmuştur. Tek parçacıklı cryoEM'de şu anda elde edilen en yüksek çözünürlük 1.2 Å57,58,59 olmasına rağmen, yapıların çoğu 3-4 şçözünürlük civarında belirlenmektedir. Orta ila düşük çözünürlüklü haritalarda ligandları modellemek zor olabilir ve genellikle belirsizliklerle dolu olabilir. CryoEM'nin hem akademide hem de ilaç endüst...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

SJ, DAE-TIFR'den doktora öğrencisi unvanı almıştır ve finansman kabul edilmektedir. KRV, DBT B-Life hibesi DBT/PR12422/MED/31/287/2014 ve Hindistan Hükümeti Atom Enerjisi Departmanı'nın Proje Kimlik No'lu kapsamında desteğini kabul eder. RTI4006.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CCP4-8.0Çeşitli enstitülerin konsorsiyumuhttps://www.ccp4.ac.ukAkademik kullanıcılar için ücretsizdir ve Coot ve X-ışını kristalografisi için geliştirilen araçların listesini içerir
ÇKP-EMKonsorsiyumuhttps://www.ccpem.ac.uk/download.phpakademik kullanıcılar için ücretsizdir ve Coot, Relion ve diğerlerini içerir
Coot Paul Emsley, LMB, Cambridgehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/Model oluşturma için genel yazılım, ancak yukarıda açıklanan diğer süitlerle de mevcuttur
DockinMap (Phoenix)Birkaç enstitünün konsorsiyumuhttps://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.htmlModeli cryoEM haritalarına yerleştirmek için Phoenix paketi içindeki yazılımlar
Elektron Mikroskobu Veri Bankası Çeşitli enstitülerden oluşan konsorsiyumhttps://www.ebi.ac.uk/emdb/Elektron Mikroskobu haritaları için Kamu
Deposu FalconThermo Fisher Scientific https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdfTicari, Thermo Fisher'dan kamera 
Phenix Çeşitli enstitülerin konsorsiyumuhttps://phenix-online.org/downloadAkademik kullanıcılar için ücretsizdir ve Coot
Protein Veri Bankası'nıÇeşitli enstitülerin konsorsiyumuhttps://rcsb.orgMakromoleküler yapıların halka açık veritabanı
PymolSchrödingerhttps://pymol.org/2/Moleküler görselleştirme aracı. Eğitim sürümü ücretsizdir ancak sınırlama ile birlikte gelir. Tam sürüm küçük bir ücret karşılığında edinilebilir.
RelionMRC-LMB, cryoEMgörüntüYazılımı, ayrıca CCP-EM
Titan Krios ThermoFisher Scientific https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE		Ticari, Thermo Fisher'dan kriyoTEM
UCSF ChimeraUCSF, ABDhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.htmlGörüntüleme, analiz ve daha fazlası için genel amaçlı yazılım
UCSF Chimera XUCSF, ABDhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Görüntüleme, analiz ve daha fazlası için genel amaçlı yazılım
Çeşitli enstitülerin içerir işleme için Cambridge https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html

Kaynaklar

  1. Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
  2. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514(2018).
  3. Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
  4. Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM': electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
  5. Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
  6. Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
  7. Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
  8. Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
  9. Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
  10. Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. EMDB (the Electron Microscopy Data Bank. , Available from: www.ebi.ac.uk/emdb/ (2023).
  13. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
  14. RCSB.org. , Available from: http://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2024).
  15. Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
  16. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  17. Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164(2023).
  18. Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
  19. Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
  20. Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
  21. Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
  22. Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
  23. Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
  24. Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
  25. Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
  26. Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
  27. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
  28. Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
  29. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
  30. Debreczeni, J. É, Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
  31. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
  32. Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , Schrödinger, LLC. New York, NY. (2022).
  33. Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
  34. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
  35. Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
  36. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
  37. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera - A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  38. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  39. Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
  40. Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
  41. Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. Biochemistry. 62 (3), 735-746 (2023).
  42. DeLano, W. L. The PyMOL molecular graphics system. Schrödinger LLC wwwpymolorg. Version 1. , Available from: http://www.pymol.org (2002).
  43. Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
  44. Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
  45. Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
  46. Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
  47. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166(2018).
  48. Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
  49. RCSB Protein Data Bank (RCSB PDB). , Available from: http://www.rcsb.org (2023).
  50. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
  51. Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648(2021).
  52. Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
  53. Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
  54. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309(2019).
  55. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  56. Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
  57. Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98(2023).
  58. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  59. Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  60. Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
  61. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  62. Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
  63. Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
  64. Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
  65. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  66. Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
  67. Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
  68. Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
  69. Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
  70. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kriyo-EM HaritalarıLigand ModellemeProtein-Ligand EtkileşimleriMakromoleküler KomplekslerFark HaritasıReel Uzay Rafine EtmeAktif Bölge KalıntılarıFosfoenolpiruvat BağlanmasıMagnezyum Koordinasyonu
Ligandların Elektron Kriyomikroskopisinden Türetilen Haritalara Modellenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.