Maya iki-hibrit testi kullanılarak etkileşim-boş/bozulmuş mutantların izole edilmesi

Biyomoleküller arasındaki etkileşimler, biyolojik olayların en temel parçasıdır. Protein-protein etkileşimleri bu etkileşimlerin önemli bir bölümünü oluşturur. Bu nedenle, ilgilenilen bir proteinin etkileşim ortağının/ortaklarının tanımlanması, ilgilenilen proteinin/genin işlevini daha fazla aydınlatmak için kritik öneme sahiptir. Maya iki-hibrit (Y2H) yöntemi, in vivo¹ protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için popüler bir tekniktir. Bu sistemde, etkileşimi test edilecek olan iki protein (X ve Y) sırasıyla DNA bağlama (DB) alanına ve transkripsiyonel aktivasyon alanına (AD) kaynaştırılır. DB-X füzyon proteini, DB alanının bir tanıma dizisine bağlanır; bu nedenle, X ve Y proteinleri etkileşime girdiğinde, AD-Y füzyon proteini, tanıma dizisinin yakınına gelir. Sonuç olarak, tanıma dizisinin aşağı akışındaki raportör genin transkripsiyonu aktive edilir. Bu nedenle, raportör gen aktivitesinin varlığı veya yokluğu, protein-protein etkileşiminin varlığını veya yokluğunu belirlemek için kullanılabilir¹.

İlgilenilen proteinin spesifik bir etkileşim ortağı belirlendikten sonra, etkileşimin biyolojik işlevini aydınlatmak için daha fazla analiz yapılmalıdır. Bu amaçla, spesifik protein-protein etkileşimini bozan veya ortadan kaldıran proteinlerin mutantları izole edilebilirse, güçlü araçlar olarak hizmet edeceklerdir. Y2H sistemi, vahşi tip 'etkileşim-pozitif' klondan başlayarak 'etkileşim-negatif' klonları tarayarak bu tür mutantları doğrudan izole etmek için kullanılabilir. Bu süreci hızlandırmak için 'ters' Y2H (rY2H) sistemleri geliştirilmiştir ^2,3. rY2H sistemlerinde, konakçı maya suşları, raportör genler olarak karşı seçilebilir işaretleyici genleri barındırır, yani maya hücreleri yalnızca AD-Y ve DB-X proteinleri etkileşime girmediğinde büyür.

Hem Y2H hem de rY2H sistemleri, etkileşim negatif mutantların izolasyonuna izin verse de, mutantları izole etme süreci zahmetlidir çünkü tarama yoluyla elde edilen adayların tümü istenen mutasyon türünü (genellikle yanlış anlamlı mutasyonlar) taşımaz. En ciddi sorun, adayların önemli bir bölümünün çerçeve kayması veya saçma sapan mutasyonlar barındırması ve istenmeyen klonları dışlamak için batı blotlama yapmanın gerekli olmasıdır. Bu sorunun üstesinden gelmek için yeni plazmit vektörleri geliştirilmiştir⁴. Bu vektörlerde, bir ilaç direnci belirteci olan KanMX, DB alanının veya AD'nin aşağı akışında çerçeve dışı konumlandırılır. İşaretleyici gen, yalnızca ilgilenilen gen eklendiğinde DB alanı veya AD ile çerçeve içi hale gelir. İlgilenilen gende rastgele bir mutasyon (lar) ortaya çıktığında, çerçeve kayması veya anlamsız mutasyonlara sahip olanlar gibi istenmeyen mutantlar, ilaç direnci seçimi yapılarak kolayca elimine edilebilir ve arzu edilen yanlış anlamlı mutasyonları taşıyan adaylar Y2H ekranı⁴ ile kolayca tanımlanabilir. Bu makale, bu stratejiyi kullanarak ilgilenilen bir proteinin etkileşimi boş/bozulmuş mutantlarını izole etmek için bir protokol sunmaktadır.

1. Mutant kütüphanesinin inşası

1. Polimeraz zincir reaksiyonunu (PCR) ayarlayın (aşağıda bir örnek gösterilmiştir). Genel olarak, 5 μL'lik on alikota bölünmüş 50 μL'lik reaksiyonu hazırlayın ve hedef gen fragmanını bir PCR makinesinde⁴ çoğaltın.
   NOT: Kullanıcılar, mutasyonları verimli bir şekilde tanıtmak için uygun bir polimeraz seçmelidir. Amplifiye edilecek DNA fragmanı kısaysa, düzeltme okuma aktivitesinden yoksun olan Taq polimeraz gibi daha yüksek hata oranına sahip bir polimeraza ihtiyaç vardır. Amplifiye edilecek DNA fragmanı uzunsa, mutasyon sayısını azaltmak için daha yüksek kaliteli bir polimeraz gerekir. Mutasyonlar, düzenli Taq polimeraz⁴ ile 30 döngü amplifikasyondan sonra her birkaç yüz baz çiftinde bir meydana gelir. Temsili sonuçlarda, normal Taq polimerazdan daha yüksek sadakate sahip farklı bir Taq polimeraz kullanıldı (Malzeme Tablosuna bakınız) ve mutasyon oranı 600 baz çiftinde birdi. PCR karışımlarının, primer detaylarının ve reaksiyon koşullarının bir örneği Ek Dosya 1'de verilmiştir.
2. PCR tamamlandığında, reaksiyonun tüm alikotlarını birleştirin, ilgilenilen DNA fragmanlarının agaroz jel elektroforezi vb. kullanılarak amplifiye edildiğini doğrulayın ve DNA^5'i saflaştırın.
3. Adım 1.2'de oluşturulan DNA parçasını 'kesintisiz' bir klonlama stratejisi kullanarak uygun Y2H vektörü ile birleştirin (Şekil 1).
   NOT: Gibson assembly⁶ gibi dikişsiz klonlama sistemi, kendi kendine ligasyon yoluyla üretilen boş vektörler tarafından oluşturulan oluşturulmuş mutant kitaplığın kirlenmesini en aza indirir. Y2H vektörlerinin bir listesi Tablo 1'de verilmiştir. Montajdan önce BamHI sindirimi ile hazırlanabilirler. Tüm plazmitler Ulusal BiyoKaynak Projesi'nden temin edilebilir - maya (bkz. Malzeme Tablosu).
4. Adım 1.3'te üretilen reaksiyon karışımını, yüksek verimli bir E. coli transformasyon protokolüne göre hazırlanan Escherichia coli yetkin hücrelerine ekleyin (örneğin, Inoue ve ark.7). Tüm yetkili hücreleri, uygun antibiyotikler içeren birkaç LB plakasına (%1 tripton, %0.5 maya özütü, %1 NaCl ve %2 agar) yayın (bkz. Bu noktada, kütüphane titresini hesaplamak için aynı seçim plakasına küçük bir miktar (toplam reaksiyonun ~ 1 / 100'ü) yayın. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
5. Çok sayıda E. coli kolonisi ortaya çıktığında, tek kullanımlık bir plastik halka kullanarak tüm hücreleri plakanın yüzeyinden kazıyın. Alkalin lizis⁸ gibi popüler yöntemleri kullanarak bu hücrelerden plazmit DNA'yı kurtarın. Aynı zamanda, dönüşüm karışımının küçük alikotlarını plaka üzerine yaydıktan sonra ortaya çıkan koloni sayısını sayın. Bu sayıyı kullanarak, kitaplıktaki toplam bağımsız klon sayısını tahmin edin.
   NOT: Bu noktada, dönüşüm reaksiyonunun küçük alikotlarının yayıldığı plaka üzerinde görünen birkaç bağımsız koloniyi (4-6) alın, bunları ayrı ayrı kültürleyin ve hemen hemen tüm klonların istenen DNA parçalarını taşıdığını doğrulamak için plazmitleri bunlardan izole edin⁵. Plazmitleri E. coli'den izole etmek için birçok ticari kit mevcuttur. Küçük alikotlar yayıldıktan sonra plaka üzerinde görünen koloni sayısı manuel olarak sayılabilir.
6. Kütüphane DNA havuzunun konsantrasyonunu ölçün. Genellikle, birkaç yüz nanogram kütüphane DNA'sı, bir sonraki adımda birkaç bin dönüştürücü elde etmek için yeterlidir.
   NOT: DNA konsantrasyonunun DNA'ya bağlanan bir floresan boya kullanılarak ölçülmesi önerilir, çünkü A₂₆₀ ölçümü genellikle yanlıştır.

2. Mutant kütüphane ve replika kaplama ile mayanın dönüşümü

1. Mutant kütüphaneyi konakçı maya suşuna (TAT-7 (L40-ura3)^9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)_8-lacZ) yaklaşık 100 ng DNA kullanarak Y2H testi için. Konakçı hücreleri 'yem' plazmidi ile önceden dönüştürün.
   1. Dönüşüm işleminden sonra, maya hücrelerini steril suda askıya alın ve uygun plakalara farklı miktarlarda alikotlar yayın (genellikle lösin ve triptofan içermeyen SC ortamı: SC-LW [% 0.67 maya azot bazı,% 2 glikoz, 1.546 g / L SC çift bırakma karışımı -Leu -Trp ve% 2 agar, Malzeme Tablosuna bakınız]). Bu plakaları gece boyunca 30 °C'de inkübe edin.
      NOT: ~5 × 10⁶ logaritmik olarak büyüyen hücrelere sahip lityum asetat-PEG yöntemi¹¹ gibi standart protokol, mayanın dönüşümü için yeterlidir. Elektroporasyon gibi yüksek dönüşüm verimliliğine sahip başka bir yöntem de kullanılabilir.
2. Ertesi gün, küçük koloniler ortaya çıktığında, uygun sayıda hücreye (500-2000) sahip plakaları seçin ve bunlardan aşağıdaki gibi kopyalar yapın.
3. Birkaç kopya yapmak için bir çoğaltma bloğuna iki yaprak filtre kağıdı yerleştirin (ortam SC-LW ve kanamisin içeren SC-LW'dir) (Malzeme Tablosuna bakınız). 30 °C'de 1-2 gün inkübe edin.
   NOT: Kanamisin (G418) konsantrasyonu 600 μg/mL'dir. Replika kaplama için kadife kullanmayın çünkü kolonilerin çözünürlüğü kaybolacaktır.
4. Koloniler büyüdükten sonra, plakaları karşılaştırın ve adayları seçin. Raporlayıcı olarak lacZ kullanılıyorsa bir Y2H renk tahlili yapın (bkz. adım 3).
   NOT: Y2H muhabiri için lacZ , zayıf bir etkileşimi tespit etmede genellikle HIS3'ten daha iyidir.

3. Y2H renk tahlili

1. Adım 2 kullanılarak hazırlanan çoğaltma plakasına önceden uygun boyutta kesilmiş bir filtre kağıdı yaprağı yerleştirin. Filtre kağıdı ile plaka arasında hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat edin.
   NOT: No. 4A filtre kağıdı veya Grade 50 filtre kağıdı kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın). Replika kaplama ile yapılan herhangi bir SC-LW veya SC-LW kanamisin plakası içeren renk tahlili için kullanılabilir.
2. Plakadaki filtre kağıdı tamamen nemlendiğinde (filtre kağıdının rengi tamamen değiştiğinde), üstüne birkaç yaprak kağıt havlu yerleştirin ve fazla nemi almak için filtre kağıdıyla temas etmesini sağlayın. Suyu emdiğinde ve renk değiştirdiğinde kağıt havluyu çıkarın. Bu işlemi iki veya üç kez tekrarlayın.
3. Filtre kağıdının kenarlarını cımbızla alın, plakadan hızlıca soyun, sıvı nitrojene batırın ve dondurun. Sıvı nitrojen yoksa, filtre kağıdını koloni tarafı yukarı bakacak şekilde plastik bir tepsiye koyun ve tamamen donması için hemen bir dondurucuya (-20 °C ila -80 °C) koyun.
4. Donmuş filtre kağıdını çıkarın ve koloni tarafı yukarı bakacak şekilde çözülmesi için kuru bir kağıt havlu üzerine koyun. Çözüldükten hemen sonra, filtre kağıdını, koloni tarafı yukarı bakacak şekilde, plastik bir tepsi veya sızdırmaz bir kap üzerine yerleştirilmiş ve Z-tamponu ile ıslatılmış başka bir filtre kağıdına yerleştirin (60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl ve 1 mM MgSO₄, pH 7.0) X-gal (5-bromo-5-kloro-3-indolil-β-D-galaktozit) ve 2-merkaptoetanol⁹ içeren (bkz.). Üst ve alt filtre kağıtları arasında hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat edin.
5. Filtre kağıdını içeren plastik tepsiyi kapatın ve hava geçirmez bir kaba veya plastik torbaya koyun. Hava geçirmez kabı veya plastik torbayı kapatın ve mavi bir renk görünene kadar 37 °C'de inkübe edin.
6. Mavi bir renk göründüğünde, filtre kağıdını koloni tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir plastik tepsiye yerleştirilmiş yaklaşık 500 μL durdurma çözeltisinin (1 M Na₂CO₃) üzerine yerleştirin. Durdurma çözeltisi hızla emilir; Bu nedenle, filtreyi hemen çıkarın, koloni tarafı yukarı bakacak şekilde taze bir kağıt havlu üzerine koyun ve kurumasını bekleyin.
7. Kağıt havlu değiştirildikten ve filtre yeterince kuruduktan sonra, verileri yakalamak için bir tarayıcı veya başka bir cihaz kullanın.

4. Aday klonların kurtarılması ve onaylanması

1. ^Replikanın orijinal plakasından (veya renk tahlili için kullanılmayan replika plakadan) beyaz ve Kan R aday klonlarını seçin. Örnekler Şekil 1C'de gösterilmiştir. Kanamisin içeren SC-LW ortamı üzerinde küçük bir yama olarak yeniden çizerek ve 30 ° C'de 1-2 gün inkübe ederek aday klonların beyaz ve Kan^R olduğunu onaylayın. En az iki set yapın veya ertesi gün tekrarlar yapın.
   NOT: Beyaz koloniler seçilmelidir çünkü soluk mavi koloniler etkileşimi koruyabilir.
2. Aday klonlar iyi bir şekilde yeniden büyüdükten sonra, renk tahlilini adım 4.1'de oluşturulan en az bir plaka ile adım 3'te açıklandığı gibi tekrarlayın ve beyaz kaldıklarını ve maviye dönmediklerini onaylayın (Şekil 2A).
   NOT: Adayları yeniden çizerken, büyük miktarda hücre taşımayın. Çok fazla hücre, Kan^R ve Kan^S klonlarını ayırt etmeyi imkansız hale getirir.
3. Plaka kalıntılarından hala beyaz olan ve adım 4.2'de üretilen Kan^R klonlarını alın ve bunları 30 ° C'de gece boyunca 1 mL seçim ortamında (kütüphane yapımı için hangi vektörün kullanıldığına bağlı olarak SC-L veya SC-W) bağımsız olarak büyütün.
4. Kültürü bir mikrotüpe aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın (~ 15.000 × g, oda sıcaklığında 10-30 saniye). Tüm DNA'yı hücre peletinden aşağıdaki gibi izole edin.
5. Hücre peletini 400 μL lizis tamponunda (%2 Triton X-100, %1 SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8.0) ve 1 mM EDTA) her biri 1 μL 2-merkaptoetanol ve 20 mg / mL Zymolyase 100T içeren süspansiyon yapın ve hücre duvarlarını sindirmek için 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Bu sırada, her 5-10 dakikada bir tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın.
6. Hücre süspansiyonu opak veya yarı saydam hale geldiğinde, eşit hacimde fenol-kloroform-izoamil alkol (25:24:1) karışımı ekleyin ve 10-20 saniye orta hızda girdaplayarak iyice karıştırın.
7. Mikrotüpleri bir mikrosantrifüjde 5 dakika boyunca tam hızda (oda sıcaklığında ~ 15.000 × g) santrifüjleyin ve yeni bir mikrotüpte DNA içeren sulu fazı geri kazanın. 0.8 hacim izopropanol ekleyin ve tüpü ters çevirerek iyice karıştırın.
8. Tüpü oda sıcaklığında 2-3 dakika bırakın ve daha sonra DNA'yı çökeltmek için tam hızda (oda sıcaklığında ~ 15.000 × g) 4-5 dakika bir mikrosantrifüjde santrifüjleyin.
9. Süpernatanı çıkarın ve çökeltiyi yaklaşık 500 μL% 70 etanol ile yıkayın. Etanolü tamamen çıkarın ve çökeltiyi kısa bir süre kurutun.
10. Çökeltiye 20 μL TE tamponu (10 mM Tris-Cl (8.0) ve 1 mM EDTA) ekleyin, kısaca karıştırın ve çökeltiyi çözmek için tüpü gece boyunca oda sıcaklığında bırakın.
    NOT: Kullanıcıların acelesi varsa, tüpleri 37-50 °C'de tutun. DNA çökeltisi birkaç saat içinde çözülür.
11. Pelet tamamen çözüldüğünde, E. coli'yi bu DNA çözeltisinin küçük bir miktarı ile dönüştürün.
    NOT: Yüksek transformasyon verimliliğine sahip E. coli kullanılıyorsa yaklaşık 0.5 μL DNA çözeltisi yeterlidir.
12. E. coli kolonileri ortaya çıktığında, birkaç bağımsız koloni seçin, onları kültürleyin ve alkalen lizisi gibi standart yöntemlerle plazmitleri geri kazanın.
13. Adım 4.12'de elde edilen plazmit DNA'sını, yem plazmidini barındıran Y2H konak hücrelerine sokun. Transformatörler ortaya çıktığında, bunları renk tahlili (beyaz görünmelidirler) ve batı lekesi⁴ (istenen boyutta bir proteini ifade etmelidirler) ile kontrol edin.
    NOT: Alkali sonrası yöntem¹² , mayadan tam hücre özü hazırlamanın kolay ve hızlı bir yoludur.
14. Yukarıdaki iki kriter karşılanırsa, klonların mutasyon bölgesini nükleotid dizilimi⁴ ile belirleyin.

Son zamanlarda, Pol2 proteininin C-terminal yarısının (Pol2-C) Mcm10 ile etkileşime girdiği bulundu. Her iki protein de DNA replikasyonunun başlatılması ve dolayısıyla tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae 13,14,15'te hücre büyümesi için gereklidir. Bu etkileşimin biyolojik önemini anlamaya yardımcı olmak için, Mcm10 ile etkileşimi olmayan/azalmış olan Pol2-C mutantları, burada açıklanan yöntem kullanılarak izole edildi.

Adım 1'de açıklanan yöntem izlenerek bir mutasyon kütüphanesi oluşturuldu. Pol2-C DNA fragmanları GoTaq polimeraz ile amplifiye edildi ve In-Fusion enzimi kullanılarak Gal4AD (pST2525) vektörüne klonlandı. Kütüphanedeki bağımsız klon sayısının 5000 olduğu tahmin ediliyordu.

Adım 2'de açıklandığı gibi, kütüphane plazmidinin DNA'sı, LexA-Mcm10 plazmidi ile önceden dönüştürülmüş olan Y2H konak suşu TAT-7'ye sokuldu. Hücreler bir SC-LW plakasına yayıldı ve ertesi gün SC-LW ve SC-LW+G418 plakalarına kopyalandı. Kopyalar, adım 3'te tarif edildiği gibi renk analizine tabi tutuldu. Renk tahlilinin sonuçlarından bazıları Şekil 1C'de gösterilmiştir.

Renk tahlilinde beyaz ve G418'e dirençli kırk yedi koloni, yaklaşık 8500 dönüştürücüden ilk adaylar olarak izole edildi. Renk tahlili ile tekrar test edildiler ve 47 klondan 25'inin beyaz olduğu doğrulandı (Şekil 2A). Bu 25 klon aday olarak tutuldu. Aday plazmit DNA'ları, adım 4'te açıklandığı gibi 25 adayın her birinden elde edildi. LexA-Mcm10'u barındıran Y2H maya konak hücrelerine yeniden sokuldular ve renk tahlili ile test edildiler ve renkten yoksun 16 klon seçildi. Bunların Pol2-C yanlış anlamlı mutantları olduğunu daha da doğrulamak için, Pol2-C proteininin ekspresyonu western blotlama ile doğrulandı. On iki aday, pozitif kontrolünkiyle hemen hemen aynı pozisyonda bir bant sergiledi (Gal4AD-HA-Pol2-C-KanMX füzyon proteini, hesaplanan mw: 158.8 kDa) (Şekil 2B). Renk analizi, bu 12 klonun Mcm10 ile etkileşime girmediğini gösterdi (Şekil 2C). Bu klonların nükleotid dizileri belirlendikten sonra, hepsinin yanlış anlamlı mutasyon(lar)a sahip olduğu doğrulandı. Yanlış anlamlı mutasyonların sayısı bir ila beş arasında değişmektedir (veriler gösterilmemiştir). Ortalama olarak, her 1000 bazda yaklaşık bir yanlış anlamlı mutasyon meydana geldi.

Şekil 1: Etkileşim-boş/bozulmuş mutantları taramak için Y2H tabanlı yaklaşımın şemaları. (A) Y2H sistemi. (B) Etkileşimi boş/bozulmuş mutantları izole etme stratejisi. 1: Yeni oluşturulan Y2H vektörü, Y2H etiketinin, DB alanının ve AD'nin aşağı akışındaki KanMX geninin bir kopyasını içerir. Daha da önemlisi, bu KanMX geni bir başlangıç kodonundan yoksundur ve Y2H etiketi ile çerçeve dışıdır. Bu nedenle, KanMX geninin bu vektörden ifade edilmesi beklenmez. PCR ile çoğaltılmış DNA fragmanı vektöre eklendiğinde, KanMX geni Y2H etiketi ile çerçeve içindedir ve eksprese edilir. Sonuç olarak, yalnızca vahşi tip eki barındıran plazmitler veya yanlış anlamlı mutasyon(lar)a sahip bir ek parça, G418'e direnç sağlayan KanMX genini ifade edebilir. Saçma sapan veya çerçeve kayması mutasyon(lar)ına sahip plazmitler, KanMX genini ifade edemez. 2: Adım 1'de oluşturulan mutant kütüphane, Y2H konak maya hücrelerine tanıtılır. Dönüştürücüler ortaya çıktığında, kopyalar yapılır. Bir raportör gen(ler)in ekspresyonunu ve G418'e direnci karşılaştırarak, etkileşimi boş/bozulmuş mutantların adayları seçilebilir. (C) Bir tarama örneği. Gal4-AD ve bir PCR mutajenize Pol2-C DNA fragmanı barındıran plazmit kütüphanesi, LexA-Mcm10 plazmidi ile önceden transforme edilmiş olan Y2H konak suşu TAT-7'ye sokuldu. Renk tahlilinden önceki (solda) ve sonraki (ortada) hücrelerin ve bir SC-LW+G418 plakasında (sağda) büyütülen hücrelerin görüntüleri gösterilmektedir. Etkileşim-sıfır/bozulmuş mutantlar ve yanlış adayların aday örnekleri sırasıyla beyaz ve siyah ok uçlarıyla belirtilmiştir. (D) Y2H vektörleri, AD (üstte) ve DB (altta) vektörlerinin klonlama bölgesi etrafındaki DNA dizisi. Y2H etiketinin (kırmızı) son on amino asidinden (aa) KanMX'in (yeşil) ilk on aa'sına karşılık gelen kısma kadar olan dizi gösterilir. SmaI ve BamHI'nin tanınma siteleri de gösterilir. PCR primerlerinin konumları, klonlama bölgesi olarak BamHI bölgesi kullanıldığında altta gösterilir. Aynı primerler, ilgilenilen geni diğer plazmitlere klonlamak için de geçerlidir (pST2303/2523). Bu rakam Tanaka ve ark.4'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Etkileşim-boş/bozulmuş mutantların tarama sürecine bir örnek. (A) Şekil 1C'de gösterildiği gibi aday klonlar olarak izole edilen 47 koloni, tekrar G418 içeren SC-LW ortamında büyütüldü ve renk tayinine tabi tutuldu. +: pozitif kontrol (Wt Pol2-C), -: negatif kontrol (vektör). 1-25 numaralı aday klonlar, plazmitleri geri kazanmak için kültürlendi. (B) (A)'daki her aday klondan plazmitler geri kazanıldı, Y2H konak hücrelerine sokuldu ve tekrar renk tayinine tabi tutuldu. On altısı beyazdı (renksiz). Onlardan tam hücre ekstraktları hazırlandı ve bir anti-HA monoklonal antikoru ile western blotlama yapıldı. Paneldeki numara (A)'daki numaraya karşılık gelir. #6 hariç her adaydan elde edilen birkaç bağımsız plazmit klonunun analizleri yapıldı. (C) Son 12 klon için renk analizinin sonuçları. Sayılar (A) 'dakilere karşılık gelir. Mcm10 ile etkileşimi koruyan # 16, renk tahlilinde pozitif kontrol olarak kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Y2H etiketi ile çerçeve dışı KanMX içeren Y2H vektörlerinin listesi.

Ek Dosya 1: PCR karışımlarına, primer detaylarına ve reaksiyon koşullarına bir örnek. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.