Yöntem makalesi

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66461

⸱

9 Şubat 2024

 ,  ,  ,  , 
1ITMO University, 2University of Central Florida

Bu makalede

Özet

DNAzyme tabanlı nanomakineler, nükleik asitlerin son derece seçici ve hassas tespiti için kullanılabilir. Bu makale, özgür yazılım kullanılarak 10-23 çekirdekli DNAzyme tabanlı nanomakinelerin tasarımı için ayrıntılı bir protokolü ve örnek olarak bir Epstein-Barr virüs parçasının tespitinde uygulanmasını açıklamaktadır.

Özet

DNA ve RNA dizilerinin (analitler) tespiti için DNAzyme tabanlı nanomakineler (DNM), oligonükleotidlerden yapılmış çok işlevli yapılardır. İşlevleri arasında sıkı analit bağlanması, yüksek derecede seçici analit tanıma, florojenik bir raportör substratın çoklu katalitik bölünmeleri ile floresan sinyal amplifikasyonu ve sensör tepkisinde bir artış için florojenik substrat çekimi yer alır. Fonksiyonel birimler, işbirlikçi eylemleri için ortak bir DNA iskelesine bağlanır. RNA parçalayan 10-23 DNM'ler, katalitik olmayan hibridizasyon problarına kıyasla geliştirilmiş hassasiyete sahiptir. DNM'nin stabilitesi ve substrat tanıma şansının artması, çift sarmallı bir DNA fragmanı, bir karo tarafından sağlanır. DNM, katlanmış bir RNA'da tek bir nükleotid farkı ve çift sarmallı bir DNA'da iki analiti ayırt edebilir ve diğer protein içermeyen hibridizasyon problarından ~ 1000 kat daha düşük konsantrasyonlarda analitleri tespit edebilir. Bu makale, DNA-nanomakine aktivitesinin tanısal potansiyelinin arkasındaki konsepti sunar ve nükleik asit tespit deneylerinde DNM tasarımını, montajını ve uygulamasını gözden geçirir.

Giriş

Nükleik asit tespiti için en eski yöntemlerden biri, seçici oligonükleotidlerin analiz edilen RNA veya DNA dizilerine tamamlayıcı bağlanmasıdır. Bu yöntem, hedeflenen bir DNA veya RNA analiti1 ile Watson-Crick baz çiftleri oluşturabilen nükleik asit fragmanları (problar) kullanır. Kompleks daha sonra çeşitli tekniklerle analit ve bağlanmamış probdan ayırt edilir. Northern blotlama, in situ hibridizasyon veya qPCR gibi bazı yöntemler, tamamlayıcı bağlanma2 olgusuna dayanmaktadır. En yaygın hibridizasyon problarının iki önemli dezavantajı vardır: düşük hassasiyet (mikromolar ila nanomolar seviyelere ulaşabilirler) ve ayrıca nokta mutasyonları dahil olmak üzere tek nükleotid varyasyonlarına (SNV) karşı düşük seçicilik. Bu sakıncalara yönelik çözümler birbiriyle çeliştiği için konu sofistike bir yaklaşım gerektirmektedir3. En iyi seçiciliği sağlamak için, tespit edilen oligonükleotid, uyumsuz analitlerle kararsız hibritler oluşturacak kadar kısa tutulmalıdır. Bu tür kısa oligonükleotidler, hedeflenen nükleik asitleri sıkıca bağlayamaz ve ikincil yapılarını çözemez, bu nedenle genellikle saptanabilir bir sinyal sağlayamaz. Biyolojik RNA'da veya çift sarmallı DNA'da (dsDNA) CG açısından zengin fragmanları tespit etmek özellikle zordur. Öte yandan, uzun problar SNV3'e duyarsızdır. Çıkmazı kırmak için ikili prob kavramı geliştirilmiştir4.

İkili sensörler, tek bir algılama probunu iki parçaya böler ve parçalarını özelleştirir, bunlardan birini saç tokalarını çözmek veya dsDNA'yı istila etmek için uzun tutar. İkinci ikili prob parçası, eşleşmeyen bir baza duyarlı olmak için kısa kalır, böylece SNV'yi tespit etmek için bir araç sağlar. İki ikili sensör parçası bir araya getirilirse sinyal üretilecektir4. Tam kompleks, FRET5, moleküler işaret probu 6,7 veya peroksidaz benzeri aktiviteye sahip G-dörtlüleri 8,9,10 veya RNA parçalayan 11,12,13 DNAzyme yoluyla görselleştirilebilir. 10-23 DNAzyme çekirdeğe sahip ikili sensörler geniş bir şekilde tanımlanmıştır. Sentetik olarak oluşturulan tek sarmallı nükleik asit fragmanlarını11 veya tek sarmallı amplifikasyon ürünlerini14,15 tespit etmek için uyarlanmışlardır. Örneğin, bir hücre kültüründen ekstrakte edilen 16S rRNA durumunda, amplifikasyon olmadan tespit de mümkündür, çünkü bu molekül12,16 hücrelerinde bol miktarda bulunur. 10-23 DNAzyme çekirdeğe sahip ikili sensörler, kurşun iyonları17 gibi nükleik olmayan asit tespiti için de uyarlanabilir. Bununla birlikte, düşük hassasiyetin hala ikili 10-23 DNAzyme sensörlerinin en büyük dezavantajlarından biri olduğu düşünülmektedir ve bu sorunu ele almak için kaskadlar18 veya alternatif sinyal geliştirme yöntemleri19 dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Ne yazık ki, yukarıdaki teknikler sensör bileşenlerinin maliyetini ve kararsızlığını büyük ölçüde artırmaktadır ve bu nedenle uygulamaya konmamıştır.

Bu çalışmada açıklanan deney, DNA-nanomakineler (DNM) olarak adlandırılan 10-23 DNAzyme tabanlı DNA-nanosensör kullanır20,21. Bu yapılar arasında ikili sensörler ve ayrıca (1) ikili probu çevreleyen, yapılandırılmış bölgeleri çözen ve çift sarmallı DNA'ları istila eden DNA kolaylaştırıcıları ve (2) tüm DNM parçalarını yakın bir şekilde bir arada tutan ve sinyal oluşturma şansını artıran bir DNA döşemesi bulunur (Şekil 1). Toplamda, 10-23 DNAzyme bazlı DNM'ler, tespit sınırını (LOD) pikomolar aralık21'e düşürür; hücre lizatlarında22 16rRNA'yı tespit etmek veya amplifikasyon olmadan viral RNA'nın varlığını bildirmek için kullanılabilirler23,24. Aynı zamanda, DNM'ler SNV'ye duyarlı kalır ve hatta heterozigot organizmalardaki alelleri genotiplemek için bile kullanılabilir25. DNM yöntemi, yüksek seçiciliğe sahip karmaşık bir karışım içinde ürünün görselleştirilmesi veya tanımlanması için herhangi bir amplifikasyon tipine tamamlayıcı bir teknik olarak kullanılabilir. DNM'ler, geleneksel TaqMan ve işaret problarının aksine, numunenin ısıtılmasını gerektirmez ve bu nedenle uç nokta algılama protokollerinde kullanılabilir, bu da genel algılamayı uygun maliyetli hale getirir.

Bu makale, bir DNM'nin in silico geliştirmesini açıklar ve DNM'nin montajı ve işlevsel karakterizasyonu için prosedürleri gösterir. Çalışma, viral DNA'nın (OR652423.1) 13972-14154 pozisyonlarına karşılık gelen sentetik bir Epstein-Barr virüsü (EBV) parçası kullanılarak gerçekleştirildi (bkz.

Protokol

1. DNM tasarımı

  1. İlgilenilen genom içinde benzersiz bir bölge seçin.
    NOT: Bu çalışma, 13972-14154 (OR652423.1) pozisyonlarında Epstein-Barr virüsü (EBV) genomunun bir bölgesini kullanmaktadır.
  2. Seçilen parçanın amplifikasyonu için bir astar seti oluşturun, örneğin, Ugene26'ya gömülü Primer3 aracı aracılığıyla.
  3. UNAFold web aracını27 açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve seçilen bölgeyi ekleyin. Katlama sıcaklığını 55 °C'ye ve iyonik koşulları 250 mM monovalent iyonlara ve 200 mM Mg2 + 'ya değiştirin.
    1. Ortaya çıkan ssDNA fragmanının ikincil yapısını açın ve stabil bir saç tokası seçin. Hedefin daha güçlü bir şekilde bağlanmasını sağlamak için DNA-nanomakinelerin bağlanma bölgesini yapılandırılmamış bölgelerde veya alternatif olarak firkete yapılarının ilmeklerinde bulun.
  4. Hedeflenen analit bölgesi bir sap ilmek yapısında katlanmışsa, Kol 1 ve 2'yi aşağıdaki gibi yerleştirin: Kol 2'nin gövdenin bir tarafını, halkayı ve ikinci gövde tarafının 3-5 nt'sini bağladığından emin olun; Kol 1, ikinci gövde tarafının bir parçasını bağlar.
  5. DinaMelt aracını28 açın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve kolların dizilerini ve ters tamamlayıcı dizilerini analiz edin. Kol 2 ve 3'ün Tm değerinin 65 °C'nin üzerinde olduğundan emin olmak için DinaMelt aracını kullanın: tahlil sıcaklığının (55 °C) en az 10 °C üzerinde.
    1. Yüksek tanıma seçiciliği elde edilecekse, Kol 1'in Tm'sini reaksiyon sıcaklığının (3 °C) en az 55-29 °C üzerinde tutun.
  6. Kol 1 ve 2 dizilerini DNAzyme çekirdeğinin yarısı ve F-sub bağlanma parçaları13 ile birleştirin.
  7. UNAFold27 kullanarak tasarlanan DNA zincirlerinin ikincil yapısını analiz edin.
    NOT: 55 °C (tahlil sıcaklığı), 200 mM Mg2+, 250 mM monovalent iyonlar (HEPES, Na+, K+).
    1. Tasarımı yalnızca katlama ΔG - 4 kcal/mol'den düşükse kullanın. CG açısından zengin uzun dizilerden kaçınmaya çalışın. İkincil yapı çok kararlıysa, ΔG30 katlanmasını artırmak için Kola bir mutasyon uygulayın. Alternatif olarak, Kol 3'ü Kol 2'den 2-3 nt uzağa yerleştirmek, kararlı moleküller arası yapılardan kaçınmak için Kol 3 dizisini değiştirmek için başka bir stratejidir.
  8. DNA döşeme parçası için Kol 3 kadar uzun rastgele bir dizi oluşturun. Kol 3 dizisini (dT)4-6 veya etilen glikol (örneğin, trietilen glikol (TEG) veya hekzaetilen glikol (HEG)) yoluyla DNA döşeme dizisiyle birleştirin. Deneyde sunulan DNM versiyonu (dT)6'yı kullanır.
  9. Kol 2'yi, bir bağlayıcı aracılığıyla adım 1.8'de seçilen DNA döşeme parçasına tamamlayıcı diziyle bağlayın.
  10. UNAFold web uygulamasını kullanarak tasarlanan DNA zincirlerinin ikincil yapısını analiz edin. Her bir DNA zincirinin katlanma enerjisinin 55 °C'de 4 kJ/mol'ün üzerinde olduğundan emin olun ve CG ile zenginleştirilmiş uzun dizilerden kaçının. Tercihen, DNA döşeme dizisini değiştirin.
  11. Mevcut herhangi bir vektör grafik yazılımını kullanarak yapıyı çizin. Bu makale, görselleştirme için Biorender ve Pixelmator Pro'yu kullanır (bkz. Her tel için 5'>-3' yönlerinde doğruluğu doğrulayın.
    NOT: Dizileri güvenilir bir ticari satıcıdan edinin.

2. DNM'nin fonksiyonel testi

  1. Tampon ve reaktiflerin hazırlanması
    1. 50 mM HEPES (pH 7.5-7.8), 50 mM NaCl, 150 mM KCl ve 200 mMMgCl2'den oluşan reaksiyon tamponunu hazırlayın. 50 mL'ye kadar deiyonize su ile doldurun.
    2. 10 μM Dzb-Tile ve Tile-Arm3 oligonükleotidleri hazırlayın. 1 μM Dza, 100 μM F-sub çözeltisi ve 1 nM, 10 nM, 100 nM analitlerini RNase / serbest su veya steril deiyonize su içinde hazırlayın. Oligonükleotid dizilerinin ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir.
  2. DNM montajı
    1. Kullanmadan önce oligonükleotid çözeltilerini tamamen çözün. Hafifçe vurarak karıştırın (yoğun bir şekilde girdap yapmayın). Bir mikrosantrifüj kullanarak çözeltiyi aşağı doğru döndürün (birkaç saniye boyunca hızlı bir şekilde).
    2. 0.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 200 μL reaksiyon tamponunda 1 μM Dzb-Tile ve Tile-Arm3 karıştırın.
    3. Tüpü yavaşça karıştırın ve çözeltiyi aşağı doğru döndürün.
    4. Kapalı tüpün kapağını parafin film ile sarın. Alternatif olarak, vidalı kapaklı tüpler kullanın.
    5. Tüpü 2 dakika kaynar su ile 500 mL'lik bir behere inkübe edin, ardından ısıtıcıyı kapatın ve sıcaklığın gece boyunca pasif olarak soğumasını bekleyin.
    6. %12 doğal PAGE'yi hazırlayın: 1 mL 10х TBE tamponu, 3 mL %40 AA:BA, 10 mL'ye kadar deiyonize su, 50 μL APS ve 5 μL TEMED'i karıştırın (bkz. Karışımı jel kasetine taşıyın ve polimerize olmasına izin verin.
    7. Her numunenin 1 μL'sini, yani birleştirilmiş DNM, Dzb-Tile ve Tile-arm3'ü 1 μL 4x yükleme boyası ile karıştırın ve bunları jele yükleyin.
    8. Kaseti hazneye koyun, 1x TBE tamponu ile doldurun ve jelin 80 V'ta 90 dakika çalışmasına izin verin.
    9. Jeli Etidyum bromür ile boyayın ve bir jel belgeleme sistemi kullanarak görselleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
  3. LOD testi
    1. Reaksiyon tamponunda 160 μL 200 nM F-sub hazırlayın. Bu, alt tabaka stabilitesinin temel arka planını değerlendirmek için yapılır.
    2. Reaksiyon tamponunda 20 nM DNM ve Dza ve 200 nM F-sub konsantrasyonlarında 160 μL önceden monte edilmiş DNM, F-sub ve Dza'dan 7 alikot hazırlayın. Yedi tüpün dışında, DNAzyme çekirdeğinin spontan montajını değerlendirmek için tüp #1'i boş arka plan olarak tutun.
    3. Analiti 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM ve 1000 pM son konsantrasyonlarında #2-7 tüplerine ekleyin.
    4. Yavaşça karıştırın, tüpleri aşağı doğru döndürün ve çözeltileri 50 μL'lik üç porsiyon halinde siyah 96 oyuklu bir plakaya sınıflandırın. Plakayı optik olarak şeffaf bir filmle kapatın.
    5. Plakayı 55 °C'de 1 saat su banyosunda inkübe edin. Plakayı aşağı doğru döndürün.
    6. Floresansı 525 nm'de ölçün (λex = 495 nm). Her nokta için ortalamayı ve standart sapmayı hesaplayın.
    7. F-sub ve DNM içeren tüpün sinyalini yalnızca F-sub içeren tüpün sinyaline bölerek boş-temel oranını hesaplayın. Oranın 1.1-1.5 aralığında olduğundan emin olun.
    8. F-sub, DNM içeren tüpün sinyalini ve analiti yalnızca F-sub ve DNM içeren tüpün sinyaline bölerek sinyal-boşluk oranını hesaplayın. Arka plan ortalaması artı üç standart sapmadan yüksekse, sinyali gerçek pozitif olarak kabul edin.
    9. Deneyi iki kez tekrarlayın ve analitik tekrarlar arasındaki standart sapmanın 0,5'ten az olduğundan emin olun.

Sonuçlar

İlk deneyin amacı, analitin sentetik parçasından önce DNM'nin montajını göstermekti. Tüm kurucu DNM iplikleri reaksiyon tamponuna eklendi ve beher içinde birleştirildi. Birleştirilen DNM kompleksi, yerel PAGE tarafından doğru boyutu ve homojenliği açısından değerlendirildi. Yerel PAGE, analit 1. şeritte ve 2. ve 4. şeritlerde iki DNM şeridi ile birleştirilmiş DNM'yi gösterir. DNA nanomakinesi bir araya getirilmeseydi, tek bir düşük hareketlilik bandı yerine 2 veya 3 ayrı bant görünür olurdu ( Şekil 2A'da şerit 2).

Protokolün ikinci kısmı, DNM performansının fonksiyonel karakterizasyonunu ve hedef nükleik asitlerin tespitini ifade eder. Bu çalışmada EBV 13972-14154'ün sentetik fragmanı kullanılmıştır. Bu amaçla, önceden monte edilmiş DNM'lerin fragmanları, Cza ile birlikte, 55 ° C'de 1 saat boyunca çeşitli analit konsantrasyonları ile inkübe edildi. İki kontrol floresan sinyal değeri, önceden monte edilmiş DNM'lerin fragmanlarının ve analitsiz Dzb'nin (boş) ve F-sub'dan (bazik) arka planın değeri ölçüldü. Üç teknik ölçüm yapıldı. İstatistikler için, üç bağımsız çalışma da yapılmıştır. Bu çalışmadaki magnezyum konsantrasyonunun literatürde bulunabilecek olandan daha yüksek olması dikkat çekicidir30. Yüksek magnezyum iyonları seviyeleri, spontan bir F-alt bölünmeyi teşvik ettikleri için tüm test tüplerindeki sinyali arttırır31. Teknoloji geliştirmenin ön aşamalarında reaksiyon tamponu bileşimini optimize ettik ve bu işlemi yapılan her çalışmada tekrarlamadık.

1 saatlik inkübasyondan sonra, numune floresansı bir spektroflorometre kullanılarak ölçüldü (bkz . Malzeme Tablosu). Analiz edilen DNA'nın DNM tarafından tespit edildiğini doğrulamak için, analiz edilen DNA ile birleştirilen sensörün floresan sinyalini ve herhangi bir analit içermeyen negatif kontrolün floresan sinyalini karşılaştırdık. Başarılı tespiti doğrulamak için sinyal-boşluk oranı (analit içeren kuyucukların ortalama nispi floresan birimleri ile analit içermeyen kuyular arasındaki oran) 1,5'ten az olmamalıdır32. Boş-temel oranı (analit yokluğunda sensör tepkisinin floresansının yalnızca F-sub kontrolününkine bölünmesi) 1.1-1.5 aralığında olmalıdır; bu oran, DNM'ler ve Dzb konsantrasyonları değiştirilerek ayarlanabilir (her biri için tipik konsantrasyon aralığı 5-20 nM'dir). Uygulamamızda, LOD, eğilim çizgisinin kesişimi ve ortalama boşluğun üzerindeki üç standart sapma olarak ölçülür (Şekil 2B). LOD, <100 pM33 ise DNM etkilidir. LOD'nin 100 pM'den yüksek olması durumunda DNM'nin yeniden tasarlanması gerekir.

figure-results-1
Şekil 1: Bu çalışmada kullanılan üç kollu DNM. Üç oligonükleotid, Dza, Dzb-Tile ve Tile-Arm3, sırasıyla yeşil, mavi ve mor olarak işaretlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: DNM karakterizasyonu. (A) DNM'nin poliakrilamid jel, 80 V, 1 saat, 50 bp+ DNA merdiveni kullanılarak doğal elektroforez yoluyla montajı. (B) 55 ° C'de 60 dakikalık inkübasyondan sonra sentetik DNA'nın tespit sınırı. Yatay çizgi eşiği temsil eder ve dikey çizgi LOD'dur. Üç bağımsız ölçümün ortalama değerleri bir standart sapma ile sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

DNA makinelerinin tasarımı basittir ancak hibridizasyon probları veya fonksiyonel DNA nanoyapıları tasarlama konusunda biraz deneyim gerektirir. Olası ikincil yapıların sayısını azaltmak ve ikincil yapıya DNM invazyonunu basitleştirmek için analit fragmanını mümkün olduğunca kısa tutmak uygundur. Stabil molekül içi yapılardan kaçınmak için CG içeriği tercihen %60'ın altında olmalıdır. DNM'nin başarılı bir şekilde monte edilmesi, yavaş soğutma hızlarında gerçekleştirilir. Bazı durumlarda, DNM'ler tüpe kendiliğinden monte edilebilir ve tavlama adımı ortadan kaldırılabilir. DNM montajı, 0,1-0,3 °C/dak ile bir termal döngüleyicide veya büyük hacimlerde soğutma suyunda gerçekleştirilebilir. Yanlış DNM montajı durumunda, tavlama adımı sırasında sıcaklık değişiminin yavaşlatılmasını öneririz.

LOD'yi ölçmek için en az yedi analit konsantrasyon noktasına ihtiyaç vardır: F-sub + DNM olan 0 pM analit konsantrasyonu ve doğrusal bağımlılığı gözlemlemek için örneğin 1 nM ila 1 pM aralığında altı farklı analit konsantrasyonu (Şekil 2B). Genellikle, daha yüksek doğruluk için yediden fazla konsantrasyon noktası kullanıldı. Her konsantrasyon noktası için üç teknik deneme (her biri 50 μL) yapılmalıdır. Bu nedenle, her konsantrasyon için toplam hacim 160 μL idi (pipet hatası dikkate alındığında 10 μL fazla).

DNM tekniği, SNV'ler için diğer hibridizasyon tabanlı sistemlere göre daha yüksek hassasiyet sunar. SNV'ye karşı yüksek seçicilik, bakteriyel genotipleme22 ile ilişkili nokta mutasyonlarının tanımlanması veya bitkilerde heterozigotların seçimi25 gibi belirli hedefler için uygun olabilir. Spesifik olmayan analitler de aynı deneysel prosedürü gerektirecektir. SNV'nin düşük bir analit konsantrasyonuna karşı herhangi bir anlaşılmamasını önlemek için, deneysel bilinmeyen analitin sinyalini, aynı konsantrasyona sahip bilinen tamamen tamamlayıcı bir analitin sinyalinin sinyaliyle karşılaştırmanızı öneririz.

Yöntem, ssDNA, miRNA, katlanmış RNA veya dsDNA amplikonlarına başarıyla uygulanabilir. Uzun RNA veya dsDNA fragmanları, özellikle CG açısından zengin olanlar, 4-6 analit bağlama kolu ile donatılmış DNM gerektirebilirken, kararsız bir ikincil yapıya sahip tek sarmallı analitler için iki analit bağlama kolu yeterlidir (-10 kcal/mol'ün üzerinde ΔG katlanma). Yöntem, PCR, SDA veya LAMP amplikonlarının tespiti için uygulanabilir. DNM, toplam RNA 22,34,35'i izole etmeden haşlanmış bakteri kültürü örneklerinde rRNA'nın amplifikasyonsuz tespiti için kullanılabilir. Teknik, femtomolar seviye kadar düşük konsantrasyonlarda ve yan bölgelerdeki CG içeriği %65'ten yüksek olan dsDNA fragmanlarında iyi çalışmayabilir. CG içeriği, örneğin Biologics CG içerik hesaplayıcısı36 ile tahmin edilebilir. Yüksek CG içeriği durumlarında hassasiyeti artırmak veya dsDNA'yı ssDNA'ya dönüştürmek için DNM tasarımlarına kanca parçaları37 eklemenizi öneririz. Yöntemin bir başka sınırlaması, DNM'lerin numunelerin kalitesine duyarlı olmasıdır, bu nedenle nükleik asitler dikkatli bir şekilde saflaştırılır. Aynısı DNM'lerin oligonükleotid dizilerinin kalitesi için de geçerlidir. Bu nedenle, her oligonükleotid kaynağının kararlılığının ve saflığının doğrulanması önerilmektedir. Geleneksel amplifikasyon teknikleriyle karşılaştırıldığında, DNM'lerin tasarımı beceri gerektirir ve makalenin yayınlanma tarihine kadar neredeyse tamamen manueldir. DNM'ler, gerçek DNA veya RNA örneklerine tabi tutulmadan önce sentetik parçalar üzerinde bazı ön testlere ihtiyaç duyar, böylece test sistemi geliştirmenin toplam süresini arttırır.

Yöntem çok yönlüdür ve farklı türde muhabir problarını benimseyebilir. Çoğullanabilir38 ve F-sub, G-dörtlüsü oluşturan bir substrat39 ile değiştirilirse, teknik kolorimetrik bir versiyona dönüştürülebilir. Polimerazın varlığı, iplik büyümesindeki hatalarla ilişkilidir; bu nedenle, bu yöntem, bozulabilir protein enzimlerinin eksikliği ve sağlam ve basit tespit prosedürü nedeniyle geleneksel gerçek zamanlı PCR ve dijital PCR'nin yanı sıra SHERLOCK ve DETECTR gibi diğer nükleaz bağımlı tekniklere göre avantajlıdır40,41.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, EBV'nin gDNA'sını sağlama nezaketini gösterdiği için Ekaterina V. Nikitina'ya teşekkür eder. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya ve Maria S. Rubel, Rusya Federasyonu Eğitim ve Bilim Bakanlığı'na (Hibe No: FSER-2022-0009) ve Öncelikli 2030 programına teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL tüpBiofilCFT011015
100 bp+ DNA MerdiveniEvrogenNL002
100-1000 & mikro; L pipetKirgenKG-Pro1000
10-100 & mikro; L pipetKirgenKG-Pro100
1-10 & mikro; L pipetKirgenKG-Pro10
20-200 & mikro; L pipetKirgenKG-Pro200
2-20 & mikro; L pipetKirgenKG-Pro20
4x Jel Yükleme BoyasıEvrogenPB020
Akrilamid 4KAppliChemA1090,0500
Amonyum persülfatCarl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisakrilamidMolekula22797959
Borik AsitTechSnabH-0202
ChemiDoc görüntüleme sistemiBioRad12003153
Costar 96 Kuyulu Siyah Polistiren PlakaCorningCOS3915
DinaMeltRNA Enstitüsühttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmresco-O105
Etidyum bromürBioLabMixEtBr-10
HEPESAmresco-O485
Magnezyum klorürAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
pipet 10 & mikro; L uçlarKirgenKG1111-L
pipet 1000 & L uçlarKirgenKG1636
pipet 200 & L ipuçlarıKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Potasyum klorürCarl Roth1782751
PowerPac Temel Güç KaynağıBioRad1645050
RNAse/DNAse içermeyen suInvitrogen10977049
PCR plakaları için sızdırmazlık filmiSovtechP-502
Sodyum klorürVektonHCh (0,1)
Spark çok modlu mikroplaka okuyucuTecanSpark- 10M
T100 yükselticiBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hidroksimetil)aminometanAmresco-O497
UNAFoldRNA Enstitüsühttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Su banyosuLOIPLB-140
kullanılan oligolar< / güçlü >
< güçlü > Analit: < / güçlü >Evrogendoğrudan sipariş, standart tuz giderme saflaştırma
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogendoğrudan sipariş, standart tuzdan arındırma
arıtma CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogendoğrudan sipariş, standart tuzdan arındırma
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogendoğrudan sipariş, standart tuzdan arındırma arıtma
F-sub oligonükleotid: < / güçlü> AAGGTT (FAM) TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntezdoğrudan sipariş, HPLC saflaştırma

Kaynaklar

  1. Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
  2. Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
  3. Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions. Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).
  4. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110, 4709-4723 (2010).
  5. Marti, A. A., Jockusch, S., Stevens, N., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for sensitive and selective DNA and RNA detection. Acc Chem Res. 40 (6), 402-409 (2007).
  6. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens.Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  7. Dark, P., et al. Accuracy of LightCycler Septi Fast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis. Intensive Care Med. 41, 21-33 (2015).
  8. Maltzeva, Y. I., Gorbenko, D. A., Nikitina, E. V., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) products without denaturation using peroxidase-like DNA machines (PxDM). Int J Mol Sc. 24 (9), 7812(2023).
  9. Gorbenko, D. A., et al. DNA nanomachine for visual detection of structured RNA and double stranded DNA. Chem Comm. 58 (35), 5395-5398 (2022).
  10. Roembke, B. T., Nakayama, S., Sintim, H. O. Nucleic acid detection using G-quadruplex amplification methodologies. Methods. 64 (3), 185-198 (2013).
  11. Mokany, E., Bone, S. M., Young, P. E., Doan, T. B., Todd, A. V. MNAzymes, a versatile new class of nucleic acid enzymes that can function as biosensors and molecular switches. JACS. 132 (3), 1051-1059 (2010).
  12. Gerasimova, Y. V., Cornett, E., Kolpashchikov, D. M. RNA cleaving deoxyribozyme sensor for nucleic acid analysis: the limit of detection. Chem Bio Chem. 11, 811-817 (2010).
  13. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  14. Hu, M., et al. Allosteric DNAzyme-based encoder for molecular information transfer. Chin. Chem Let. , 109232(2023).
  15. Peeters, B., et al. Solid-phase PCR-amplified DNAzyme activity for real-time FO-SPR detection of the MCR-2 gene. Anal Chem. 92 (15), 10783-10791 (2020).
  16. Wood, H. N., et al. Species typing of nontuberculous Mycobacteria by use of deoxyribozyme sensors. Clin Chem. 65 (2), 333-341 (2019).
  17. Yan, T., et al. Ultralow background one-pot detection of Lead (II) using a non-enzymatic double-cycle system mediated by a hairpin-involved DNAzyme. Biosen Bioelectron. 237, 115534(2023).
  18. Hasick, N. J., Radhika, R., Todd, A. V. Subzymes: Regulating DNAzymes for point of care nucleic acid sensing. Sens. Act. B: Chem. 297, 126704(2019).
  19. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  20. Cox, A. J., Bengtson, H. N., Gerasimova, Y. V., Rohde, K. H., Kolpashchikov, D. M. DNA antenna tile-associated deoxyribozyme sensor with improved sensitivity. Chem Bio Chem. 17 (21), 2038-2041 (2016).
  21. Lyalina, T. A., Goncharova, E. A., Prokofeva, N. Y., Voroshilina, E. S., Kolpashchikov, D. M. A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA. Analyst. 144 (2), 416-420 (2019).
  22. Ateiah, M., Gandalipov, E. R., Rubel, A. A., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species. Int J Mol Sc. 24 (5), 4473(2023).
  23. El-Deeb, A. A., et al. Toward a home test for COVID-19 diagnosis: DNA machine for amplification-free SARS-CoV-2 detection in clinical samples. Chem Med Chem. 17 (20), 202200382(2022).
  24. Kirichenko, A., Bryushkova, E., Dedkov, V., Dolgova, A. A Novel DNAzyme-based fluorescent biosensor for detection of RNA-containing Nipah henipavirus. Biosensors. 13 (2), 252(2023).
  25. Akhmetova, M. M., Rubel, M. S., Afanasenko, O. S., Kolpashchikov, D. M. Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine. Sens Act Rep. 4, 100132(2022).
  26. Okonechnikov, K., et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 28, 1166-1167 (2012).
  27. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  28. Markham, N. R., Zuker, M. DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res. 33, Web Server issue W577-W581 (2005).
  29. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. JACS. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  30. Dong, J., Ouyang, Y., Wang, J., O'Hagan, M. P., Willner, I. Assembly of dynamic gated and cascaded transient DNAzyme networks. ACS Nano. 16 (4), 6153-6164 (2022).
  31. Montserrat Pagès, A., Hertog, M., Nicolaï, B., Spasic, D., Lammertyn, J. Unraveling the kinetics of the 10-23 RNA-cleaving DNAzyme. Int J Mol Sc. 24 (18), 13686(2023).
  32. Nguyen, C., Grimes, J., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Molecular-beacon-based tricomponent probe for SNP analysis in folded nucleic acids. Chem-eur J. 17 (46), 13052-13058 (2011).
  33. MacDougall, D., Crummett, W. B. Guidelines for data acquisition and data quality evaluation in environmental chemistry. Anal Chem. 52 (14), 2242-2249 (1980).
  34. Gerasimova, Y. V., Yakovchuk, P., Dedkova, L. M., Hecht, S. M., Kolpashchikov, D. M. Expedited quantification of genetically modified ribosomal RNA by binary deoxyribozyme sensors. RNA. 10, 1834-1843 (2015).
  35. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  36. GC Content Calculator. , Available from: https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU (2023).
  37. Hussein, Z., et al. DNAzyme nanomachine with fluorogenic substrate delivery function: advancing sensitivity in nucleic acid detection. Anal Chem. 95 (51), 18667-18672 (2023).
  38. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  39. Gerasimova, Y. V., et al. Deoxyribozyme cascade for visual detection of bacterial RNA. Chem Bio Chem. 14, 2087-2090 (2013).
  40. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Gen Res. 1 (1), 17-24 (1991).
  41. Pandya, K., Jagani, D., Singh, N. CRISPR-Cas systems: Programmable nuclease revolutionizing the molecular diagnosis. Mol Biotech. , (2023).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

DNAzim NanomakineleriRNA Kesici DNAzimHibridizasyon ProblarTek N kleotid PolimorfizmiFloresan Sinyal Amplifikasyonuift Zincirli DNADNA skeleDo al PAGEDNA Nanoteknolojisi
DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.