DNAzyme tabanlı nanomakineler, nükleik asitlerin son derece seçici ve hassas tespiti için kullanılabilir. Bu makale, özgür yazılım kullanılarak 10-23 çekirdekli DNAzyme tabanlı nanomakinelerin tasarımı için ayrıntılı bir protokolü ve örnek olarak bir Epstein-Barr virüs parçasının tespitinde uygulanmasını açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler
Bu makalede
Özet
Özet
DNA ve RNA dizilerinin (analitler) tespiti için DNAzyme tabanlı nanomakineler (DNM), oligonükleotidlerden yapılmış çok işlevli yapılardır. İşlevleri arasında sıkı analit bağlanması, yüksek derecede seçici analit tanıma, florojenik bir raportör substratın çoklu katalitik bölünmeleri ile floresan sinyal amplifikasyonu ve sensör tepkisinde bir artış için florojenik substrat çekimi yer alır. Fonksiyonel birimler, işbirlikçi eylemleri için ortak bir DNA iskelesine bağlanır. RNA parçalayan 10-23 DNM'ler, katalitik olmayan hibridizasyon problarına kıyasla geliştirilmiş hassasiyete sahiptir. DNM'nin stabilitesi ve substrat tanıma şansının artması, çift sarmallı bir DNA fragmanı, bir karo tarafından sağlanır. DNM, katlanmış bir RNA'da tek bir nükleotid farkı ve çift sarmallı bir DNA'da iki analiti ayırt edebilir ve diğer protein içermeyen hibridizasyon problarından ~ 1000 kat daha düşük konsantrasyonlarda analitleri tespit edebilir. Bu makale, DNA-nanomakine aktivitesinin tanısal potansiyelinin arkasındaki konsepti sunar ve nükleik asit tespit deneylerinde DNM tasarımını, montajını ve uygulamasını gözden geçirir.
Giriş
Nükleik asit tespiti için en eski yöntemlerden biri, seçici oligonükleotidlerin analiz edilen RNA veya DNA dizilerine tamamlayıcı bağlanmasıdır. Bu yöntem, hedeflenen bir DNA veya RNA analiti1 ile Watson-Crick baz çiftleri oluşturabilen nükleik asit fragmanları (problar) kullanır. Kompleks daha sonra çeşitli tekniklerle analit ve bağlanmamış probdan ayırt edilir. Northern blotlama, in situ hibridizasyon veya qPCR gibi bazı yöntemler, tamamlayıcı bağlanma2 olgusuna dayanmaktadır. En yaygın hibridizasyon problarının iki önemli dezavantajı vardır: düşük hassasiyet (mikromolar ila n....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. DNM tasarımı
- İlgilenilen genom içinde benzersiz bir bölge seçin.
NOT: Bu çalışma, 13972-14154 (OR652423.1) pozisyonlarında Epstein-Barr virüsü (EBV) genomunun bir bölgesini kullanmaktadır. - Seçilen parçanın amplifikasyonu için bir astar seti oluşturun, örneğin, Ugene26'ya gömülü Primer3 aracı aracılığıyla.
- UNAFold web aracını27 açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve seçilen bölgeyi ekleyin. Katlama sıcaklığını 55 °C'ye ve iyonik koşulları 250 mM monovalent iyonlara ve 200 mM Mg2 + 'ya değiştirin.
- ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İlk deneyin amacı, analitin sentetik parçasından önce DNM'nin montajını göstermekti. Tüm kurucu DNM iplikleri reaksiyon tamponuna eklendi ve beher içinde birleştirildi. Birleştirilen DNM kompleksi, yerel PAGE tarafından doğru boyutu ve homojenliği açısından değerlendirildi. Yerel PAGE, analit 1. şeritte ve 2. ve 4. şeritlerde iki DNM şeridi ile birleştirilmiş DNM'yi gösterir. DNA nanomakinesi bir araya getirilmeseydi, tek bir düşük hareketlilik bandı yerine 2 veya 3 ayrı bant görünür olurdu ( Şekil 2.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
DNA makinelerinin tasarımı basittir ancak hibridizasyon probları veya fonksiyonel DNA nanoyapıları tasarlama konusunda biraz deneyim gerektirir. Olası ikincil yapıların sayısını azaltmak ve ikincil yapıya DNM invazyonunu basitleştirmek için analit fragmanını mümkün olduğunca kısa tutmak uygundur. Stabil molekül içi yapılardan kaçınmak için CG içeriği tercihen %60'ın altında olmalıdır. DNM'nin başarılı bir şekilde monte edilmesi, yavaş soğutma hızlarında gerçekleştirilir. Bazı durumlarda,.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Yazarlar, EBV'nin gDNA'sını sağlama nezaketini gösterdiği için Ekaterina V. Nikitina'ya teşekkür eder. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya ve Maria S. Rubel, Rusya Federasyonu Eğitim ve Bilim Bakanlığı'na (Hibe No: FSER-2022-0009) ve Öncelikli 2030 programına teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL tüp | Biofil | CFT011015 | |
| 100 bp+ DNA Merdiveni | Evrogen | NL002 | |
| 100-1000 & mikro; L pipet | Kirgen | KG-Pro1000 | |
| 10-100 & mikro; L pipet | Kirgen | KG-Pro100 | |
| 1-10 & mikro; L pipet | Kirgen | KG-Pro10 | |
| 20-200 & mikro; L pipet | Kirgen | KG-Pro200 | |
| 2-20 & mikro; L pipet | Kirgen | KG-Pro20 | |
| 4x Jel Yükleme Boyası | Evrogen | PB020 | |
| Akrilamid 4K | AppliChem | A1090,0500 | |
| Amonyum persülfat | Carl Roth | 2809447 | |
| Biorender | Biorender | https://www.biorender.com | |
| Bisakrilamid | Molekula | 22797959 | |
| Borik Asit | TechSnab | H-0202 | |
| ChemiDoc görüntüleme sistemi | BioRad | 12003153 | |
| Costar 96 Kuyulu Siyah Polistiren Plaka | Corning | COS3915 | |
| DinaMelt | RNA Enstitüsü | http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php | |
| EDTA | Amresco | -O105 | |
| Etidyum bromür | BioLabMix | EtBr-10 | |
| HEPES | Amresco | -O485 | |
| Magnezyum klorür | AppliChem | 131396 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658001EDU | |
| pipet 10 & mikro; L uçlar | Kirgen | KG1111-L | |
| pipet 1000 & L uçlar | Kirgen | KG1636 | |
| pipet 200 & L ipuçları | Kirgen | KG1212-L | |
| Pixelmator Pro | Pixelmator Team | https://www.pixelmator.com/pro/ | |
| Potasyum klorür | Carl Roth | 1782751 | |
| PowerPac Temel Güç Kaynağı | BioRad | 1645050 | |
| RNAse/DNAse içermeyen su | Invitrogen | 10977049 | |
| PCR plakaları için sızdırmazlık filmi | Sovtech | P-502 | |
| Sodyum klorür | Vekton | HCh (0,1) | |
| Spark çok modlu mikroplaka okuyucu | Tecan | Spark- 10M | |
| T100 yükseltici | BioRad | 10014822 | |
| TEMED | Molekula | 68604730 | |
| Tris(hidroksimetil)aminometan | Amresco | -O497 | |
| UNAFold | RNA Enstitüsü | http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php | |
| Su banyosu | LOIP | LB-140 | |
| kullanılan oligolar< / güçlü > | |||
| < güçlü > Analit: < / güçlü > | Evrogen | doğrudan sipariş, standart tuz giderme saflaştırma | |
| GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC | |||
| Tile-Arm3: | Evrogen | doğrudan sipariş, standart tuzdan arındırma | |
| arıtma CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT | |||
| Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT | Evrogen | doğrudan sipariş, standart tuzdan arındırma | |
| Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA | Evrogen | doğrudan sipariş, standart tuzdan arındırma arıtma | |
| F-sub oligonükleotid: < / güçlü> AAGGTT (FAM) TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1 | DNA-Syntez | doğrudan sipariş, HPLC saflaştırma |
Kaynaklar
- Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
- Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
