Bu makale, farelerde miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarını (IRI) indüklemek için benzersiz bir kapalı göğüs tekniği sunmaktadır. Sunulan yöntem, farelerin uzaktan miyokard iskemisini indüklerken kendiliğinden nefes almalarını sağlar. Bu, iskemi ve reperfüzyonun dinamik süreçlerini yerinde ve noninvaziv görüntüleme yoluyla gerçek zamanlı olarak incelemek için hayvana erişim sağlar.
Yöntem makalesi
Spontan Solunum Yapan Farelerde Balon Kateter Kullanılarak Uzaktan Tetiklenen LAD Oklüzyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Akut miyokard infarktüsü (AMİ) sık görülen ve yüksek mortaliteye sahip bir kardiyovasküler hastalıktır. için revaskülarizasyon stratejilerindeki gelişmelere rağmen, sıklıkla miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarına (IRI) yol açarak kardiyak hasarı arttırır. Murin modelleri, hem akut yaralanmayı hem de kronik miyokardiyal yeniden şekillenmeyi in vivo olarak araştırmak için hayati araçlar olarak hizmet eder. Bu çalışma, farelerde miyokardiyal IRI'yi uzaktan indüklemek için benzersiz bir kapalı göğüs tekniği sunar ve MRI veya PET gibi in vivo görüntüleme kullanılarak oklüzyon ve reperfüzyonun çok erken evresinin araştırılmasını sağlar. Protokol, göğüs kapatıldıktan sonra iskemi başlangıcı üzerinde hassas kontrol sağlayan bir uzaktan oklüzyon yöntemi kullanır. Cerrahi travmayı azaltır, spontan nefes almayı sağlar ve deneysel tutarlılığı artırır. Bu tekniği diğerlerinden ayıran şey, oklüzyon ve reperfüzyon olayları sırasında ultrason ve manyetik rezonans görüntüleme (MRI) dahil olmak üzere eşzamanlı noninvaziv görüntüleme potansiyelidir. Doku tepkilerini neredeyse gerçek zamanlı olarak analiz etmek için eşsiz bir fırsat sunarak, iskemi ve reperfüzyon sırasındaki süreçler hakkında kritik bilgiler sağlar. Bu yenilikçi yaklaşımın kapsamlı sistematik testleri yapıldı, enfarktüs için kardiyak nekroz belirteçleri ölçüldü, kontrastlı MRG kullanılarak risk altındaki alan değerlendirildi ve yara olgunlaşma aşamasında enfarktüsler boyandı. Bu araştırmalar sayesinde, miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarına yönelik araştırma yaklaşımlarını ilerletmede ve hedefe yönelik müdahalelerin geliştirilmesini hızlandırmada önerilen aracın değerine vurgu yapılmıştır. Önerilen yenilikçi deneysel protokolün noninvaziv görüntüleme teknikleri ile kombine edilmesinin uygulanabilirliğini gösteren ön bulgular burada sunulmuştur. Bu ilk sonuçlar, aynı anda MRI taramaları yaparken miyokardiyal iskemiyi uzaktan indüklemek için amaca yönelik hayvan beşiğinin kullanılmasının faydasını vurgulamaktadır.
Giriş
Akut miyokard infarktüsü (AMİ), sık görülen global bir kardiyovasküler hastalıktır ve yüksek mortalite oranları ve morbidite ile ilişkilidir1. hastaları için erken ve etkili revaskülarizasyon stratejilerini mümkün kılan teknolojik gelişmelere rağmen, hastalar bu girişimleri takiben hala miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) yaşamaktadır2. Bu nedenle, IRI'yi azaltmak için temel mekanizmaları anlamak ve yaklaşımlar formüle etmek çok önemlidir. IRI, çok sayıda karmaşık biyolojik süreci içeren karmaşık bir patofizyolojik durumu temsil eder. Bunlar, düzenlenmiş hücre ölümünü, oksidatif stres tepkilerini, iltihaplanmayı, yara iyileşmesini, fibrozu ve ventriküler yeniden şekillenmeyi kapsar. Fareler gibi hayvan modelleri, IRI araştırmaları için büyük önem taşımıştır ve maliyet etkinlikleri, hızlı üremeleri ve transgenik modellerden elde edilen mekanik bilgi zenginliği nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır3.
Bu protokol, insan patolojisini daha yakından taklit eden, kapalı bir göğsü olan kendiliğinden nefes alan farelerde IRI'yi uzaktan indüklemek için yenilikçi bir teknik sunar. Sol ön inen arteri (LAD) tıkamak için miyokarddan uzakta konumlandırılan balon kateter kullanılarak uzaktan oklüzyon sağlandı. Bu yaklaşım, ultrason veya manyetik rezonans görüntüleme (MRI) dahil olmak üzere eşzamanlı görüntüleme modalitelerini kolaylaştırarak, oklüzyon ve reperfüzyonun tam anlarında atan kalbe sürekli erişim sağlar. Bu noninvaziv yöntemler, oklüzyon ve reperfüzyon olaylarından önce, sırasında ve sonrasında doku tepkileri hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.
Fare modellerinde IRI'yi indüklemek için çeşitli cerrahi teknikler mevcuttur. Açık göğüs koroner ligasyon modellerinde torakotomiden kaynaklanan cerrahi travma, iskemi ve reperfüzyon ile ilişkili çeşitli mekanizmaları etkileyen bir immün yanıtı tetikler. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin aktivasyonu, miyokard enfarktüsünün derecesini etkileme potansiyeline sahiptir4. Önerilen uyarlanmış teknik, açık toraks zaman dilimini maksimum 5 dakikaya indirgeyerek murin IRI çalışmalarında miyokardiyal ön ve son koşullandırmayı keşfetmek ve muhtemelen cerrahi travmaya doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin etkisini azaltmak için potansiyel bir yaklaşım sağlar. Ayrıca, yeni geliştirilen teknik, ventilatöre bağlı akciğer hasarının neden olduğu proinflamatuar sekellerin azaltılmasına da katkıda bulunabilir5. Bununla birlikte, bu yeni kapalı göğüs yönteminin birleşik etkileri daha derinlemesine araştırma gerektirecektir.
Önerilen tekniğin kapsamlı bir şekilde doğrulanması, LAD'nin cerrahi göğüs diseksiyonu ve ligatür kaynaklı oklüzyon yoluyla 30 dakika boyunca açığa çıkarılmasını içeren geleneksel yöntemle karşılaştırılarak gerçekleştirildi. Kardiyak enfarktüs boyutunu yansıtan troponin ölçümleri, gadolinyum kontrast arttırımlı MRG kullanılarak risk altındaki alanın değerlendirilmesi, histolojik trifenil tetrazolyum klorür (TTC) boyaması ve Sirius Red (SR) boyama yoluyla nihai yara izi boyutlarının belirlenmesi dahil olmak üzere her iki teknikten elde edilen sonuçlar karşılaştırıldı. Sonuç, murin modellerinde iskemi-reperfüzyon hasarını incelemek için önerilen yaklaşımın sağlamlığını ve etkinliğini göstermektedir.
Protokol
Bu hayvan protokolü, Leuven Katolik Üniversitesi'ndeki Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (ECD) tarafından belirlenen yönergeler ve düzenlemeler tarafından onaylanmıştır ve bunlara uygundur. Yerel ECD tarafından geliştirilen tüm politikalar, 2010/63/EU sayılı Direktifte belirtildiği gibi Avrupa Birliği'nin laboratuvar hayvanlarının refahı ile ilgili düzenlemelerini takip eder. Aşağıda açıklanan tüm testler 8-12 haftalık (vücut ağırlığı = 20-23 g) erkek C57BL / 6 fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Akut deneyler, ameliyattan hemen sonra sakrifiye edilen hayvanları temsil ediyor. Hayatta kalma deneyleri, troponin ölçümü, MRI ve SR boyama dahil olmak üzere dört haftalık bir takibi temsil ediyordu.
1. Anestezi ve endotrakeal entübasyon
- Anestezi öncesi ilaçları bir ketamin karışımı (7.5 mg / kg; Nimatek 100 mg / mL), ksilazin (1 mg / kg; Rompun, 20 mg / mL) ve asepromazin (0.1 mg / kg; Plicivet, 10 mg / mL) (KXA) (Malzeme Tablosuna bakınız) intraperitoneal olarak% 0.9 tuzlu su seyreltici ile. Bu, daha yumuşak ve daha az invaziv bir entübasyon sağlar.
- Fareyi bir indüksiyon odasına yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve saf oksijende %2,5 izofluran kullanarak 1 L / dk akış hızıyla doğru ve ayak parmağını sıkıştırma refleksi kaybolana kadar anestezi uygulayın.
- Hayvanı ısıtılmış bir pede (±38 °C) aktarın ve başı cerraha bakacak şekilde sırtüstü pozisyonda konumlandırın. Kuyruk ve ön pençeleri pedin üzerine bantla sabitleyin. Ön uzuvların aşırı gerilmediğinden emin olun, çünkü bu solunumu tehlikeye atabilir.
- Üst kesici dişlerin etrafına 2-0 ipek sütür ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin ve fareyi gergin bir şekilde çekmek için pediskin kenarına bantlayın. Gerekirse, dikişin gerginliğini korumak için bir iğne tutucu takın. Bir burun konisi kullanarak 1 L / dk'lık bir akışla% 100 oksijen içinde% 2 izofluran kullanılarak uyuşturulmuş hayvanı koruyun.
- Sternumun hemen rostral kısmına bir ışık kaynağı yerleştirin, burun konisini çıkarın ve izofluran beslemesini ventilatörün üzerine yerleştirin. Dili yukarı kaldırarak ve dilin bazal kısmını daha fazla kaldırmak ve ses tellerini görselleştirmek için kendi kendine yapılan bir laringoskop tutarak fareyi forseps kullanarak entübe edin.
- Ses telleri arasındaki kör bir iğneye 18 G'lik bir kateter kullanarak kendi kendine yapılan bir trakeal tüp yerleştirin. Kateteri yukarı doğru hareket ettirin, kör iğneyi çıkarın ve tüpü fare ventilatörüne bağlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Entübasyon tüpünü ventilatöre bağlamak için modifiye edilmiş Y şeklinde bir konektör kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın). Trakeal tüpün doğru konumlandırılması, simetrik göğüs genişlemesinin değerlendirilmesiyle doğrulanabilir.
- Tidal hacmi (mL) vücut ağırlığı (BW) (g) x 7'ye ve ventilasyon hızını dakikada 53,5 x (BW (g)-0,26) vuruşa ayarlayın ve gerekirse belirli bir farenin vücut ağırlığına ayarlayın6 (örneğin, 25 g'lık bir fare için tidal hacim dakikada 140 vuruşta 175 mL'dir).
- İzofluranı% 100 oksijende% 1'e düşürün, çünkü hayvan premedikasyon nedeniyle anestezi altında kalacaktır. Bununla birlikte, bir ayak parmağı çimdikleme yaparak anestezi derinliğini düzenli olarak değerlendirin. İzofluran konsantrasyonunu anestezi derinliğine göre uyarlayın.
- Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için bir damla oftalmik merhem sürün.
2. IRI aracının kurulumu
NOT: Tüm bantları çıkarın ve hayvanı amaca yönelik olarak üretilmiş IRI aletinin taban plakasına yerleştirin. IRI aracının özellikleriyle ilgili ayrıntılar Ek Dosya 1'de belirtilmiştir.
- Amaca yönelik olarak üretilmiş uzaktan IRI aletinin taban plakasını cerrahın önünde yan konuma sabitleyin. Kuyruğu ve pençeleri bant kullanarak sabitleyin. Kazara hareketi önlemek için üst kesici dişlerin etrafına 2-0 ipek sütür kullanarak başı sabitleyin (Şekil 1).
- Vücut sıcaklığını izlemek için rektal termal probu yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve sıcaklığı 37 °C civarında tutmak için hayvanın üzerinde bir kızılötesi ısıtma lambası kullanın. Aşırı ısınmayı önlemek için hayvan ile lamba arasındaki yeterli mesafeye dikkat edin.
- Kalp atış hızını ve EKG dalga biçimini gözlemlemek ve kaydetmek için EKG iğne elektrotlarını dört pençenin tümüne yerleştirin. Rektal probu ve EKG elektrotlarını bant kullanarak platforma sabitleyin.
- Tüyleri almak ve net bir cerrahi alan oluşturmak için göğüs kafesinin sol tarafına tüy dökücü krem sürün.
NOT: Kimyasal yanıkları önlemek için uygulama süresini sınırlayın ve kremin tamamen çıkarılmasına dikkat edin.
3. Torakotomi
- Betadine Solüsyonu kullanarak cildin aseptik hazırlığını gerçekleştirin, ardından steril bir ortam sağlamak için sol göğüs kafesine cerrahi bir örtü yerleştirin. Prosedürü gerçekleştirmek için sterilize edilmiş ekipman kullanın. Göğüs kasının orta kısmında, yaklaşık 1 cm uzunluğunda ve sol sternal sınırdan 2 mm uzakta dikey bir cilt kesisi yapın.
- Altındaki kaburgaları ortaya çıkarmak için göğüs kasını tükürün. Geminin kazara yaralanmasını önleyin. Kanama olursa, herhangi bir kanamayı durdurmak için pamuklu aplikatörler kullanın.
- Kaburgaları görselleştirin ve ince, yarı saydam göğüs duvarından şişen akciğeri gözlemleyerek interkostal boşlukları tanımlayın. Üçüncü interkostal aralıkta 6-8 mm'lik bir kesi yaparak cerrahi makas kullanarak göğüs boşluğunu açın. Kesinin, internal torasik arterin bulunduğu sternal sınırdan en az 2 mm uzakta olduğundan emin olun.
- İnterkostal boşluğa küçük bir sıçan gözü spekulumu yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Bu, bir kaburga ekartörü olarak işlev görecektir (Şekil 1A).
- Perikardları kavisli forseps ile yavaşça kaldırın ve ayırın.
- Akciğerin üzerine küçük bir parça pamuk yerleştirin ve yavaşça aşağı doğru itin.
4. LAD hazırlığı
- LAD parlak kırmızı görünür ve sol kulak kepçesinin altındaki aorttan apekse doğru uzanır. Ligatür için ideal konumlandırma, sol kulak kepçesinin ucundan yaklaşık 2 mm daha aşağıdır. Sol kulak kepçesini tanımlamaya ve ışık akışını kullanarak LAD görselleştirmesini optimize etmeye yardımcı olmak için pulmoner gövdeyi bir işaretleyici olarak kullanın (Şekil 2).
- LAD'ın etrafından 7-0 polipropilen sütür geçirmek için konik bir iğne kullanın. İğneyi sol ventriküle girebileceği için çok derine veya LAD'ye zarar verebileceği için çok sığ yerleştirmeyin.
- Küçük pamuk parçasını çıkarın ve sol akciğerin hala havalandırılıp havalandırılmadığını kontrol edin.
- Kaburga ekartörünü çıkarın.
- Dikişin her iki ucunda en az 15 cm uzunluğunda olduğundan emin olun. İğneyi kesin.
- 1 mm'lik bir PE-50 boru parçasının üzerine bir parça 15 mm PE-10 boru yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Sütürün her iki ucunu PE-10 tüpünden geçirin ve PE tüpünü daha kalın ucu kalbe doğru kaydırın.
5. Göğüs kapatma ve ekstübasyon
- Açık interkostal boşluğa bir miktar fusidik asit jeli uygulayın ve ventilatörün dışarı akışını kısa bir süre engelleyerek kalan intratorasik havanın nazikçe kaçmasına izin verin. Göğüs kafesine hava girişini önlemek için PE tüpünün dış kısmına ek fusidik asit jeli eklenebilir.
- Göğüs kasını, PE tüpünün seviyesinin üstünde ve altında 5-0 polipropilen X dikişle kapatın ve PE tüpünün kalınlaşmış kısmının kas seviyesinin altında olduğundan emin olun.
- PE tüpünün üstünde ve altında iki adet 5-0 polipropilen X dikişle cildi kapatın (Şekil 1B ve Şekil 3).
- Kapalı bir göğüs ile hayvan tekrar kendiliğinden nefes alabilir. Tidal hacmi ve solunum hızını yavaşça azaltarak hayvanı ventilatörden ayırın. Hayvan nefes almaya başladığında, ventilatör tüpünü kendiliğinden dikkatlice ayırın, ancak stabil bir solunum paterni gözlenene kadar yerinde tutun.
- İzofluran kaynağını, hayvanın burnunun üzerine yerleştirilen ve taban plakasına sabitlenen bir nosekon ile bağlayın.
6. Uzak IR aracının montajı
- Dikey yan parçayı yarıklara yerleştirerek taban plakasına yerleştirin.
- İki dikiş ucunu almak için ince bir kanca kullanın ve bunları balonun arkasındaki yan kısımdaki merkezi delikten çekin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Dikişlerden birinin uçlarını balonun üzerine ve etrafına yönlendirin. Balonun altındaki ve etrafındaki diğer dikiş ucu ile devam edin. Sütürün daha düzgün yönlendirilmesi için fusidik asit jeli uygulayın.
- Dikiş uçlarını yan kısmın üst kısmındaki yarıklardan geçirin. Sütürün distal kısmında, her bir dikiş ucunu yerinde tutmak için 2.1 g'lık bir ağırlık uygulayın (Şekil 1C ve Şekil 4).
NOT: Uygun ağırlıkların konfigürasyonu değişebilir ve önceden test edilmelidir. Ayrıntılar için Ek Şekil 1 ve Ek Dosya 1'e bakın. Uzak IRI araç tasarımı Ek Şekil 2'de verilmiştir.
7. İskemi ve reperfüzyonun indüksiyonu
- Vasküler balon pompasını kullanarak balonu 2 bar'a kadar hemen şişirerek iskemiyi indükleyin. Pompayı kilitleyin. Balonun şişirilip şişirilmediğini ve ağırlıkların kaldırılıp kaldırılmadığını görsel olarak kontrol edin (Şekil 4).
- EKG izindeki değişikliği gözlemleyerek iskemiyi doğrulayın.
- Balonu belirli çalışma protokolüne göre ayarlanan süre boyunca şişirilmiş halde bırakın (sunulan deneylerde 30 dakika).
- Pompanın kilidini açarak tıkanıklığı durdurun. Balonu dikkatlice söndürün. Balonun sönüp sönmediğini ve ağırlıkların indirilip indirilmediğini görsel olarak kontrol edin.
8. Uzak IR aracının sökülmesi
- Hayvan ile yan kısım arasındaki dikişi ve tüpü kesin ve yan kısmı dikkatlice çıkarın.
- Borunun göğüs kafesine yerleştirildiği yere fusidik asit jeli uygulayın. Cildi tüpe doğru nazikçe itmek için kavisli forseps kullanın ve tüpü çıkarmak için başka bir forseps kullanın. Cilde yakın kalan dikişleri kesin.
- Tüpün çıkış bölgesini kapatmak ve göğüs kafesine hava girişi riskini en aza indirmek için ekstra bir 5-0 polipropilen sütür yerleştirin.
9. Narkozun sona ermesi ve iyileşmesi
- İzofluran kaynağını durdurun ve hayvanın sessiz, sıcak ve oksijen açısından zengin bir ortamda uyanmasına izin verin.
- Farenin herhangi bir solunum sıkıntısı içinde olmadığını, tamamen iyileşene kadar gözlemleyerek onaylayın. Dehidrasyonu önlemek için intraperitoneal enjeksiyonla 0.3 mL steril salin (vücut sıcaklığında) sağlayın.
- Postoperatif analjezi için, hayvan ayaktan olmadan önce deri altına bir opioid analjezik (buprenorfin, 0.1 mg / kg) uygulayın. Farelerin ağrı kesici ilaçlara yanıt verdiğinden emin olmak ve ek ağrı kesici ilaçlara ihtiyaç olup olmadığını belirlemek için buprenorfin verildiğinde sonraki 24-48 saat boyunca fareleri her 4-6 saatte bir kontrol edin. Ek destek, ameliyat sonrası kafes tabanına yerleştirilen standart bir destekleyici bakım diyeti, jel veya püre içermelidir.
Sonuçlar
İskemiyi indükleme yeteneğinin doğrulanması dört testle gerçekleştirilmiştir: Trifenil tetrazolyum klorür (TTC) ve Sirius Red (SR) boyama, kardiyak troponin I ölçümü ve Geç gadolinyum güçlendirme (LGE) MR görüntüleme. İstatistiksel anlamlılık, sınırlı örneklem büyüklükleri göz önünde bulundurularak Mann-Whitney non-parametrik test kullanılarak değerlendirildi. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 olarak belirlendi.
Akut deneylerde (TTC boyama, n = 15) teknik bir arıza yoktu ve tüm hayvanlar dahil edildi. Bu akut deneyler, acil takip deneylerini (kardiyak troponin I, LGE MRG, Sirius kırmızı boyama, n = 12) içeriyordu ve 4 haftalık bir süre boyunca uzak ve standart oklüzyon teknikleri için sırasıyla% 85 ve% 80'lik bir sağkalım oranına sahipti.
Trifenil tetrazolyum klorür boyama
Kalpte iskemi-reperfüzyon hasarının bir fare modelinde TTC (Trifenil tetrazolyum klorür) boyaması, dehidrojenaz enziminin fonksiyon kaybını göstererek miyokardiyal canlılık olgusunu makroskopik olarak ölçer. Bu boyama yöntemi, kalbin hala canlı (canlı) olan bölgeleri ile iskemi nedeniyle yaşayamaz hale gelen bölgeleri ayırt etmeye yardımcı olur. Canlı miyokard TTC ile kırmızıya boyanırken, iskemik alan soluk veya lekesiz kalır çünkü dehidrojenaz enzimi artık işlevsel değildir. Bu, iskeminin başlamasından hemen sonra doku hasarının derecesi hakkında kritik bilgiler sağlar. Boyama, standart IRI (n = 7) ve uzak IRI (n = 8) grupları için 30 dakikalık iskemiden hemen sonra yapıldı. Şekil 5 , bir hayvan için temsili lekeli dilimleri göstermektedir ve doku dilimleri tabandan tepeye doğru geçmektedir. TTC boyama sonuçları Şekil 6'da sunulmuştur ve iki IRI tekniği arasında anlamlı bir fark göstermemektedir. TTC boyaması Fishbein ve ark.7 tarafından tarif edildiği şekilde yapıldı.
Geç gadolinyum tutulumu MRG
İskemik alanın derecesini noninvaziv olarak ölçmek için, standart IRI (n = 5) ve uzak IRI (n = 5) grupları için oklüzyondan 24 saat sonra LGE MRG kullanıldı. Ayrıntılı satın alma özellikleri Ek Dosya 1'de verilmiştir. Risk altındaki alan, Ek Dosya 1'de ayrıntıları verilen eşik kriterlerini aşan en apikal üç dilimde sol ventrikülün % dokusu olarak ölçülür. Şekil 7'deki grafiksel gösterim, risk altındaki alan ölçümlerini değerlendirirken yeni önerilen uzaktan oklüzyon tekniği ile geleneksel 'açık göğüs' yöntemi arasında önemli bir fark gözlenmediğini göstermektedir.
Sirius Kırmızısı boyama
Miyokard iskemisinin bir sonucu olan miyokard enfarktüsü, iskemi yaşayan bireyler için ciddi bir sorun teşkil eder, çünkü kalbin kasılma kütlesinin azalmasına neden olur ve kanı verimli bir şekilde pompalama kapasitesini bozar. Şekil 8 , LGE MRG ile gösterilen risk altındaki alana dayalı olarak yara oluşumunun yerini doğrulamak ve yara dokusunun derecesini ölçmek için oklüzyondan 4 hafta sonra Sirius Kırmızı boyama kullanarak bulguları daha da açıklamaktadır. Boyama standart IRI (n = 5) ve uzak IRI (n = 5) grupları için yapıldı. Parlak kırmızı alanlar enfarktüsün nekrotik çekirdeğini işaretlerken, turuncu kısımlar canlı dokuyu işaretler. Son olarak, Şekil 9 , her iki teknikte de Sirius Red boyama kullanılarak ölçülen son yara izi boyutlarını bildirmektedir. Yara izi boyutu, 2.4 mm kalınlığındaki apikal doku kesitli levhada lekeli enfarktüsün alanının, sol ventrikül serbest duvarının toplam alanına bölünmesiyle hesaplanır. Sirius Red boyaması Rittié8'e göre yapıldı.
Kardiyak troponin I
Görüntüleme ve boyama tekniklerine ek olarak, çalışma ayrıca bir belirteç olarak Kardiyak troponin I kullanarak kardiyak hasarı da değerlendirdi. Ameliyattan 24. saatte standart IRI (n = 8) ve uzak IRI (n = 8) grupları için kan örnekleri toplandı. Şekil 10 , yeni uzaktan oklüzyon tekniğini standart IRI tekniği ile karşılaştırırken önemli bir fark göstermeden Kardiyak troponin I değerini göstermektedir.
Önerilen konseptin uygulanabilirliğinin bir göstergesi olarak, eşzamanlı noninvaziv görüntüleme ile uzak bir yerden iskemiyi indüklemenin ön sonuçları da sağlanmıştır. Bu, MRI hayvan beşiğine yerleştirilen ve MR tarayıcısının merkezine yerleştirilen özel yapım uzaktan oklüzyon aracı kullanılarak elde edildi. Şekil 11'de gösterilen sonuçlar, enfarktüslü ve enfarktüssüz bölgeler arasındaki görüntü kontrastındaki (parlaklık seviyeleri) farklılıkları göstermektedir. Hayvan MR tarayıcı içinde konumlandırılırken LAD'ın başarılı oklüzyonunu doğrulayan bir belirteç olarak tipik ST elevasyonunu gösteren EKG izi Şekil 12B'de sunulurken, Şekil 12A'da oklüzyon öncesi EKG izi gösterilmektedir.
Bu kapsamlı yaklaşım, yeni önerilen uzaktan oklüzyon tekniğinin, geleneksel 'açık göğüs' yöntemine kıyasla deneysel modelde iskemi, nekroz ve kardiyak hasar üzerindeki etkilerinin ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Şekil 1: Protokolde belirtildiği gibi hayvanın hazırlanışını gösteren temsili görüntüler. (A) Kaburga ekartörünün yerleştirilmesi ile torakotomi. (B) Göğüs kafesinden çıkan bir PE-10 tüpü ile göğsün kapatılması ve sütürün LAD etrafında yönlendirilmesi. (C) Hayvanı monte edilmiş uzak IRI aletinin içine yerleştirmek. Sütürün her iki ucunu sıkıştıran ve uzak IRI beşiğinin yan kısmında duran iki adet 2.1 g ağırlığa dikkat edin. Yan kısım, aletin taban plakasındaki kesikler tarafından konumlandırılır ve yerinde tutulur. Vasküler balon kateter söndürülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: LAD (beyaz ok) ve sol kulak kepçesinin (siyah ok) ex vivo görselleştirmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Uzaktan oklüzyon için kullanılan aletin konumunu gösteren deney düzeneğinin şematik yukarıdan aşağıya görünümü. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yandan görünümden uzaktan oklüzyon için aletin kullanımını gösteren şematik. (A) Ameliyatın başlangıcından itibaren hayvan alt kısma yerleştirilir. Göğsü kapattıktan sonra yan kısım yerine monte edilir. Bu noktada, balon hala sönüktür ve ağırlıklar alt kısımda durmaktadır. (B) Balon kateterinin şişirilmesi, ağırlıkları (oklarla işaretlenmiş) kaldıracak ve LAD'nin tıkanmasına ve ardından miyokardda iskemiye neden olacaktır. EKG izindeki değişikliklerde başarılı oklüzyon görülür. Balonun söndürülmesi, LAD'den geçen kan akışını eski haline getirecektir. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Trifenil tetrazolyum klorür (TTC) ile boyanmış fare kalp dilimlerinin temsili görüntüleri. Dilimler, en üst sıradan başlayarak tabandan tepeye soldan sağa doğru hareket eder. (A) Standart IRI. (B) Uzaktan IRI. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: TTC boyama sonuçları. Oklüzyondan 24 saat sonra enfarktüs boyutunu ölçmek için TTC boyaması yapıldı. Veri noktaları, standart IRI (n = 7) ve uzak IRI (n = 8) gruplarının SEM ile ortalama olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Geç gadolinyum tutulumu MRG. LGE MRG ile elde edilen en apikal üç dilimde (apeksin kendisi hariç) tanımlandığı gibi oklüzyondan 24 saat sonra risk altındaki alan. Veri noktaları, standart IRI (n = 5) ve uzak IRI (n = 5) gruplarının SEM ile ortalama olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: İskemi/reperfüzyon işleminden sonra uzak oklüzyon cihazının MRG ile doğrulanması. Oklüzyondan 1 gün sonra LGE MR görüntülerinde tanımlandığı gibi risk altındaki alan ile oklüzyondan 4 hafta sonra Sirius Red ile boyanmış kesin skar dokusu arasında temsili karşılaştırma. (A-B) Sırasıyla uzak ve tezgah oklüzyonu olan bir hayvanın kısa eksenli dilimleri. Ok, risk altında tanımlanan alanı işaretler. (C-D) Aynı ilgili hayvanlardan Sirius Kırmızısı ile boyanmış histolojik dilimler, son yara izi oluşumunun, oklüzyondan 24 saat sonra MRG ile risk altındaki alan tanımlamasıyla eşleştiğini doğrular. LV = sol ventrikül. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Sirius Kırmızısı boyama sonuçları. Oklüzyondan 4 hafta sonra skar oluşum derecesini ölçmek için Sirius Red boyaması yapıldı. Veri noktaları, standart IRI (n = 5) ve uzak IRI (n = 5) gruplarının SEM ile ortalama olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Oklüzyondan 24 saat sonra elde edilen fare serumundaki kardiyak troponin I konsantrasyonunun miktar tayini. cTnI'nin veri noktaları, standart IRI (n = 8) ve uzak IRI (n = 8) gruplarının SEM ile ortalama olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Önerilen uzaktan oklüzyon aracının eş zamanlı MRG alımı ile birlikte kullanılmasıyla elde edilen ön sonuçlar gösterilmiştir. Oklüzyon öncesinde, sırasında ve kısa bir süre sonra bir hayvanın kısa eksen oryantasyonunda aynı orta ventrikül dilimi sunulur. Solda, temsili görüntü dilimi, deneyin başlangıcındaki miyokardiyal sınırları gösterir (IRI'yi tetiklemeden önce). Ortada, aynı kısa eksen dilimi, 30 dakikalık uzaktan indüklenen iskemi sonrasında gösterilir. Manganez klorür (MnCl), enfarktüslü bölgeyi (sarı ile işaretlenmiş) vurgulamak için bir kontrast madde olarak kullanıldı. Parlaklık, farklı doku bölgelerini vurgulamak için manuel olarak ayarlandı ve doygun hale getirildi. Septal ve yanal serbest duvar arasındaki parlaklık farkına dikkat edin (sarı ile işaretlenmiştir). Sağ tarafta, daha önce olduğu gibi aynı parlaklık ayarları kullanılarak, oklüzyondan 20 dakika sonra (reperfüzyon aşaması) aynı kısa eksen dilimi gösterilir. Ok, oklüzyon zamanına kıyasla parlaklığı artan bölgeyi gösterir, reperfüzyon aşamasında kontrast maddenin alımını ve oklüzyon anında belirtildiği gibi ilk hipointens bölgenin büzülmesini şart koşar. LV = sol ventrikül. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 12: İskemi başlangıcını doğrulamak için MRG izleme sistemi kullanılarak yakalanan EKG izi. (A) Uzak oklüzyondan önce yakalanan normal EKG izi. (B) Aynı hayvanda balon şişirmeden hemen sonra yakalanan EKG izi. Ok, tipik olarak başarılı iskemi başlangıcının bir belirteci olarak kabul edilen ST segmentindeki yükselmeyi gösterir. Sinyal genliğinde bir azalmaya ek olarak kalp ve solunum hızlarında bir artış da gözlenir. Hayvan, oklüzyon ve reperfüzyon aşamalarında MR tarayıcısının merkezine yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Ağırlıkların konfigürasyonu. Balon uzaktan kumanda sistemi (mavi) kullanılarak dinamometre yer değiştirme fonksiyonundaki tüm ağırlıkların grafiği vs. Orijinal kasnak sistemi (turuncu). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Uzaktan IRI araç tasarımı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: IRI aracının özellikleri ve görüntü elde etme ve analiz teknikleri hakkında ayrıntılar. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Bu çalışmada tanıtılan yeni uzaktan oklüzyon tekniği, ilk cerrahi sırasında doğrudan damar manipülasyonu ihtiyacını ortadan kaldırarak ve erken reperfüze miyokardın eşzamanlı multimodal görüntülemesine izin vererek iskemi-reperfüzyon yaralanma modellemesi alanındaki araştırmaları ilerletmek için benzersiz bir platform sunmaktadır. Troponin-I ölçümleri, LGE kontrast MRG, TTC ve SR boyama dahil olmak üzere kapsamlı karakterizasyon, önerilen tekniğin mevcut altın standarda eşdeğer olduğunu göstermektedir (ör., açık göğüs LAD ligasyonu)9.
Önerilen tekniğin geleneksel 'açık' LAD ligasyon yaklaşımına göre birçok avantajı vardır. Öncelikle, geleneksel yaklaşımda gerekli olan oklüzyon süresi (30-60 dakika) artı cerrahi sürenin (15 dakika) aksine, ameliyat sırasında açık göğüs süresini sadece 15 dakikaya düşürür. Bu en aza indirilmiş açık kalp ameliyatı, doku hasarını ve iltihabı hafifletebilir, ancak daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyacaktır. Ayrıca, erken torakotomi kapatma, ventilatörün kesilmesine izin verir, böylece iskemi-reperfüzyon deneyleri sırasında izofluran altında spontan solunumu mümkün kılar. Bu, ventilatöre bağlı akciğer hasarını ve ilişkili iltihabı azaltma potansiyeline sahipken, aynı zamanda miyokardiyal iskemi ve reperfüzyona fizyolojik olarak daha doğru bir yanıt verir10.
Ayrıca, uzaktan oklüzyon tekniği, iskemi indüksiyonunun tam zamanlaması üzerinde gelişmiş kontrol sağlar. Kavram kanıtı olarak, miyokard iskemisini uzaktan indüklemenin ve kontrol etmenin fizibilitesi ve ön sonuçları gösterilirken, hayvan MR tarayıcısının merkezine yerleştirildi. Göğüs kapandıktan sonra iskemiyi kesin olarak başlatma yeteneği, araştırmacıların terapötik müdahaleleri veya ek araştırmaları zamanlamasına ve iskemik hakareti deneysel denekler arasında senkronize etmesine olanak tanır. Bu artan kontrol, mekanik ve terapötik çalışmalar için kritik olan IRI'nin daha doğru ve tutarlı bir şekilde indüksiyonuna yol açabilir. Bununla birlikte, kardiyak MRG kurulumu sırasında izofluran inhalasyonunun marjinal uzantısı bu çalışma için bir sınırlama oluşturabilir. Yani, izoflurana uzun süre maruz kalmak, murin çalışmalarında gösterildiği gibi ek kardiyoprotektif etkilere sahip olabilir ve önerilen model11 için daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyacaktır.
İndüklenen yaralanmanın derecesindeki değişiklik, IRI modellerinde yaygın bir zorluktur ve genellikle cerrahi uygulama veya değişken anatomideki farklılıklardan kaynaklanır12. Daha da önemlisi, cerrahın yeterli eğitimi, bu modeldeki ölüm oranlarını LAD yerleşimi, deney süresi, fare suşları ve genetik arka planlar gibi diğer tanınmış değişkenlerin ötesinde etkileyecektir13. Anestezik ve analjezik ajanların seçimi de sonuçları etkileyebilir. Tecrübeye göre, bu model %15'e yakın bir genel ölüm oranı sergilemektedir. Titiz ağrı yönetimi ve dikkatli hayvan izlemesi uygulamak mortaliteyi daha da azaltabilir.
Bu çalışmanın işaret ettiği zorlayıcı yönlerden biri, oklüzyon veya reperfüzyonun erken evrelerinde terapötik müdahalelerin değerlendirilmesinde uzaktan oklüzyon tekniğinin potansiyel uygulamasıdır.
Sonuç olarak, uzaktan oklüzyon tekniği, IRI modellemesinde, potansiyel olarak mekanik çalışmaların iyileştirilmesinde ve hedefe yönelik tedavilerin hızlandırılmasında umut verici bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Cerrahi travmayı azaltma, iskemi zamanlaması üzerindeki kontrolü artırma ve deneysel tutarlılığı artırma kapasitesi önemini vurgulamaktadır. Araştırmacılar, tekniğin uyarlanabilirliğini daha fazla keşfederek, tam potansiyelini ortaya çıkarabilir ve iskemi indüksiyonu, reperfüzyon ve eşlik eden iskemi-reperfüzyon hasarının erken aşamalarının daha doğru bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunabilirler. Ayrıca, farklı tedavi stratejilerinin etkisi artık bu ilk aşamalarda gözlemlenebilir.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Deneyler, KU Leuven çekirdek tesisi 'Moleküler Küçük Hayvan Görüntüleme Merkezi'nde (MoSAIC) gerçekleştirildi. Yazarlar, teknik yardım için Katarzyna Błażejczyk'e teşekkürlerini sunarlar. Araştırma, KU Leuven (C14/20/095) ve Araştırma Vakfı - Flanders (FWO G0A7722N) tarafından sağlanan araştırma hibeleri ile desteklenmiştir. M. Algoet, Araştırma Vakfı - Flanders Burs Bursu (FWO 11A2423N) tarafından desteklenmektedir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2-0 ipek sütür | Sharpoint Ürünler | DC-2515N | |
| 5-0 polipropilen sütür | Ethicon | 8710H | |
| 7-0 polipropilen sütür | Ethicon | 8206H | |
| ACCLARENT Balon Şişirme Cihazı | Johnson& Johnson MedTech | BID30 | |
| Asepromazin | Kela | ||
| BD Vialon 18 G | BD | 381347 | |
| BD Vialon 20 G | BD | 381334 | |
| Betadine | Çözeltisi Purdue Pharma | 25655-41-8 | |
| Buprenorfin (Buprenex Enjekte Edilebilir) | Reckitt Benkiser Sağlık | NDC 12496-0757-1 | |
| Sazan Zoom Styl Knijplood 2.1 g (kurşun balıkçılık ağırlıkları) | Visdeal.nl | ||
| Dumont #3 Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11251-30 | |
| İnce Makas | Güzel Bilim Araçları | 14040-10 | |
| Fucidine jel | Leo Pharma | ||
| Isofluran | Abbott | NDC 5260-04-05 | |
| KD Fare/Sıçan Göz Spekulumu | Dünyası Hassas Aletler | 501897 | |
| KD fare/sıçan gözü spekulumu | Dünyası Hassas Aletler | 501897 | |
| Ketamin | Dechra | ||
| Işık kaynağı | Zeiss | KL 1500 LCD | |
| MRI sistemi | Bruker BioSpin, Ettlingen, Almanya | BioSpec 70/30 | |
| NatriumChloride %0.9 | Baxter | ||
| Gece Kızılötesi Isı | Lambası Zoo Med Laboratories, Inc. | RS-75 | |
| ParaVision yazılımı | Bruker BioSpin | sürüm 6.0.1 | |
| polietilen boru PE-10 | SAI İnfüzyon teknolojileri | PE-10 | |
| polietilen boru PE-50 | SAI İnfüzyon teknolojileri | PE-50 | |
| uzaktan IRI aracı (PMMA) | ev yapımı | ||
| Kemirgen Cerrahi Monitörü | Indus aletleri | ||
| Segment v4.0 | Medviso, segment.heiberg.se | R12067 | |
| Kendinden kapılı gradyan yankı dizisi | Bruker BioSpin, Ettlingen, Almanya | IntraGate, ParaVision 6.0.1 | |
| İnce Uzatılmış İğne Tutucu | Güzel Bilim Araçları | 12005-15 | |
| Sure-Seal Fare/Sıçan İndüksiyon Odası | Dünya Hassas Aletler | EZ-178 | |
| Boru Konnektörleri, Poli, Y Şekli | Westlab | 072025-0001 | |
| Ultraverse 035 PTA Dilatasyon Kateteri: 5mm x 40mm, 130 cm uzunluğunda kateter üzerinde 17 ATM RBP balonu | Bard Periferik Vasküler, Inc. | ||
| Veet (tüy dökücü krem) | Reckitt Benkiser Sağlık Ventilatörü | ||
| , MiniVent Model 845 | Hugo Sachs | 73-0043 | |
| Vidisic | BAUSCH & LOMB PHARMA | 685313 | |
| Ksilazin | Bayer |
Kaynaklar
- Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101 (5), 593-600 (1981).
- Ibáñez, B., et al. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. J Am Coll Cardiol. 65 (14), 1454-1471 (2015).
- Dąbrowska, A. M., et al. The immune response to surgery and infection. Cent Eur J Immunol. 39 (4), 532-537 (2014).
- Muthuramu, I., et al. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. J Vis Exp. (94), e52206(2014).
- Nickles, H. T., et al. Mechanical ventilation causes airway distension with proinflammatory sequelae in mice. Am J Physiol-Lung C. 307 (1), L27-L37 (2014).
- Reed, G. W., et al. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).
- Rittié, L. Method for picrosirius red-polarization detection of collagen fibers in tissue sections. Methods Mol Biol. 1627, 395-407 (2017).
- Schwarte, L. A., et al. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Vaneker, M., et al. Mechanical ventilation induces a Toll/Interleukin-1 receptor domain-containing adapter-inducing interferon β-dependent inflammatory response in healthy mice. Anesthesiology. 111, 836-843 (2009).
- Van Allen, N. R., et al. The role of volatile anesthetics in cardioprotection: A systematic review. Med Gas Res. 2, 22(2012).
- Kumar, D., et al. Distinct mouse coronary anatomy and myocardial infarction consequent to ligation. Coron Artery Dis. 16 (1), 41-44 (2005).
- Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Res Cardiol. 97 (3), 206-213 (2002).
Yeniden basım ve izinler
