Yöntem makalesi

Granüloza hücrelerinden yoksun zebra balıklarında evre I oositlerin hızlı izolasyonu

DOI:

10.3791/66458

⸱

26 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery and Laboratory of Pediatric Surgery, West China Hospital / West China School of Medicine, Sichuan University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, granüloza hücrelerinden yoksun zebra balıklarında temiz evre I oositlerin hızlı bir şekilde izole edilmesi için modifiye edilmiş bir prosedürü tanımlar ve böylece oosite özgü araştırmalar için uygun bir yöntem sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oosit gelişiminin incelenmesi, gelişimsel biyolojide önemli etkilere sahiptir. Zebra balığı (Danio rerio), oositten embriyoya kadar erken gelişimsel süreçleri araştırmak için model bir organizma olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Zebra balıklarında, oositler tek bir somatik granüloza hücresi tabakası ile çevrilidir. Bununla birlikte, granüloza hücrelerini oositlerden ayırmak bir zorluk teşkil eder, çünkü saf oositler elde etmek hassas analiz için çok önemlidir. Farklı gelişim aşamalarında zebra balığı oositlerini izole etmek için çeşitli yöntemler önerilmiş olsa da, mevcut teknikler granüloza hücrelerinin tamamen çıkarılmasında yetersiz kalmakta ve yalnızca oositlere odaklanan genom analizinin doğruluğunu sınırlamaktadır. Bu çalışmada, granüloza hücre kontaminasyonunu ortadan kaldırırken zebra balıklarında saf evre I oositleri izole etmek için hızlı ve verimli bir süreç geliştirdik. Bu teknik, özellikle oositlere özgü epigenetik ve genom yapısı yönlerinin araştırılmasında biyokimyasal ve moleküler analizleri kolaylaştırır. Özellikle, yöntem kullanıcı dostudur, oosit hasarını en aza indirir ve sonraki araştırma ve analizler için pratik bir çözüm sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı, gelişim biyolojisindeki en önemli model sistemler arasında yer alır. Son yıllarda, çok sayıda çalışma, zebra balığını, oositten embriyoya kadar önemli biyolojik olayları ve düzenleyici süreçleri incelemek için bir model olarak kullanmıştır. Bunlar, oosit gelişimi ve olgunlaşması1, maternal genlerinişlevselliği 2, maternal-zigotik geçişlerindüzenlenmesi 3 ve kapsamlı omik analizler4'ün karmaşık süreçlerini kapsar.

Yumurtalık folikülü5,6 içinde gelişmekte olan oositi saran ve besleyen somatik hücreler olan granüloza hücreleri, bu gelişim sürecinde çok önemli bir rol oynar. İlkel germ hücreleri (PGC'ler) oogonyaya dönüştükçe, tek katmanlı bir granüloza hücresi ile çevrili hale gelirler7. Dış tekal hücrelerle birlikte, oosit ve çevresindeki granüloza hücreleri olgun bir folikül oluşturur8. Germ hücreleri ve somatik hücreler arasındaki temel ayrım göz önüne alındığında, özellikle genomla ilgili analizler için saf bir oosit örneği almak zorunludur.

Zebra balığının foliküler yapısı içinde, granüloza hücreleri tipik olarak sadece birkaç mikronluk bir çap sergiler8, bu da granüloza hücreleri ve oositler9 arasındaki yakın bağlantıyı vurgular. Bu yakın ilişki, granüloza hücrelerinin hem sayısı hem de hacmi ile oositler arasındaki önemli fark (tek bir oosite kıyasla yüzlerce granüloza hücresi) nedeniyle tam ayırmanın elde edilmesinde bir zorluk teşkil etmektedir10,11. Tek bir granüloza hücresi ile minimum kontaminasyon bile, özellikle oositleri hedef alan aşağı akış analizlerini engelleyebilir. Bu nedenle, genomik ve epigenetik özelliklere odaklanan çalışmalar için granüloza hücrelerinin eliminasyonu esastır.

İyi karakterize edilmiş morfolojik kriterlerden yararlanarak, her aşamadaki oositler çap11'e göre ayırt edilebilir. Zebra balığında oogenez süreci, morfoloji ve karyotip11'e göre beş aşamaya ayrılır. Evre I oositler (7-140 μm çapında), mayoz bölünmenin başlangıcından mayoz I'in erken aşamasına kadar oositleri kapsar. Evre II oositler (140-340 μm çapında) yavaş yavaş köpüklü ve yarı saydam hale gelir. Foliküllerin büyümesi ve kortikal alveollerin çoğalması ile merkezdeki germinal veziküllerin ayırt edilmesi zorlaşır12 (Şekil 1Aii). Evre III oositler (340-690 μm çapında) giderek vitellogenin biriktirir ve taze foliküller giderek opak hale gelir (Şekil 1Aiii). Mayoz, evre IV oositlerde (690-730 μm çapında) devam ederken, kromozomlar mayoz II'nin ortasına girer ve burada durgunlaşırlar (Şekil 1Aiv). Evre V oositler (730-750 μm çapında) olgunlaşmıştır ve yumurtlama için hazırdır 7,11 (Şekil 1Av).

Yukarıda belirtilen aşamaların her birinin benzersiz özelliklerine dayanarak, zebra balığı yumurtalıklarını kollajenaz I, kollajenaz II ve hyaluronidaz içeren bir sindirim çözeltisi kullanılarak sindirerek ve ardından belirli boyutlu bir hücre süzgecindensüzülerek oositleri aşama I'den III'e kadar izole etmek için bir yöntem önerilmiştir 13. Bununla birlikte, bu yöntem farklı gelişim aşamalarında oosit elde edilmesine izin verirken, oositleri ve granüloza hücrelerini tamamen ayırmada başarısız olur. Diğer araştırmacılar da granüloza hücrelerini oositlerden ayırmak için yöntemler önermişlerdir. Bununla birlikte, bu yöntemler öncelikle oosit hasarına neden olabilecek, zaman alıcı ve analiz için önemli sayıda oosit elde etmek için yetersiz olan mekanik yaklaşımlara dayanmaktadır14,15.

Mevcut yöntemlerin sınırlamaları ve özel araştırma gereksinimleri göz önüne alındığında, bu çalışma, oositleri ve granüloza hücrelerini tamamen ayırmak ve analiz için yeterli sayıda temiz evre I oosit elde etmek için bir prosedür oluşturmayı amaçlamaktadır. Atıfta bulunulan yöntem13'ü genişleterek, daha nazik olan ve oositlerin dağılmasını ve granüloza hücrelerinin ayrışmasını kolaylaştıran gelişmiş bir sindirim tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanıyoruz. Daha sonra, oositler bir hücre süzgecinden geçirilir, ardından yıkama ve daha fazla mikroskobik seçim yapılır, bu da çok sayıda temiz evre I oositin elde edilmesini sağlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm zebra balıkları, ilgili ulusal ve/veya yerel hayvan refahı kuruluşları tarafından belirtilen katı hayvan bakımı yönergelerine göre ele alındı. Balıkların bakımı ve işlenmesi hem yerel makamlardan hem de Sichuan Üniversitesi Batı Çin Hastanesi'nin hayvan etik komitesinden onay aldı (onay No. 20220422003). Zebra balığı yumurtalıkları, her gelişim aşaması yetişkin zebra balığı yumurtalıklarında bulunan çok aşamalı oositlerin bir karışımını içerir. Bununla birlikte, yetişkin balıkların yumurtalıklarında büyük ve opak olan geç evre oositlerin (evre II-III) baskınlığı nedeniyle bu çalışma için yavru zebra balığı seçilmiştir. Buna karşılık, yavrular esas olarak evre I oositlerden oluşan düz ve uzun yumurtalıklara sahiptir (Şekil 1B) (Şekil 1B). Önceki araştırmalar, yetişkin ve genç zebra balıklarında erken oogenezin morfolojik özelliklerinin oldukça tutarlı olduğunu ve yavru zebra balığının kullanılmasının fizibilitesini desteklediğini göstermiştir13. Aşağıda açıklanan ve Şekil 2'de özetlenen prosedürler, diseksiyondan temiz evre I oositlerin elde edilmesine kadar izolasyon sürecinin ayrıntılı bir tanımını sağlar. Daha fazla referans için, çalışmada kullanılan reaktifler, tamponlar ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Yumurtalık diseksiyonu

  1. Standart uzunluğu (SL) 10 mm ila 15 mm arasında değişen birkaç dişi zebra balığı seçin.
    NOT: Burundan kuyruk tabanına kadar milimetre cinsinden ölçülen SL, uygun balığın seçilmesi için güvenilir bir kriter görevi görür. Bu işlem için 10 mm ila 15 mm arasında değişen bir SL ile döllenmeden 5 ila 7 hafta sonra (wpf) yavru balıkların kullanılması önerilir. Yavru zebra balıklarının yumurtalıkları ağırlıklı olarak erken oositler tarafından işgal edilir ve evre I oositleri kolayca elde etmek için en uygun koşulları sağlar (Şekil 1B).
  2. Yavru dişi balıkları buz gibi soğuk suya (0-4 °C) koyarak ötenazi yapın.
    NOT: Ötenaziyi sağlamak ve zebra balığının ötenazi sırasında yaşadığı acıyı en aza indirmek için aşağıdaki prosedürler uygulanmalıdır: buz gibi soğuk suyun sıcaklığının bir termometre kullanarak 0-4 °C aralığında olduğunu doğrulayın, zebra balığını hızlı bir şekilde buz gibi suya aktarın ve operküler hareketin kesilmesinden sonra en az 10 dakika buz gibi suda tutun16, 17,18.
  3. Emici kağıt kullanarak balığın yüzeyindeki fazla suyu kurutun.
  4. Aşağıdaki adımları izleyerek zebra balığını stereomikroskop altında inceleyin:
    1. Solungaç kapağının arka kenarı boyunca mikro makas kullanarak kafayı kesin; Kloaka boyunca kuyruğu kesin. Orta gövdeyi 2 mL L-15 ortamı (L-glutamin ile) içeren 35 mm'lik bir tabağa aktarın.
    2. Orta gövdeyi L-15 ortamında inceleyin. Karnın merkezi ekseni boyunca kesin ve iç organları çıkarın ve mesaneyi yüzün.
      NOT: Zebra balığının iç organları birbirine bağlıdır. Bu nedenle, arka bağırsağı anal bölgenin yakınına sıkıştırın ve tüm viseral kütleyi kolayca çıkarmak için kaldırın.
    3. Cımbız kullanarak iki taraflı yumurtalıkları karından çıkarın. Yumurtalığa bağlı yağ dokusunu, pulları ve diğer vücut dokularını çıkarın.
      NOT: Yumurtalıklar yağ dokusu ile kaplıdır. Bu nedenle, oositlerin mekanik olarak zarar görmesini önlemek için bunları birlikte çıkarmak en iyisidir.
      DİKKAT: Yaralanmaları önlemek için cımbızları dikkatli kullanın.

2. Sindirim

  1. Yumurtalıkları 2 mL Kinger hücre ayrışma çözeltisi içeren 6 oyuklu bir plakaya aktarın ve 28.5 ° C'de 2-3 saat inkübe edin. Dağılmayı teşvik etmek için 6 oyuklu plakayı her 30 dakikada bir çalkalayın.
    NOT: Sindirim etkinliğini artırmak için yumurtalıkları küçük doku bloklarına ayırmak için cımbız kullanın. Sindirim süresi değişkendir; stereomikroskop altında önemli sayıda evre I oosit dağıldığında işlemi düzenli olarak izleyin ve sonlandırın. Kinger'in hücre ayrışma çözeltisi çalışan çözeltidir ve doğrudan kullanılabilir. Ambalajlandıktan sonra -20 °C'de stabil bir şekilde saklanabilir ve kullanımdan önce düşük sıcaklıkta (4 °C) çözülebilir.
  2. Sindirimi durdurmak için 28.5 ° C'de önceden ısıtılmış L-15 ortamını sindirim tamponuna ekleyin.

3. Filtreleme

  1. 6 oyuklu plakanın başka bir kuyucuğuna 100 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin, L-15 ortamı ekleyin ve orta seviyenin filtreden daha yüksek olduğundan emin olun.
    NOT: Evre I oositlerin teorik çapı 140 μm'den azdır. Bununla birlikte, daha büyük çaplı oositler yine de hücre süzgecinden geçebilir. Bu nedenle, bu adımda hedeften daha küçük çaplı bir hücre süzgeci seçildi. Ağ boyutları, özel deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak ayarlanabilir.
  2. Sindirim ortamını bir pipet kullanarak hücre süzgecinden çekin. Tüm evre I oositleri süzgecten geçene kadar 1-2 dakika bekleyin, ardından çıkarın. Transfer işlemi boyunca oositlerin sıvı içinde kaldığından emin olun.
    NOT: Oositleri ortamda tutmak, bütünlüklerinin ve optimal durumlarının korunmasına yardımcı olur. Oositler uzun süre havaya maruz kalırsa kuruyabilir ve hasar görebilir, bu da nihai ayırma verimliliğini etkileyebilir. Oositleri askıda eklemek yerine hücre süzgecinden aktarırken pipeti sıvı yüzeyinin altında tutun.

4. Yıkama

  1. Bir pipet kullanarak fazla ortamı çıkarın. 4 mL taze L-15 besiyeri ekleyin ve oositleri nazikçe yeniden süspanse edin. 1-2 dakika bekleyin, ardından süpernatanı çıkarın.
    NOT: Oositlerin zarar görmesini önlemek için düşük yapışma özelliğine sahip aletler kullanın.
  2. Başka kirlilik kalmayana kadar adım 4.1'i 5-6 kez tekrarlayın.
    NOT: Yıkama işlemi sırasında nazik kullanım, oosit hasarını önlemek için çok önemlidir. Önceki yıkama adımlarını takiben bol miktarda evre I oosit (bir zebra balığından yaklaşık 200-400 evre I oosit) elde edilmesine rağmen, oositler hala hücre fragmanları, diğer aşamalardan oositler veya kırık geç evre oositlerin oluşturduğu küçük granüller ile karıştırılabilir. Ek olarak, bazı granüloza hücreleri, eksik enzim sindirimi nedeniyle birkaç oositin yüzeyine hala yapışabilir. Bu nedenle, genom dizilimi gibi daha yüksek bir saflık seviyesi gerektiren uygulamalar için, tamamen temiz oositleri seçmek için ek adımlar gereklidir. Bu sorunu çözmek için 5. ve 6. adımlara geçin.

5. Kalite kontrol için seçim

  1. Yıkanmış aşama I oositlerini taze L-15 ortamı içeren 35 mm'lik bir tabağa aktarın.
  2. 10x'e eşit veya daha fazla büyütme oranına sahip bir mikroskop altında, künt enjeksiyon iğnesi gibi hassas bir şekilde manipüle edilebilen bir alet kullanarak granüloza hücreleri tarafından yapıştırılan hücre parçalarını, diğer aşama oositleri ve evre I oositleri çıkarın.
    NOT: Bu adım, deneyi yapan kişiden sabır gerektirir, ancak temiz ve sağlam oositlerin izolasyonunu sağlar.
    DİKKAT: Yaralanmaları önlemek için enjeksiyon iğnelerini dikkatli kullanın.

6. Nükleer boyama ile onay

NOT: İzole edilen oositlerin daha da rafine edilmesi için, önceki adımda gözden kaçmış olabilecek granüloza hücrelerine yapışmış tek tek oositleri tanımlamak ve çıkarmak için Hoechst 33342 ile boyama yapıldı.

  1. L-15 ortamına 5 μg/mL Hoechst 33342'lik bir son konsantrasyon ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  2. UV lazer uyarımı altında bir floresan mikroskobu ile Hoechst floresansını gözlemleyin.
    NOT: Hoechst tipik olarak ultraviyole bölgesinde, genellikle 310 ila 360 nm arasındaki dalga boylarında uyarılır. Bu işlem sırasında 80x ile 100x arasında bir büyütme kullanılması önerilir. Otomatik pozlama modunu kullanın. Uyarma dalga boyu ve maruz kalma süresi, özel mikroskop modeline ve bireysel gereksinimlere göre ayarlanabilir.
  3. Bir iğne kullanarak, istenen kriterleri karşılamayan oositleri dikkatlice seçin.
    NOT: Hücreleri görselleştirirken, oositin merkezinde büyük bir nükleer kromatin bulunur. Granüloza hücreleri oosite yapışırsa, oositin kenarına yapışan küçük ve parlak çekirdekler görünür hale gelirdi (Şekil 3). Onları mikroskop altında seçin.
  4. Fazla Hoechst'i çıkarmak için oositleri L-15 ile iyice ve tekrar tekrar yıkayın.
  5. Tanımlanan aşama I oositlerini daha sonraki ekstraksiyon için doğrudan kullanın veya sıvı nitrojen içinde hızlı dondurmadan sonra -80 ° C'de saklayın.
    DİKKAT: Sıvı nitrojen ve ultra düşük sıcaklıklı dondurucuları tutarken koruyucu bir yüz maskesi ve kriyojenik eldiven kullanın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1 , hem yetişkin hem de genç zebra balıklarında gözlemlenen yumurtalık morfolojisini göstermekte ve referans olarak hizmet etmek için farklı gelişim aşamalarındaki oositleri göstermektedir. Şekil 1A , birincil büyüme aşamasından (evre I) başlayarak ve yumurtlanmış yumurta (evre V) ile sona eren her gelişim aşamasında oosit morfolojisinin ve boyutunun grafiksel bir temsilini sağlar. Şekil 1Ai-v , oositlerin I'den V'ye kadar olan aşamalarına karşılık gelen çapları göstermektedir. Şekil 1B (sol panel) yavru balıklarda yumurtalık görüntülerini göstermektedir (SL = 1,5 cm ile 6 wpf). Özellikle, juvenil yumurtalık, daha küçük bir evre II oosit popülasyonunun eşlik ettiği, esas olarak bol miktarda şeffaf evre I oosit ile karakterize edilen belirgin bir lobüler görünüm sergiler. Evre I oositlerin bu prevalansı, gözlemlerini ve geri kazanımlarını büyük ölçüde kolaylaştırır. Sağ panel, çeşitli gelişim aşamalarındaki oositlerin gözlenebildiği yetişkin balık yumurtalığının (6 ay) morfolojisini göstermektedir. Bununla birlikte, opak geç evre oositler (evre II-III) yumurtalıkta baskındır.

Şekil 2 , diseksiyondan temiz evre I oositlerin elde edilmesine kadar olan temsili süreçleri göstermektedir. Şekil 3 , hem referans yöntemi hem de modifiye yöntem kullanılarak elde edilen evre I oositleri göstermektedir. Hoechst boyamasını takiben, oosit ve granüloza hücre çekirdekleri UV ışığı altında mavi floresan sergiledi. Referans yöntemi kullanılarak elde edilen görüntülerde (Şekil 3A), oositlerin yüzeyi çok sayıda lekeli granüloza hücre çekirdeği ile yoğun bir şekilde çevrelenmiştir. Buna karşılık, modifiye yöntemle ayrılan evre I oositler (Şekil 3B), granüloza hücre çekirdeği boyaması olmaksızın tam maruziyet ve temizlik sergiler.

Bulgularımız, evre I oositleri izole etmek için önerilen yöntemin etkinliğini göstermiştir. Teleost balıklarında oositlerin gelişim süreci birkaç ortak özellik sergiler7. Türler arası uygulanabilirliğini değerlendirmek için, diğer balık türleri üzerinde daha fazla analiz yapılmıştır. Dişi havuz çoprabalığı yerel bir pazardan satın alındı ve aynı prosedür izlenerek erken evre oositler (çap <100 μm) izole edildi. Havuz çoprabalığının yumurtalık bileşimi ayrıca, aynı aşamada oosit morfolojisi ve boyutunda zebra balığınınkine çarpıcı bir benzerlik ile karakterize edilen, çoklu gelişim aşamalarında bir oosit karışımı sergiledi. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, erişkin dişi pond loach'un yumurtalıklarına, şeffaf erken oositlerle serpiştirilmiş opak geç oositler hakimdir. Oositlerin yüzeyinde berrak bir tek tabaka granüloza hücresi gözlendi. Zebra balıklarındaki gözlemlerimizle tutarlı olarak, çapı 100 μm'den küçük olan çoprabalığı oositleri, diploten aşamasından önceki aşamaya karşılık geldi. Şekil 4B , modifiye yöntemle elde edilen temiz havuz çoprabalığı (Misgurnus anguillicaudatus) oositlerini göstermektedir. Zebra balığı yumurtalıkları ile karşılaştırıldığında, havuz çoprabalığı yumurtalıklarının ayrışması daha zordur. 6-7 saatlik sindirimden sonra, daha erken evre oositler ayrışır. Bununla birlikte, bu düzeltilmiş yaklaşım, istenen temiz ve çıplak oositleri verdi. Zebra balığı Cyprinidae familyasına aittir, oysa havuz çoprabalığı Cobitidae familyası içinde sınıflandırılır. Bu iki aile uzak bir taksonomik ilişki sergiler, ancak yumurtalık gelişim aşamaları ve morfolojileri oldukça benzerdir, bu da bu yöntemin genellikle çeşitli balık türlerinin oositlerini analiz etmek için kullanılabileceğini gösterir.

figure-results-1
Şekil 1: Zebra balığı yumurtalıklarının ve oositlerinin farklı aşamalardaki temsili görüntüleri. (A) Her gelişim aşamasında oositlerin morfolojisi ve büyüklüğü (St). i-v, evre I'den V'ye kadar olan oositlerin görüntülerini ve çapını temsil eder. Ölçek çubuğu = 200 μm. (B) Yetişkin ve genç zebra balıklarının yumurtalık morfolojisi. Ölçek çubukları = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Diseksiyondan temiz evre I oositlerin elde edilmesine kadar izolasyon prosedürünün temsili görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: İki yöntemle elde edilen evre I oositler. (A) Referans alınan yöntemle izole edilen evre (St) I oositler. (B) Modifiye yöntemle izole edilen Evre I oositler. Oosit ve granüloza hücre çekirdekleri Hoechst ile boyandı ve UV ışığı ile uyarıldı. Ölçek çubukları = 100 μm. BF = parlak alan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Modifiye yöntemle elde edilen havuz çoprabalığından elde edilen erken evre oositler. (A) Havuz çoprabalığının yumurtalık ve oositlerinin temsili görüntüleri. I, II, farklı büyütmeler altında havuz çoprabalığının yumurtalıklarını temsil eder ve III-IV, havuz çoprabalığının erken evre oositlerini temsil eder. Ölçek çubukları: i (500 μm); ii (200 μm); III, IV (100 μm). (B) Havuz çoprabalığından izole edilen erken evre oositler. Oositler ve granüloza hücre çekirdekleri Hoechst ile boyandı ve UV ışığı ile uyarıldı. Ölçek çubukları = 100 μm. BF = parlak alan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, granüloza hücreleri hariç saf ve temiz evre I oositlerin aşağı akış analizi (özellikle genomik analizler) için izole edilmesi için bir yöntem geliştirdik. Bu modifiye edilmiş yöntem ile referans alınan yöntem13 karşılaştırıldığında, bu yöntem kullanılarak elde edilen evre I oositler morfolojik olarak sağlamdır, sayıca yeterlidir ve diğer somatik hücrelerle kontaminasyondan arındırılmıştır, bu da onları sonraki çeşitli çalışmalar ve analizler için uygun hale getirir. Ayrıca, diğer mekanik ayırma yöntemleriyle14,15 karşılaştırıldığında, geliştirilmiş yöntemin kullanımı daha basittir, daha fazla sayıda oosit elde edilmesini kolaylaştırır ve oosit hasarını önler.

Ayrıca, evre I zebra balığı oositlerini etkili bir şekilde izole etmenin yanı sıra, bu yöntem aynı zamanda havuz çoprabalığına da uygulanabilir ve bu da çeşitli balık türleri arasında geniş uygulanabilirliğini gösterir. Granüloza hücre kontaminasyonunun gen ekspresyonu ve epigenetik analiz üzerindeki etkisini araştırmak için, referans ve modifiye yöntemler kullanılarak elde edilen oositler üzerinde RNA dizileme (RNA-seq) ve CUT&Tag analizi gerçekleştirdik. Diferansiyel olarak eksprese edilen birkaç gen RNA-seq ile tanımlanmış olsa da, granüloza hücrelerinde spesifik olarak eksprese edilen bazı genler hala tanımlanmıştır (veriler gösterilmemiştir). Analiz ayrıca, farklı yöntemlerle izole edilen oositler arasındaki histon modifikasyonlarında önemli farklılıklar olduğunu ortaya çıkardı (veriler gösterilmemiştir). Bu sonuçlar, doğru gen ekspresyonu ve epigenetik analiz için oositlerin ve granüloza hücrelerinin tamamen ayrılmasında bu yöntemin önemini vurgulamaktadır.

Önerilen yöntemi uygularken dikkat edilmesi gereken birkaç husus vardır: (1) Uygun boyutta zebra balığı seçmek çok önemlidir. Bu, yeterli oosit elde edilmesini sağlar ve sonraki yıkama adımlarını azaltır. SL <10 mm olan zebra balıklarının yumurtalıkları yeterli oosit sağlamaz, bu nedenle örnekleme gereksinimlerini karşılamak için daha fazla sayıda balık gerektirir ve üreme baskısını arttırır. Tersine, SL'si 15 mm'den büyük olan zebra balığı, sindirim reaksiyonu sırasında zarları kolayca kırılan evre II-III oositlerin kademeli oluşumunu sergiler. (2) Daha büyük balıklar kullanıldığında, hasarlı oositlerden kaynaklanan hücre içeriğinin sızması kontaminasyona yol açabilir ve böylece sindirim reaksiyonunu bir dereceye kadar engelleyebilir. Bu gibi durumlarda, eski sindirim tamponunun çıkarılması, L-15 ile yıkanması ve daha sonra daha fazla sindirim için yeni bir Kinger hücre ayrışma çözeltisi eklenmesi önerilir. (3) Uygun ekipman mevcutsa, sindirim sırasında çalkalamak ayrılmayı artırabilir.

Adım 3.1'de, daha küçük granüloza hücreleri, hücre süzgeci boyunca oositlere eşlik edebilir. Bununla birlikte, pratik gözlemler, nihai toplanan oosit örneğinin granüloza hücreleri içermediğini göstermektedir. Eksik sindirimin bazı oositlerde rezidüel granüloza hücrelerinin varlığına neden olduğu durumlar dışında, sistemde Hoechst işaretli başka granüloza hücresi tespit edilmedi. Burada, daha küçük ve daha hafif olan granüloza hücrelerinin kültür ortamında asılı kalabileceğini ve daha sonra çoklu yıkama adımları sırasında çıkarılabileceğini varsaydık. İzolasyon verimliliği, Hoechst boyamasından sonra granüloza hücre eki olan oositlerin ve temiz oositlerin oranı hesaplanarak da ölçüldü. 1000 oosit içeren örneklerde %98'e varan temiz oosit oranları gözlenmiştir.

Birçok avantajına rağmen, önerilen yaklaşımın bazı dikkate değer sınırlamaları da vardı. İlk olarak, bu yöntem DNA veya RNA ekstraksiyonu, dizileme ve bozulmamış canlı hücrelerin anında tespiti için doğrulanmıştır, ancak diğer tahlil alanlarına genişletmenin fizibilitesi ve güvenilirliği henüz doğrulanmamıştır. Diğer bir sınırlama, önerilen yöntemin sadece evre I oositlerin izole edilmesi için uygulanabilmesidir, çünkü diğer aşamalar için izolasyon verimliliği tatmin edici değildir. Bu nedenle, önerilen yöntemin verimliliğini ve uygulanabilirliğini geliştirmek için ek çabalar gerekmektedir. Ek olarak, gelecekteki çalışmalar, önerilen yöntemin oositleri diğer aşamalardan verimli bir şekilde izole etmek için uygulanıp uygulanamayacağını araştırmaya odaklanmalı ve böylece uygulanabilirliğini genişletmelidir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32170813 ve 31871449) ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Departmanı (2024NSFSC0651) ve mükemmellik disiplinleri için 1·3·5 projesi–Klinik Araştırma Fonu, Batı Çin Hastanesi, Sichuan Üniversitesi (2024HXFH035) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu çalışmayla ilgili zebra balığı yetiştiriciliği için Pediatrik Cerrahi Laboratuvarı'ndan Zhao Wang ve Yanqiu Gao'ya teşekkür eder. Yazarlar ayrıca, incelemeye katılan tüm hakemlere ve bu makalenin hazırlanması sırasında İngilizce redaksiyon hizmetleri sağlayan MJEditor'a (www.mjeditor.com) teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kinger'in hücre ayrışma çözeltisiPlantChemMedPC-33689Kinger'in hücre ayrışma çözeltisi -20 ° C'de stabil bir şekilde saklanabilir; Ambalajlandıktan sonra C ve düşük sıcaklıkta çözüldükten sonra kullanılabilir (4 ° C; C). Zebra balığı yumurtalıklarını ayırmak için doğrudan kullanılabilir. En uygun sıcaklık 28.5 °C'dir; C, yaklaşık 2-3 saat. Süre, kısaltılmış veya uzatılmış (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689) spesifik ayrışma koşullarına göre ayarlanabilir.
Hücre süzgeçleri (100 μ m)Falcon352360
Floresan mikroskobuZeissAxio Zoom.V16
ForsepsDumont#5
Cam kılcal iğne//Çakmakla yakılarak köreltilir
HoechstYesen40732ES03
Düşük adsorpsiyonlu pipet uçları (10 μ l)LabsellectT-0010-LR-R-S
Leibovitz' s L-15 orta orta (L-glutamin ile)HycloneSH30525.01
Buz kovası//Zebra balığı kuluçka makinesi ötenazi yapmak için buz gibi soğuk su kullanılır
WIGGENSWH-01
Yavru balıklar//5– Döllenmeden 6 hafta sonra, standart uzunluk [SL] 10– 15 mm
Plastik tabak (35 mm)SORFA230101
StereomikroskopMoticSMZ-161
Doku Kültürü Plakası (6 kuyulu)SORFA0110006
Vannas yaylı makasGüzel Bilimler Toosl#15000-00

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304(2021).
  2. Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385(2020).
  3. Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).
  4. Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014(2022).
  5. Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
  6. Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
  7. Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
  8. Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).
  9. Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
  10. Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
  11. Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
  12. Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
  13. Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
  14. Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
  15. Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
  16. Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma. , Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  17. Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw. , Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015).
  18. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zebra Bal Oosit zolasyonuGran loza H cresi Uzakla t rmaOosit Safla t rmaH cre DisosiasyonuL 15 BesiyeriFloresan MikroskopiGenom AnaliziEpigenetik Ara t rmaOosit Geli imi

İlgili makaleler