Yöntem makalesi

Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi

2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66381

⸱

16 Şubat 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, University of Cincinnati College of Medicine

Bu makalede

Özet

Çoğu organizmada bulunan sirkadiyen ritimler, biyolojik süreçlerin zamansal organizasyonunu düzenler. 3D organoidler son zamanlarda fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, organoidlerde sirkadiyen ritimleri gözlemlemek için biyolüminesan raportörlerin kullanımını açıklar ve çok hücreli sistemlerde sirkadiyen ritimlerin in vitro olarak araştırılmasını sağlar.

Özet

Çoğu canlı organizma, yaklaşık 24 saatlik bir süre içinde meydana gelen ve uyku-uyanıklık döngülerinden metabolizmaya kadar çeşitli hücresel ve fizyolojik süreçler repertuarını düzenleyen biyolojik süreçler olan sirkadiyen ritimlere sahiptir. Bu saat mekanizması, çevresel değişikliklere dayalı olarak organizmayı sürükler ve moleküler ve fizyolojik olayların zamansal düzenlemesini koordine eder. Daha önce, otonom sirkadiyen ritimlerin, sirkadiyen ritimlerin mekanizmalarını ortaya çıkarmada etkili olan NIH3T3 fibroblastları gibi hücre hatları kullanılarak tek hücre düzeyinde bile korunduğu gösterilmişti. Bununla birlikte, bu hücre hatları, çok hücrelilik ve sağlam hücreler arası iletişimden yoksun homojen kültürlerdir. Son on yılda, in vivo morfolojik yapılara ve işlevlere benzeyen in vitro çok hücreli sistemler olan 3D organoidlerin geliştirilmesi, karakterizasyonu ve uygulanması üzerine kapsamlı çalışmalar yapılmıştır. Bu makale, çok hücreli sistemlerde sirkadiyen ritimlerin in vitro olarak araştırılmasını sağlayan, insan bağırsak enteroidlerinde bir biyolüminesan raportör kullanarak sirkadiyen ritimleri tespit etmek için bir protokolü açıklamaktadır.

Giriş

Sirkadiyen saat
Bakterilerden memelilere kadar tüm organizmaların çevreleri ile karmaşık ve dinamik bir ilişkisi vardır. Bu ilişki içinde, çevresel değişikliklere adaptasyon, organizmaların hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Çoğu organizma, işlevlerini yaklaşık 24 saatlik günlük döngülere adapte etmelerini ve optimize etmelerini sağlayan sirkadiyen ritimlere sahiptir. Sirkadiyen saat, fizyolojik homeostazı korumak ve organizmaları günlük değişikliklerle senkronize tutmak için işbirliği içinde çalışan hiyerarşik bir merkezi ve periferik saatler ağıdır 1,2. Memelilerde, suprakiazmatik çekirdekte (SCN) bulunan merkezi veya ana saat, ışık gibi dış ipuçlarını alır ve bilgileri, nöral ve humoral sinyal yollarının gelişmiş bir etkileşimi yoluyla periferik saatlere iletir3. Merkezi saate ek olarak, periferik dokular, dokuya özgü saat kontrollü genleri (CCG'ler) düzenleyen bir transkripsiyonel-translasyonel negatif geri besleme döngüsü (TTFL) tarafından sürdürülen kendi hücre otonom sirkadiyen saat mekanizmasına sahiptir4,5. Bu moleküler makine, gen ekspresyonları, sinyal yolları, bağışıklık tepkileri ve sindirim gibi hücresel ve fizyolojik olaylarda yaklaşık 24 saatlik ritmiklik üretir. Sirkadiyen saat hemen hemen tüm memeli hücrelerinde bulunur ve genlerin ifade modellerinin %50'ye kadarının sirkadiyen ritmiklik sergilediği gösterilmiştir6. CCG'lerin bolluğu göz önüne alındığında, bu saat mekanizmasının bozulması kritik fizyolojik sorunlara neden olabilir. Bu nedenle, sirkadiyen ritimlerin araştırılması, temel biyolojik mekanizmaları aydınlatmak ve yeni terapötik stratejiler geliştirmek için gereklidir.

Luciferase muhabir sistemi
Sirkadiyen çalışmalarda, gerçek zamanlı izleme, hücresel davranışların ve yanıtların daha iyi anlaşılması için kritik öneme sahiptir, çünkü gen ekspresyonu ve/veya protein seviyelerindeki zamansal değişikliklerin izlenmesine izin verir ve sirkadiyen saat tarafından düzenlenen moleküler mekanizmalar hakkında bilgi sağlar. Ayrıca, gerçek zamanlı izleme, araştırmacıların çevresel değişikliklerin moleküler mekanizmalar üzerindeki etkilerini incelemelerini sağlar 7,8. Zaman içinde gen ekspresyonunu veya protein seviyelerini izlemek için yaygın olarak kullanılan biyolüminesans testi de dahil olmak üzere gerçek zamanlı izleme çalışmaları için çok sayıda teknik vardır. Biyolüminesans testi, ışık üretimini bir okuma olarak kullanarak biyolojik süreçleri tespit etmek için bir yöntemdir. Bu tahlilde, biyolüminesans üreten oksidatif bir enzim (örneğin, lusiferaz) ya geçici ya da stabil bir şekilde ilgilenilen hücrelere transfekte edilir ve biyolüminesans okuması, zaman içinde bir substratın (örneğin, lusiferin) varlığında ölçülür. Örneğin, lusiferaz enzimi, ATP9 varlığında substrat lusiferini oksitleyerek biyolüminesans üretir. Kısa yarı ömrü (3-4 sa10) nedeniyle, ateşböceği lusiferaz, minimum arka plan gürültüsü ile gerçek zamanlı dinamik izleme sağlama açısından sirkadiyen çalışmalar için güçlü bir araçtır 11,12,13. DNA'nın lusiferaz etiketli bir promotör veya açık okuma çerçevesi (ORF) ile eklenmesi için, lentiviral gen dağıtım sistemi, yüksek transdüksiyon etkinliği, stabil entegrasyon ve düşük immünojenisite sağlayan güvenilir bir yöntemdir. Bir biyolüminesan raportörün kararlı transdüksiyonu, bölünen ve bölünmeyen hücrelerde sağlam ifade sağlar ve sirkadiyen çalışmalar için tutarlı veriler üretir14.

Bir model olarak organoid
Geleneksel ölümsüzleştirilmiş iki boyutlu hücre hatları, sirkadiyen ritimlerin temel moleküler mekanizmalarının ortaya çıkarılmasından ilaç taramasına kadar uzanan biyolojik çalışmalarda etkili olmuştur. Homojenize hücre hatlarını kullanmanın rahatlığına rağmen, çok hücreli yapılardan ve hücreler arası etkileşimlerden yoksundurlar. Buna karşılık, organoidler, kök, progenitör ve farklılaşmış hücre tipleri dahil olmak üzere in vivo doku mimarisi ve çok hücrelilik ile benzerlik göstererek bir tabaktaki organ yapısını taklit eden in vitro 3D çok hücreli "organ benzeri" yapılardır15,16. Kendi kendine organizasyon, çok hücrelilik ve işlevsellik özelliklerine sahip olmak, organoidleri gerçek dokularda meydana gelen hücresel ve fizyolojik süreçleri temsil eden dikkate değer bir in vitro model haline getirir17. İnce bağırsak, beyin, karaciğer, akciğer ve böbrek dahil olmak üzere çeşitli organlardan toplanan yetişkin kök hücrelerden yönlendirilmiş farklılaşma yoluyla pluripotent kök hücrelerden farklı organoid türleri türetilebilir18,19. Organoid yapılar gerçek doku benzeri bir mimariye sahip olduklarından, çok hücrelilik ve dinamik hücreden hücreye etkileşim ile işlev gördüklerinden, in vivo dokularda meydana gelen hücresel olayları anlamak için homojenize hücre hatlarına üstündürler. Organoidler ayrıca kolayca manipüle edilebilir ve kontrollü koşullar altında yetiştirilebilir, bu da onları sirkadiyen çalışmalar için faydalı kılar20.

Bu çalışmanın temel amacı, çok hücreli 3D organoidlerde sirkadiyen ritimleri incelemek için özel olarak tasarlanmış bir biyolüminesans testi kullanan gerçek zamanlı bir izleme yöntemini tanıtmaktır. Bir biyolüminesans tahlil tekniği kullanılarak hücresel olayların gerçek zamanlı izlenmesi, gerçek dokularda bulunan çok hücreli karmaşıklık ve hücreler arası iletişimden yoksun hücre kültürleri için yaygın olarak gerçekleştirilmiştir. 3D organoidler, in vitro olarak çok hücreli sistemlerde sirkadiyen ritimlerin işlevlerini araştırmak için eşsiz fırsatlar sunar. Örneğin, değişmiş hücre bileşimleri veya hastaların hastalıklı dokularından türetilen organoidler ile organoidlerdeki sirkadiyen ritimler araştırılabilir. Bu protokol, sirkadiyen ritimlerin farklı yönlerini, periferik organlardaki sirkadiyen ritimlerin rollerini daha iyi anlamamıza yardımcı olacak fizyolojik olarak daha ilgili bir in vitro model olan organoidlerde araştırmak için bir biyolüminesans testinin kullanılmasını sağlar.

Protokol

HİE'lerin üretilmesi için insan dokularını kullanan tüm deneyler, CCHMC'deki bir IRB tarafından onaylandı (IRB # 2014-0427). Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

NOT: Bu protokolde özetlenen prosedürü göstermek için Bmal1-luc insan bağırsak enteroidlerini (HIE'ler) kullandık. Bu enteroidlere, lusiferaza kaynaşmış Bmal1 promotörü içeren ve Bmal1 promotörü21'in aktivitesini gösteren pABpuro-BluF raportör plazmidi ile stabil lentiviral transdüksiyon22 uygulandı.

1. Lentiviral transdüksiyon

  1. HİE'ler için kök hücreden zenginleştirilmiş koşullar altında lentiviral transdüksiyonu22 gerçekleştirin. Spesifik olarak, kök hücre açısından zenginleştirilmiş koşullar yaratan bağırsak büyüme ortamına geçtikten sonraki 3-4 gün içinde HİE'lerde sferoid oluşumunu sağlayın.
  2. Lentiviral transdüksiyon22'den sonra, 2 μg / mL puromisin ile antibiyotik seçimi yapın, puromisine dirençli HIE'leri geri kazanın ve bunları nispeten yüksek yoğunlukla (ör. 2-3x için 1 kuyu 2 kuyucuğa) geçirin. HİE'lerin büyüme hızı yavaşsa, bağırsak organoid büyüme ortamına 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632) ve 10 μM GSK-3 inhibitörü (CHIR-99021) ekleyin.

2. Biyolüminesans deneyi için organoidlerin hazırlanması

  1. 1. Gün: HIE'leri 35 mm'lik yuvarlak tabaklara geçirin.
    1. Kısaca, HİE'lerin genişletilmesi için, HİE'leri büyüme faktörü azaltılmış (GFR) 3D kültür matrisi ile karıştırın ve bunları, kuyucuk başına 10 μL 3D kültür matrisi olan üç damlacık ile 24 oyuklu plakalara tohumlayın. 350 μL HIE büyüme ortamı ekleyin ve her gün değiştirin.
      NOT: 3D kültür matrisindeki HİE'nin yoğunluğu, enteroidlerin büyümesi için kritik öneme sahiptir. Yaklaşık olarak, sferoidlerin sayısı her damlacıkta 50'den fazla olmalıdır. Sayı düşükse, HİE'nin büyüme hızı olumsuz etkilenir.
    2. HİE'ler yeterince büyüdüğünde (geçiş sonrası yaklaşık 7 gün sonra), HİE'leri dört kuyudan 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine toplayın.
    3. Kalıntıları ve aşırı 2,000D kültür matrisini pipetle temizlemek için 40 saniye hızlı sıkma için bir tezgah üstü mini santrifüj (3 × g) kullanarak HIE'leri soğuk PBS ile yıkayın.
    4. Peletin içine 0,5 mL soğuk PBS ekleyin ve HIE'leri ayırmak için 1 mL'lik bir insülin şırıngası ile 10x'e kadar şırınga ederek fiziksel türbülans uygulayın.
    5. Ayrışmış HİE'leri adım 2.1.3'teki gibi bir tezgah üstü mini santrifüj ile döndürün ve süpernatanı pipet ile nazikçe çıkarın. Ardından, yaklaşık 3 dakika soğuması için HIE peletli mikrosantrifüj tüpünü buz üzerine yerleştirin.
    6. Mikrosantrifüj tüpüne GFR 3D kültür matrisi ekleyin ve HIE peleti ile karıştırın.
      NOT: Deney için kullanılacak 35 mm'lik yuvarlak tabakların sayısına göre 3D kültür matrisinin miktarını hesaplayın. Genellikle yuvarlak tabak başına 30 μL 3D kültür matrisi damlacıkları tohumlarız.
    7. HIE'ler ve 3D kültür matrisi karışımını 35 mm'lik yuvarlak tabağın ortasına tohumlayın ve 3D kültür matrisini katılaştırmak için tabağı 37 °C'de 20 dakika inkübe edin.
      NOT: Tohumlama HİE'lerinin yoğunluğu deneysel olarak belirlenmelidir. Biyolüminesansın yoğunluğuna bağlı olarak, bu işlem sırasında HİE'lerin sayısı belirlenebilir.
    8. Her yemeğe 2 mL önceden ısıtılmış bağırsak organoid büyüme ortamı ekleyin ve bulaşıkları bir sonraki adıma kadar bir CO2 inkübatörde inkübe edin.
  2. 3. Gün: Farklılaşmanın başlatılması
    1. HİE'lerin farklılaşmasını başlatmak için, büyüme ortamını çıkarın ve 2 mL önceden ısıtılmış farklılaşma ortamı ekleyin.
      NOT: HIE farklılaşma ortamının 1 tarifleri içinTablo 23'e bakın.
  3. 4. Gün: Ek bir işleme gerek yoktur.
  4. 5. Gün: Enteroidlerin ortamını 2 mL önceden ısıtılmış farklılaşma ortamı ile değiştirin.
  5. 6. Gün: Saat senkronizasyonu ve biyolüminesans kaydı
    1. Enteroidlerin moleküler saatini senkronize etmek için, her bir tabakta nihai konsantrasyonu 100 nM yapmak için 2 μL 100 μM deksametazon (Dex) ekleyin ve ardından bulaşıkları bir CO2 inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2) 1 saat24 boyunca inkübe edin.
    2. Dex sıfırlama sırasında, inkübasyon luminometresini hazırlayın. İnkübasyon luminometresinin CO2 ve sıcaklığını kontrol edin ve sırasıyla %5 ve 37 °C'ye ayarlayın.
      NOT: Steril kalması için makinenin her kullanımından önce ve sonra inkübasyon luminometresinin içinin %70 alkol ile silinmesi önerilir.
    3. Saat senkronizasyonundan sonra, enteroidleri 200 μM D-lusiferin içeren 3 mL önceden ısıtılmış farklılaşma ortamı ile doldurun.
      NOT: Lusiferin ışığa duyarlı olduğundan, lusiferin içeren ortam folyo ile sarılmalı ve tabağa uygulanmadan önce 37 ° C'lik bir ısı banyosunda önceden ısıtılmalıdır.
    4. Bulaşıkları inkübasyon luminometresinin 8 oyuklu bir tabak masasına yerleştirin ve numune tabak masasını kapağıyla örtün. Numune kabı masasının üstüne ıslak mendil veya sünger içeren iki nemlendirici haznesi yerleştirin. Bu tek seferlik bir işlemdir.
      NOT: Deney başlatıldıktan sonra, inkübasyon luminometresinin kapağı, deney sonlandırılana kadar kapalı tutulmalıdır. Mendilleri/süngerleri yeterince ıslattığınızdan emin olun.
    5. Makinenin kapağını kapatın ve istenen gün sayısı ve çözünürlük için biyolüminesansı ölçmek için programı başlatın.
      1. Yazılımda, Durum sekmesine tıklayarak durum ayarlarını seçin ve bu paneldeki ayarları yapın: bulaşık sayısı, ölçüm süresi, arka plan işleme ve filtre türü.
        NOT: Bu gösteri için A'dan H'ye kadar tüm yemekleri seçtik; yemek sayısına göre yazılım tarafından belirlenen varsayılan ölçüm süresi; arka planda işleme için bekleme süresi ve F0 filtre türü. Üç filtre seçeneği olduğundan, üç ışıldayan renk aynı anda ölçülebilir.
      2. Deneye dayalı olarak tüm uygun ayarları girdikten sonra, Tamam'a tıklayarak ayarları kaydedin.
      3. Denemeyi çalıştırmaya başlamak için Çalıştır sekmesine tıklayın | Başlat düğmesi (yeşil üçgen simgesi). Deneyleri çalıştırırken yazılım ekranının üst kısmında uygun seçimleri yaparak verileri ham, gürültü filtrelenmiş veya trendden arındırılmış olarak gözlemleyin. Seçilen verileri gözlemlemek için Ham, Gürültü Filtreli veya Trendden Çıkarılmış sekmelere tıklayın.
      4. Sinyalleri 5 güne kadar gözlemleyin.
        NOT: İnkübasyon luminometresinde 5 günlük izlemeden sonra, ortamın tükenmesi nedeniyle enteroidler ölmeye başlayabilir. Deney sırasında olası herhangi bir sirkadiyen bozulmayı önlemek için, deney süresince ortam değişikliği yapmıyoruz.
      5. Denemenin sonunda, Durdur düğmesine (mavi kare simge) tıklayarak çalıştırmayı durdurun, Dosya sekmesine gidin ve Farklı kaydet'e tıklayın. Verileri Kronos biçiminde kaydedin; Verileri bir elektronik tabloya aktarın Dosya bölümünde Dosya seçeneğini tıklayarak ve ardından daha fazla analiz için Dosya altında Excel biçiminde dışa aktar'ı seçerek verileri bir elektronik tabloya aktarın.

Sonuçlar

Biyolüminesans kaydı, iki farklı koşul altında insan bağırsak enteroidlerinin (HİE'ler) sirkadiyen ritmikliğini değerlendirmek için gerçekleştirildi: bağırsak organoid büyüme ortamı (Şekil 3) kullanılarak kök hücre ile zenginleştirilmiş koşullar ve bağırsak organoid büyüme ortamının bir farklılaşma ortamı ile değiştirilmesiyle elde edilen farklılaşmayı indükleyen koşullar. Deney günü, 100 nM Deksametazon ile 1 saatlik bir tedavi gerçekleştirerek sirkadiyen saatleri senkronize ettik. Daha sonra, ortamı 3 mL bağırsak organoid büyüme ortamı veya 200 μM D-Luciferin ile desteklenmiş farklılaşma ortamı ile değiştirdik ve biyolüminesans aktivitesinin izlenmesini başlattık. 4-5 günlük bir kayıt periyodunun ardından, gözlenen sirkadiyen ritimlerin periyodunu belirlemek için Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT) analizi gerçekleştirdik. Şekil 3 , yukarıda belirtilen koşullarda Bmal1 promotör aktivitesinin zamansal dinamiklerini göstermektedir. Farklılaşan koşullar altında, Bmal1-luc biyolüminesans, ortalama 22.92 saatlik bir periyodiklik ile sağlam sirkadiyen salınımlar sergiledi. Buna karşılık, HİE'ler kök hücreden zenginleştirilmiş koşullarda bozulmuş sirkadiyen ritimler göstermiştir (Şekil 3). Bu veriler, kök hücreden zenginleştirilmiş koşullardaki HİE'lerin sağlam sirkadiyen salınımlar göstermediğini göstermektedir. Başka bir deyişle, organoidlerde sirkadiyen saate bağlı fonksiyonları araştırmadan önce büyüme koşullarının sirkadiyen ritimlere göre etkisini değerlendirmek gerekir.

figure-results-1
Şekil 1: Protokolün şematik çizimi. HİE'ler 1. günde 35 mm'lik tabaklara geçirilir ve 3. güne kadar 2 mL büyüme ortamı ile kültürlenir. Geçişten sonraki üçüncü günde, enteroidlerin farklılaşmasını başlatmak için besiyeri, 2 mL önceden ısıtılmış farklılaşma ortamı ile değiştirilir. Besin tüketiminin tükenmesini önlemek için 5. günde 2 mL önceden ısıtılmış ortam ile orta değişim tekrarlanır. 6. günde, enteroidler sirkadiyen saat senkronizasyonu için 1 saat boyunca 100 nM Deksametazon ile tedavi edilir. Bir saat sonra, ortam 3 mL 200 μM D-lusiferin içeren ortam ile değiştirilir ve bulaşıklar inkübasyon luminometresine yerleştirilir. Biyolüminesans ifadesini 4-5 gün boyunca kaydettikten sonra deney sonlandırılır ve oluşturulan veriler daha fazla analiz için elektronik tablolar olarak dışa aktarılır. Kısaltma: HIE = insan bağırsak enteroidi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Büyüme ortamı altındaki HİE'ler için temsili bir görüntü. Görüntü, 25x objektifli bir geniş alan mikroskobu ile çekildi. Ölçek çubuğu = 1 mm. Kısaltma: HIE = insan bağırsak enteroidi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Kök hücreden zenginleştirilmiş ve farklılaşma koşullarından HİE'lerden biyolüminesans kayıtları. (A) Kök hücreyle zenginleştirilmiş (kırmızı) ve farklılaşma (siyah) koşulları altında Bmal1-luc HIE'lerin ham ve (B) trendi bozulmuş biyolüminesans kayıt verileri. (C) Farklılaşma koşulları altında HİE'lerde Bmal1-luc salınımlarının periyodu. Periyot FFT analizi ile hesaplanır; kök hücre ile zenginleştirilmiş koşul altındaki Bmal1-luc HIE'ler için n = 3 ve farklılaşma koşulu altındaki Bmal1-luc HIE'ler için n = 4. Hata çubukları SD'yi gösterir. Kısaltmalar: HIE = insan bağırsak enteroidi; FFT = Hızlı Fourier Dönüşümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Farklılaştırma Medya Tarifleri
Reaktifin AdıŞirketKatalog NumarasıSon KonsantrasyonYorum
İleri düzey DMEM/F12Yaşam Teknolojileri12634-028Son bileşen olarak ekleyin. 50 mL'lik ortam hazırlarsanız, diğer tüm bileşenleri ekledikten sonra kalan kısmı 50 mL'ye kadar sonunda Gelişmiş DMEM/F12 ile doldurun.
Bir 83-01Sigma AldrichSML0788500 deniz mili
B-27 Takviyesi (50x)Gibco (Türkçe)17504-0441 katı
Gastrin I İnsanSigma AldrichG9020 Serisi10 nM
GlutaMAX (GlutaMAX)Gibco (Türkçe)350500611 katı
HEPES PROJESİGibco (Türkçe)1563008010 milyon
N-2 takviyesi (100x)Gibco (Türkçe)17502-0481 katı
N-Asetil-L-sisteinSigma AldrichA9165 Serisi1 milyon
NOGGIN Şartlandırılmış Ortam5%Laboratuvarda üretilmiştir
Penisilin-StreptomisinGibco (Türkçe)15140122100 U/mL
Rekombinant murin EGFPeproTech Teknolojisi315-0950 ng/mL
R-SPONDIN Şartlandırılmış Ortam10%Laboratuvarda üretilmiştir

Tablo 1: HİE farklılaşma ortamının bileşimi23.

Tartışma

Biyolüminesans testi, uzun süreli zaman kursu deneylerinden veri toplanmasını gerektiren sirkadiyen ritimlerin araştırılması için çeşitli avantajlar sunar. İlk olarak, araştırmacıların, hücreler hareket ettikçe ve çoğaldıkça ilgilenilen gen ekspresyonunu veya proteini izlemelerini sağlar. Gereksiz ayarlamalar yapmadan veya hücrelerin işlevlerini bozmadan, ilgili hücresel olaylar veya gen ekspresyonu, güvenilir gerçek zamanlı veriler sağlayan biyolüminesans okuması kullanılarak kaydedilebilir. Daha da önemlisi, biyolüminesans deneyi, sürekli karanlıkta gerçekleştirildiği için floresan deneylerine kıyasla minimum arka plan gürültüsü üretir25. Ayrıca, uzun süreli izleme için biyolüminesans testi tercih edilir, çünkü floresan testi için birkaç gün boyunca sürekli uyarma, yüksek fototoksisiteye ve fotoağartmaya neden olabilir. Bununla birlikte, ışık uyarımı olmadığından, biyolüminesans testi, floresan proteinlerinden daha kısık bir sinyal sağlar26. Lusiferazın kısa yarı ömrü, onu sirkadiyen çalışmalar için tercih edilir kılar ve ek kararsızlaştırıcı diziler eklenerek daha da kısaltılabilir12.

Canlı hücre izleme için çeşitli avantajlar sunmasına rağmen, biyolüminesans deneylerinin bazı sınırlamaları vardır. Biyolüminesans testi, bir hücre popülasyonundan geçici gen ekspresyonu veya protein izleme için sağlam bir okuma sağlasa da, uzamsal çözünürlüğü sınırlıdır, bu da onu tek hücrelerden protein lokalizasyon verileri toplayan deneyler için daha az uygulanabilir hale getirir. Avantajları ve dezavantajları göz önüne alındığında, biyolüminesans testi, özellikle sirkadiyen çalışmalar için diğer yöntemlerden üstündür; Daha az toksisite ve yüksek hassasiyet sunar, bu da onu uzun süreli izleme için ideal hale getirir.

Deney hazırlama aşamasında birkaç kritik faktör göz önünde bulundurulmalıdır. Öncelikle, lentiviral transdüksiyon için uygun bir seçim stratejisinin uygulanması kritik öneme sahiptir; Olgumuzda 2 hafta boyunca 2 μg/mL puromisin seçimi yaptık. Seçimin yetersiz uygulanması, raportör plazmidini barındıran yetersiz sayıda enteroid ile sonuçlanabilir ve bu da tutarsız lusiferaz ekspresyon seviyeleri verir. Optimal tohumlama yoğunluğu da aynı derecede önemlidir; Aşırı yoğunluk, biyolüminesans kaydının başlatılmasından sonra herhangi bir ortam ikamesi olmadığından, deney sırasında erken besin tükenmesine neden olabilir. Tersine, HİE'lerin düşük yoğunluğu, biyolüminesans çıkışının azalmasına neden olabilir ve böylece okumanın sağlamlığını etkileyebilir. İzleme sırasında enteroidler için uygun bir ortamın sağlanması, deneysel sonuçların güvenilirliği için esastır. CO2, sıcaklık ve nem seviyeleri dahil olmak üzere optimal koşulların korunması, enteroidler içindeki hücresel süreçlerin sağlamlığını teşvik ederek HIE'lerin bakımı için kritik öneme sahiptir. Optimal sıcaklık ve CO2 seviyelerinden sapmalar, hücresel metabolizmayı ve sinyal yollarını etkileyerek potansiyel olarak sirkadiyen ritimleri etkileyebilir. Yeterli nem seviyeleri eşit derecede önemlidir, kurumayı önler ve enteroidlerin yapısal bütünlüğünü korur. Bu nedenle, çevresel koşullara titiz bir şekilde dikkat edilmesi, deneysel modelin ve enteroidleri içeren sirkadiyen çalışmaların doğruluğu için kritik öneme sahiptir.

Saat senkronizasyonu, tek tek hücrelerin iç sirkadiyen saatini hizalayarak birleşik ve koordineli bir durumda olmalarını sağladığı için sirkadiyen çalışmalar için gereklidir. Bu senkronizasyon, sirkadiyen ritmikliğin tüm kültür düzeyinde kesin bir şekilde gözlemlenmesi ve analizi için gereklidir. Bu protokolde 100 nM Deksametazon (Dex) ile saat senkronizasyonu gerçekleştirdik. Dex'in hücre yapısı veya işlevi üzerindeki etkisi hakkında bazı endişeler olabilir. Daha önceki araştırmalar, kortikosteroidlerin enteroidlerde epitel bariyer fonksiyonunu arttırdığını göstermektedir27. Bununla birlikte, bu fenotipin, enteroidlerin 12 saat boyunca 10 μM prednizolon ile tedavi edilmesinden sonra gözlendiğini vurgulamak önemlidir. Deksametazonun 1 saatlik kısa bir tedavisinin, enteroidler içindeki hücrelerin yapısı ve işlevi ile ilgili önemli değişikliklere neden olmayacağını umuyoruz.

Homolog tek hücreli kültür yerine organoid kültürün biyolüminesans aktivitesinin izlenmesi benzersiz güçlü yönlere sahiptir. İlk olarak, çoklu hücre tipleri, in vivo dokuda olduğu gibi bir organoid kültürde birbirleriyle etkileşime girerken, tipik bir 2D hücre kültürü, tek bir hücre tipinden oluşan bir tür izole ortamda ilgilenen gen ekspresyonunu izler. Organoid kültür, çok hücreli etkileşimler ve sinyal yolakları ile daha gerçekçi sonuçlar sağlar. Hücreden hücreye etkileşim, özellikle heterojen hücre kültürü gerektiren farklılaşma ve hücreler arası yol çalışmaları için kritik öneme sahiptir28. Sonuçlarımız, farklılaşmış durumdaki HİE'lerin sağlam sirkadiyen salınımlar gösterdiğini, ancak kök hücreyle zenginleştirilmiş durumda sirkadiyen ritimlerin bozulduğunu göstermektedir. Bu veriler, sirkadiyen saat mekanizmasının yetişkin kök hücrelerden farklılaşmış hücrelere potansiyel olarak yeniden şekillendiğini göstermektedir. Özetle, sirkadiyen biyolüminesan raportörlü organoidler, sirkadiyen ritimlerin işlevlerini fizyolojik olarak daha ilgili bir şekilde ortaya çıkaran çok hücreli bir in vitro sistemde sirkadiyen ritimlerin araştırılmasını sağlar.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

İnsan bağırsak enteroidleri, Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi'ndeki (CCHMC) Dr. Michael Helmrath'ın laboratuvarından elde edildi. Bu çalışma R01 DK11005 (CIH) ve Cincinnati Üniversitesi Kanser Merkezi Pilot Fonu tarafından desteklenmiştir. Cincinnati Üniversitesi Canlı Mikroskopi Çekirdeği'nden (NIH S10OD030402) görüntüleme desteği için minnettarız.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
35 x 10 Falcon doku kültürü kaplarıFisher Scientific08-772A
A 83-01Sigma AldrichSML0788
Gelişmiş DMEM/F12Yaşam Teknolojileri12634-028
B-27 Takviyesi (50x)Gibco17504-044
BD Micro-Fine IV İnsülin ŞırıngalarıFisher Scientific14-829-1BbMfrn: BD 329424
CHIR99021Cayman Chemical13122GSK-3 inhibitörü
DeksametazonSigma AldrichD4902-500MG
D-Luciferin (potasyum tuzu)Cayman Chemical14681
Gastrin I İnsanSigma AldrichG9020
GlutaMAXGibco35050061
Büyüme Faktörü azaltılmış (GFR) MatrigelCorningCB-40230C
HEPESGibco15630080
IntestiCult Organoid Büyüme Ortamı (İnsan)Kök Hücre Teknolojileri06010, IntestiCult OGM İnsan Bazal Ortamı, 50 mL ve organoid takviyesi, 50 mL'den oluşur. Bağırsak organoid büyüme ortamı olarak kullanmak için her ikisini de 1: 1 oranında karıştırın
Kronos Dio Luminometre MakinesiATTO CorporationAB-2550
N-2 Takviyesi (100x)Gibco17502-048
N-Asetil-L-sisteinSigma AldrichA9165
pABpuro-BluF muhabir plazmidAddgene46824
PBS Kalsiyum ve MagnezyumiçermezCorning21-040-CV
Penisilin-StreptomisinGibco15140122
Rekombinant murin EGFPeproTech315-09
Y-27632R& D Systems1254/10KAYA inhibitörü

Kaynaklar

  1. Cox, K. H., Takahashi, J. S. Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism. J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).
  2. Ayyar, V. S., Sukumaran, S. Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions. J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).
  3. Reppert, S., Weaver, D. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  4. Takahashi, J. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).
  5. Wolff, C. A., et al. Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice. Cell Rep. 42 (1), 111982(2023).
  6. Ruben, M. D., et al. A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine. Science Trans Med. 10 (458), 8806(2018).
  7. Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions. STAR Protoc. 2 (2), 100416(2021).
  8. Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).
  9. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1030 (2003).
  10. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), 590-598 (2000).
  11. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters. J Vis Exp. (67), e4234(2012).
  12. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  13. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
  14. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  15. Lee, S., Hong, C. I. Organoids as model systems to investigate circadian clock-related diseases and treatments. Front Genet. 13, 874288(2022).
  16. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  17. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med. 95 (7), 729-738 (2017).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  19. Rosselot, A. E., et al. Ontogeny and function of the circadian clock in intestinal organoids. EMBO J. 41 (2), 106973(2021).
  20. Corrò, C., Novellasdemut, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (1), C151-C165 (2020).
  21. Brown, S. A., et al. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLos Biol. 3 (10), e338(2005).
  22. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. J Vis Exp. (98), e52531(2015).
  23. Criss, Z. K., et al. Drivers of transcriptional variance in human intestinal epithelial organoids. Physiol Genomics. 53 (11), 486-508 (2021).
  24. Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput Biol. 2 (10), e136(2006).
  25. Hara-Miyauchi, C., et al. Bioluminescent system for dynamic imaging of cell and animal behavior. Biochem Biophys Res Commun. 419 (2), 188-193 (2012).
  26. Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).
  27. Xu, P., Elizalde, M., Masclee, A., Pierik, M., Jonkers, D. Corticosteroid enhances epithelial barrier function in intestinal organoids derived from patients with Chron's disease. J Mol Med (Berl). 99 (6), 805-815 (2021).
  28. AlMusawi, S., Ahmed, M., Nateri, A. S. Understanding cell-cell communication and signaling in the colorectal cancer microenvironment. Clin Transll Med. 11 (2), 308(2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Sirkadiyen Ritmlernsan Ba rsak EnteroidleriOrganoid ModeliK k H cre DiferansiyasyonuMolek ler Saat Senkronizasyonu3B K lt r MatrisiBiyol minesans AnaliziFourier D n m Analizi
Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.