Ligandların Elektron Kriyomikroskopisinden Türetilen Haritalara Modellenmesi

Summary

Bu protokol, makromoleküllerin kriyoEM haritalarında küçük moleküllü ligandları modellemek için mevcut araçları tanıtır.

Abstract

Bir makromoleküler kompleksteki protein-ligand etkileşimlerinin deşifre edilmesi, moleküler mekanizmayı, altta yatan biyolojik süreçleri ve ilaç geliştirmeyi anlamak için çok önemlidir. Son yıllarda, kriyojenik örnek elektron mikroskobu (cryoEM), makromoleküllerin yapılarını belirlemek ve atoma yakın çözünürlükte ligand bağlanma modunu araştırmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. CryoEM haritalarında protein olmayan moleküllerin tanımlanması ve modellenmesi, ilgilenilen molekül boyunca anizotropik çözünürlük ve verilerdeki doğal gürültü nedeniyle genellikle zordur. Bu makalede, okuyuculara, seçilen makromolekülleri kullanarak ligand tanımlaması, model oluşturma ve atomik koordinatların iyileştirilmesi için şu anda kullanılan çeşitli yazılım ve yöntemler tanıtılmaktadır. Enolaz enzimi ile gösterildiği gibi bir ligandın varlığını tanımlamanın en basit yollarından biri, ligandlı ve ligandsız elde edilen iki haritayı çıkarmaktır. Ligandın ekstra yoğunluğunun, daha yüksek bir eşikte bile fark haritasında öne çıkması muhtemeldir. Metabotropik Glutamat reseptörü mGlu₅ durumunda gösterildiği gibi, bu kadar basit fark haritalarının oluşturulamadığı durumlar vardır. Yakın zamanda tanıtılan Fo-Fc atlama haritasını türetme yöntemi, ligandın varlığını doğrulamak ve göstermek için bir araç olarak hizmet edebilir. Son olarak, iyi çalışılmış β-galaktosidaz örnek olarak, çözünürlüğün cryoEM haritalarında ligandların ve çözücü moleküllerinin modellenmesi üzerindeki etkisi analiz edilmekte ve cryoEM'nin ilaç keşfinde nasıl kullanılabileceğine dair bir bakış sunulmaktadır.

Introduction

Hücreler, sayısız kimyasal reaksiyonu aynı anda ve bağımsız olarak gerçekleştirerek işlevlerini yerine getirirler, her biri çevresel ipuçlarına yanıt olarak hayatta kalmalarını ve uyum sağlamalarını sağlamak için titizlikle düzenlenir. Bu, biyomoleküllerin, özellikle proteinlerin, diğer makromoleküllerin yanı sıra küçük moleküller veya ligandlar ile geçici veya kararlı kompleksler oluşturmasını sağlayan moleküler tanıma ile elde edilir¹. Bu nedenle, protein-ligand etkileşimleri, protein ekspresyonunun ve aktivitesinin düzenlenmesini, substratların ve kofaktörlerin enzimler tarafından tanınmasını ve ayrıca hücrelerin sinyalleri nasıl algıladığını ve ilettiğini^içeren biyolojideki tüm süreçler için temeldir ^1,2. Protein-ligand kompleksinin kinetik, termodinamik ve yapısal özelliklerinin daha iyi anlaşılması, ligand etkileşiminin moleküler temelini ortaya çıkarır ve ayrıca ilaç etkileşimini ve özgüllüğünü optimize ederek rasyonel ilaç tasarımını kolaylaştırır. Protein-ligand etkileşimini incelemek için ekonomik ve daha hızlı bir yaklaşım, çok çeşitli küçük molekülleri sanal olarak tarayan ve bu ligandların hedef proteinlere bağlanma modunu ve afinitesini tahmin eden bir hesaplama yöntemi olan moleküler yerleştirmeyi kullanmaktır³. Bununla birlikte, X-ışını Kırınımı (XRD), Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) veya elektron kriyomikroskopisi (cryoEM) ile belirlenen yüksek çözünürlüklü yapılardan elde edilen deneysel kanıtlar, bu tür tahminler için temel kanıtı sağlar ve belirli bir hedef için daha yeni ve daha etkili aktivatörlerin veya inhibitörlerin geliştirilmesine yardımcı olur. Bu makale, tekniğe yaygın olarak atıfta bulunulduğu için 'cryoEM' kısaltmasını kullanır. Bununla birlikte, doğru isimlendirmenin seçilmesi konusunda devam eden bir tartışma vardır ve son zamanlarda, numunenin kriyojenik sıcaklıkta olduğunu ve elektronlarla^{görüntülendiğini} belirtmek için kriyojeniknumune Elektron Mikroskopisi (cryoEM) terimi önerilmiştir. Benzer şekilde, cryoEM'den türetilen haritalar elektron potansiyeli, elektrostatik potansiyel veya Coulomb potansiyeli olarak adlandırılmıştır ve basitlik için burada cryoEM haritaları 5,6,7,8,9,10 kullanıyoruz.

XRD, protein-ligand komplekslerinin yüksek çözünürlüklü yapı tayininde altın standart teknik olmasına rağmen, son birkaç yılda Elektron Mikroskobu Veritabanında (EMDB)^12,13 biriken Coulomb potansiyel haritalarının veya kriyoEM haritalarının dalgalanmasıyla gösterildiği gibi, çözünürlük devrimi^{sonrası 11} kriyoEM ivme kazanmıştır¹⁴. Numune hazırlama, görüntüleme ve veri işleme yöntemlerindeki ilerlemeler sayesinde, kriyoEM kullanan Protein Veri Bankası (PDB)¹⁴ birikimlerinin sayısı 2010 ve 2020 yılları arasında %0,7'den %17'ye yükselmiştir ve 2020'de rapor edilen yapıların yaklaşık %50'si 3,5 şveya daha iyi çözünürlükte belirlenmiştir^15,16. CryoEM, farmasötik endüstrisi de dahil olmak üzere yapısal biyoloji topluluğu tarafından hızla benimsenmiştir, çünkü esnek ve kristal olmayan biyolojik makromoleküllerin, özellikle membran proteinlerinin ve çoklu protein komplekslerinin, atoma yakın çözünürlükte çalışılmasına izin verir, kristalleşme sürecinin üstesinden gelir ve XRD ile yüksek çözünürlüklü yapı tayini için gerekli olan iyi kırınım kristalleri elde eder.

CryoEM haritasındaki ligandın doğru modellenmesi, moleküler düzeyde protein-ligand kompleksinin bir planı olarak hizmet ettiği için çok önemlidir. X-ışını kristalografisinde kullanılan, ligandı elektron yoğunluğu ^{17,18,19,20'ye} sığdırmak veya inşa etmek için ligand yoğunluğunun şekline ve topolojisine bağlı olan birkaç otomatik ligand oluşturma aracı vardır. Bununla birlikte, çözünürlük 3 Å'den düşükse, bu yaklaşımlar daha az arzu edilen sonuçlar üretme eğilimindedir, çünkü tanıma ve oluşturma için bağlı oldukları topolojik özellikler daha az tanımlanmış hale gelir. Birçok durumda, bu haritalar düşük-orta çözünürlük aralığında, tipik olarak 3.5 Å-5 Ź⁷ arasında belirlendiğinden, bu yöntemlerin ligandları cryoEM haritalarına doğru bir şekilde modellemede etkisiz olduğu kanıtlanmıştır.

CryoEM ile bir protein-ligand kompleksinin 3D yapı tayinindeki ilk adım, ligandın protein ile birlikte saflaştırılmasını (ligandın proteine yüksek bir bağlanma afinitesine sahip olduğunda) veya protein çözeltisinin ızgara hazırlığından önce belirli bir süre ligand ile inkübe edilmesini içerir. Daha sonra, plazma ile temizlenmiş delikli bir TEM ızgarasına küçük bir numune hacmi yerleştirilir, ardından sıvı etan içinde hızlı dondurma ve son olarak bir kriyo-TEM ile görüntüleme yapılır. Yüz binlerce ila milyonlarca bireysel parçacıktan gelen 2D projeksiyon görüntülerinin ortalaması, makromolekülün 3 boyutlu (3D) Coulomb potansiyel haritasını yeniden oluşturmak için alınır. Bu haritalardaki ligandların ve çözücü moleküllerinin tanımlanması ve modellenmesi, harita boyunca anizotropik çözünürlük (yani, çözünürlük makromolekül boyunca aynı değildir), ligandın bağlı olduğu bölgedeki esneklik ve verilerdeki gürültü nedeniyle birçok durumda önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. XRD için geliştirilen modelleme, iyileştirme ve görselleştirme araçlarının çoğu şimdi aynı amaçlar için cryoEM'de kullanılmak üzere uyarlanmaktadır 18,19,20,21. Bu makalede, ligandları tanımlamak, modeller oluşturmak ve cryoEM'den türetilen koordinatları iyileştirmek için şu anda kullanılan çeşitli yöntemlere ve yazılımlara genel bir bakış sunulmaktadır. Değişen çözünürlük ve karmaşıklığa sahip spesifik protein-ligand kompleksleri kullanılarak ligandların modellenmesinde yer alan süreçleri göstermek için adım adım bir protokol sağlanmıştır.

CryoEM haritalarında ligandların modellenmesindeki ilk adım, haritadaki ligand yoğunluğunun (protein olmayan) tanımlanmasını içerir. Ligand bağlanması proteinde herhangi bir konformasyonel değişikliğe neden olmazsa, protein-ligand kompleksi ile apo-protein arasındaki basit bir fark haritasının hesaplanması, ligandın varlığını düşündüren ekstra yoğunluk bölgelerini esasen vurgular. Bu tür farklılıklar hemen gözlemlenebilir, çünkü sadece iki harita gerektirir ve hatta ligandın mevcut olup olmadığını kontrol etmek için 3D iyileştirme işlemi sırasında ara haritalar bile kullanılabilir. Ek olarak, çözünürlük yeterince yüksekse (<3.0 Å), fark haritası, su moleküllerinin yanı sıra ligand ve protein kalıntıları ile etkileşime giren iyonların konumu hakkında da bilgi sağlayabilir.

Apo-protein haritasının yokluğunda^{, bağımsız} bir araç olarak mevcut olan ve ayrıca Refmac iyileştirmesinin bir parçası olarak CCP-EM yazılım paketi 23,24'e ve CCP4 8.0 sürüm 25,26'ya entegre edilmiş olan Servalcat^22'yi kullanmak artık mümkün. Servalcat, keskinleştirilmemiş yarım haritaları ve apoprotein modelini girdi olarak kullanarak bir FSC ağırlıklı fark (Fo-Fc) haritasının hesaplanmasına izin verir. Fo-Fc atlama haritası, deneysel harita (Fo) ile modelden türetilen harita (Fc) arasındaki eşitsizliği temsil eder. Modelde bir ligandın yokluğunda, deneysel EM haritasıyla örtüşen bir Fo-Fc haritasındaki pozitif bir yoğunluk tipik olarak ligandın varlığını gösterir. Buradaki varsayım, protein zincirinin haritaya iyi bir şekilde oturduğu ve kalan pozitif yoğunluğun ligandın yerini gösterdiğidir. Bununla birlikte, pozitif yoğunluğun, bir protein yan zincirinin yanlış döndürücüsü gibi modelleme hatalarından kaynaklanıp kaynaklanmadığını titizlikle incelemek önemlidir.

İkinci adım, mevcut kimyasal bilgilerden iyi tanımlanmış geometriye sahip ligandın kartezyen koordinat dosyasının elde edilmesini veya oluşturulmasını içerir. CCP4 monomer kütüphanesinde zaten mevcut olan standart ligandlar (örneğin, ATP ve NADP⁺), koordinat ve geometri dosyalarını monomer erişim kodları aracılığıyla alarak iyileştirme için kullanılabilir. Bununla birlikte, bilinmeyen veya standart olmayan ligandlar için, geometri dosyalarını oluşturmak için çeşitli araçlar mevcuttur. Örneklerden bazıları arasında Phenix^28'deki eLBOW²⁷ - (elektronik ligand oluşturucu ve optimizasyon tezgahı), Lidia - Coot²⁹, JLigand/ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Schrödinger paketi içindeki Glide'ın Ligprep^32-a modülünde yerleşik bir araç bulunmaktadır. Ligand koordinat dosyası daha sonra hem deneysel cryoEM haritası hem de Coot'taki fark haritası tarafından yönlendirilen yoğunluğa yerleştirilir. Bunu, Phoenix^28'de gerçek alan iyileştirmesi veya Refmac^33'te karşılıklı iyileştirme takip eder. İyi bir grafik kartı ve yukarıda belirtilen yazılımla donatılmış bir Linux iş istasyonu veya dizüstü bilgisayar gereklidir. Bu programların çoğu çeşitli süitlere dahil edilmiştir. CCP-EM²⁴ ve Phenix²⁸, akademik kullanıcılar tarafından ücretsiz olarak kullanılabilir ve Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, vb. dahil olmak üzere bu makalede kullanılan çeşitli araçları içerir. Benzer şekilde, Chimera³⁷ ve ChimeraX³⁸ akademik kullanıcılara ücretsiz lisanslar sağlar.

Protocol

1. Mycobacterium tuberculosis'ten enolazda fosfoenolpiruvat (PEP) modellenmesi

1. PEP-enolaz kompleksinin kriyoEM haritasında ligand yoğunluğunun tanımlanması
   1. EMDB'deki ek verilerden apo-enolazın keskinleştirilmemiş yarı haritalarını (emd_30988_additional_1.map ve emd_30988_additional_2.map) indirin (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. ChimeraX'ı açın ( Malzeme Tablosu'na bakın). Araç çubuğundan Aç'a tıklayarak ve dosya adlarını seçerek apo-enolase'nin yarı haritalarını açın. Apo-enolase keskinleştirilmemiş haritayı elde etmek için her iki yarım haritayı birleştirmek için komut satırına vop add #1 #2 yazın.
      NOT: #1 ve #2, adım 1.1.1'de belirtildiği gibi apo-enolaz enzimi için iki yarım haritayı gösterir.
   3. Birleştirilmiş haritayı (ChimeraX harita kimliği: #3) rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map yazarak yeniden adlandırın. Model panelinden haritayı griye boyayın. Harita, D4 simetrisi ile çözeltide enolazın oktamerik olduğunu göstermektedir.
   4. PEP-enolase-unsharpened-map (harita ID: #6) elde etmek için aşağıdaki yarım haritaları emd_30989_additional_1.map (harita ID: 4) ve emd_30989_additional_2.map (harita ID:5) kullanarak 1.1.1-1.1.3 adımlarını tekrarlayın.
   5. Bir fark haritası hesaplamak için, önce ChimeraX'taki Harita panelinde (araç çubuğu) Sığdır (haritadaki harita) seçeneğine tıklayarak iki haritayı (adım 1.1.3 ve adım 1.1.4'teki PEP-enolaz ve apo-enolaz keskinleştirilmemiş haritalar) birbirine yerleştirin.
      NOT: İki harita arasında normalleştirme yapılmaz. Bazı durumlarda, haritaları aynı ölçeğe getirmek için normalleştirme gerekebilir.
   6. Komut satırına vop subtract #6 #3 yazarak PEP-enolaz haritasını apo-enolaz haritasından çıkarın.
      NOT: #6 = PEP-enolaz keskinleştirilmemiş harita, #3 = Apo-enolaz keskinleştirilmemiş harita.
   7. Çıkarılan haritayı (harita ID:7) pozitif yoğunluğu gösterecek şekilde yeşile boyayın (X-ışını kristalografisindeki konvansiyona göre)³⁹.
   8. M. tuberculosis oktamerik enolaz (PDB: 7e4x) koordinatlarını Protein Veri Bankası'ndan (PDB) indirin, araç çubuğundan aç'a tıklayın ve dosya adını seçin.
   9. Komut satırına rename #8 Apo_enolase.pdb yazarak 7e4x.pdb modelini yeniden adlandırın. #8, ChimeraX'taki Apo_enolase.pdb'yi belirtir.
   10. Model panelinden modeli seçin. Araç çubuğundan Sağ Fare'ye tıklayın. Modeli PEP-enolaz haritasına (# 6) yakın konumlandırmak ve modeli haritaya göre hizalamak için Molekülü taşı'ya tıklayın. Komut satırına #6 içinde fit #8 yazarak bu modeli PEP-enolase-unsharpened-map'e sığdırın. Burada harita 6, model ise 8 olarak numaralandırılmıştır.
       NOT: Bazı durumlarda, ChimeraX'taki yerel uyum modeli hizalamak için yeterli olmayabilir. Bu durumlarda, Phoenix'te ek bir global fitting adımı (DockinMap, Malzeme Tablosuna bakınız) gerçekleştirilebilir.
   11. Komut satırına save Apo-enolase.pdb #8 yazarak takılan modeli kaydedin.
2. PEP-enolaz kompleksinin B-faktörü keskinleştirilmiş kriyoEM haritasında PEP'in modellenmesi ve iyileştirilmesi
   1. Terminalden ./Coot & yazarak "coot"u (Malzeme Tablosuna bakın) açın.
   2. Dosya'ya tıklayarak "Apo-enolase.pdb" dosyasını görüntüleyin > Apo-enolase.pdb koordinatlarını açın. Koordinat dosyası bağlarla görüntülenir (atoma göre renk).
   3. EMDB'den PEP'e bağlı Enolase keskinleştirilmiş haritasını, yani emd_30989.map'i indirin. Dosya'ya tıklayarak aynısını görüntüleyin > Haritayı Aç > emd_30989.map . Farenin orta düğmesini kaydırarak eşiği 7,00 σ olarak ayarlayın.
   4. Modellenmemiş blobları doğrula > Blobları Bul'> tıklayarak modellenmemiş blobları bulun.
   5. Enolaz modelinin aktif bölge kalıntıları Ser 42, Lys-386 ve Arg-364'ün yakınında modellenmemiş ligand yoğunluğunu bulun.
   6. Coot monomer kitaplığından File > Get Monomer'a tıklayarak ve 3 Harfli kod olarak PEP girerek PEP monomer model dosyasını alın.
   7. Kenar çubuğu menüsündeki Döndür/Çevir- Bölge/Zincir/Molekül seçeneğini kullanarak PEP molekülünü yoğunluğa taşıyın. Kenar çubuğu menüsündeki Gerçek Alan İyileştirme Bölgesi'ne tıklayarak PEP molekülünü yoğunluğa sığdırmak için Coot'ta gerçek alan iyileştirmeyi kullanın. Düzenle sekmesindeki molekül birleştirme seçeneğini kullanarak takılan ligandı Apo-enolase.pdb ile birleştirin. Modeli PEP-Enolase.pdb olarak kaydedin.
      NOT: Ligandı takmak için ligand> Jiggle-Fit Ligand seçeneği de kullanılabilir.
   8. Koordinat dosyasındaki monomerlerin geri kalanına ligandlar eklemek için, NCS Araçları > NCS ligandları > Hesapla'ya tıklayın. NCS ile İlgili Ligandları Bul adlı ayrı bir pencere görünecektir. NCS'li Protein seçeneği için, Apo-enolase.pdb koordinat dosyasını ve NCS Master Chain olarak Chain ID A'yı seçin.
      1. Ligand içeren molekül için, koordinat dosyası olarak Apo-enolase.pdb'yi ve Zincir Kimliği, J ve Kalıntı Numarası 1'den 1'e kadar seçin. Aday pozisyonlarını bul'a tıklayın. Aday pozisyonlarının bir listesini içeren Takılı Ligandlar adlı bir pencere görünecektir. Bireysel aday ligandlara tıklayarak uyumu değerlendirin ve uyumu görsel olarak analiz edin.
         NOT: Servalcat/Refmac'ta sadece bir monomer modeli sağlanabilir ve rekonstrüksiyonda kullanılan simetri verilmiş bir model elde etmek için verilebilir.
   9. Ligandın yakınında çözücü molekülleri için ek yoğunluk da gözlendi. Çeşitli homologlardan elde edilen yüksek çözünürlüklü enolaz kristal yapıları, muhtemelen reaksiyon ara maddesinin negatif yükünü stabilize eden iki Mg²⁺ iyonunun^40,41 varlığını göstermektedir. İşaretçiye atom yerleştir'e tıklayarak ve İşaretçi Atom türü listesinden MG'yi seçerek aktif bölge yoğunluğunda iki Mg²⁺ iyonu modelleyin.
      NOT: Bağ geometrisi ve mesafesi, metal iyonunu seçmek için bir kılavuz olarak kullanılabilir. Protein kalıntılarında oksijen atomlarına bağlı Mg²⁺ durumunda, bağ mesafesi oktahedral geometri ile 2.1 ş-2.4 şarasında değişir. Bununla birlikte, düşük çözünürlüklü haritalar söz konusu olduğunda, koordinasyon alanı genellikle eksiktir ve çözünürlükteki sınırlamalar nedeniyle mesafe de değişebilir.
   10. Simetri ile ilgili monomerlere Mg²⁺ iyonlarını eklemek için adım 1.2.8'i tekrarlayın.
   11. Dosya > Koordinatları kaydet'e tıklayarak > Dosya Adı > Seç'e tıklayarak ve Enolase+PEP+Mg.pdb yazarak modeli kaydedin.
   12. Phoenix GUI'yi açın (Malzeme Tablosuna bakın). Varsayılan parametreleri kullanarak sırasıyla giriş modeli ve harita olarak Enolase+PEP+Mg.pdb ve emd_30989.map ile gerçek bir alan iyileştirme işi çalıştırın. Bu adım, iyi bir harita modeli uyumu ve geometrisi elde etmek için Coot ile yinelemeli olarak yapılır.
       NOT: Keskinleştirilmemiş fark haritası, bir şekilde olduğu gibi ligandın varlığını göstermek için kullanılır. Modelleme amacıyla, B faktörü keskinleştirilmiş harita kullanılmıştır ve önerilir. B faktörü keskinleştirilmiş harita, keskinleştirilmemiş haritanın aksine, gösteri amaçlı fark haritasını hesaplamak için de kullanılabilir. Bununla birlikte, ligandın bağlı olduğu bölgede çözünürlük daha düşükse, tüm haritayı keskinleştirmek için kullanılan tek B faktörü ligand yoğunluğunu net bir şekilde ortaya çıkarmayabilir.
3. Modellenen ligandın görselleştirilmesi ve şekil oluşturulması
   1. PyMOL^42'deki son Phoenix iyileştirme işinden rafine Enolase + PEP + Mg modelini açın (Malzeme Tablosuna bakın) Dosya > Aç'a tıklayarak ve dosya adını seçerek açın.
   2. Dosya > Aç'a tıklayarak ve dosya adını seçerek emd-30989.map dosyasını (PEP'e bağlı keskinleştirilmiş harita) yükleyin.
   3. Eylemlere tıklayarak haritayı PEP keskinleştirilmiş olarak yeniden adlandırın > emd_30989 nesneye karşı yeniden adlandırın ve PEP keskinleştirilmiş yazın.
      NOT: Çoğu durumda, örneğin enolaz, pymol'de açıldığında haritalar normalleştirilir, çünkü haritayı normalleştir seçeneği pymol'de varsayılan olarak işaretlidir. CryoEM haritaları daha büyük bir kutuya odaklandığından, normalleştirme kutudaki her şeyi içerecektir. Böylece, pymol'de açılmadan önce normalizasyon kapatılabilir.
   4. Dizisini görüntülemek > tıklayarak ligandları seçin.
   5. Komut satırına isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 yazın ve enter tuşuna basın.
   6. mesh_ligand nesnenin yanındaki son kutu olan C'ye tıklayarak mesh_ligand maviye boyayın.
   7. Aktif bölge kalıntılarını, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 ve Lys-386'yı sırasıyla çubuk ve küre temsilinde PEP ve Mg²⁺ ile etkileşime girerek ve enolaz enzimini çizgi film temsilinde görüntüleyin.
   8. Yayın kalitesinde görüntüler oluşturmak için ray 3600, 3600 yazarak ışın izleme yapın ve Dosya'ya tıklayarak > kaydedin ve dosya adı olarak PEP.png'yi seçerek png dosyası olarak kaydedin.

2. Metabotropik Glutamat reseptörü mGlu 5'teki ligandların modellenmesi

1. Agonist ve antagoniste bağlı mGlu'nun cryoEM haritasındaki ligand yoğunluğunun belirlenmesi ve modellenmesi₅
   1. Agonist bağlı (EMD-31536, 7fd8.pdb) ve antagonist bağlı (EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu₅ komplekslerinin her biri için karşılık gelen koordinat dosyalarıyla birlikte iki yarım haritayı indirin.
   2. ChimeraX'i açın
      1. Aç'a tıklayıp 7fd8.pdb'yi seçerek 7fd8.pdb koordinat dosyasını açın.
      2. Komut satırına delete ligand yazın ve Enter'a basın.
      3. Benzer şekilde, B zincirini silmek için delete/B komutunu kullanın.
         NOT: Ligandlar ve zincirler, silmek > atomlar/bağlar > seçme ve eylemler kullanılarak üstteki açılır menü kullanılarak silinebilir.
      4. Komut satırına aşağıdakileri yazarak ligandlanmamış pdb'yi kaydedin: save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 model kimliğini belirtir.
      5. 2.1.2.1-2.1.2.4 adımlarını 7fd9.pdb için tekrarlayın.
   3. CCP-EM'yi açın. mGlu₅ adlı yeni bir proje oluşturun ve proje dizinini ve kullanıcı adını belirtin.
      1. Sol paneldeki seçeneklerden Relion'u açın.
         1. Maske Oluşturma sekmesine gidin.
         2. Giriş olarak EMD-31536 için yarım haritalardan birini sağlayın.
            NOT: Relion, son ek olarak .mrc içeren haritaları kabul eder ve EMD haritaları .map sonekine sahiptir. Harita dosyaları incelenmek üzere ChimeraX'ta açılabilir ve .mrc formatında kaydedilebilir.
         3. Maske sekmesinde piksel boyutunu 0,89 Å ve ilk ikili eşiği 0,007 olarak sağlayın.
         4. İşi 31536 diğer adıyla (veya izlemesi kolay başka bir adla) çalıştırın.
         5. Benzer şekilde, EMD - 31537 yarım haritası için bir maske oluşturun.
      2. CCPEM'de sol panelde bulunan seçeneklerden Refmac Servalcat programını açınız.
         1. Adı mGlu₅_agonist olarak sağlayın.
         2. 7fd8_noligand_chainA .pdb dosyasını model bölümü 2.1.2.4'te açıklandığı gibi içe aktarın. İki yarım haritanın konumunu ve Relion'da oluşturulan ilgili maskeyi sağlayın.
         3. Çözünürlüğü 3,8 şolarak belirtin.
         4. Katı Simetri > iyileştirme ayarlarına gidin ve Relion nokta grubu simetrisi olarak C2'yi belirtin.
         5. Üst kısımda bulunan başlat düğmesine basarak programı başlatın.
   4. İş bittiğinde, sonucu Coot'ta açın (sonuç bölümünde en üstte bulunan seçenek). Bu, varsayılan olarak Coot'ta bir diffmap.mtz görüntüler, burada kırmızı ve yeşil renkler sırasıyla negatif ve pozitif yoğunlukları gösterir.
      1. Görüntü yöneticisine gidin > DELFWT PHDELWT etiketli fark haritasının özelliklerini seçin ve kontur seviyesini 4.0 (mutlak değer) olarak değiştirin.
         NOT: Eşik seçimi haritaya ve çözünürlüğe bağlıdır.
      2. FWT PHWT etiketli haritayı ve refined.pdb etiketli molekülü gizleyin.
      3. Pozitif yoğunluğu (yeşil renkli) görselleştirmek için fareyi kullanarak haritayı hareket ettirin ve daha büyük blobu merkeze getirin.
      4. Dosya > Monomer Al'a gidin, QUS yazın ve enter tuşuna basın.
      5. Rijit Vücut Uyumu molekülü > Hesaplama > Modelleme bölümüne gidin ve molekülü Fo-Fc yoğunluğuna uyacak şekilde ayarlamak için QUS monomerine çift tıklayın.
      6. QUS molekülünü refined.pdb koordinat dosyasına eklemek için düzenle sekmesindeki molekülü birleştir seçeneğini kullanın.
      7. 2.1.4.3-2.1.4.6 adımlarını, sırasıyla hücre dışı ve transmembran alanının tepesindeki daha küçük blob içine monomer kodu NAG ve CHS ile ligandı sığdırmak için tekrarlayın.
      8. Koordinatı refined_ligands.pdb olarak kaydedin.
         NOT: Transmembran (TM) alanının çözünürlüğü daha düşüktür ve bu nedenle burada tartışılmamıştır.
2. mGlu₅ ligandlı yapının iyileştirilmesi
   1. CCPEM'i açın ve önceki iyileştirme işini kopyalayın (adım 2.1.3.2) ve refined_ligands.pdb ve keskinleştirilmiş harita (emd. 31536.mrc) giriş olarak, varsayılan parametreleri ve C2 simetrisini kullanarak.
      NOT: Program ligandı tanımazsa, CIF dosyalarının sağlanması gerekir. Bu CIF dosyaları PDB'den indirilebilir veya çeşitli programlar kullanılarak oluşturulabilir (ayrıntılar için bkz. adım 3.1.1).
3. PyMOL'de görselleştirme ve figür oluşturma
   1. PyMOL'deki en son Refmac iyileştirme işinden refined_expanded.pdb modelini açın.
   2. Dosya > Aç'a gidin ve diffmap_normalised_fofc.mrc (adım 2.1.3.2'deki Servalcat işinden fark haritası) dosyasını yüklemek için Refmac iş dizinine göz atın.
      NOT: Tarama sırasında .mrc uzantılı dosyalar görünmüyorsa, dosya türünü tüm dosyalar olarak değiştirin ve göz atın.
   3. Ekran > sırasını kullanarak ligandları seçin.
   4. Eylemler düğmesine gidin ve seçimi ligandlar olarak yeniden adlandırın.
   5. Komut satırına aşağıdakileri yazın ve enter tuşuna basın: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.
      NOT: Ağ genişliği ayarlanabilir. Burada 0,2 ağ genişliği kullanılır ve bu, aşağıdaki komut kullanılarak ayarlanır: mesh_width=0,2 olarak ayarlayın.
   6. Monomerlerden birine sağ tıklayın ve her bir monomerin rengini belirtmek için zincir > rengine gidin. Ligandı ve mesh_ligands nesnelerde c etiketli son kutuyu kullanarak ligandı ve ağı renklendirin. mGlu₅ reseptör dimeri çizgi film temsilinde gösterilmiştir ve monomerler deniz mavisi ve buğday rengindedir. Ligandlar çubuk halinde gösterilir ve ligandları şekillendiren ağ yeşil renktedir.
   7. Nesnelere karşı yönlendirme / merkez / yakınlaştırma seçeneği > eylemleri kullanın ve ağı net bir şekilde görselleştirmek için manuel olarak ayarlayın. Ligand ile etkileşime girebilecek yakındaki kalıntıları seçin, örneğin, Tyr64, QUS için Trp100 ve gerektiği gibi, yan zincirlerini veya ana zincirlerini veya her ikisini de çubuk temsili olarak görüntüleyin.
   8. Yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak ve bunları bir png dosyası olarak kaydetmek için ışın izleme.
      NOT: Yukarıdaki adımlar, antagonist bağlı harita EMD-31537 ve karşılık gelen koordinat dosyası PDB-7fd9 için tekrarlanır.

3. İnhibitör, deoksigalakto-nojirimisin (DGN) ve çözücü moleküllerinin yüksek çözünürlüklü keskinleştirilmiş bir β-galaktosidaz haritasında modellenmesi

1. CryoEM'den alınan yarı haritaları kullanarak ligandın, DGN'nin tanımlanması
   1. Modelleme için bilinmeyen Ligand sözlüğünün hazırlanması [Deoksigalakto-nojirimycin(DGN)]
      NOT: Deoksigalakto-nojirimisin sözlük dosyası, CCP4 monomer kütüphanesine DGJ (3 harfli ligand ID) olarak dahil edilmiştir. Bununla birlikte, burada bilinmeyen ligandlar için sözlük dosyaları oluşturma sürecini göstermek için yeni ve bilinmeyen bir ligand olarak kabul edilir, DGN 3 harfli kod olarak kullanılır.
      1. PubChem web sayfasında deoksigalakto-nojirimisin (DGN) için bileşik özetini açın ve deoksigalakto-nojirimisin bileşiği için gülümseme dizesini kopyalayın.
      2. eLBOW > Phenix > Ligandlarını açın.
      3. Gülümseme dizesini giriş olarak belirtin.
      4. Uygun ligand bina optimizasyon yöntemini belirtin. Burada basit optimizasyon kullanılır.
      5. Ligand tanımı bölümüne kimyasal gülümseme ipini yapıştırın.
      6. Bir iş unvanı, çıktı dosyası öneki ve ligand kimliğini uygun şekilde sağlayın ve çalıştır'a basın.
         Not: İşin çıktısı bir koordinat dosyası (DGN.pdb) ve bir sözlük dosyası (DGN.cif dosyası) içerir. Jligand²⁹ , cif dosyasını oluşturmak için de kullanılabilir.
   2. PDB'den β-galaktosidaz koordinat dosyasını (6tsh.pdb) indirin ve bir metin düzenleyici kullanarak protein zincirleri (B, C, D), ligand, DGN ve diğer çözücü molekülleri için koordinatları kaldırın veya Coot'ta zincir / bölge seçeneğini silin. Koordinat dosyasını apo-betaGal_chainA.pdb olarak kaydedin.
      NOT: ChimeraX veya Pymol, ligand/çözücü molekülünü çıkarmak için de kullanılabilir.
   3. EMDB'den EMD-10563 girişinin ek verilerinden yarım haritaları (emd_10563_half_map_1.map ve emd_10563_half_map_2.map) indirin.
   4. CCPEM'i açın ve 0,01 eşiğinde harita için maske oluşturmak için Relion'u kullanın (2.1.3.1.1-2.1.3.1.4 adımlarında açıklandığı gibi).
   5. Adım 3.1.3'te elde edilen yarım haritalar ve adım 3.1.2'de apo modeli ve D2 simetrisi ile Servalcat'i (adım 2'de açıklandığı gibi CCPEM paketi içinde) çalıştırın.
      NOT: Ligand yoğunluğunu bulmak için modelin yarım haritalardan veya tam haritalardan birine hizalanması gerekir. Bu, modeli ChimeraX kullanarak haritaya sığdırarak ve ardından koordinatları yarım haritaya göre kaydederek yapılabilir. Bu örnekte, yarı haritalar ve EMDB'deki birincil harita farklı kutu boyutlarına/ızgaralara sahiptir ve modelin yarım haritaya yerleştirilmesi gerekir.
   6. Coot'u açın.
      1. Phoenix eLBOW ile adım 3.1.1'de oluşturulan ligand sözlüğü için DGN.cif dosyasını açın. Bu, Dosya > CIF sözlüğünü İçe Aktar'a giderek ve eLBOW iş dizinine göz atarak yapılır.
      2. Protein ve ligand koordinat dosyalarını, sırasıyla adım 3.1.2'den apo-betaGal_chainA.pdb ve adım 3.1.6'dan DGN.pdb'yi açın.
      3. Servalcat işinden diffmap.mtz dosyasını otomatik olarak açın (adım 3.1.5) ve Coot'ta DELFWT PHDELWT etiketli haritayı görselleştirin. Haritayı ~ 4 mutlak değer eşiğinde konturlayın.
         NOT: map.mrc başlığını yazarak veya Chimera'daki araçları kullanarak harita istatistiklerini kontrol etmek önemlidir. Piksel boyutu, kutu boyutu, minimum, ortalama ve maksimum yoğunluk ve ortalama yoğunluktan rms sapması ile ilgili gerekli tüm bilgiler elde edilebilir. CryoEM haritalarının piksel boyutunu ve kutu boyutunu kontrol etmek çok önemlidir. 3B harita, 3B voksellerden oluşan bir ızgarada protein-ligand harita hacmini temsil eder. Her vokselde elektron potansiyel değeri veya o konumda elektronu bulma olasılığı saklanır. Belirli bir eşik seçildiğinde, belirtilen değerden daha düşük bir yoğunluğa sahip olan vokseller sıfıra ayarlanır. Bu, haritadaki deneysel gürültüyü en aza indirmeye ve harita özelliklerini daha iyi görselleştirmeye yardımcı olur⁴³. Bu nedenle, harita, harita özelliklerinin kolayca görülebileceği ve haritadaki gürültünün minimum olduğu bir eşikte konturlanmalıdır.
      4. Ligand'a gidin > Ligandları bulun. Görüntülenen yeni pencerede ligandı, fark haritasını ve apo-betaGal_chainA.pdb modelini seçin. Diğer seçenekleri varsayılan ayarlarında bırakın ve aramayı başlatmak için Ligandları Bul'a tıklayın.
      5. Potansiyel ligand yoğunluğunu gösteren en iyi vuruşların bir listesi, yoğunlukların her birine yerleştirilmiş bir kopya ile görüntülenir. Ligandın yerleştirildiği tüm vuruşları manuel olarak kontrol edin. En olası isabetleri saklayın ve belirsiz olanları kaldırın.
         NOT: Yüksek bir eşikte harita yoğunluğundaki fark, aktif bölgede ligandın varlığını açıkça göstermektedir.
2. Ligand DGN ve solvent moleküllerinin modellenmesi
   1. Fark yoğunluğu haritasına ligandı (DGN.pdb) sığdırmak için Coot'ta gerçek bir alan iyileştirmesi gerçekleştirin ve ardından ligand koordinatlarını apo-betaGal_chainA.pdb ile birleştirin ve betaGal_chainA+ligand.pdb olarak kaydedin.
      NOT: Diğer zincirlerin bölgelerine yerleştirilmiş olan ligandlar, birleştirilmiş koordinat dosyası kaydedilirken çıkarılabilir ve birleştirilemez. Diğer zincirlerdeki ligandlar, örnek 1, adım 1.2.8'de gösterildiği gibi NCS Ligandları tarafından veya simetri açılımı kullanılarak Refmac / Servalcat'te üretilebilir.
   2. Giriş modeli olarak betaGal_chainA+ligand.pdb ve D2 simetrisi ile yarım haritalar (adım 3.1.3'ten itibaren) ile yukarıdaki gibi (adım 3.1.5) başka bir Servalcat işi çalıştırın.
   3. Modellenen ligandı çevreleyen fark yoğunluğu (adım 3.2.2'deki Servalcat işinden), ligand molekülü ile koordineli olarak çalışan çözücü moleküllerinin varlığını göstermektedir. Ligand'a yakın merkezi yoğunluk, su molekülleri için çok büyük görünmektedir.
   4. Bu konumda Mg^{2 +} 'nın varlığını gösteren önceki biyokimyasal ve yapısal verilere dayanarak, Mg²⁺ iyonu burada atomu yerleştir seçeneğine tıklanarak ve atomu MG olarak belirterek modellenir.
   5. Çözücü molekülünün varlığını gösteren aktif bölgedeki fark yoğunluğundaki su moleküllerini, işaretçideki atomun yerine tıklayarak ve suyu seçerek modelleyin.
      NOT: Coot ayrıca su moleküllerini otomatik olarak toplama seçeneğine de sahiptir. Burada odak sadece aktif bölge üzerinde olduğu için su molekülleri manuel olarak eklenir.
   6. Mg²⁺ ve su koordinatlarını betaGal+ligand.pdb dosyasıyla birleştirin ve betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb olarak kaydedin.
   7. betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb ile D2 simetrisi ile Servalcat'te Refmac iyileştirmesi gerçekleştirin.
      NOT: Bu işten elde edilen çıktı farkı haritası, fark haritasının minimum artık pozitif veya negatif yoğunluk göstermesi gerektiğinden, ligandın doğru bir şekilde modellenip modellenmediğini doğrulamak için bir araç görevi görebilir.
3. PyMOL ile görselleştirme ve figür oluşturma
   NOT: Aşağıda özetlenen adımlar, ligandların ve çözücülerin varlığını göstermek için kullanılabilecek modelleri ve haritaları kullanarak şekil oluşturmaya ilişkin birkaç örnek sağlar.
   1. Son Servalcat işinden (adım 3.2.6) refined_expanded.pdb'yi ligand ve çözücü modellenmiş olarak açın.
   2. Örnek 2'de açıklandığı gibi macenta, sarı, yeşil ve deniz mavisi renklendirmek için farklı zincirleri ayrı ayrı seçin.
   3. Görüntü > Sırası'na gidin, su molekülleri, magnezyum ve DGN için ayrı seçimler yapın ve nesneleri sırasıyla su, MG ve DGN olarak yeniden adlandırın.
   4. Nesneleri seçip sağ tıklayarak MG ve su moleküllerini küre olarak görüntüleyin ve > küre gösterin. Benzer şekilde, ligandı çubuk temsilinde görüntüleyin ve ligandları ve çözücüleri uygun şekilde renklendirin. Bu durumda, ligand bir heteroatom tarafından sarı renktedir, magnezyum iyonu mor renktedir ve su molekülleri kırmızı renktedir.
   5. DGN, MG ve su moleküllerini seçin. Nesneye kopyalamak > eylemleri sağ tıklayın ve seçin ve ligandlar olarak adlandırın.
   6. Adım 3.2.6'daki Servalcat işinden diffmap_normalised_fo.mrc'yi açın ve ligand_fo.mrc olarak yeniden adlandırın. Şu komutu yazın: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligandlar, carve=2.
      NOT: Atomların etrafına 2 şoyma seçeneği uygulanır ve haritaların çözünürlüğüne ve kalitesine bağlı olarak 3-5 değerleri kullanılabilir. Ayrıca, PyMOL'de cryoEM haritalarını açarken normalize_ccp4_maps kapalı olarak ayarlamanız önerilir.
   7. Yönlendirme/yakınlaştırma seçeneklerinin > eylemleri kullanın ve adım 2.3.7'de gösterildiği gibi ligandları ve yakındaki etkileşimli kalıntıları (uygun olan her yerde) görselleştirmek için manuel olarak ayarlayın.
   8. Işın 3600, 3600 komutunu kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntüleri kaydetmek için bu sahneleri ışın izleyin.
   9. Sahneyi .png dosyası olarak kaydedin.
      NOT: Aşağıdaki adımlar isteğe bağlıdır ve (1) modellenmemiş ligand, DGN için fark yoğunluğunu (Fo-Fc), (2) modellenmemiş ligandın yoğunluğunu (Fo), DGN'yi ve modellenmemiş çözücüler için fark yoğunluğunu (Fo-Fc) ve son olarak (3) modellenmiş ligand, DGN ve aktif bölgedeki çözücü molekülleri için yoğunluğu (Fo) görselleştirme sürecini ana hatlarıyla belirtir.
   10. Fark haritasını kullanarak ligand, DGN ve çevresindeki çözücü moleküllerinin varlığını göstermek için, adım 3.1.5'teki Servalcat işinden diffmap_normalised_fofc.mrc'yi açın. Harita nesnesinin yanındaki eylemlere > yeniden adlandır'a tıklayarak harita dosyasını unliganded_fofc.mrc olarak yeniden adlandırın. Komut satırına şunu yazın: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligandlar, level=6, carve=2.
   11. Modellenmiş ligandın, DGN'nin yoğunluğunu ve çevresindeki modellenmemiş çözücü yoğunluğunu göstermek için, adım 3.2.2'deki servalcat işinden diffmap_normalised_fo.mrc'nin yanı sıra diffmap_normalised_fofc.mrc'yi açın. diffmap_normalised_fo.mrc'yi DGN_fo ve diffmap_normalised_fofc.mrc'yi DGN_unmodelled_solvents_fofc olarak yeniden adlandırın.
   12. Display > Sequence'dan MG ve suyu seçin, sağ tıklayın ve nesneye kopyalamak > eylemleri seçin ve bunları çözücü olarak adlandırın.
   13. Komut satırına şunu yazın: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, çözücüler, level=6, carve=2.
       NOT: mesh_DGN_fo, ligandın yoğunluğunu gösterecek ve mesh_solvent_fofc, MG ve su için ihmal yoğunluğunu gösterecektir.
   14. Son olarak, modellenen ligandları ve aktif bölgedeki çevreleyen çözücü moleküllerini görselleştirmek için, adım 3.2.6'daki Servalcat işinden diffmap_normalised_fo.mrc'yi açın ve ligand_fo.mrc olarak yeniden adlandırın.
   15. Komut satırına şunu yazın: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
       NOT: Burada diffmap_normalised_fo.mrc kullandık, ancak son keskinleştirilmiş harita, ligandların ve çevredeki kalıntıların yoğunluğunu göstermek için kullanılabilir. Kullanılan haritanın türünü, B-faktörü keskinleştirme değerlerini şekil açıklamasında belirtmek iyi bir uygulamadır.
   16. Kafes genişliği ve küre boyutu aşağıdaki komutlar yazılarak ayarlanabilir: küre boyutunu küçültmek için mesh_width=0,2 olarak ayarlayın ve sphere_scale=0,25 olarak ayarlayın .
   17. Fo ağını maviye ve fofc ağını yeşile boyayın.
   18. Adım 2.3.7'de gösterildiği gibi, yönlendirme/yakınlaştırma seçeneklerini > eylemleri kullanın ve ligandları ve yakındaki etkileşimli kalıntıları (uygun olan her yerde) görselleştirmek için manuel olarak ayarlayın.
   19. Işın 3600, 3600 komutunu kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntüleri kaydetmek için bu sahneleri ışın izleyin.
   20. Tek tek sahneleri .png dosyaları olarak kaydedin.

4. β-galaktosidazda çözünürlüğün ligand modellemesine etkisi

1. Terminal'i açın ve iki yarım haritayı içeren dizine gidin.
2. İki yarım haritayı (adım 3.1.3) .map formatında ChimeraX'ta açın, görselleştirin ve emd10563_half1_1_unfil.mrc ve emd10563_half2_1_unfil.mrc olarak kaydedin.
3. Adım 3.1.4'te oluşturulan maske bir girdi olarak kullanılabilir.
4. Varsayılan parametrelerle 4.2-4.3 adımlarındaki yarım haritaları ve maskeleri kullanarak Relion'da bir Son İşleme işi çalıştırın.
5. Adım 4.4'ü tekrarlayın, şimdi FSC tartımını atla etkinleştirilmiş ve 3 Å'lik geçici bir alçak geçiren filtre belirterek.
6. Adım 4.4'ü 3.5 Å'lik geçici bir alçak geçiren filtre ile tekrarlayın.
7. 4.4-4.6 adımlarındaki haritaları (postprocess.mrc) açın, farklı çözünürlüklerde filtreleyin ve PyMOL'deki 3.1.2 adımındaki model koordinatı olan 6tsh.pdb (ChimeraX'teki yarı haritalara hizalanmış) dosyasını açın. Farklı haritaları, çözünürlüklerine göre tanımlandığı şekilde 3.0, 3.5 ve 2.3 olarak yeniden adlandırın.
   NOT: Haritaların alçak geçişli filtrelemesi, onları ChimeraX veya Coot'ta görselleştirerek doğrulanabilir.
8. Farklı çözünürlüklere filtrelenmiş haritalarla adım 3.3.6'da açıklandığı gibi 6σ eşiğinde ligand ve çözücü molekülleri etrafında 2 Å'lik bir ağ oluşturarak çözünürlüğün ligand ve çözücü moleküllerinin yoğunluğu üzerindeki etkisini görselleştirin.

Results

Örnek 1
M. tuberculosis'ten elde edilen enolaz enzimi, glikolizin sondan bir önceki adımını katalize eder ve 2-fosfogliseriatı, çeşitli metabolik yollar için temel bir ara madde olan fosfoenolpiruvata (PEP) dönüştürür^44,45. Apo-enolaz ve PEP'e bağlı enolaz örnekleri için CryoEM verileri aynı piksel boyutu olan 1.07 Å'de toplandı ve Relion 3.1^46,47 ile görüntü işleme gerçekleştirildi. Apo-enolaz ve PEP-enolaz yapıları sırasıyla 3.1 şve 3.2 şolarak belirlendi⁴⁸. Haritalar ve modeller EMDB ve PDB ^49,50'de (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x ve PDB-7e51) saklandı. Enzimin cryoEM haritası, çözeltide bir oktamer olduğunu gösterir (Şekil 1A). PEP-enolaz haritasındaki ligand yoğunluğunu tanımlamak için, apoenzim ve PEP'e bağlı enzimin keskinleştirilmemiş haritaları seçildi ve apoenzim haritasından PEP-enolaz haritası çıkarılarak ChimeraX'ta bir fark haritası hesaplandı. Yüksek bir eşikte belirgin bir yoğunluk (yeşil) gözlendi, bu da ligandın varlığını düşündürdü (Şekil 1B). Protein zincirinin keskinleştirilmemiş haritada modellenmesi, ekstra yoğunluğun proteinin aktif bölgesinde mevcut olduğunu açıkça göstermiştir (Şekil 1C). Ligand, PEP, daha sonra Coot kullanılarak B-faktörü keskinleştirilmiş haritada modellendi ve protein+ligand modeli, Phoenix ile gerçek uzayda rafine edildi. Ligandın yakınında gözlenen yoğunlukta iki Mg²⁺ iyonu modellenmiştir (Şekil 1D). Ligand, PEP, diğer enolaz homologlarında gözlemlenene benzer bir yönelimi benimser ve Lys-386, Arg-364 gibi birkaç aktif bölge kalıntısı, ligand PEP ile hidrojen bağı etkileşimleri oluşturur. Mg²⁺ iyonları, Asp-241, Glu-283, Asp-310 ve PEP'in fosfatı ile metal koordinasyon bağları oluşturur (Şekil 1D).

Örnek 2
Mevcut bir apo-protein yapısının yokluğunda veya protein büyük bir konformasyonel değişikliğe uğrarsa, yukarıda tarif edildiği gibi fark haritalarını hesaplamak mümkün değildir. 2021'de Garib Murshudov'un Cambridge'deki Moleküler Biyoloji Laboratuvarı'ndaki grubu, Refmac kullanarak bir iyileştirme iş akışı uygulayan ve ayrıca iyileştirmeden sonra bir Fo-Fc fark haritası hesaplayan Servalcat^22'yi tanıttı. Pozitif bir Fo-Fc fark yoğunluğu, arıtma sırasında modele dahil edilmeyen moleküllerin/ligandların varlığını, esasen bir atlama haritasını önerir. Ancak öncelikle modelin genel olarak haritaya uyumunun değerlendirilmesi ve ardından fark yoğunluk haritasının değerlendirilmesi önerilir.

Servalcat/Refmac'ın kullanımını göstermek için, nörotransmitere bağlanan dimerik bir G-proteinine bağlı reseptör olan mGlu₅, L-Glutamat seçildi. Agonistin, L-quisqualate'in bağlanması üzerine, hücre dışı alan yeniden yönlendirilir, bu da 7TM'nin dönüşünü tetikler ve aktive olmuş durumu stabilize etmek için onları daha da yaklaştırır. Bu nedenle, apo/ antagonist ile arasında büyük bir konformasyonel değişiklik gözlenir. agonist bağlı durumlar⁵¹ (Şekil 2A ve Şekil 2E). Hem agonist (EMD-31536) hem de antagonist (EMD-31537) bağlı kompleksler için iki yarı harita EMDB'den elde edildi ve kriyoEM haritaları, molekül boyunca değişen çözünürlük ve daha iyi çözülmüş hücre dışı alan gösterdi. Daha sonra bunlar, her bir veri kümesi için farkı veya Fo-Fc haritasını hesaplamak için model olarak apo-protein ile birlikte Servalcat'ta girdi olarak kullanıldı. Bu harita, çeşitli ligand moleküllerinin (protein olmayan) varlığını belirgin bir şekilde gösterdi. Agonist ve antagonist bağlı kompleksler için FSC (Fourier Shell korelasyonu) ile tahmin edilen çözünürlük sırasıyla 3.8 şve 4.0 şidi. Agoniste bağlı mGlu₅ durumunda, Servalcat Fo-Fc fark haritası, reseptörün ECD'sinde hem agonistin (L-quisqualate) (Şekil 2B) hem de N-AsetilGlukozamin (NAG) (Şekil 2C) varlığını gösterdi (TMD'nin daha düşük çözünürlüğü nedeniyle, burada sadece ECD'ye ve TMD'nin üst kısmına odaklanıyoruz). Tyr-64, Trp-100, Ser-151 ve Thr-175 dahil olmak üzere protein kalıntılarının agonist ile etkileşime girdiği görülmektedir. Asn-210 kalıntısına yakın yoğunluk, N-asetil glukozamin varlığını düşündürdü. mGlu_5'in saflaştırılması sırasında eklenen kolesteril hemisüksinat ile tutarlı bir yoğunluk, transmembran sarmal 1'in tepesine yakın bir yerde gözlenmiştir (Şekil 2D). Çözünürlük orta düzeyde olduğundan ve ligand, L-quisqualate, farklı yönlere yerleştirilebildiğinden, ligandı modellemek için bir kılavuz olarak ligand ile hücre dışı alanın önceki yapısı (PDB-6N50) kullanılmıştır. Antagonist bağlanması, reseptörün açık veya dinlenme durumunu stabilize eder (Şekil 2E). ECD'deki venüs sinek tuzağı alanının lob I ve lob II'nin menteşesinde antagonist LY341495 ile uyumlu bir yoğunluk gözlendi. Antagonist, agonistinkine benzer kalıntılarla etkileşime girer. Lob II'deki Tyr-223 ile antagonist arasındaki istifleme etkileşimi, reseptörü açık bir durumda stabilize eder (Şekil 2F). Agonist yapıya benzer şekilde, Asn-210 yakınında glikosilasyon veya N-asetilglukozamin kısmının varlığı gözlenmiştir (Şekil 2G).

Örnek 3
Üçüncü örnek, yüksek çözünürlüklü CryoEM haritalarında parça boyutlu veya küçük boyutlu ligandları ve çözücü moleküllerini modellemek için protokolü açıklar. Parçaya Dayalı İlaç Keşfi (FBDD), çeşitli hastalık alanlarında hedefe dayalı yeni terapötiklerin geliştirilmesinde güçlü ve yenilikçi bir yöntem olarak ortaya çıkmış ve onu ilaç Ar-Ge'sinde umut verici bir yol haline getirmiştir^52,53. FBDD, belirli hedef proteinlere veya ilgilenilen biyomoleküllere bağlanan küçük, yüksek derecede çözünür, düşük moleküler ağırlıklı molekül parçalarının taranması ve dikkatli bir şekilde seçilmesi ile başlar. Bu protein-fragman komplekslerinin yapılarının belirlenmesi, hedef proteine karşı artan afinite ve özgüllüğe sahip daha büyük ve daha karmaşık ilaç benzeri moleküllerin tasarlanması için bir kılavuz görevi gören bu fragmanların bağlanma modunu ortaya çıkarır⁵⁴. Bununla birlikte, bu yöntem, pozu doğru bir şekilde belirlemek ve ligandın¹⁵ fonksiyonel gruplarını doğru bir şekilde yerleştirmek için yüksek çözünürlüklü bir ligand yoğunluğu gerektirir.

CryoEM teknolojisindeki gelişmelerden belirlenen ilk yüksek çözünürlüklü yapılardan biri olan β-galaktosidaz, laktozun glikoz ve galaktoza 55 hidrolizini katalize eden, iyi çalışılmış^450kDa homotetramerik bir enzimdir. FBDD'de cryoEM kullanımını sergilemek için Astex, İngiltere, aktif bölgeye bağlı fragman boyutunda bir inhibitör olan deoksigalakto-nojirimisin (DGN) ile β-galaktosidazın yapısını belirledi (EMDB-10563, PDB: 6tsh)⁵⁶. Bu veri seti, ligandları ve çözücüleri yüksek çözünürlüklü haritalarda açık bir şekilde modelleme protokolünü göstermek için kullanılır. Çözünürlüğün ligand modelleme ve görselleştirme üzerindeki etkisini göstermek için, haritalar Relion'daki işlem sonrası adımda 3.0 şve 3.5 şolarak filtrelendi. Bu, farklı çözünürlüklerde harita yoğunluğunun kalitesini vurgular ve ligandları ve çözücüleri modellemek için daha yüksek çözünürlüğe duyulan ihtiyacın altını çizer.

Enzim, çözelti içinde D2 simetrisine sahip bir tetramerdir (Şekil 3A). Servalcat tarafından hesaplanan fark haritası (harita ve model arasında), enzimin aktif bölgesinde DGN ve birkaç çözücü molekülünün varlığını önerdi (Şekil 3B). Tahmini 2.3 şçözünürlükte, yoğunluk, protein aktif bölgesindeki inhibitörün doğru modellenmesine yardımcı olan yüksek çözünürlüklü özellikler gösterdi. DGN ile Tyr-503 ve His-540 arasındaki etkileşimler gözlenmiştir (Şekil 3C). Fark yoğunluğu ayrıca, protein kalıntılarının yanı sıra DGN ile etkileşime giren çözücü moleküllerinin varlığını da önerdi. Yoğunlukta Mg²⁺ ve birkaç su molekülü modellenmiştir (Şekil 3D). Mg^{2 +} ve Glu-416, Glu-461 ve birkaç su molekülü arasında metal koordinasyon bağları gözlenir (Şekil 3D). Mg^{2 +} 'nın bir su molekülü aracılığıyla DGN ile etkileşime girdiği görüldü.

3.5 şve 3.0 şgibi daha düşük bir çözünürlükte, ligand yoğunluğu bir blob'a benzer ve ligandın doğru modellenmesi için çok önemli olan yüksek çözünürlüklü özelliklerden yoksundur (Şekil 4A, B). Bu çözünürlüklerde su molekülleri için yoğunluk neredeyse yoktu. Özetle, artan çözünürlükle, özellikle 3.0 Å'den daha yüksek olan yoğunluk, daha fazla sayıda su molekülünün modellenmesini sağladı (Şekil 4C, D). Ligandın kiral merkezinin doğru konumlandırılması, haritada su moleküllerinin ve Mg^{2.3 +} 'nın yerleştirilmesine ve modellenmesine rehberlik eden farklı özelliklerin varlığı nedeniyle ~ 2 Å'de (Şekil 4C, D) elde edilebilir hale geldi. Karşılaştırıldığında, Mg^{2 +} için yoğunluk, çözünürlük aralığı boyunca fark edilebilir kaldı (Şekil 4A-C).

Şekil 1: M. tuberculosis enolase'de ligand fosfoenolpiruvatın modellenmesi. (A), PEP'e bağlı enolaz enziminin B-faktörü keskinleştirilmiş haritasını göstermektedir. Harita, enolazın çözelti içinde oktamerik olduğunu ve haritadaki her monomerin farklı renkte olduğunu göstermektedir. (B) apo-Enolaz enziminin keskinleştirilmemiş bir kriyoEM haritasını, gri renkte, fark haritasını (PEP'e bağlı ve apo-Enolaz keskinleştirilmemiş haritalar arasında) yeşil renkle kaplanmış olarak gösterir, bu da ligand, PEP'in varlığını düşündürür. Bu, ligandların varlığını gösteren bir gösteri haritasıdır. (C) keskinleştirilmemiş cryoEM haritasında enolaz modelinin uyumunu gösterir ve proteine göre fark yoğunluğunun konumunu vurgular. Protein modeli çizgi film temsilinde gösterilmiş ve Chainbow ile renklendirilmiştir. Bu şekil, ekstra yoğunluğun (yeşil) her bir monomerin aktif bölgesinde mevcut olduğunu göstermektedir. (D), B-faktörü keskinleştirilmiş haritada yer alan, mavi renkli ligand, PEP'i gösterir. Ek olarak, Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 ve ligand atomları dahil olmak üzere çeşitli aktif bölge kalıntıları ile metal koordinasyon bağları oluşturan iki Mg²⁺ iyonu için yoğunluk da gözlendi. Ligand, Lys-386, Lys-335 ve Arg-364 ile hidrojen bağı etkileşimleri yapar. Protein kalıntıları çubuk temsilinde gösterilir ve Mg²⁺ iyonları mor küreler olarak gösterilir. Panolardaki figürler (A-D) Pymol ile oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: mGlu₅ reseptöründeki çeşitli ligandların tanımlanması, modellenmesi ve görselleştirilmesi. Fo-Fc atlama haritaları Servalcat kullanılarak elde edildi. (A), mGlu₅ reseptör dimer yapısını (PDB-7fd8) karikatür temsilinde, her bir monomer sırasıyla deniz mavisi ve buğdayda renklendirilmiş ve agonist L-quisqualate'e bağlı olarak gösterir. Hücre dışında ve reseptörün transmembran alanının üstünde tanımlanan tüm ligandlar, Fo-Fc atlama haritasında yer alır, yeşil renktedir ve 6σ'da konturlanmıştır. (B) fark haritasında yer alan agonist, L-quisqualate'in uyumunu vurgular. L-quisqualate, Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 ve Gly-280 dahil olmak üzere birkaç mGlu₅ kalıntısı ile etkileşime girer. H-bağı etkileşimleri kırmızı çizgilerle temsil edilir. (C)'de, reseptörün hücre dışı alanında bulunan Asn-210'un yakınında ek bir yoğunluk belirgindir ve bu yoğunlukta N-asetilglukozamin molekülü (NAG) modellenmiştir. Netlik sağlamak için, NAG mevcut şekilde Asn ile bağlantılı değildir. (D), reseptörün lipide maruz kalan yüzeyinin yakınında yeşil renkte kolesterol hemisüksinat (CHS) için yoğunluk farkını gösterir. Çubuklarda temsil edilen CHS molekülü bu yoğunlukta modellenmiştir. (E), çizgi film temsilinde antagonist LY341495 bağlı mGlu₅ reseptör yapısını (PDB-7fd9) gösterir. (F)'de, hücre dışı alanın lob I ve lob II arasındaki menteşede bulunan Fo-Fc fark haritasındaki ekstra bir yoğunluk, antagonistin varlığını gösterir. Antagonistin etrafındaki anahtar kalıntılar (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 ve Tyr-223) çubuk temsillerinde gösterilir ve antagonist ile potansiyel hidrojen bağı etkileşimleri kırmızı çizgilerle gösterilir. (G), antagoniste bağlı yapıda Asn-210 yakınında NAG molekülünün varlığını düşündüren yoğunluk farkını gösterir (not, NAG, netlik için Asn ile bağlantılı değildir). Figürler Pymol ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: β-galaktosidazın (EMD-10563) yüksek çözünürlüklü haritasında küçük bir inhibitör ve çözücü moleküllerinin tanımlanması, modellenmesi ve rafine edilmesi. (A), her bir monomerin belirgin bir şekilde renklendirildiği çizgi film gösteriminde 2.3 ş(PDB: 6tsh) olarak çözülmüş β-galaktosidaz modelini gösterir. Gri kutu, ligand bağlanma bölgesini vurgular. (B) enzimin aktif bölgesindeki yeşil ağda Fo-Fc fark yoğunluğunu (Servalcat'ten) gösterir. Yoğunluktaki fark, aktif bölgede inhibitörün (DGN) ve birkaç çözücü molekülünün varlığını gösterir. (C), Fo-Fc haritası tarafından yönlendirilen inhibitör deoksigalakto-nojirimisinin (DGN) aktif bölgede modellendiğini gösterir. Bu modellenmiş ligand, çubuk formatında tasvir edilmiştir ve blue_mesh renklendirilmiş olan Fo yoğunluğu (Servalcat tarafından) ile kaplanmıştır. DGN ile Tyr-503 ve His-540 dahil olmak üzere çeşitli protein kalıntıları arasındaki hidrojen bağı etkileşimleri gözlenir. Ligand (yeşil) etrafındaki ek Fo-Fc fark yoğunluğu, çözücü moleküllerinin göstergesidir. (D) Harita, sırasıyla kırmızı ve mor küreler olarak temsil edilen su ve Mg²⁺ dahil olmak üzere birkaç çözücü molekülünün, her bir çözücü molekülünün ya proteine (Glu-416, His-418 ve Glu-461) ya da ligand kalıntılarına bağlandığından emin olduktan sonra aktif bölgede modellendiğini göstermektedir. Su molekülleri ve Mg²⁺ Fo yoğunluğu (mavi ağ) ile kaplıdır. Mg^{2 +} 'nın bir su molekülü aracılığıyla ligand, DGN ile etkileşime girdiği görülmektedir. Panellerdeki (B,C) Fo-Fc haritası (yeşil ağ) 6σ'da konturlanırken, C ve D'deki Fo yoğunluğu - mavi ağ (modellemeden sonra Servalcat arıtmasından) 3σ'de konturlanmıştır. Panolardaki figürler (A-D) Pymol ile oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: β-galaktosidazda çözünürlüğün ligand modellemesi üzerindeki etkisi. EMD-10563'ten alınan yarım haritalar, Relion işlem sonrası adımında girdi olarak kullanıldı ve birleştirilmiş işlem sonrası haritalar, farklı B faktörlerine sahip 2.3 Å, 3.0 şve 3.5 şçözünürlüklerine göre filtrelendi. Tüm panellerde gösterilen harita 6σ'da konturlanmıştır. Netlik sağlamak için, A, B ve C panellerinde yan zincirler, ligand veya çözücü molekülleri olmadan sadece protein omurgası gösterilmiştir. (A) Harita 3.5 Å'ye filtrelenir ve β-galaktosidazın aktif bölgesi gösterilir. Bu çözünürlükte ligand'a benzeyen bir blob (DGN) görülür ve buna civarda birkaç küçük blob eşlik eder. Ligandı doğru yönde modellemek, haritada belirgin özelliklerin olmaması nedeniyle zor olabilir. (B) 3.0 şçözünürlüğe filtrelenmiş harita gösterilir. Burada, ligand blobu biraz daha belirgin hale gelir, ancak yine de genel olarak özelliklerden yoksundur. Çözücü moleküllerini düşündüren birkaç küçük leke daha gözlenir. (C) 2.3 şçözünürlüğe kadar filtrelenen harita, özellikle iminosugar'ın sandalye konformasyonunu ortaya çıkaran, belirgin özelliklere sahip ligand yoğunluğunu ortaya çıkarır. Bu çözünürlükte su moleküllerine karşılık gelen önemli sayıda küçük leke gözlenir. Relion işlem sonrası otomatik B-faktörü tahmini/keskinleştirmesi, 3 şve 3.5 şolarak filtrelenmiş haritalar için -18 Ų değerini verirken, 2.3 şolarak filtrelenmiş harita için değer -52 Å^2'dir. EM haritalarının farklı B-faktörü keskinleştirmesi de Coot ile gerçekleştirilebilir ve model oluşturmada kullanışlıdır. (D) Panel, aktif bölgede modellendiği gibi ligand DGN (çubuk temsili), Mg²⁺ ve su moleküllerinin (küreler olarak) ve bu atomları çevreleyen mavi ağ ile gösterilen 2.3 Å'de keskinleştirilmiş haritayı göstermektedir. Panolardaki figürler (A-D) Pymol ile oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Mikroskop donanım ve yazılımındaki gelişmeler, son yıllarda cryoEM yapılarının sayısında artışa neden olmuştur. Tek parçacıklı cryoEM'de şu anda elde edilen en yüksek çözünürlük 1.2 Å^57,58,59 olmasına rağmen, yapıların çoğu 3-4 şçözünürlük civarında belirlenmektedir. Orta ila düşük çözünürlüklü haritalarda ligandları modellemek zor olabilir ve genellikle belirsizliklerle dolu olabilir. CryoEM'nin hem akademide hem de ilaç endüstrisinde translasyonel araştırma ve ilaç keşfi için yaygın kullanımı göz önüne alındığında, ligandların doğru ve belirsizlik olmadan modellenmesini sağlamak çok önemlidir. Bu nedenle, ligand atomlarının çözülebilirliğini, Chimera'da olduğu kadar haritaların kalitesini ve modelin uyumunu değerlendirmek için bir metrik olarak EMDB'de de mevcut olan Q-skorları^60'ı hesaplayarak ölçmek ihtiyatlı olacaktır.

İlk örnekte, M. tuberculosis enolaz enzimindeki apo ve ligand-bound haritaları arasındaki gerçek uzaydaki fark haritasını hesaplamak için ChimeraX kullanıldı. Yüksek bir eşikteki ek yoğunluk, aktif bölgede ligand, fosfoenolpiruvat ve ligand'a bağlı Mg^{2 +} 'nın varlığını gösterir. Bu durumda, haritanın orta çözünürlükte (3.2 Å) olduğunu ve su moleküllerinin güvenle modellenemeyeceğini belirtmek önemlidir (Şekil 1). Bu yöntemle ilişkili sınırlama, yalnızca ligand bağlanmasının proteinde önemli konformasyonel değişikliklere neden olmadığı durumlarda uygulanabilmesidir. Bu durumda hem apo hem de ligand'a bağlı veri kümeleri aynı piksel boyutunda elde edildiğinden ve Relion'da aynı parametrelerle işlendiğinden harita normalizasyonu yapılmamıştır. Bununla birlikte, Relion ^46,47 ve CryoSparc⁶¹ gibi farklı yeniden yapılandırma programları tarafından veya farklı kaliteye sahip haritalar karşılaştırıldığında, anlamlı karşılaştırmalar yapılmadan önce haritaların normalleştirilmesinin gerekli hale geldiğini belirtmekte fayda var.

Bir sonraki örnek, cryoEM_{yapılarından} ^51,62 (Şekil 2) anlaşılacağı gibi, agonist bağlanması üzerine büyük moleküler yeniden yapılanmaya uğrayan mGlu 5'tir. Bu senaryoda, haritalar arasındaki önemli farklılıklar nedeniyle, bağlanmamış (apo) ve ligand-bağlı reseptörler arasında basit bir fark haritası hesaplamak mümkün değildir. Burada, karşılıklı uzayda arıtma için girdi olarak keskinleştirilmemiş ve ağırlıklandırılmamış yarı haritalar kullanan ve daha sonra deneysel harita ile modelden türetilen harita arasında bir fark haritası hesaplayan Servalcat kullanılmıştır. Yüksek bir eşikte, farklılıklar görselleştirilebilir ve modelin düzeltilmesi ve iyileştirilmesi için bir rehber görevi görebilir. mGlu_5'in hücre dışı ve transmembran alanının yakınında birkaç modellenmemiş blob gözlendi ve ligandları modellemek için bir kılavuz olarak kullanıldı (Şekil 2).

Üçüncü örnek, çözünürlüğün (2.3 Å) β-galaktosidazda parça boyutlu bir inhibitörün harita yorumlanmasında ve modellenmesinde nasıl önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Buradaki zorluk, verilerdeki doğal gürültünün ortasında Servalcat fark haritasında çok küçük bir ligandı (<200 Da) tanımlamak ve onu doğru bir şekilde modellemekti. Fourier Kabuk Korelasyonu (FSC) kullanılarak belirlenen yüksek global çözünürlüğe ek olarak, ligandlara özgü yerel çözünürlük de ligandların kiral merkezlerinin doğru yerleştirilmesini sağlamak için yeterince yüksekti (Şekil 3). Çözücü molekülleri için yoğunluk, enzim boyunca ve özellikle ligandı çevreleyen fark haritasında gözlendi. Çözünürlüğün ligandların ve çözücü atomlarının modellenmesi üzerindeki etkisi de gösterilmiştir (Şekil 4). Su veya çözücü moleküllerini modellerken dikkatli olmak önemlidir, çünkü bazen düşük bir eşikteki gürültü su veya çözücü moleküllerine benzeyebilir ve bu da olası yanlış yorumlamalara yol açabilir.

Bir diğer önemli husus, cryoEM haritalarının tek başına bir metal iyonunu doğru bir şekilde tanımlamak için yeterli olmayabileceğidir. Metal iyonunun varlığını ve kimliğini doğrulamak için genellikle Genişletilmiş X-ışını Absorpsiyon İnce Yapısı (EXAFS) veya Enerji Dağıtıcı X-ışını Spektroskopisi (EDX) gibi ek biyofiziksel yöntemler gereklidir. Hem enolaz hem de β-galaktosidaz enzimlerinde, Mg^{2 +} , bu proteinler üzerinde halihazırda mevcut olan bilgi zenginliği nedeniyle modellendi ve metal iyonunun kimliğini doğruladı. Ayrıca, klasik oktahedral geometri ve Mg^{2 +} 'nın ideale yakın koordinasyon mesafeleri ile örneklenen bu durumlarda metal iyonlarının koordinasyonu, kimliklerinin önemli bir kanıtını sağlamıştır.

Genel olarak, cryoEM haritalarında ligandlar modellenirken birkaç önemli husus dikkate alınmalıdır. Başlangıç olarak, ligand tanımlama ve modelleme için doğru haritayı seçmek önemlidir. Her durumda, ligand yoğunluğunu görselleştirmek için keskinleştirilmiş ve ağırlıklı bir harita yerine keskinleştirilmemiş ve ağırlıklandırılmamış bir harita veya yarım harita tavsiye edilir, çünkü keskinleştirme ve ağırlıklandırma haritada az keskinleştirilmiş veya aşırı keskinleştirilmiş (seri sonlandırmadan kaynaklanan gürültü) bölgelere neden olabilir. Bu, optimal olmayan bir ligand yoğunluğuna neden olabilir ve Coot'ta model oluşturma sırasında yoğunluğu değerlendirmek için farklı B-faktörü keskinleştirmenin kullanılması kullanılabilir. Bir cryoEM haritasında ligandları tanımlamak için keskinleştirilmiş haritanın kullanılmasında bir risk olmasına rağmen, keskinleştirilmemiş harita ligand yoğunluğunun tam detayını göstermeyebilir, ancak Şekil 1B, C'de gösterildiği gibi gösteri amacıyla kullanılabilir.

Modellenen ligandın pozu, özellikle verilerin zayıf olduğu durumlarda doğrulanmalıdır. Burada mGlu₅ için gösterildiği gibi, yerel çözünürlük cryoEM haritası boyunca değişir ve ligandın tarafsız modellemesi zor olabilir. Servalcat, protein ve ligand modellemesindeki potansiyel yanlışlıkları tespit etmek için değerli bir araç olarak kullanılabilir²².

Bileşimsel heterojenlik, yalnızca belirli bir popülasyonun ligandın mevcut olabileceği bir protein-ligand kompleksinde mevcut olabilir (ligand düşük moleküler ağırlığa sahipse, sınıflandırma adımı heterojenliği ortadan kaldırmayabilir). Bununla birlikte, ligand modellemesinden önce görüntü işleme sırasında 3D sınıflandırma⁶³ adımını yinelemeli olarak gerçekleştirmek ve ligandın yoğunluğunun iyileşip iyileşmediğini doğrulamak önemlidir. Proteinin birden fazla kopyası mevcutsa, ilk model oluşturma ve iyileştirme sırasında harita boyunca simetri uygularken dikkatli olunmalıdır, çünkü bu, simetri ile ilgili tüm moleküllerdeki ligand yoğunluğunun ortalamasını alabilir. Simetri, yalnızca tüm protein zincirlerinde ligand yoğunluğunun varlığını doğrulamak için harita kapsamlı bir şekilde incelendikten sonra uygulanmalıdır.

Duruma (kristal veya çözelti) ve konuma (gömülü veya yüzey) bağlı olarak, atomlar dinamik olabilir ve model iyileştirmede buna atomik yer değiştirme parametresi (ADP) denir. Modeldeki olası yanlışlıklara görsel ipuçları sağlayan fark haritası ile birlikte, ADP değerleri, ^64,65,66,67 iyileştirmesinden sonra ligandların doğruluğunu değerlendirmek için kullanılabilir. Tipik olarak, ligand, çevredeki kalıntılarla benzer ADP değerlerine sahip olmalıdır, yani kararlı bir şekilde bağlanmış ve doğru bir şekilde modellenmişse. Bununla birlikte, makromoleküllerden uzak olan bir ligandın çevresindeki ligandlar veya atomlar (lipitler gibi) daha yüksek ADP değerlerine sahip olabilir. Koordinatların iyileştirilmesine ek olarak, hem Refmac^33,34 hem de Phenix,^{ADP değerlerinin 28,68} iyileştirilmesine izin verir. Refmac'ta, harita hesaplaması sırasında tek tek atomların elektron saçılma faktörünü hesaplamak için Mott-Bethe yaklaşımı kullanılır. Phoenix'in son versiyonunda, atom bozukluğunu açıklamak için kristalografiye benzer bireysel B-faktörü iyileştirmesi tanıtıldı. Çok sık olarak, cryoEM'den türetilen rafine modellerde, çok çeşitli ADP değerleri gözlenir (bazen sıfıra yakın değerler) ve hatta EMDB'de modelin haritaya uyumunu değerlendirmek için kullanılan Q skoru, biriktirilen birincil haritaya ve B-faktörü keskinleştirmenin doğasına^{bağlıdır 60}. CryoEM model oluşturmada, genellikle birden fazla harita kullanılır ve bu nedenle, modelleme ve iyileştirmede kullanılan haritalar, birçok makromoleküldeki anizotropik çözünürlük nedeniyle, tüm detayları açıklamak için tek bir harita yeterli olmayabileceğinden, yöntemlerde açıkça belirtilmelidir. 

Makromoleküllerdeki ligandların modellenmesinde, cryoEM haritalarının (kristalografide olduğu gibi) ana sınırlamalarından biri, ligand bağlanma bölgesinin düşük çözünürlüklü olması veya bağlı ligandın dinamik olması durumunda, doğru konformasyonu tespit etmenin zor olabileceğidir. Ek olarak, çoğu cryoEM yapısı 3 Å'nin altında çözünürlüğe sahiptir ve haritalarda su moleküllerinin temsili sınırlıdır, bu da hidrasyonun ligand veya ilaç bağlanmasındaki rolünü değerlendirmeyi zorlaştırır (burada enolaz ve mGluR örneklerinde gösterildiği gibi). Hesaplama yöntemleri, bu sınırlamaları ele almak için cryoEM verileriyle birlikte kullanılabilir⁶⁹. Kristalografinin aksine, harita değil, yalnızca model iyileştirmeye tabi tutulur. Şu anda, bir ligandın varlığını göstermenin veya doğru modellemeyi sağlamanın tek yolu, atlama haritaları oluşturmaktır (Servalcat gibi araçları kullanarak). Bu nedenle, araştırmacıların modeli oluşturmasına ve değerlendirmesine yardımcı olacak bir dizi araç vardır, ancak model iyileştirmede yakın gelecekte daha yeni yaklaşımların veya mevcut yaklaşımların modifikasyonlarının beklenebileceği birkaç alan vardır.

Bu makalede, ligand yoğunluğunun manuel olarak incelenmesini, ligand geometri dosyasının oluşturulmasını ve ardından ligandın cryoEM haritasında modellenmesini içeren ligandların modellenmesi için mevcut yaklaşımlara odaklandık. Bu, yapısal biyoloji ve ilaç keşfinde heyecan verici bir dönemdir, çünkü daha hızlı kare hızlarına sahip doğrudan elektron dedektörleri ve daha hızlı veri toplamanın^{70 kullanılması} , genellikle küçük moleküllü ligandlarla nispeten kısa sürede bağlanan birkaç makromolekülün yüksek çözünürlüklü haritalarının (<2.8 Å) elde edilmesiyle sonuçlanmıştır. Schrödinger takımında GEMspot⁶⁹ ve Rosetta takımında EMERALD¹⁷ gibi otomatik ligand modelleme araçlarının yakın zamanda piyasaya sürülmesi, deneysel kriyoEM verilerini hesaba katarken ligandın en olası bağlı pozunu bulmaya çalışan, bu süreci kolaylaştırma ve otomatikleştirme sözü veriyor. X-ışını kristalografisine benzer şekilde, küçük moleküllü ligandların bağlanma modlarının cryoEM ile tanımlanmasının, belki de tek bir günde iki veya daha fazla, gerçekçi bir olasılık haline geleceği öngörülmektedir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	Çeşitli enstitülerin konsorsiyumu	https://www.ccp4.ac.uk	Akademik kullanıcılar için ücretsizdir ve Coot ve X-ışını kristalografisi için geliştirilen araçların listesini içerir
ÇKP-EM	Konsorsiyumu	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	akademik kullanıcılar için ücretsizdir ve Coot, Relion ve diğerlerini içerir
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	Model oluşturma için genel yazılım, ancak yukarıda açıklanan diğer süitlerle de mevcuttur
DockinMap (Phoenix)	Birkaç enstitünün konsorsiyumu	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Modeli cryoEM haritalarına yerleştirmek için Phoenix paketi içindeki yazılımlar
Elektron Mikroskobu Veri Bankası	Çeşitli enstitülerden oluşan konsorsiyum	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Elektron Mikroskobu haritaları için Kamu
Deposu Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Ticari, Thermo Fisher'dan kamera
Phenix	Çeşitli enstitülerin konsorsiyumu	https://phenix-online.org/download	Akademik kullanıcılar için ücretsizdir ve Coot
Protein Veri Bankası'nı	Çeşitli enstitülerin konsorsiyumu	https://rcsb.org	Makromoleküler yapıların halka açık veritabanı
Pymol	Schrödinger	https://pymol.org/2/	Moleküler görselleştirme aracı. Eğitim sürümü ücretsizdir ancak sınırlama ile birlikte gelir. Tam sürüm küçük bir ücret karşılığında edinilebilir.
Relion	MRC-LMB, cryoEM	görüntü	Yazılımı, ayrıca CCP-EM
Titan Krios Thermo	Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Ticari, Thermo Fisher'dan kriyoTEM
UCSF Chimera	UCSF, ABD	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	Görüntüleme, analiz ve daha fazlası için genel amaçlı yazılım
UCSF Chimera X	UCSF, ABD		https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Görüntüleme, analiz ve daha fazlası için genel amaçlı yazılım