Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Hematopoietik Kök ve Progenitör Hücrelerinin İmmün Kuvvetlenmiş Farelere İntrafemoral Enjeksiyonu

2.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66315

⸱

8 Aralık 2023

 ,  , 
1Wellcome and Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute, Department of Haematology, University of Cambridge

Bu makalede

Özet

İntrafemoral enjeksiyonlar, hücreleri doğrudan kemik iliği boşluğuna yerleştirerek az sayıda hematopoietik kök ve progenitör hücrenin (HSPC'ler) aşılanmasına izin verir. Burada, insan HSPC'lerinin immün yetmezliği olan farelere intrafemoral enjeksiyonunun deneysel bir protokolünü açıklıyoruz.

Özet

Hematopoetik kök hücreler (HSC'ler), yaşam boyu tüm kan hücresi tiplerini üretme yetenekleri ile tanımlanır. Bu, HSC'leri içeren hücre popülasyonlarının sinjeneik veya immün sistemi baskılanmış farelere nakledilmesiyle operasyonel olarak test edilir. Greftin boyutu ve çok soylu bileşimi daha sonra zaman içinde, genellikle akış sitometrisi ile ölçülür. Klasik olarak, HSC'leri içeren bir popülasyon, hayvanın dolaşımına enjekte edilir, daha sonra HSC'ler kemik iliğine ev sahipliği yapar, burada yerleşirler ve kan üretimine başlarlar. Alternatif olarak, HSC'ler ve/veya progenitör hücreler (HSPC'ler) doğrudan kemik iliği boşluğuna yerleştirilebilir.

Bu makale, insan HSPC'lerinin immün yetmezliği olan farelere intrafemoral enjeksiyonu için bir protokolü açıklamaktadır. Kısacası, önceden şartlandırılmış fareler uyuşturulur ve bir iğne kullanılarak dizden uyluk kemiğine küçük bir delik açılır. Daha küçük bir insülin iğnesi kullanılarak, hücreler daha sonra doğrudan ilk iğne tarafından oluşturulan aynı kanala enjekte edilir. Bu nakil yöntemi, donör hücreler olarak fare veya insan hücreleri kullanılarak çeşitli deneysel tasarımlarda uygulanabilir. En yaygın olarak ksenotransplantasyon için kullanılmıştır, çünkü bu bağlamda, intravenöz enjeksiyonlara göre daha iyi aşılama sağladığı, dolayısıyla istatistiksel gücü iyileştirdiği ve kullanılacak fare sayısını azalttığı düşünülmektedir.

Giriş

Kan, insan vücudundaki en yüksek yenilenme oranlarından birine sahiptir ve yetişkin insan kemik iliğinde günde 1 ×10 12 hücre üretir1. Hematopoetik kök hücreler (HSC'ler), hematopoez süreci ile yaşam boyu kan üretimini garanti eder ve kendilerini korurken (kendini yenileme) tüm kan hücresi tiplerini üretme kapasiteleri (çok potansiyelli) ile tanımlanır. Tarihsel olarak, bir HSC'nin işlevini test etmek için altın standart her zaman transplantasyona dayanmıştır ve bir donör popülasyonunun bir farenin tüm kan soylarını uzun vadede (genellikle en az 20 hafta olarak tanımlanır) yeniden oluşturma yeteneğini test etmiştir2. Birkaç on yıla yayılan geniş bir fonksiyonel çalışma grubu, HSC bölmesinin hem soy çıktısında hem de uzun vadeli sulandırmada heterojen olduğunu göstermiştir. Hematopoezi incelemek için kullanılan araç seti, in vitro tek hücreli fonksiyonel tahliller, tek hücreli -omik yaklaşımlar ve soy takibi3 dahil olmak üzere birçok yeni teknikle yıllar içinde önemli ölçüde genişlemiştir. Sonuncusu, HSC ve multipotent progenitörlerin katkılarının, doğal hematopoezde ve transplantasyonun getirdiği stres altında büyük ölçüde farklılık gösterdiğini kesin olarak göstermiştir. Tüm bu teknikler, HSC'lerin uzun vadeli repopülasyon kapasitesini değerlendirmek için önemini koruyan transplantasyon testlerini tamamlar. İnsan hematopoezi çalışması bağlamında, ksenotransplantasyon, tüm organizma ortamında kendini yenilemeyi deneysel olarak değerlendirmek için tek yöntemi sağlar.

HSC'lerin ksenotransplantasyonu yaygın olarak, immün sistemi baskılanmış farelere intravenöz hücre enjeksiyonu kullanılarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, HSC'ler nadirdir4 ve HSC içeren insan örneklerine erişim sınırlıdır. 2003 yılında, John Dick grubu, kemik iliği aspirasyonu için bir protokol uyarladı ve intrafemoral olarak enjekte edilen obez olmayan diyabetik / şiddetli kombine immün yetmezlik (NOD-SCID) fareleri ile Lin-CD34 + göbek kordonu kanı (CB) hücreleri5. Bildiğimiz kadarıyla, uzun süreli ve seri transplantasyon sonuçlarında intravenöz ve intrafemoral enjeksiyonların resmi bir karşılaştırması bildirilmemiştir. Bununla birlikte, doğrudan intravenöz enjeksiyonlarla karşılaştırıldığında, intrafemoral enjeksiyonlar, en azından kısa vadede, aynı sayıda nakledilen hücre6 ile daha büyük greft boyutları sağlar. Ek olarak, nakledilen çok daha az hematopoietik kök ve progenitör hücre (HSPC) ile aşılama tespit edilebilir. Bunun nedeninin, intrafemoral doğumun, HSC'lerin kemik iliğine ev sahipliği yapma ihtiyacını atladığı düşünülmektedir, bu da ksenogreft bağlamında bir dizi reseptör ve sitokin için türler arası reaktivite eksikliği nedeniyle sınırlayıcıdır. İntrafemoral enjeksiyonların kullanılmasıyla, Notta ve meslektaşları, tek insan HSC'lerini7 nakleden ilk kişilerdi, ancak yöntemlerinde açıklandığı gibi ekstra hususlar alınması gerekiyor. HSPC'lerin intrafemoral doğumunun da sınırlamaları vardır. Enjeksiyonun kendisi kemik iliğinin bir kısmını bozar ve yok eder ve bu nedenle HSC'ler ile kemik iliği mikro çevresi arasındaki karışma çalışmaları için endike değildir. Ek olarak, maksimum hücre sayısı o kemik boşluğunun hacmi ile sınırlıdır ve bu, bazı uygulamalar için çok az olabilir. Her teknikte olduğu gibi, belirli bir deneydeki uygulamasının, yararlarına/dezavantajlarına ve sorulan soruya göre tartılması gerekir. Ksenotransplantasyon bağlamında, deneyin amacı, mikroçevre değerlendirmesi yapılmadan az sayıda insan HSPC'sinin aşılanmasını test etmekse, intrafemoral doğum genellikle intravenöz enjeksiyona tercih edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada sunulan tüm hayvan araştırmaları, 1986 tarihli Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası, 2012 Değişiklik Yönetmeliklerine uygundur ve Cambridge Üniversitesi Hayvan Refahı ve Etik İnceleme Kurumu (AWERB) tarafından etik inceleme ve onaydan sonra gerçekleştirilmiştir. Kadın BAŞINI BALLADI. Yaşları 12 ila 16 hafta (~ 21-30 g) arasında değişen, kurum içinde yetiştirilen ve Spesifik Patojen İçermeyen bir hayvan tesisinde tutulan Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) fareleri, intrafemoral enjeksiyonlar için kullanıldı. Tanımlanmamış CB örnekleri, Cambridgeshire Yerel Araştırma Etik Komitesi (18/EE/0199) tarafından onaylanan düzenlenmiş prosedürlere uygun olarak Cambridge Kan ve Kök Hücre Biyobankası (CBSB) tarafından bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra sağlıklı bağışçılardan toplanmıştır.

1. Farenin hazırlanması

  1. Işınlamadan önce, tanımlama için farelerin kulaklarına çentik açın ve temel ağırlık için tartın.
  2. Hücrelerin transplantasyonundan yirmi dört saat önce, fareleri 2.4 Gy radyasyonla sub-letoral olarak ışınlayın.

2. Hücrelerin hazırlanması

NOT: Bu enjeksiyonlar için taze veya donmuş numunelerden hücreler kullanılabilir. Hücrelerin spesifik alt popülasyonları akış sitometrisi ile sıralanabilir. Alternatif olarak, hücreler transplantasyondan önce istenen koşullarda kültürlenebilir. Gösterilen deneyler için donmuş CB CD34 + hücreleri kullanıyoruz.

  1. Tüpü manuel olarak çalkalarken, hücrenin hacminin 10 katı önceden ısıtılmış IMDM +% 50 fetal sığır serumu (FBS) + 0.1 mg / mL DNaz'ın damla damla eklenmesiyle hücreleri 50 mL'lik bir tüpte çözün. Hücreleri 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  2. Hücreleri fare başına 20-40 μL (ideal olarak 25 μL) PBS + Penisilin-Streptomisin (10 U / mL veya% 0.1) içinde yeniden süspanse edin. Mümkünse, hücreleri enjeksiyonlar için şırıngaya alırken ölü bir hacim için ekstra hücrelere izin verin. Hücreleri enjeksiyonlara kadar buz üzerinde saklayın. Enjeksiyon başına maksimum hücre sayısı 4 milyon hücredir.

3. Hayvan tesisinde intrafemoral enjeksiyon için hazırlık

  1. Bu prosedür için gerekli olan aşağıdaki üç iğneyi hazırlayın:
    1. 27 G 1/2" iğne ile 3 mL'lik bir şırınga hazırlayın.
    2. Hücre süspansiyonunu içeren 29 G x 12,7 mm iğneli 0,5 mL'lik bir İnsülin Şırıngası hazırlayın.
    3. 0,1 mg/kg buprenorfin (100 μL) içeren 29 G x 0,5" iğneli 1 mL İnsülin Şırıngası hazırlayın.
  2. Fareleri anestezik bir kutuda uyuşturun (izofluran% 2 (h / h) ve oksijen 2 L / dak solunması yoluyla). Fareyi bir burun konisine aktarın ve ayak parmağınızı sıkıştırarak prosedüre hazır olduğunu onaylayın. Kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün.
    NOT: Bu prosedür, muhafaza seviyesi 2 biyogüvenlik başlığında gerçekleştirilir ve steril koşullar kullanılır.

4. İntrafemoral enjeksiyon

  1. Fareyi sırt üstü yatırın ve arka bacağını esnetin. Başparmağınızı ayağınıza, orta parmağınızı kalçaya ve işaret parmağınızı uyluk kemiğinin dışına yerleştirerek baskın olmayan elinizi kullanarak arka bacağı sabitleyin.
  2. Diz kapağının etrafındaki tüyleri nazikçe tıraş edin veya koparın ve bölgeyi silmek için alkollü bir bez kullanın.
  3. 3 mL'lik şırıngayı 27 G 1/2" iğne ile kullanın ve ciltten uyluk kemiğine doğru nazikçe bir delik açmak için diz kapağının üst iç köşesini hedefleyin. İğne ilk başta ileri geri döndürülebilse de, tüm iğne kemiğe girene kadar kemiğe yalnızca bir kez saat yönünde hareket ettirin.
    NOT: Bu adımın amacı, hücre iletimi için bir kanal oluşturmaktır. (İsteğe bağlı) İğnenin kemikte doğru olup olmadığını kontrol etmek için bacağı serbest bırakın ve şırıngayı yan yana döndürün; Kemikte doğru bir şekilde ise, tüm bacak rotasyonla birlikte hareket etmelidir. Devam etmeden önce başparmağınızı ayağınıza, orta parmağınızı kalçaya ve işaret parmağını uyluk kemiğinin dışına yerleştirerek baskın olmayan eli kullanarak bacağı yeniden sabitleyin. Yanlış yerleştirilirse, iğne muhtemelen kas veya tendon içinde olacaktır, bacak şırınga ile dönmeyecektir ve iğneyi cilt altında hissedebilirsiniz.
  4. Yarıya gelene kadar saat yönünün tersine çevirerek iğneyi çıkarın. Bu noktada, iğnenin etrafını silmek için alkollü bir bez kullanın (küçük bir damla kan olabilir) ve ardından iğneyi saat yönünün tersine çevirmeye devam edin ve iğneyi çıkarın.
  5. Femur şaftındaki hücreleri içeren 0.5 mL insülin şırıngasını aynı kanaldan yerleştirin. İğne içeri girdikten sonra, doğru yeri gösteren bir çizik hissettiğini not edin. Bu noktada, bacaktaki tutamağı serbest bırakın, ancak iğneyi bacağından çıkarmamaya dikkat edin. Ardından, nazikçe 25 μL hücre süspansiyonunu uyluk kemiğine enjekte edin ve iğneyi çıkarın.
    NOT: Açıklanan 'çizik' pürüzlü bir yüzeye çarpmak gibidir ve iğne pürüz hissi olmadan düzgün bir şekilde girdiğini hissediyorsa, doğru yerde değildir. Çoğu kullanıcı, uygulamalarında başarılı olduklarında bunu net bir şekilde anlar.

5. Enjeksiyon sonrası bakım

  1. Fareyi kafesine geri koymadan ve anesteziden iyileşme için izlemeden önce deri altına Buprenorfin (0.1 mg / kg, 100 μL) enjekte edin.
    NOT: Fare, sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözetimsiz bırakılmamalı ve tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların yanına geri gönderilmemelidir. Farelerin intrafemoral enjeksiyona herhangi bir olumsuz etki göstermesi olası değildir; Bununla birlikte, intrafemoral enjeksiyon, ameliyat edilen bölgede aktivitenin azalmasına ve ağrıya neden olabilir.
  2. İşlemi takiben diz şişmesini, ağrıyı ve hareketliliği değerlendirin.
    NOT: Fareler, enjeksiyondan sonraki 24 saat içinde normal uzuv hareketliliğini yeniden kazanmalıdır.

6. Verilerin analiz edilmesi

  1. Fareleri herhangi bir zamanda servikal çıkık veya enjeksiyondan sonra onaylanmış herhangi bir yöntemle ötenazi yapın, ör., hedef arama deneyleri için 24-48 saat, kısa süreli HSC aktivitesi için 4-12 hafta, uzun süreli aşılama için >18 hafta. Periferik kan (PB) analizi planlanıyorsa, fareleri herhangi bir yetkili yöntemle kurban etmeden önce kanayın, ideal olarak 50-100 μL kan verin (toplam hacmin% 10'undan fazla değil). Arka bacak kemiklerini ve dalağı standart diseksiyon protokollerine göre çıkarın.
  2. Kemik iliği için:
    1. Enjekte edilen uyluk kemiğini (IF) ve enjekte edilmeyen kemikleri (arka bacak tibiasları ve BM olarak adlandırılan enjekte edilmemiş uyluk kemikleri) ayrı tutun. Kemikleri 1 mL IMDM +% 5 FBS ve 36 G x 3/4 "iğne kullanarak yıkayın ve 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    2. Peleti 500 μL PBS +% 3 FBS içinde yeniden süspanse edin ve ardından 50 μL'yi boyama için 96 yuvarlak tabanlı bir plakanın kuyusuna aktarın.
    3. Kalan kemik iliğini dondurun ve daha fazla ex vivo veya ikincil in vivo deneyler için sıvı nitrojen içinde saklayın.
  3. PB için:
    1. Toplama tüpünü 100 μL PBS +% 3 FBS ile yıkayın, kanı 5 mL'lik bir FACS tüpüne aktarın ve PBS +% 3 FBS ile hacmi 2,5 mL'ye kadar tamamlayın.
    2. FACS tüplerinin dibine dikkatlice 1 mL Pancoll pipetleyin ve fren kapalıyken 500 × g'da 25 dakika santrifüjleyin.
    3. Buffy coat tabakasını toplayın, 1,5 mL'lik tüplere aktarın ve PBS +% 3 FBS ile 1,5 mL'ye kadar doldurun. 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    4. Peleti 50 μL PBS +% 3 FBS içinde yeniden süspanse edin ve boyama için 96 yuvarlak tabanlı plakanın bir kuyusuna aktarın.
  4. Dalak için:
    1. Dalağı 50 mL'lik bir tüpe yerleştirilmiş bir hücre süzgecine yerleştirin ve 3 mL'lik bir şırıngadan piston ile ezin.
    2. Bir seferde bir mililitre, hücreleri yıkamak için 5 mL IMDM +% 5 FBS ekleyin. Boyama için 96 yuvarlak tabanlı bir plakanın kuyusuna 50 μL alın.
  5. Bir antikor mastermix hazırlayın; İşte 10 örnek için bir örnek:
    1. 1,5 veya 2 mL'lik bir tüpte 550 μL PBS + %3 FBS (50 μL/numune + %10 ekstra) ekleyin.
    2. Titrasyonlarına bağlı olarak nihai konsantrasyonları 2x olacak şekilde tek tek antikorlar ekleyin (örneğin, 1:100 titre edilmiş bir antikor için 11 μL ekleyin).
      NOT: İlgilenilen tüm kan soylarında potansiyel farklılaşmayı değerlendiren bir antikor paneli seçin, örneğin, CD19 / FITC, GlyA / PE, CD45 / PECy5, CD14 / PECy7, CD33 / APC, CD19 / Alexa 700, CD45 / BV510 ve CD3 / APCCy7.
  6. Boyama: Boyanacak numuneleri içeren 96 yuvarlak tabanlı plakanın her bir oyuğuna 50 μL antikor mastermix ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyayın, hücreleri yıkamak için 100 μL PBS +% 3 FBS ekleyin ve 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
  7. Peleti 200 μL PBS +% 3 FBS içinde yeniden süspanse edin ve her numuneyi bir hücre süzgeci kapağı olan bir FACS tüpünden geçirin. Kemik iliği ve dalak örneklerine 200 μL daha PBS +% 3 FBS ekleyin.
  8. Akış sitometrisi kontrolleri: Bir FACS tüpüne 100 μL PBS, 1 damla pozitif boncuk, 1 damla negatif boncuk ve 1 μL antikor ekleyerek kompanzasyon boncukları kullanarak tek leke kontrolleri yapın. Oda sıcaklığında 5 dakika bekletin ve ardından 300 μL PBS ekleyin. Boyanmamış bir kontrol olarak PBS +% 3 FBS ile 400 μL'ye kadar yapılmış 50 μL boyanmamış kemik iliği hücresi alın.
  9. Numuneleri akış sitometrisi ile analiz edin.
    1. Kullanılan sitometre için tavsiye edildiği gibi telafi için tek leke kontrollerini ve lekesiz çalıştırın. Kapıyı Şekil 3A'daki gibi ayarlayın.
    2. PB için tüm hücreleri çalıştırın ve kemik iliği ve dalak için, insan aşılama seviyelerine bağlı olarak numune başına en az 50.000 olay çalıştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İntrafemoral olarak enjekte edilen hücrelerin aşılanması, deneysel tasarıma bağlı olarak 24 saatten itibaren herhangi bir zaman noktasında değerlendirilebilir. Bitiş zaman noktasında IF, BM, PB ve dalaklar toplanabilir. Bunlar işlenebilir ve engraftman seviyesi akış sitometrisi ile değerlendirilebilir. Düşük seviyelerde bile insan aşılamasını sağlam bir şekilde adlandırmak için, insan CD45'e (klon HI30 ve klon 2D1) karşı iki farklı antikorla boyadık. Sadece her iki antikor için pozitif hücreler (CD45++) insan ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İntrafemoral enjeksiyonlar, sadece az sayıda HSPC'nin mevcut olduğu durumlarda ksenotransplantasyonda yararlı bir araçtır ve intravenöz enjeksiyonlara kıyasla daha iyi engraftman sağlar. Bununla birlikte, teknik el becerisi ve eğitim gerektirir. Pratik yaparken, doğru ağırlık aralığında taze kadavralar kullanmanızı (aşağıya bakınız) ve renkli bir boya (tripan mavisi gibi) enjekte etmenizi öneririz, böylece diseksiyon sırasında enjeksiyonun uyluk kemiğine girip girmediği ve onunla sınırlı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, bu yöntemle ilgili önceki çalışmaları için Dr. John Dick grubuna ve eğitim için Monica Doedens'e teşekkür eder. Cambridge Kan ve Kök Hücre Biyobankası'na (CBSB), özellikle Dr. Joanna Baxter'a ve kordon kanı örneklerini onaylayan ve toplayan CBSB hemşirelerinden oluşan ekibe minnettarız; Örnek bağışçılarımız; Üniversite Biyomedikal Servisi, özellikle Nicolas Lumley ve Anne McLaren Binası'ndaki personel, fare suşlarımızın bakımı ve in vivo deneylerimizin desteklenmesi için; El yazmasının düzenlenmesi için Shaaezmeen Basheer.

EL, Wellcome Trust ve Royal Society (107630/Z/15/A) tarafından ortaklaşa finanse edilen bir Sir Henry Dale Bursu tarafından finanse edilmektedir. L.M., Sofinter - İK Refah Programı tarafından desteklenmektedir. Bu araştırma tamamen veya kısmen Wellcome Trust (203151/Z/16/Z, 203151/A/16/Z, 215116/Z/18/Z) ve UKRI Tıbbi Araştırma Konseyi (MC_PC_17230) tarafından finanse edilmiştir. Açık erişim amacıyla, yazar, bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Tarafından Kabul Edilen Makale sürümüne bir CC BY kamu telif hakkı lisansı uygulamıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
29 G x 12,7 mm İğneli 0,5 mL İnsülin ŞırıngasıBD324892
1 mL İnsülin Şırıngası, 29 G x 0,5 "İğneliBD324827
1,5 mL tüpFisherbrand509-GRD-PFB
3 mL şırınga HENKE SASS WOLF GMBH4020.000V0
5 mL Hücre Süzgeç Kapaklı Yuvarlak Alt Polistiren Test Tüpü 12 x 75 mmFalcon352235FACS tüpü
5 mL Geçmeli Kapaklı Yuvarlak Alt Polistiren Test Tüpü 12 x 75 mmFalcon352058FACS tüpü
27 G 1/2" iğne BD 
40 ve mikro; 50 mL tüp için m hücreli süzgeçGreiner Bio-one542040
50 mL tüpSarstedt Ltd62.547.254
96 kuyu yuvarlak tabanlı plaka Falcon351177
Alkollü ÇubukVITREX MEDICAL A/S
BD LSR Fortessa X-20 Hücre Analiz Cihazı akış sitometresi
BuphrenorfineAnimalcareXVD190
CD14/PECy7 (Klon M5E2)biolegend3018141000'de 1'de kullanılır
CD19/Alexa 700 (Klon HIB19)biolegend302226300'de 1'de kullanılır
CD19/FITC (Klon HIB19)biolegend302206200'de 1'de kullanılır
CD3/APCCy7 ( Klon HIT3a)biolegend300318100'de 1'de
CD33/APC (Klon P67.6)BD345800200'de 1'de kullanılır
CD45/BV510 (Klon HI30)biolegend304036500'de 1'de kullanılır
CD45/PECy5 (Klon 2D1)biolegend368526300'de 1'de kullanılır
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/negatif kontrol telafisi Parçacıklar setiBD
Dnase 1Worthington BiyokimyasalLS002139
Fetal Sığır Serumu (FBS)PAN-BiotechP40-37500
Glikoforin A (GlyA) / PE (Klon GA-R2)BD3409471000'de 1'inde Kullanılır
Iscove Modifiye Dulbecco Media (IMDM)PAN-BiotechP04-20250
İzofluran (IsoFlo% 100 w / w Soluma Buharı, sıvı)Zoetis115095
Microvette  300 Lityum heparin LH, 300 ve mikro; LSarstedt Ltd20.1309Fare kanı alma tüpü
NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) fareleri Charles Nehri 
Pancoll insan, Yoğunluk: 1.077 g/mLPAN-BiotechP04-60500
Penisilin-Streptomisin Gibco15140122
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)Gibco14190169
300635 520213 BD kullanılır 552843

Kaynaklar

  1. Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A. Neutrophil kinetics in man. J Clin Invest. 58 (3), 705-715 (1976).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  4. Cosgrove, J., Hustin, L. S. P., de Boer, R. J., Perié, L. Hematopoiesis in numbers. Trends Immunol. 42 (12), 1100-1112 (2021).
  5. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9 (7), 959-963 (2003).
  6. McKenzie, J. L., Gan, O. I., Doedens, M., Dick, J. E. Human short-term repopulating stem cells are efficiently detected following intrafemoral transplantation into NOD/SCID recipients depleted of CD122+ cells. Blood. 106 (4), 1259-1261 (2005).
  7. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
  8. Belluschi, S., et al. Myelo-lymphoid lineage restriction occurs in the human haematopoietic stem cell compartment before lymphoid-primed multipotent progenitors. Nat Commun. 9 (1), 4100(2018).
  9. McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  10. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγ(null) humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  11. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nat Biotechnol. 32 (4), 364-372 (2014).
  12. McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ−/− KitW41/W41 (NBSGW) Mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
  13. Notta, F., Doulatov, S., Dick, J. E. Engraftment of human hematopoietic stem cells is more efficient in female NOD/SCID/IL-2Rgc-null recipients. Blood. 115 (18), 3704-3707 (2010).
  14. Futrega, K., Lott, W. B., Doran, M. R. Direct bone marrow HSC transplantation enhances local engraftment at the expense of systemic engraftment in NSG mice. Sci Rep. 6, 23886(2016).
  15. Mende, N., et al. Unique molecular and functional features of extramedullary hematopoietic stem and progenitor cell reservoirs in humans. Blood. 139 (23), 3387-3401 (2022).
  16. Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
  17. Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
  18. Sanchez, P. V., et al. A robust xenotransplantation model for acute myeloid leukemia. Leukemia. 23 (11), 2109-2117 (2009).
  19. Li, J., Chen, H., Zhao, S., Wen, D., Bi, L. Patient-derived intrafemoral orthotopic xenografts of peripheral blood or bone marrow from acute myeloid and acute lymphoblastic leukemia patients: clinical characterization, methodology, and validation. Clin Exp Med. 23 (4), 1293-1306 (2023).
  20. Dobson, S. M., et al. Relapse-fated latent diagnosis subclones in acute B lineage leukemia are drug tolerant and possess distinct metabolic programs. Cancer Discov. 10 (4), 568-587 (2020).
  21. Marktel, S., et al. Intrabone hematopoietic stem cell gene therapy for adult and pediatric patients affected by transfusion-dependent ß-thalassemia. Nat Med. 25 (2), 234-241 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hematopoetik Kök HücrelerKsenotransplantasyonKemik İliği TutunmasıAkış SitometrisiKord Kanı CD34Tek Hücre OmikleriKök Hücre Transplantasyonu
İnsan Hematopoietik Kök ve Progenitör Hücrelerinin İmmün Kuvvetlenmiş Farelere İntrafemoral Enjeksiyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.