Yöntem makalesi

Populus trichocarpa kabuğunun endofitik ve epifitik bakteriyel mikrobiyomlarının kantitatif değerlendirmesi için bir iş akışı

DOI:

10.3791/66318

⸱

27 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, 2College of Life Science, Northeast Forestry University, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, 4Forest Biotechnology Group, Department of Forestry and Environmental Resources, North Carolina State University, 5Institute of Economic Forest of Xinjiang Academy of Forestry Sciences

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Populus trichocarpa'nın kabuğunda bulunan endofitik ve epifitik bakteriyel mikrobiyomların profilini çıkarmak için numune toplamadan veri analizine kadar güvenilir ve verimli bir iş akışı sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki yüzeylerini ve iç dokuları kolonize eden mikroorganizmalar, bitki büyümesini ve sağlığını geliştirmede faydalı işlevlere sahip olabilir. Bununla birlikte, odunsu bitkilerin kabuk dokularının mikrobiyomu hakkındaki bilgiler, özellikle Populus kabuğunun endofitik ve epifitik bakteriyel mikrobiyotası ile ilgili olarak sınırlı kalmaktadır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, Populus trichocarpa'nın kabuğunu kolonize eden endofitik ve epifitik bakteriyel mikrobiyotanın bileşimini ve çeşitliliğini ölçmek için bir iş akışı oluşturduk. Kısaca, sapın epidermisi P. trichocarpa epifitik bakteri örnekleri elde etmek için% 0.1 Tween 20'ye batırılmış bir pamuk top ile tekrar tekrar silindi. Soyulmuş epidermis sterilize edildi ve daha sonra endofitik bakteri örneklerini toplamak için sırasıyla sıvı nitrojen ve bir boncuk çırpıcı kullanılarak tekrar tekrar donduruldu ve ezildi. Genomik DNA, pamuğa yapışmış epifitik bakteri topluluklarından ve P. trichocarpa'nın ezilmiş kabuğundan ekstrakte edildi ve bakteriyel 16S rRNA geninin hiperdeğişken V5-V7 ve V4 bölgelerini hedefleyen primerlerle ploymerase zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonuna tabi tutuldu. Her bir endofitik veya epifitik numuneden elde edilen PCR ürünlerinin üç kopyası, daha sonra sekanslanan amplikon kütüphanesini oluşturmak için eşit konsantrasyonlarda karıştırıldı. Elde edilen diziler, dizi ekleme, kalite filtreleme, kimera giderme ve taksonomik açıklamalar ile analiz edildi. Özetle, 16S rRNA gen profillemesi yoluyla P. trichocarpa kabuğunun endofitik ve epifitik bakteriyel mikrobiyomlarını belirlemek için numune toplamadan veri analizine kadar güvenilir ve verimli bir iş akışı oluşturduk. Önceki çalışmada oluşturulan mikrobiyota kolonize edici kabukları keşfetme yöntemleriyle birlikte, metodolojimiz, diğer odunsu bitki türlerinin, özellikle de ekonomik açıdan önemli orman ağaçlarının kabuk mikrobiyomunu araştırmak için protokoller tasarlamak için bir plan görevi görebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kabuk, odunsu bitkilerin gövdelerinin en dış tabakasıdır ve floem ve periderm 1,2 dahil olmak üzere vasküler kambiyum dışındaki tüm dokulara atıfta bulunur. Kapsamlı araştırmalar, kabuğun su ve karbonhidratların yer değiştirmesinde, ağaçların yangından ve mekanik hasarlardankorunmasında 3 ve abiyotik4ve biyotik streslere5 adaptasyonunda çok önemli roller oynadığını göstermiştir. Daha da önemlisi, bir ağaç ile çevredeki hava arasındaki arayüz olarak ağaç kabuğu aynı zamanda mikroorganizmalar için eşsiz bir yaşam alanı görevi görür6. Özellikle, kabukla ilişkili mikropların, konukçu büyümesini teşvik etme 7, ağaçlara besin alımındayardımcı olma8, bitki hormonu senteziniartırma 9 ve konukçuları fitopatojen enfeksiyonundankoruma 5 işlevlerine sahip olduğu doğrulanmıştır. Bununla birlikte, filosfer ve rizopshere mikrobiyotası ile karşılaştırıldığında, kabuğu kolonize eden mikrobiyal topluluklara çok daha az dikkat edilmiştir10,11. Ağaç kabuğu mikrobiyomunun biyolojik özellikleri hakkında sınırlı bilgi bulunmaktadır. Bu metodoloji makalesinin amacı, araştırmacılara odunsu bitki kabuğunun endofitik ve epifitik bakteriyel mikrobiyomunun çeşitliliğini ve bileşimini tanımlamak için bir dizi protokol sağlamaktır.

Bu çalışmada kabuk mikrobiyotasınıaraştırmak için yayınlanmış yöntemlere 12,13 dayanarak, odunsu bitki biyolojisinde kullanılan önemli bir model organizma olan Populus trichocarpa'nın kök kabuğunun iç dokularına veya yüzeylerine yerleşen bakteriyel mikrobiyomu keşfetmek için16S rRNA gen amplikon dizileme analizine dayalı ayrıntılı bir iş akışı tasarladık ve test ettik 14. P. trichocarpa hızlı büyüme15, deneysel manipülasyonun göreceli kolaylığı16 ve kolay genetik dönüşüm özelliklerine sahiptir ve ayrıca kereste üretiminde17 geniş uygulama alanı ile bilinir. Spesifik olarak, bu çalışmada öne sürülen yöntem, P. trichocarpa'nın kök kabuğunun endofitik ve epifitik mikrobiyota örneklemesinin ayrıntılı bir açıklaması ile başlar. Yüzeyi kolonize eden mikrobiyomun hasat edilmesinden sonra kabuğun alkol ve sodyum hipoklorit ile yüzey sterilize edilmesi için bir adımın dahil edilmesiyle, bu çalışma, kabuğun iç yapısında bulunan mikroorganizmaların (endofitler) ve kabuğun dış yüzeyinde yaşayanların (epifitler) aynı anda ve ayrı ayrı toplanması için bir prosedür oluşturmuştur. Bildiğimiz kadarıyla, odunsu bitki kabuğu mikrobiyomu ile ilgili yayınlanmış çalışmalar arasında, kabuğun iç ve dış nişleri arasında yapılan net bir ayrıma dayalı olarak aynı kabuk örneğinden toplanan endofitik ve epifitik mikrobiyal topluluklar üzerinde herhangi bir test yapılmamıştır 18,19,20. Bu nedenle, bu araştırmada geliştirilen yöntem, araştırmacıların kabukta yaşayan bakteri topluluklarının çeşitliliğini ve bileşimini kesin ve kapsamlı bir şekilde incelemelerini sağlayacaktır. Ek olarak, bu çalışma, genomik DNA ekstraksiyonu, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu, 16S rRNA gen amplikon dizileme kütüphanesi21'in hazırlanması ve dizileme veri analizi için prosedürlerin ayrıntılı açıklamalarını sağlar. Özellikle, bu çalışma, konakçı bitkilerin22 mitokondriyal ve kloroplast dizilerinin spesifik olmayan amplifikasyonunu azaltmak için bakteriyel 16S rRNA geninin hiperdeğişken V5-V7 bölgelerini hedefleyen bir çift primer kullandı ve bu da kabukla ilişkili mikrobiyomun tarafsız profillerini verdi. α çeşitlilikler, ekoloji araştırmalarında yaygın olarak kullanılan popüler bir çeşitlilik indeksi olan Shannon indeksi23 kullanılarak değerlendirildi ve filum seviyesindeki taksonomik kompozisyon, Mikrobiyal Ekolojiye Nicel Bakışlar (QIIME) 24ve R yazılımı25'te hesaplandı ve görselleştirildi. Önceki çalışma 1,6'da kurulan mikrobiyota kolonize edici kabukları keşfetme yöntemleriyle birlikte, metodolojimiz, diğer odunsu bitki türlerinin, özellikle de ekonomik açıdan önemli orman ağaçlarının kabuk mikrobiyomunu incelemek için protokoller tasarlamak için bir plan görevi görebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Örnek toplama

  1. 3 aylık P'yi büyütün.bir büyüme odasında trichocarpa fidanları (21–25°C; üç bantlı lineer floresan lambadan [T5 28 W 6400 K] yaklaşık 300 μEm−2 s−1 ek ışıkla 16 saat aydınlık/8 saat karanlık döngü; ve %60–80 nem)26.
  2. P'nin 10 cm uzunluğundaki sap kısımlarını kesin. sterilize edilmiş bir budayıcı kullanılarak sterilize edilmiş toprak yüzeyinin 2-12 cm yukarısından trichocarpa (Şekil 1A). Gövde segmentlerini sterilize edilmiş kare bir Petri kabına (13 cm x 13 cm) yerleştirin.
    NOT: Bu çalışma için aynı büyüklükte altı ağaç seçilmiştir ve bunlardan üçü her bir primer setinde PCR amplifikasyonu için kullanılmıştır.

2. Numune işleme

  1. Kabuk yüzeylerinde kolonize olan mikroorganizmaları daha verimli bir şekilde toplamak için %0.1 Tween 20'ye batırılmış steril bir pamuklu çubuk kullanarak sterilize edilmiş kare Petri kabı üzerindeki sapın epidermisini tekrar tekrar silin (Şekil 1, B).
    NOT: Gövde yüzeyine yapışan mikroorganizmaları toplamak için alt nemli steril pamuklar kullanılır. Gövde yüzeyini silerken çok kuru veya çok ıslak pamuk kullanmayın. Tween 20, bitki yüzeylerinden daha fazla mikrobiyal numune elde etmek için faydalı bir özellik olan yüzey gerilimini azaltabilen bir yüzey aktif maddedir27,28.
  2. Steril bir bıçak kullanarak pamuklu çubuktan pamuk ucunu kesin ve epifitik mikrobiyal örnekler içeren her bir pamuk ucunu steril bir 1,5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Numuneleri -80 °C'de saklayın.
  3. Gövde yüzeyini sildikten sonra, steril bir neşter kullanarak epifitik mikroorganizmaların örneklendiği kabuğu kesin, kabuğunu soyun ve kare bir Petri kabına yerleştirin.
  4. Adım 2.3'te gövdeden sıyrılan kabuğu steril bir neşter ile yaklaşık 1 cm'lik segmentler halinde kesin (Şekil 1C).
  5. Segmentleri 2 dakika boyunca %70 (h/h) alkole batırarak sterilize edin. Daha sonra, segmentleri 5 dakika boyunca% 0.1 Tween 80 ile desteklenmiş sodyum hipoklorit (% 2.5 etkili klor içeriği) içinde bekletin.
  6. Adım 2.5'te elde edilen segmentleri 30 saniye boyunca %70 (h/h) alkol29 içinde sterilize edin. Ardından, tüm numuneleri steril damıtılmış suyla üç kez yıkayın ve havayla kurutmak için temiz bir tezgah üzerine koyun.
    NOT: Kabuk örnekleri, yeterli yüzey sterilizasyonunu sağlamak için steril cımbız kullanılarak ileri geri karıştırılır.
  7. Her bir yüzey sterilize edilmiş kök kabuğu segmentini (endofitik numuneler) -80 ° C'de steril 2 mL'lik bir santrifüj tüpünde saklayın.

3. Genomik DNA ekstraksiyonu

  1. DNA ekstraksiyonu için numuneleri ön işleme tabi tutmak için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. Adım 2.7'de elde edilen yüzey ile sterilize edilmiş gövde kabuğu segmentlerini steril 5 mL sert tüplere yerleştirin ve her tüpe üç adet sterilize edilmiş çelik boncuk (4 mm) ekleyin.
      NOT: Mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için bu adımı temiz bir tezgah üzerinde gerçekleştirin. Adım 2.2'de (epifitik numuneler) hazırlanan pamuk toplarının önceden işlenmesine gerek yoktur ve doğrudan genomik DNA ekstraksiyonu için kullanılır.
    2. Numuneleri içeren sert tüpleri sıvı nitrojen içinde 10 dakika dondurun.
    3. Kabuk örneklerini bir boncuk çırpıcı ile 5 dakika boyunca ezin. Ardından, sert tüpü tekrar sıvı nitrojen içinde 1 dakika dondurun ve boncuk çırpma adımını 5 dakika boyunca tekrarlayın.
  2. Genomik DNA'yı çıkarın.
    NOT: Endofitik ve epifitik örneklerden genomik DNA'yı izole etmek için ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanın.
    1. P'nin ezilmiş kök kabuğunu ekleyin.trichocarpa ve pamuğa yapışmış epifitik bakteri toplulukları (her biri 0.25 g) boncuk tüplerinin her birine. Daha sonra ticari bir kit tarafından sağlanan 60 μL C1 çözeltisi ekleyin ve ters çevirerek hafifçe karıştırın.
    2. Daha sonra, endofitik ve epifitik numuneleri bir boncuk çırpıcı kullanarak dört adet 1 dakikalık çalışmada homojenize edin. Her çalıştırmadan sonra numuneleri 30 saniye boyunca buzun üzerine yerleştirin.
    3. Tüpleri 1 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
    4. Endofitik ve epifitik numuneleri, üreticinin talimatlarını izleyerek bir kit ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak çıkarın.
    5. Beyaz filtre membranının ortasına 30 μL çözelti C6 ekleyin ve 25 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
    6. Oda sıcaklığında 10.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.

4. PCR amplifikasyonu

  1. Ekstrakte edilen DNA konsantrasyonunu standartlaştırın.
    1. Bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak epifitik ve endofitik örneklerden ekstrakte edilen genomik DNA'nın konsantrasyonlarını ölçün.
    2. PCR amplifikasyonu için DNA şablonunu elde etmek için her DNA örneğini steril ddH2O ila 2 ng/μL ile seyreltin.
  2. Bu DNA örneklerini çoğaltın.
    1. İleri primer 799F (5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3') ve ters primer 1193R (5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3') kullanarak bakteriyel 16S rRNA geninin V5-V7 bölgesini amplifiye edin 10. İleri primer 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') ve ters primer 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 30 kullanarak bakteriyel 16S rRNA geninin V4 bölgesini amplifiye edin.
      NOT: Her numuneden ekstrakte edilen genomik DNA, üçlü PCR amplifikasyon reaksiyonlarının her biri için şablon olarak kullanılır ve negatif kontrol olarak DNA içermeyen ek bir reaksiyon ayarlanır. Her numune için PCR reaksiyon karışım hacmi 25 μL'dir. 799F/1193R primer çifti için, her reaksiyon 12 μL PCR suyu, F/R primerlerinin her birinden 1 μL (10 μM), 1 μL DNA şablonu ve 10 μL karışım çözeltisi içerir. 515F/806R primer çifti için, her reaksiyon 12 μL PCR suyu, F/R primerlerinin her birinden 1 μL (10 μM), 1 μL DNA şablonu ve 10 μL karışım çözeltisi içerir. 799F/1193R primer çifti ile PCR reaksiyonları aşağıdaki döngü koşullarında gerçekleştirilir: 5 dakika boyunca 98 ° C'de ilk denatürasyon, 30 saniye boyunca 98 ° C'de 25 döngü, 30 saniye boyunca 53 ° C ve 45 saniye boyunca 72 ° C'de son uzatma ve 72 ° C'de 5 dakika boyunca son uzatma. 515F/806R primer çifti ile PCR reaksiyonları aşağıdaki döngü koşullarıyla gerçekleştirilir: 3 dakika boyunca 94 ° C'de ilk denatürasyon, 45 s boyunca 94 ° C'de 35 döngü, 60 s için 50 ° C ve 90 s için 72 ° C ve 72 ° C'de 10 dakika boyunca son bir uzatma.
    2. Her numuneyi iyice karıştırın ve kabarcıkları gidermek için santrifüjleyin.
    3. Bir termal döngüleyici üzerinde bakteriyel 16S rRNA genlerinin V5–V7 veya V4 bölgesinin amplifikasyonunu gerçekleştirin.
  3. Güçlendirilmiş ürünleri tespit edin.
    1. % 1'lik bir agaroz jel üzerine her amplikonun 5 μL'sini yükleyin ve 30 dakika boyunca 120 V'ta elektroforez gerçekleştirin.
    2. Başarılı PCR amplifikasyonunu doğrulamak için jeli UV ışığı altında görüntüleyin. 799F/1193R ve 515F/806R primer çiftleri ile elde edilen PCR ürünlerinin boyutları sırasıyla yaklaşık 430 bp ve 400 bp olmalıdır.

5. Amplikon Dizileme Kütüphanesinin Hazırlanması

  1. Amplifiye edilmiş ürünleri karıştırın ve konsantrasyonlarını belirleyin.
    1. Bir PCR tüpündeki her numune için PCR amplifikasyonunun üç kopyasından üretilen ürünleri karıştırın.
    2. 5 μL PCR ürünü ve 195 μL çalışma solüsyonunu, üreticinin kit talimatlarına göre 96 oyuklu bir mikroplakanın kuyusuna ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Daha sonra, 10 μL standart DNA (kitten 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 ve 100 ng / μL konsantrasyonlara sahip DNA reaktifleri) ve 190 μL çalışma solüsyonu ekleyin. Bu adımı takiben, PCR ürünlerinin ve standart DNA'nın floresan yoğunluğunu belirleyin.
    3. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak floresansı ölçün.
      NOT: Standart floresein dalga boylarının uyarılması/emisyonu, her numunedeki çift sarmallı DNA'nın miktarını ölçmek için 480/530 nm'ye ayarlanmıştır.
    4. Standart DNA çözeltilerinin standart DNA konsantrasyonlarını (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 ve 100 ng/μL) ve standart DNA çözeltilerinin her birinin floresan yoğunluğunu kullanarak DNA konsantrasyonlarının ve floresan yoğunluklarının standart eğrisini oluşturun. PCR ürünlerinin DNA konsantrasyonlarını hesaplamak için PCR ürünlerinin her birinin floresan yoğunluk değerini standart eğriye koyun.
  2. Amplikon sıralama kitaplıkları oluşturun.
    1. Adım 5.1.4'te tespit edilen konsantrasyonlara göre, amplikon dizileme kitaplığını oluşturmak için aynı primer çifti tarafından amplifiye edilen kalan PCR ürünlerini eşit konsantrasyonlarda karıştırın.
      NOT: Floresan yoğunluğunu ölçerek çift sarmallı DNA'nın konsantrasyonunu ölçmek için kullanılan her bir numunenin PCR ürünlerinin fraksiyonu, aynı numunenin kalan PCR ürünlerinden oluşturulan amplikon dizileme kitaplığına dahil değildir.
  3. Jel ekstraksiyonu gerçekleştirin.
    1. Elektroforez aparatı kullanarak agaroz jel elektroforezi yapın. Kısaca,% 1.3'lük bir agaroz jeli hazırlayın (ör., 100 mL 1 x TAE tamponunda 1.3 g agaroz tozu).
      NOT: Jel içindeki kuyucukların miktarının her bir PCR ürününü ve DNA merdivenini tutmak için yeterli olduğundan emin olmak için özen gösterilir; Bu çalışmada, 1.3 g agaroz tozunun 100 mL 1 x TAE tamponu içinde çözülmesiyle %1.3'lük agaroz jeli hazırlanmaktadır.
    2. Jel katılaştıktan sonra tarakları çıkarın ve jeli 1 x TAE tamponlu bir elektroforez tankına yerleştirin. Daha sonra, her bir PCR ürününün 5 hacim birimine 1 hacim birimi 6 x turuncu yükleme tamponu ekleyin ve ikincisi her bir oyuğa 100 μL yüklendi. Bir kuyucuğa 30 μL DNA merdiveni ekleyin. Pozitif ve negatif kabloları bağladıktan sonra, 50 dakika boyunca 80 V'ta elektroforez yapın.
      NOT: Bu çalışmada, sırasıyla 515F/806R veya 799F/1193R primer çifti ile amplifiye edilmiş 400 bp veya 430 bp bandı ile temsil edilen amplikon dizileme kitaplığını saflaştırmak için jel ekstraksiyonu kullanılmıştır.
    3. Temiz, keskin bir neşter kullanarak agaroz jelden DNA parçalarını çıkarın.
    4. Jel dilimini tartın ve renksiz bir tüpe aktarın. Jel dilimini daldırmak için tampon ekleyin.
      NOT: Sıkma kolonu başına maksimum jel miktarı 400 mg'dır. Belirli bir jel diliminin bir hacim birimine üç hacim birimi tampon eklenir.
    5. Üreticinin talimatlarını izleyerek Jel Ekstraksiyon Kitini ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak jel ekstraksiyonu gerçekleştirin.
      NOT: Endofitik ve epifitik bakteri topluluklarını dizilemek için kullanılan bakteriyel 16S rRNA genini hedefleyen PCR ürünlerinden oluşturulan amplikon kütüphanesi bu yöntem kullanılarak elde edilir.
  4. Saflaştırılmış amplikon sıralama kitaplığının kalitesini onaylayın.
    1. Üreticinin protokolünü izleyerek ticari bir kit (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak bir florometre ile adım 5.3.5'te elde edilen saflaştırılmış amplikon dizileme kitaplığındaki çift sarmallı DNA'nın konsantrasyonunu belirleyin (Şekil 2).
    2. Adım 5.3.5'te elde edilen amplikon dizileme kütüphanesinin hedef DNA fragman boyutunu, üreticinin protokolünü izleyerek ticari çipler ve kitler içeren bir nükleik asit kalite kontrol analiz sistemi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak belirleyin.
      NOT: Parça boyutunun beklenen aralıkta olduğundan ve amplikon sıralama kitaplığında primer dimer olmadığından emin olun.
    3. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonunu (qRT-PCR) ticari bir kit ile (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak adım 5.3.5'te elde edilen sıralama kitaplığının etkili konsantrasyonunu, üreticinin protokolünü izleyerek belirleyin.
    4. Dizileme platformu için önerilen yükleme konsantrasyonunu karşılamak için amplikon dizileme kitaplığını seyreltin.

6. Dizi işleme ve istatistiksel analiz

  1. Adım 5.4.4'te elde edilen amplikon kütüphanesi bir sıralama platformu kullanılarak dizilendikten sonra (bkz. Malzeme Tablosu)31. Çalışma dizininde emp-paired-end-sequences adlı bir klasör oluşturun ve ardından sıkıştırılmış sıralama dosyasını bu klasöre fastq biçiminde kaydedin. Ardından Ubuntu'yu açın ve conda ortamını ve Nicnicative Insights into Microbial Ecology 2'yi (QIIME2)(v2021.2)32 etkinleştirin.
  2. Bir eşleme dosyası yazın ve bunu bir metin dosyası olarak kaydedin. Dosya içeriği Tablo 2'de gösterilmiştir.
  3. Amplikon dizileme kitaplığı ile elde edilen dizileme verilerini bölün ve eşleme dosyasını kullanarak dizileme verilerinden primerleri kaldırın.
    1. Sıralama verilerini bölmek için aşağıdaki komutu kullanın: time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza
    2. Primerleri kaldırmak için aşağıdaki komutu kullanın: time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F veya 515F --p-front-r 1193R veya 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza
  4. DADA2 boru hattını33 kullanarak herhangi bir kimerayı tarayın ve çıkarın. Filtrelenmiş dizileri %99 benzerlikte amplikon dizi varyantları (ASV'ler) halinde kümeleyin.
    1. Chimera ve küme dizilerini ASV'lere taramak ve kaldırmak için aşağıdaki komutu kullanın: time qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza -o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --pn-threads 0
  5. Referans dizilerine dayalı olarak SILVA veritabanını (v138) kullanarak taksonomik açıklamalar yapın34.
    1. Adım 6.4'te elde edilen ASV'lere açıklama eklemek için aşağıdaki komutu kullanın: time qiime özellik sınıflandırıcı classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-sınıflandırma taksonomisi.qza
  6. Aşağıdaki komutları kullanarak QIIME2'de (v2021.2) bir ASV tablosu oluşturun:
    qiime araçları dışa aktarma --input-path table.qza --output-path exported-feature-table
    qiime araçları dışa aktarma --input-path taxonomy.qza --output-path exported-feature_table
    biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.womd.biom --observation-metadata-fp taxonomy.tsv --observation-header OTUID, taksonomi --sc-ayrılmış taksonomi
    biom convert -i table.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --header-key taksonomisi
    NOT: Bu komutlar, her örnek için tüm ASV'lerin okuma sayısını içeren bir tablo oluşturur.
  7. Sırasıyla 799F/1193R ve 515F/806R primer çiftleri ile oluşturulan endofitik ve epifitik bakteri topluluklarının ASV sayısını ve okumalarını hesaplayın.
    1. Adım 6.6'da elde edilen ASV tablosundaki her bir örnekte sırasıyla filum, sınıf, takım, aile ve cins seviyelerinde ≥ 1 okumaya sahip toplam ASV sayısını sayarak hesaplayın.
    2. Sayarak adım 6.6'da elde edilen ASV tablosundaki tüm ASV'lerin okuma sayılarının toplamına dayalı olarak her bir örnekteki toplam okuma sayısını hesaplayın.
    3. Adım 6.6'da sayarak elde edilen ASV tablosunda kloroplast veya mitokondri olarak açıklanan ASV'lerin okuma sayısını kullanarak her bir numunedeki bitki okuma sayısını hesaplayın.
    4. Aşağıdaki formülü kullanarak her numunedeki bakteri okuma sayısını hesaplayın:
      Bakteri okuma sayısı = Toplam okuma sayısı − Bitki okuma sayısı.
    5. Excel (2019) ve Prism (v8.0) yazılımını kullanarak 799F/1193R ve 515F/806R primer çiftleri tarafından üretilen endofitik ve epifitik bakteri topluluklarının ortalama ASV sayısını (sırasıyla filum, sınıf, takım, aile ve cins düzeyinde) veya okumalarını (sırasıyla toplam veya bitki ve bakteri düzeyinde) hesaplayın ve görselleştirin.
    6. 799F/1193R ve 515F/806R primer çiftleri ile oluşturulan ASV sayıları (sırasıyla filum, sınıf, takım, aile ve cins düzeyinde) veya okumalar (sırasıyla toplam veya bitki ve bakteri düzeyinde) arasındaki farkların önemini Prism (v8.0) yazılımında Öğrencinin t-testini kullanarak değerlendirin.
  8. Aşağıdaki komutu kullanarak kloroplast ve mitokondri olarak açıklamalı okumaları filtreleyin: time qiime takson filtre tablosu --i-tablo tablosu.qza --i-taksonomi taksonomisi.qza --p-mitokondriyi dışla, kloroplast --o-filtreli-tablo ASV-tablosu-no-mitokondri-no-chlorplast.qza
  9. Aşağıdaki komutu kullanarak filogenetik ağaç oluşturun: time qiime filogeni align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-maskeli-alignment maskeli-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
  10. QIIME2 (v2021.2) ve R'deki 'ggplot2' paketini (v4.0.5)35 kullanarak endofitik ve epifitik bakteri topluluklarının Shannon indeksi ile temsil edilen alfa çeşitlerini hesaplayın ve görselleştirin.
    1. Alfa çeşitlerini hesaplamak için aşağıdaki komutu kullanın: time qiime diversity core-metrics-phylogenetic --i-phylogeny rooted-tree.qza --i-table ASV-table-no-mitokondria-no-chlorplast.qza --p-sampling-depth tüm örnekler arasında en düşük okuma değeri --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
  11. Endofitik ve epifitik bakteri topluluklarının filum düzeyindeki popülasyonların nispi bolluklarını hesaplayın. Aşağıdaki QIIME2 (v2021.2) komutunu kullanarak "taxa-bar-plots" adlı qzv biçiminde bir dosya oluşturun: time qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitokondria-no-chlorplast.qza --i-taksonomi taksonomisi.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
    1. taxa-bar-plots.qzv dosyasını https://view.qiime2.org/'da çevrimiçi olarak açın. Yeni oluşturulan dosyayı level2'den indirin ve kaydedin. R (v4.0.5) ile aşağıdaki formülle bağıl bolluğu hesaplayın:
      Her bir bakteri filumunun nispi bolluğu (%) = (her bir numunedeki her bir bakteri filumunun okunma sayısı / her bir numunenin toplam okunma sayısı) x %100.
      R'de ggplot2, RColorBrewer, reshape ve ggalluvial paketlerini kullanarak verileri görselleştirin (v4.0.5).
  12. Primer çifti 799F/1193R ile dizilenen endofitik ve epifitik bakteri topluluklarında baskın filumların her birinin (%0,5'>lik nispi bolluğa sahip bir filum olarak tanımlanır) nispi bolluğu arasındaki farkın anlamlılığını, STAMP yazılımı36'da Tukey'in post-hoc testi ile tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanarak analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P kabuğunun endofitik ve epifitik bakteriyel mikrobiyomlarının yüksek kaliteli genomik DNA'sı. trichokarpa, optimize edilmiş protokol kullanılarak elde edildi (Tablo 1). 12 numunenin tümünün PCR amplifikasyonu, doğru boyutta tek güçlü bantlar verdi (Şekil 3). Her iki primer çifti 799F/1193R ve 515F/806R, endofitik veya epifitik kabuk dokusu örneklerinden hedef ürünleri sırasıyla yaklaşık 400 ve 430 bp'de başarıyla amplifiye etti. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kabuk mikrobiyotasını incelemek için yayınlanmış metodoloji 7,18'den geliştirilen tarafımızca önerilen iş akışı, odunsu bitkilerin kabuğunun endofitik ve epifitik mikrobiyomlarının tanımlanması ve karakterize edilmesi için genel rehberlik sağlar. Bu yöntem, odunsu bitki türlerinin kabuk mikrobiyomlarını incelemek için protokoller tasarlamak için potansiyel bir plan görevi görerek, numune toplama ve işleme, genomik DNA ekstraksiyo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Video anlatımı sağladığı için Bay David Anthony Atherton'a ve değerli tavsiyeleri için B.N. laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı (32071741 numaralı hibe numarası [BN'ye]), Sincan Uygur Özerk Bölgesi'ndeki Anahtar Ar-Ge Planı Projeleri (hibe numarası 2022B02014), "Tianchi Yetenekleri" Giriş Planı (BN'ye), Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (hibe numarası 2021YFD2200203 [GQ]'ya) ve Devlet Ağaç Genetiği ve Islahı Anahtar Laboratuvarı İnovasyon Projesi (Kuzeydoğu Ormancılık Üniversitesi) (hibe numarası 2019A01 [BN]) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekipman:
Boncuk çırpıcıDHS Yaşam Bilimleri401265
1.5 mL tüpler içinSantrifüj PCR
Santrifüj
Teknoloji Co., Ltd.2010/2020 Mikrohacim spektrofotometresi
Qubit 3.0 Florometre ve nbsp;invitrogenQ33216florometre ve nbsp;
Buzdolabı(-80)Panasonic Healthcare Co., Ltd17060107
T100 Termal DöngüleyiciBio-Rad1861096Termal Döngüleyici
Tanon EPS-600 TanonA-179047-2313Elektroforez için
LabChip GX Touch HTPerkinElmerCLS138625Kütüphanesi DNA fragman dağılımı tespiti, nükleik asit kalite kontrol analizi
Applied Biosystems QuantStudio 12KUygulamalı Biyosistemler4485694Miktar Belirleme kitaplığı
Illumina Novaseq6000Illumina Kütüphane sıralama
Malzemeleri:
EldivenlerHerhangi birNA
aerosol bariyer ucu 10 & mu; LAxygenTF-300-RS
aerosol bariyer ucu 20μ LAxygenTF-20-RS
aerosol bariyer ucu 200μ LAxygenTF-200-RS
aerosol bariyer tipr 1000μ LAxygenTF-1000-R-S
santrifüj tüpü 1.5 mlAxygenMCT-150-C
Corning 96 kuyulu Siyah/Şeffaf Düz Tabanlı MikroplakaCorning3631
pamuklu çubukZHENDE MEDICAL76606
DNeasy PowerSoil KitiQIAGEN 12888-100DNA ekstraksiyonu için
enzim içermeyen santrifüj tüpü 1.5 mlABD BİLİMSEL1415-2600
etanolTianjin Yongda Kimyasal Reaktif Limited Şirketi64-17-5
sert tüpler (5 ml)DHS Yaşam Bilimleri0401261-17
Hot Master Mix Quanta Bio2200400
mikrosantrifüj tüpü 2.0 mlAxygenMCT-200-C-S
PCR SuQIAGEN 17000-10
QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti QIAGEN28704Jel ekstraksiyonu için
Quant-iT dsDNA Test Kitleri, Geniş AralıklıInvitrogenQ33130Amplifiye edilmiş ürünlerin ve saflaştırılmış amplikon kütüphanelerinin konsantrasyon tayini için
kare petri kabıChangde Bkman Biotechnology Co., Ltd110301014
çelik boncuklarShangyu Yixin Top Sanayi A.Ş.
sodyum hipoklorit çözeltisiTianjin Beilian İnce Kimyasallar Geliştirme Co, Ltd & nbsp;7681-52-9
Tween 20Nachuan Biyoteknoloji Stüdyosu9005-64-5
Çift Protokollü DNA Yüksek Duyarlı Reaktif KitiPerkinElmerCLS760672DNA kütüphanesi algılama
Vazyme Biotech Co., Ltdiçin VAHTS Kütüphanesi Miktar Belirleme KitiNQ104Niceleme kitaplığı
tüpleri için Thermo Scientific 75002440 Mikroplaka okuyucu BioTek 8040528 Nanodrop DHS Yaşam Bilimleri &YXB36985Illumina

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aguirre-Von-Wobeser, E., Alonso-Sanchez, A., Mendez-Bravo, A., Villanueva Espino, L. A., Reverchon, F. Barks from avocado trees of different geographic locations have consistent microbial communities. Archs Microbiol. 203 (7), 4593-4607 (2021).
  2. Konopka, B., Pajtik, J., Seben, V., Merganicova, K. Modeling bark thickness and bark biomass on stems of four broadleaved tree species. Plants (Basel). 11 (9), 1148(2022).
  3. Rosell, J. A. Bark in woody plants: Understanding the diversity of a multifunctional structure. Integr Comp Biol. 59 (3), 535-547 (2019).
  4. Kobayashi, K., Aoyagi, H. Microbial community structure analysis inacer palmatumbark and isolation of novel bacteria IAD-21 of the candidate division FBP. PeerJ. 7, e7876(2019).
  5. Pellitier, P. T., Zak, D. R., Salley, S. O. Environmental filtering structures fungal endophyte communities in tree bark. Mol Ecol. 28 (23), 5188-5198 (2019).
  6. Dreyling, L., Schmitt, I., Dal Grande, F. Tree size drives diversity and community structure of microbial communities on the bark of beech (fagus sylvatica). Front For Glob Change. 5, 858382(2022).
  7. Jo, Y., et al. Changes in microbial community structure in response to gummosis in peach tree bark. Plants (Basel). 11 (21), 2834(2022).
  8. Dong, C., et al. core microbiota, and function of the rhizosphere soil and bark microbiota in Eucommia ulmoides. Front Microbiol. 13, 855317(2022).
  9. Bodenhausen, N., Bortfeld-Miller, M., Ackermann, M., Vorholt, J. A. A synthetic community approach reveals plant genotypes affecting the phyllosphere microbiota. PLoS Genet. 10 (4), e1004283(2014).
  10. Bodenhausen, N., Horton, M. W., Bergelson, J. Bacterial communities associated with the leaves and the roots of Arabidopsis thaliana. PLoS One. 8 (2), e52369(2013).
  11. Stone, B. W. G., Weingarten, E. A., Jackson, C. R. The Role of the phyllosphere microbiome in plant health and function. Annual plant reviews. 1, 1-24 (2018).
  12. Lambais, M. R., Lucheta, A. R., Crowley, D. E. Bacterial community assemblages associated with the phyllosphere, dermosphere, and rhizosphere of tree species of the atlantic forest are host taxon dependent. Microb. Ecol. 68 (3), 567-574 (2014).
  13. Arrigoni, E., Antonielli, L., Pindo, M., Pertot, I., Perazzolli, M. Tissue age and plant genotype affect the microbiota of apple and pear bark. Microbiol Res. 211, 57-68 (2018).
  14. Germain, H., Séguin, A. Innate immunity: Has poplar made its bed. New Phytol. 189 (3), 678-687 (2011).
  15. Varnagirytė-Kabašinskienė, I., et al. Evaluation of shoot collection timing and hormonal treatment on seedling rooting and growth in four poplar genomic groups. Forests. 15 (9), (2024).
  16. Lu, S., et al. Ptr-mir397a is a negative regulator of laccase genes affecting lignin content in Populus trichocarpa. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (26), 10848-10853 (2013).
  17. Krabel, D., et al. Early root and aboveground biomass development of hybrid poplars (populus spp.) under drought conditions. Can J For Res. 45 (10), 1289-1298 (2015).
  18. Vitulo, N., et al. Bark and grape microbiome of vitis vinifera: Influence of geographic patterns and agronomic management on bacterial diversity. Front Microbiol. 9, 3203(2018).
  19. Aschenbrenner, I. A., Cernava, T., Erlacher, A., Berg, G., Grube, M. Differential sharing and distinct co-occurrence networks among spatially close bacterial microbiota of bark, mosses and lichens. Mol Ecol. 26 (10), 2826-2838 (2017).
  20. Liang, X., Wan, D., Tan, L., Liu, H. Dynamic changes of endophytic bacteria in the bark and leaves of medicinal plant eucommia ulmoides in different seasons. Microbiol Res. 280, 127567(2024).
  21. De Muinck, E. J., Trosvik, P., Gilfillan, G. D., Hov, J. R., Sundaram, A. Y. M. A novel ultra high-throughput 16s rRNA gene amplicon sequencing library preparation method for the illumina Hiseq platform. Microbiome. 5 (1), 68(2017).
  22. Anguita-Maeso, M., Haro, C., Navas-Cortes, J. A., Landa, B. B. Primer choice and xylem-microbiome-extraction method are important determinants in assessing xylem bacterial community in olive trees. Plants (Basel). 11 (10), 1320(2022).
  23. Wang, C., Liu, D. W., Bai, E. Decreasing soil microbial diversity is associated with decreasing microbial biomass under nitrogen addition. Soil Biol Biochem. 120, 126-133 (2018).
  24. Almeida, A., Mitchell, A. L., Tarkowska, A., Finn, R. D. Benchmarking taxonomic assignments based on 16s rRNA gene profiling of the microbiota from commonly sampled environments. GigaScience. 7 (5), giy54(2018).
  25. Liland, K. H., Vinje, H., Snipen, L. Microclass: An R-package for 16s taxonomy classification. BMC Bioinform. 18 (1), 172(2017).
  26. Li, S., et al. The AREb1 transcription factor influences histone acetylation to regulate drought responses and tolerance in Populus trichocarpa. Plant Cell. 31 (3), 663-686 (2019).
  27. Cregger, M. A., et al. The Populus holobiont: Dissecting the effects of plant niches and genotype on the microbiome. Microbiome. 6 (1), 31(2018).
  28. Maria Rodríguez, J. O., Ziani, K., Maté, J. I. Combined effect of plasticizers and surfactants on the physical properties of starch based edible films. Food Res Int. 39 (8), 840-846 (2006).
  29. Beckers, B., De Beeck, M. O., Weyens, N., Boerjan, W., Vangronsveld, J. Structural variability and niche differentiation in the rhizosphere and endosphere bacterial microbiome of field-grown poplar trees. Microbiome. 5 (1), 25(2017).
  30. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16s rrna diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 4516-4522 (2011).
  31. Mcpherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass experiments. J Vis Exp. 24 (137), e57932(2018).
  32. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  33. Callahan, B. J., et al. Dada2: High-resolution sample inference from illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  34. Pruesse, E., et al. A comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Res. 35 (21), 7188-7196 (2007).
  35. Ginestet, C. Ggplot2: Elegant graphics for data analysis. J R Stat Soc Ser A Stat Soc. 174, 245-245 (2011).
  36. Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. Stamp: Statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinform. 30 (21), 3123-3124 (2014).
  37. Holmes, S. P., McMurdie, P. J., Callahan, B. J. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. 11, 2639-2643 (2017).
  38. Chernov, T. I., Tkhakakhova, A. K., Kutovaya, O. V. Assessment of diversity indices for the characterization of the soil prokaryotic community by metagenomic analysis. Eurasian Soil Sci. 48 (4), 410-415 (2015).
  39. Li Yu, X., Hu, X. Y., Wang, X. X., Zhang, X. Y., Du, K. B. A protocol specialized for microbial DNA extraction from living poplar wood. Not Bot Horti Agrobot Cluj Napoca. 50 (4), (2022).
  40. Jeffrey, L. C., et al. Bark-dwelling methanotrophic bacteria decrease methane emissions from trees. Nat Commun. 12 (1), 2127(2021).
  41. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of zea mays l. Microb Ecol. 41 (3), 252-263 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kabuk MikrobiyomuEndofitik BakterilerEpifitik Bakteriler16S rRNA DizilemeDNA EkstraksiyonuPCR AmplifikasyonuAmplikon K t phanesiAgaroz Jel ElektroforeziMikrobiyal e itlilik

İlgili makaleler