Fototermal Rezonans Kılavuz Çekme Kullanılarak DNA Üç Köşeli Yıldız Motifi Kendi Kendine Montajın Yüksek Hızlı Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntülemesi

Özet

Burada, görüntüleme parametrelerini optimize ettiğimiz, sistem sınırlarını belirlediğimiz ve üç noktalı yıldız DNA motifi montajını görüntülemedeki potansiyel iyileştirmeleri araştırdığımız fototermal kapalı rezonans dokunma (PORT) ile biyomoleküler etkileşimleri gözlemlemek için görüntüleme protokolünü gösteriyoruz.

Özet

Yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobu (HS-AFM), sıvı ortamlarda fizyolojik koşullar altında görüntüleme yeteneği nedeniyle tek moleküllü biyolojik süreçleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için popüler bir moleküler görüntüleme tekniğidir. Fototermal kapalı rezonans kılavuz çekme (PORT) modu, konsolu kontrollü bir şekilde salmak için bir sürücü lazeri kullanır. Bu doğrudan konsol çalıştırma, MHz aralığında etkilidir. Rezonans genliği yerine zaman alanı kuvvet eğrisi üzerinde geri besleme döngüsünün çalıştırılmasıyla birleştirilen PORT, uç örnekleme kuvvetleri üzerinde doğrudan kontrol ile saniyede on kareye kadar yüksek hızlı görüntüleme sağlar. PORT'un hassas montaj dinamiklerinin görüntülenmesini ve biyomoleküller tarafından oluşturulan modellerin hassas bir şekilde izlenmesini sağladığı gösterilmiştir. Şimdiye kadar, teknik, bu çalışmada gösterilen DNA 3 köşeli yıldız motifi montaj desenleri de dahil olmak üzere çeşitli dinamik in vitro çalışmalar için kullanılmıştır. Bu protokol, bir dizi deney aracılığıyla, HS-PORT AFM görüntüleme sisteminin optimal görüntüleme parametre ayarlarını ve nihai sınırlarını ve bunların biyomoleküler montaj süreçlerini nasıl etkilediğini sistematik olarak tanımlar. Ek olarak, özellikle tarama küçük alanlarla sınırlı olduğunda, sürücü lazerinin numune ve çevresindeki sıvı üzerinde neden olduğu potansiyel istenmeyen termal etkileri araştırır. Bu bulgular, karmaşık biyolojik sistemlerin incelenmesinde PORT modunun uygulamasının ilerlemesini sağlayacak değerli bilgiler sağlar.

Giriş

Yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobu (HS-AFM) hızla büyüyen bir görüntüleme tekniğidir 1,2,3,4. Araştırmacıların biyomoleküler etkileşimleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmelerine olanak tanıyan hızlarda çalışır 5,6,7,8,9. Fototermal kapalı rezonans kılavuz çekme (PORT), tepe kuvveti dokunma^10,11, darbeli kuvvet modu^12,13 veya atlama modu^14'e benzer bir rezonans dışı görüntüleme modudur. Bununla birlikte, tarayıcıyı dikey olarak salmak yerine, PORT, konsola odaklanan bir uyarma lazeri aracılığıyla (genellikle sıkıştırma noktasına yakın) yalnızca konsolu dikey olarak salınır. Konsol, bimorf etkisi nedeniyle deforme olur: güç modülasyonlu bir uyarma lazeri, konsolun ve kaplama malzemelerinin¹⁵ farklı termal genleşme katsayıları nedeniyle bükülen kaplanmış konsolu periyodik olarak ısıtır. Konsol ve numune ısıtması, tam bir sinüzoidal tahrik⁵ kullanmak yerine, her salınım döngüsü sırasında periyodik olarak kapatılıp tekrar açılan bir tahrik lazeri kullanılarak en aza indirilebilir.

DNA, birkaç yıldır biyolojik olarak ilgili, yapısal olarak ilginç ve biyokimyasal olarak yararlı motifler oluşturmak için kullanılmıştır 16,17,18,19,20. Ek olarak, DNA yapılarının AFM görüntüleme kalitesini²¹ karakterize etmek ve yüksek hızlı AFM^22'nin uç etkisini değerlendirmek için ideal olarak uygun olduğu kanıtlanmıştır. Künt uçlu DNA üç noktalı yıldızlar (3PS), aksi takdirde karmaşık biyolojik sistemlerde benzer şekilde yapılandırılmış moleküllerin supramoleküler organizasyonunu araştırmak için programlanabilir bir model sistem olarak pratik hale geldi¹⁹. Daha önce, künt uçlu trimerik DNA monomerleri tarafından oluşturulan kafeslerin kendi kendine montajı HS-AFM²³ ile izleniyordu. Sonunda, bunlar altıgen düzende büyük ağlar halinde düzenlenir. Burada, DNA 3 noktalı yıldızların¹⁹ kendi kendine birleşmesi, kendi kendine birleşmeyi ve düzeltme mekanizmalarını²⁴ izlemek için yeterince hızlı tarama hızlarında PORT tekniği ile görüntülenirken, sürecin veya numune hasarının minimum düzeyde bozulmasını sağlar. Herhangi bir HS-AFM modunda olduğu gibi, ulaşılabilir görüntüleme kalitesi, görüntüleme hızı ve numunenin istenmeyen rahatsızlığı arasında bir denge vardır. Doğru uzlaşmayı seçerek, supramoleküler düzeneklerin kendi kendine organizasyon modellerini daha iyi anlayabiliriz. Bu nedenle bu protokol, PORT'a özgü parametreleri optimize etmek için bir model sistem olarak DNA 3PS ile benzer bir kurulum kullanacaktır. Bu, numune hasarını en aza indirirken yeterince büyük tarama boyutlarında yüksek görüntüleme hızlarında çalışmaya izin verecektir.

Protokol

1. Örnek ve tamponlar

NOT: Bu çalışmada kullanılan DNA karosu, Purdue Üniversitesi'ndeki Mao laboratuvarında geliştirilen 3 köşeli yıldız motifidir^19,25. Bu çalışmada kullanılan tüm oligonükleotidler, gerekli malzemeleri ve reaktifleri toplayın.

1. Tek sarmallı DNA'ları (ssDNA'lar) 1: 3: 3 molar oranda (S1 0.6 μM, S2 için 1.8 μM ve S3 için 1.8 μM) tavlama tamponunda (5 mM TRIS, 1 mM EDTA ve 10 mM MgAc₂) karıştırın. DNA motifinin nihai konsantrasyonu 0.6 μM (49 ng/μL, 3PS'lik moleküler ağırlık 82020.3 g/mol) olmalıdır.
2. DNA solüsyonunu ısıya dayanıklı bir kaba koyun ve 80 °C'ye ısıtın. DNA çözeltisini 4 saatlik bir süre boyunca 80 ° C'den 20 ° C'ye yavaşça soğutun. Bu tavlama işlemi, ssDNA oligonükleotidlerinin istenen çift sarmallı DNA motifini oluşturmasına yardımcı olur.
3. Saflaştırma için, fazla ssDNA'ları ve istenmeyen yan ürünleri çıkarmak için tavlanmış DNA solüsyonunu %3'lük bir agaroz jel üzerine yükleyin. % 3'lük jeli yaklaşık 60 V'ta çalıştırın. 0,5x Tris-Borat-EDTA (TBE) ve 10 mM Mg (CH₃COO)₂ içeren bir çalışma tamponunda 2,5 saat.
4. DNA motifini içeren jel üzerindeki bandı tanımlayın ve bulun. Bandın boyutuna bağlı olarak belirli bir konuma taşındığından emin olun.
5. DNA motifini içeren bandı jelden dikkatlice çıkarın. Eksize edilen jel fragmanından DNA motifini, bir jel ekstraksiyon döndürme kolonuna yerleştirerek ve 3.000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyerek çıkarın.
6. Ekstrakte edilen DNA motifindeki tamponu, bir santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak tavlama tamponu ile değiştirin. Konsantre çözelti 100 μL'den az olana kadar oda sıcaklığında (veya daha düşük) 3000 x g'da santrifüjleyin. Ardından, 300 μL tavlama tamponu ekleyin ve tamponun değiştirildiğinden emin olmak için bu adımı iki kez tekrarlayın.
7. Görüntüleme amacıyla DNA motifini 6 nM'ye seyreltin. Konsantrasyonu doğru bir şekilde belirlemek ve ayarlamak için bir spektrofotometre veya diğer uygun yöntemler kullanın. DNA motifi artık görüntüleme için hazırdır.
   NOT: Protokoldeki tüm tamponlar pH 8.0'dır. İlgili üç bant için sıra bilgisi aşağıdaki gibidir:
   S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
   AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
   S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
   CGGTAACG (Türkçe)
   S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. Konsol ucu büyümesi

1. SEM konsol tutucusuna konsol montajı: Konsolların temiz olduğundan ve herhangi bir kirletici madde içermediğinden emin olun. Konsolları SEM sistemi ile uyumlu uygun bir tutucuya monte edin. Özel yapım konsol tutucu tasarımı istek üzerine paylaşılabilir.
2. Gaz enjeksiyonu: Yeni ucu büyütmek için gaz enjeksiyon sisteminde kullanılacak öncü gazı (örneğin, amorf karbon uçları için fenantren C₁₄H₁₀ öncüsü) ısıtın. Vakum ^10-5 mbar'ın altına düşer düşmez, nozul hattında istenmeyen kalıntı hava olmadığından emin olmak için gaz enjeksiyon hattını 2 saniye boyunca 10 kez boşaltın (bu, tabanca haznesine giden valf kapalıyken yapılmalıdır).
3. Uç konumu ayarı: Konsolun ucunu bulmak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanın. Konsol tutucuyu, yüzeye göre AFM konsol tutucusuna yerleştirildiğinde konsolun sunacağı açıya eşdeğer bir açıya (örn. bu durumda 11°) eğin, böylece büyüyen uç görüntüleme sırasında yüzeye dik olacaktır. Keskin bir karbon nano ucun yetiştirileceği konsol ucunun net bir görünümünü elde etmek için SEM'in konumunu ve odağını ayarlayın.
4. Odaklanmış elektron demetine bağlı biriktirme (FEBID):
   1. Işın akımı (I) ve hızlanma voltajı (V), çalışma mesafesi (WD), büyütme, maruz kalan şekil, doz/biriktirme süresi ve bekleme süresi gibi seçilen yazılımda (bu durumda SmartFIB) biriktirme parametrelerini ayarlayın. AFM görüntüleme için iyi mekanik özellikler sunan, yaklaşık 130 nm uzunluklara ve 2-4 nm aralığında yarıçaplara yol açan amorf karbon uçları büyütmek için aşağıdaki parametreler kullanıldı:
      Noktayı/noktayı pozlanan şekil olarak seç
      WD = 5 mm
      I = 78 pA ve V = 5 kV
      Bekleme süresi = 1 μs
      Doz = 0.05 nC ve biriktirme süresi = 0.64 s
      Büyütme = 20000x
   2. Elektron ışınını bir noktada konsol ucuna ışınlayarak ve aynı anda öncü gazı enjekte ederek ucu büyütmek için biriktirme işlemine başlayın ve biriktirme tamamlandığında gazı kapatın. Bu durumda SmartFIB yazılımı, yukarıda belirtilen tarifi ayarladıktan sonra bunu otomatik olarak gerçekleştirir.
5. Büyüme sonrası analiz: Yeni büyüyen ucu incelemek ve kalitesinden ve özelliklerinden (uç yarıçapı ve uzunluğu) emin olmak için büyüme sonrası SEM görüntüleme yapın. SEM görüntüleme sırasında yeniden birikmeyi önlemek için tüm öncü gazın dışarı pompalandığından emin olmak için uç büyümesinden sonra 1-2 dakika bekleyin. Numune tutucuyu SEM odasından çıkarın.
6. Konsol geri dönüşümü: SEM sisteminde ayrıca birleşik bir odaklanmış iyon kirişi (FIB) takılıysa, daha önce büyümüş hasarlı veya kirli bir ucu, düşük FIB akımları (örneğin, konsol hasarını önlemek için 1 pA) kullanarak FIB sistemi ile frezeleyerek çıkarın. Uç çökmesini önlemek için uç sökme işlemini, uç ucundan tabana kadar enine kesit şeklinde frezeleyerek gerçekleştirin. Bu, yeni bir tane yeniden büyütmeye izin verecektir.

3. HS-AFM donanımı

1. Görüntüleme kurulumu, özel yapım PORT kafası^{5, 26} (Şekil 1A), üzerinde mika bulunan bir örnek disk bulunan yüksek hızlı tarayıcı²⁶ , uyumlu kontrolör²⁷, yüksek hızlı görüntüleme için gereken yüksek bant genişliğine sahip yüksek voltaj amplifikatörü, AFM tabanı ve daha önce bahsedilen ekipmanı²⁷ kontrol etmek için gerekli yazılıma sahip PC'den oluşur.
   NOT: Bu durumda, bunlar, EPFL^{27, 28'deki} Biyo- ve Nano- Enstrümantasyon Laboratuvarı'ndan planları alınabilecek açık kaynaklı bileşenlerdir. PORT kafası ve kontrolörün²⁹ nasıl oluşturulacağına dair atölye çalışmalarına katılmak ve LabView tabanlı yazılımı indirmek ve kullanmak da mümkündür.
2. Ultra kısa bir konsolu (örn. AC10DS veya eşdeğeri) cımbız kullanarak konsol tutucusundaki yaylı klipsin altına dikkatlice yerleştirin. Konsol çipinin sabit ve sağlam olduğundan emin olun.
3. Şekil 1B'de gösterildiği gibi sol sıvı erişim portundan bir şırınga kullanarak 50 μL sıvı ekleyin. Uyarma lazeri hala kapalıyken, Şekil 1A'da gösterilen AFM kafasındaki üç özel düğmeyi kullanarak okuma lazerini konsol üzerinde hizalayın. Bunu, toplamı en üst düzeye çıkarırken konsol gölgesini beyaz bir kağıt üzerinde gözlemleyerek yapın (gölge yöntemi). Ardından, iki özel düğmeyi kullanarak lazer noktasını fotodiyot üzerinde ortalayın.
4. Uyarma VI'daki Uyarma Etkinleştirme kutusunu işaretleyerek sürücü lazerini açın ve hizalayın, böylece konsolu harekete geçirir ve salınır. Bağlı bir osiloskop üzerinde konsol uyarma sinyalini ve konsol sapma sinyalini gösterin. Sapma salınımı çok düşükse (veya yoksa), tahrik lazeri konsoldan çok uzakta olabilir. Bu durumda, gölge yöntemini kullanın ve daha kolay hizalama için saptırma lazerini kapatın. Şekil 1A'da gösterilen sürücü lazer ayar düğmelerini kullanarak salınım genliğini en üst düzeye çıkarın.
5. PORT'taki konsol salınım genliğini ayarlamak için, yazılımın ilgili kontrolüne, Uyarma VI'da lazer diyot kontrol devresine (bundan böyle tepeden tepeye AC girişi) gönderilen tepeden tepeye voltajı girin. Lazer diyotu iletim rejiminde tutmak ve dolayısıyla lazer oluşturmak için, lazer diyot kontrol devresine (bundan böyle DC ofset girişi) bir DC voltajı ekleyin, bu da Uyarma VI'daki bir konfigürasyon kutusundan yapılır. Her ikisi de bir lazer güç ölçer ile ölçülebilen ve konsol salınım genliğini ayarlamak için kullanılan lazer gücünü de etkileyecektir.
6. Konsolun rezonans frekansının altında olması gereken, konsola uygulanabilecek maksimum fototermal uyarma frekansını belirleyin. Rezonans frekansını bir termal ayar veya bir frekans taraması ile belirleyin. Sıvılarda rezonans frekansı yaklaşık 400 kHz (havada 1 MHz)³⁰ olan bu çalışmada kullanılan konsollar (AC10DS), 300 kHz'in altında yarı statik bir eğilme bölgesine sahiptir⁵. Bu nedenle, bu sınırın altındaki (yaklaşık 100-200 kHz) PORT frekansları kullanılmalıdır.
7. PORT hızı ve tarama hızı için görüntüleme parametrelerini ve ayarlarını sırasıyla Uyarma ve Tarama Vis'inde istenen değerlere ayarlayın (bu makalede kullanılan parametreler şekil açıklamalarında belirtilmiştir). Kurulum ve görüntüleme parametreleri yapılandırıldıktan sonra, moleküler etkileşimleri gözlemlemek ve izlemek için gerekli görüntüleme deneylerini gerçekleştirin.
   NOT: AC10DS konsolları artık satılmadığından, eşdeğeri mevcut olana kadar Fastscan D veya BioLever³¹ gibi bir alternatifin kullanılması gerekebilir.

4. Uygun etkileşim eğrilerinin elde edilmesi

1. İlk olarak, s'ye yaklaşınample temas modunda Z-denetleyici VI'da Başlat'a tıklayarak Temas Moduna ayarlayın.
   1. Bu modda, AFM ucu numune ile doğrudan temas eder. Yüzeye ulaşıldığında, konsol sapma hassasiyeti kalibrasyonunu elde etmek için Ramp VI'da bir kuvvete karşı mesafe eğrisi gerçekleştirin.
   2. Ayrıca, bir interferometre ile elde edilen konsol sağlayıcı spesifikasyonlarından (daha az doğru bir şekilde) veya sapma hassasiyeti kalibrasyonundan sonra termal ayar tabanlı bir kalibrasyon yoluyla konsol yay sabitini tahmin edin. Doğru bir uç numunesi kuvvet kontrolü için hassas bir konsol kalibrasyonu şarttır.
2. Z denetleyici VI'da Yukarı'ya tıklayarak ucun yüzeye ulaşamadığı yüzeyden Z-piezo'yu tamamen geri çektikten sonra, Z denetleyici VI'da PORT moduna geçin ve Uyarma VI onay kutusunda uyarma lazerini açın. Başlamak için, PORT modunu, bu deneysel durumda bir AC10DS konsol kullanarak 100 kHz olan Uyarma VI'da istenen frekansta çalışacak şekilde ayarlayın.
3. Konsolsuz salınımı yakın ancak yüzeye değmeyecek şekilde kaydedin. Ardından, kaydetmek için Z kontrol cihazındaki Geri Bildirimi yüzeyle temas edecek şekilde AÇIN ve konsol yüzeyle aralıklı olarak temas ettiğinde, her ikisi de nanometre cinsinden olmak üzere konsolun salınımını elde etmek için Düzelt'e tıklayın. Gerçek etkileşim eğrisini elde etmek için serbest salınım eğrisini aralıklı temas eğrisinden çıkarın ve konsol yay sabitini (bu durumda 0,1 N/m) kullanarak bunları pN'ye dönüştürün.

5. HS-AFM görüntüleme

1. 10 mM konsantrasyonda bir Mg(_CH3COO)₂ çözeltisi hazırlayın. Bir Hamilton şırınga kullanarak, hazırlanan 10 mM Mg(_CH3COO)₂ çözeltisinin 50 μL'sini konsol tutucunun akışkan kanalına enjekte edin ve konsolu saran bir sıvı damlası oluşturun.
2. Z Controller VI'da Başlat'a tıklayarak konsola kademeli olarak yüzeye yaklaşın. Yüzey algılandığında, Geri Beslemeyi AÇIK konuma getirin ve ORT Kuvvet Eğrileri VI'da etkileşim eğrisinin zirvesini bulun. Uygun izlemeye izin veren en düşük kuvvet ayar noktasını bulun (kırılgan biyo-numunelerin zarar görmesini önlemek için 300 pN'nin altında).
3. Scan VI'daki Tarama Boyutu'nu 800 nm'ye 800 nm'ye ve Çizgi Hızı'nı 100 Hz'e ayarlayın. Yüzey kalitesini kontrol etmek için Scan VI'daki Çerçeve (aşağı) oka tıklayarak yüzeyi tarayın. Herhangi bir kontaminasyon tespit edilirse, devam etmeden önce yüzeyi, konsolu ve/veya konsol tutucuyu temizleyerek sorunu çözün.
4. Taramadan sonra, Z denetleyicisi VI'da Geri Çek'e tıklayarak konsolu yüzeyden geri çekin. Ölü hacim sorunlarını önlemek için tampon çözeltisini bir Hamilton şırınga ile konsol tutucudaki delikten çıkarın.
5. Protokolün 1. bölümünden seyreltilmiş bir DNA 3PS çözeltisi hazırlayın. 50 μL seyreltilmiş DNA 3PS solüsyonunu konsol tutucunun özel kanalına enjekte edin.
6. 5.2-5.3 adımlarını tekrarlayarak, 800 nm'ye 800 nm'lik bir alanı 100 Hz varsayılan hat hızında (256 satır × 256 piksel) tarayarak görüntüleme işlemini başlatın. İlk taramadan sonra, daha fazla veri toplama için Scan VI'daki görüntüleme boyutunu ve hızını belirtilen değerlere ayarlayın.
7. Aksi belirtilmedikçe, numune hasarını/bozulmasını en aza indirmek için görüntüleme süreci boyunca uygun izleme için gereken en düşük seviyede (300 pN'nin altında) Z Denetleyici VI Ayar Noktası kutusundaki uç-numune etkileşiminin giriş kuvveti ayar noktasını tutun. Gerekli tüm numune alanları için bu işlemi tekrarlayın.

6. Görüntü işleme

1. Özelleştirilmiş Pygwy (Python for Gwyddion) toplu işleme kodunu çalıştırmak için ortamı ayarlayın, Python ve gerekli tüm kitaplıkların olduğundan emin olun. Daha fazla bilgi Gwyddion'un web sitesinde bulunabilir:³² sisteme düzgün bir şekilde yüklenmiştir. Bu, kodun sorunsuz çalışmasını ve gerekli işlevlere erişebilmesini sağlar.
2. Özelleştirilmiş Pygwy toplu işleme kodunu açın (istek üzerine sağlanır). Bu, görüntü işleme ve analizi için gereken araçlara ve işlevlere erişim sağlayacaktır.
3. Görüntüler üzerinde yatay medyan çizgi düzeltmesi yaparak görüntü işlemeye başlayın. Bu adım, tarama hatlarında bulunan herhangi bir düzensizliği veya artefaktı ortadan kaldırmayı ve sonraki işleme adımlarının doğru verilere dayanmasını sağlamayı amaçlar. Düzlem arka planını kaldırdıktan sonra, çizgi düzeltmesini uygulayın. Dış etkenlerin neden olduğu istenmeyen izleri veya kusurları ortadan kaldırarak görüntüleri daha da geliştirmek için yara izi gidermeyi kullanın. Bu adım, görüntülerin genel görsel görünümünü iyileştirir.
4. Renk yüksekliği haritasını ayarlayarak görüntülerin görünürlüğünü ve kontrastını artırın. Bu, ilgilenilen özelliklerin net bir şekilde görselleştirilmesini ve görüntülerde öne çıkmasını sağlar.
5. Bir videoda birleştirilmesi gereken işlenmiş görüntüleri seçin. Video için istenen kare hızını belirleyin. Bu durumda, saniyede 7 kare (fps) olarak ayarlayın.
6. Her karenin süresini hesaplayın. İşlenen görüntüleri bir videoda birleştirmek için Fiji'yi (ImageJ) kullanın. Kare hızının ve kare süresinin doğru ayarlandığından emin olun.

Sonuçlar

Bu araştırmada, DNA 3 noktalı yıldız motiflerinin kararlı adalara dinamik montaj süreci, HS-PORT AFM'nin yetenekleri kullanılarak başarılı bir şekilde gözlemlendi. Bu teknik, bu yapıların montajını gerçek zamanlı olarak yakalamamızı sağladı. Şekil 2A,B'de, 100 kHz PORT hızı (200 nm x 100 nm tarama boyutu) için sırasıyla 800 Hz ve 800 Hz çizgi hızlarında net bir görüntü taraması elde ediyoruz. Bu, piksel başına sırasıyla 3,9 ve 1,95 salınım döngüsüne karşılık gelir. Bununla birlikte, piksel başına en az bir salınım döngüsüne izin verecek PORT hızında eşzamanlı artışlar olmadan daha yüksek hızlarda görüntüleme, Şekil 2C'de görülebileceği gibi (piksel başına 0,78 salınım döngüsü) görüntü kalitesini büyük ölçüde azaltacaktır. Görüntüleme hızı, topografya değişim hızı yüzey örnekleme hızında izlenemeyecek kadar hızlı hale geldiğinden, konsolun uygun uç-numune kuvveti kontrolü ile yüzeyi problama hızı ile sınırlıdır.

Yeterince yüksek bir PORT hızı ayarlamanın yanı sıra, PORT eğrilerinin kuvvetleri kontrol etmek için gerekli bilgileri içermesi önemlidir. Özellikle hidrodinamik sürtünme ve düşük algılama bant genişliği, uygulanan kuvveti gizleyebilir. Şekil 3, gürültüyü azaltmak için ortalama 4096 eğri kullanarak numunenin yüzeyinden farklı mesafelerde konsol sapmasını ve uyarma frekansı oranlarını göstermektedir. Şekil 3A'daki (100 kHz PORT hızı için) ve Şekil 3D'deki (500 Hz PORT hızı için) mavi eğriler, konsol yüzeyden uzakta olduğunda ve serbestçe salındığında (bir salınım döngüsü sırasında yüzeye temas etmediğinde) konsol hareketini temsil eder. Kırmızı eğriler, konsol yüzeye yakın salındığında ve aralıklı olarak yüzeye temas ettiğinde ve numuneyi inceleyerek konsol sapmasını gösterir. Gerçek etkileşim eğrisini ve dolayısıyla uç-örnek etkileşimini elde etmek için, sırasıyla Şekil 3B,E'yi elde etmek için mavi eğriyi kırmızı eğriden çıkarırız. Tahribatsız biyo-numune görüntüleme için gerekli olan net bir etkileşim eğrisi örneği Şekil 3B'de gösterilmiştir. Bu konfigürasyon, PORT hızının 100 kHz olduğu Şekil 3C'de gösterilen iyi görüntüleme kalitesine yol açar. Konsol rezonansına yakın uyarma frekansını artırdıkça, bir noktada, konsol, uyarma lazer gücünü yükselttikten sonra yüzeyden ayrılmak için yeterli genlik salınımı gösterse bile geri besleme kontrolü bozulur (Şekil 3E). PORT frekansı konsol rezonans frekansına çok yakınsa, konsol rezonansı, konsol dinamiğinin zaman tepkisini sınırlar. Konsol bükülmesi, bu nedenle artık uç-numune etkileşimini doğru bir şekilde temsil etmemektedir ve elde ettiğimiz etkileşim eğrisi gizlenmiştir. Bu, Şekil 3F'de gösterildiği gibi görüntü kalitesinin düşmesine yol açar.

Şu anda ticari yüksek hızlı AFM konsollarının sınırlayıcı faktörlerinden biri olan daha yüksek frekanslarda³³ azalan çalıştırma verimliliği nedeniyle daha yüksek PORT frekanslarında tehlikeye atılmış bir etkileşim eğrisi de meydana gelebilir. Bu azalma sonunda, uygun görüntülemenin engellendiği roll-off'ta bir eşik seviyesine ulaşır: salınım genliği yüzeyden ayrılmak için yetersiz olabilir ve uç her zaman temas halindedir ve numune yapılarına zarar verir. Daha yüksek PORT oranlarında neden olan genlikteki azalmayı önlemek için, lazer gücünde bir artış araştırdık. Bu etkiyi daha iyi gözlemlemek için daha yüksek lazer güçlerine ulaşabilen bir PORT kafası kullandık. Bir güç ölçer ile ölçtüğümüz uyarma lazerinin lazer gücü, DC ve AC bileşenlerine ayrıldı. Toplam güç, yazılım üzerinde lazer diyot kontrol devresine gönderilen tepeden tepeye voltaj (tepeden tepeye AC girişi) ve DC voltajı (DC ofset girişi) ayarlanarak kontrol edilir. Şekil 4A , artan tepeden tepeye AC girişinden kaynaklanan tepeden tepeye konsol salınım genliğini gösterir. Beklendiği gibi, salınım genliği AC giriş değeri ile iyi bir korelasyon gösterir. Bu tepeden tepeye genliklerin normalde PORT görüntülemede kullanılandan daha yüksek olduğuna dikkat etmek önemlidir. Kırılgan numuneleri görüntülerken, AC genliği 10-30 nm mertebesindedir. Şekil 4B , artan DC ofset girişleri için tepeden tepeye konsol salınım genliğini gösterir. Tepeden tepeye salınım genliği, DC ofset voltaj aralığı üzerinde oldukça sabit kalır. Küçük varyasyonları algılamadaki doğrusal olmayanlara bağlıyoruz. Şekil 4C , artan tepeden tepeye AC'den kaynaklanan AC ve DC lazer güç bileşenlerinin artışını göstermektedir. Şekil 4D , artan DC giriş ofsetinden kaynaklanan AC ve DC lazer güç bileşenlerinin artışını göstermektedir.

Tepeden tepeye AC girişini ve DC ofset girişini artırmanın etkileri, toplam güç ve salınım genliği üzerindeki ilgili etkileri belirlemek için ayrı ayrı test edildi. Lazer gücündeki bir artış, muhtemelen sıcaklık artışı nedeniyle numunenin bozulmasına neden olurken, salınım genliğindeki bir artış, numune⁵ üzerindeki darbe kuvvetini artıracaktır. Yalnızca tepeden tepeye AC girişinin arttırılması, Şekil 4C'de gösterildiği gibi toplam lazer gücü artışı üzerinde daha az etkiye sahip olacak ve Şekil 4A'da gösterildiği gibi ağırlıklı olarak konsol salınım genliğini (ve sonuç olarak darbe kuvvetini) artıracaktır. DC ofset girişinin arttırılması, Şekil 4D'de gösterildiği gibi, numuneyi ısıtan ancak Şekil 4B'de görüldüğü gibi sapma genliği üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahip olacak olan lazer güç çıkışının artışı üzerinde daha büyük bir etkiye sahip olacaktır. Görüntüleme sonuçları Şekil 4E,F'de gösterilmiştir. Şekil 4E, en düşük tepeden tepeye AC girişi (soldaki resim, mavi daire içine alınmış) ve en yüksek tepeden tepeye AC girişi (sağdaki resim, kırmızı daire içine alınmış) için DNA 3PS'yi göstermektedir, bu da muhtemelen daha yüksek kuvvetler yoluyla numune hasarına neden olur. Şekil 4F, yapıların hasar gördüğü en düşük DC ofset girişi (soldaki resim, mavi daire içine alınmış) ve en yüksek DC ofset girişi (sağdaki resim, kırmızı daire içine alınmış) için DNA 3PS'yi sergiler.

Resim 1: HS-AFM kurulumu. (A) AFM'nin tarayıcısı ve tabanı üzerindeki PORT kafası, (i) konsol üzerindeki okunan lazer odağını ayarlamak için düğme, (ii) konsol üzerindeki okunan lazer konumunu ayarlamak için düğme, (iii) lazerin fotodiyot üzerindeki yatay konumunu ayarlamak için düğme, (iv) lazerin fotodiyot üzerindeki dikey konumunu ayarlamak için düğme, ve (v) fototermal tahrik lazerinin konsol üzerindeki konumunu ayarlamak için düğmeler. (B) Numune aşaması ile başın enine kesit görünümünde konsolun yakın çekimi, burada (vi) konsolu tutan yaylı klipstir. Sıvı enjeksiyon kanalı kırmızı ile işaretlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: AC10 ile 100 kHz PORT hızında farklı hat hızlarında görüntülenen DNA 3PS örneği. (A) 100 Hz (piksel başına 3,9 salınım döngüsü), (B) 200 Hz (piksel başına 1,95 salınım döngüsü) ve (C) 500 Hz (piksel başına 0,78 salınım döngüsü). Görüntüler 350 pN veya daha düşük ayar noktalarında çekildi. Ölçek çubuğu 200 nm. Görüntülemeden sonra sapma duyarlılığı elde etmek için bir kuvvet eğrisi alındı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 100 KHz ve 500 kHz PORT hızlarında konsol sapması, etkileşim eğrisi ve görüntü kalitesi. (A) Konsol sapması (konsol serbest salınımı mavi renkte yüzeye yakın ancak yüzeye değmiyor ve konsol yüzeyle aralıklı olarak kırmızı temas halindeyken konsol salınımı), (B) etkileşim eğrisi ve (C) 100 kHz PORT hızı için ilgili görüntü kalitesi. (D) Konsol sapması (mavi renkte yüzeye yakın ancak yüzeye temas etmeyen konsol serbest salınımı ve konsol yüzeyle aralıklı olarak temas halindeyken kırmızı renkte salınması), (E) etkileşim eğrisi ve (F) 500 kHz PORT hızı için ilgili görüntü kalitesi. Görüntüler 100 Hz. Ölçek çubuğu 200 nm çizgi hızında çekildi. Görüntülemeden sonra sapma duyarlılığı elde etmek için bir kuvvet eğrisi alındı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Tepeden tepeye AC giriş voltajının etkisi DC ofset giriş voltajı. (A) tepeden tepeye AC giriş voltajını ve (B) DC ofset giriş voltajını artırmanın konsolun tepeden tepeye salınımı üzerindeki etkisi. (C) tepeden tepeye AC giriş voltajını ve (D) DC ofset giriş voltajını artırmanın AC ve DC lazer gücü üzerindeki etkisi. Minimum (mavi daire içine alınmış) ve maksimum (kırmızı daire içine alınmış) görüntüleme kalitesi: (E) tepeden tepeye AC giriş voltajı ve (F) DC ofset giriş voltajı. Tepeden tepeye AC giriş voltajı arttırılırken, DC ofset giriş voltajı 600 mV'de tutuldu. DC ofset giriş voltajı arttırılırken, tepeden tepeye AC giriş voltajı 200 mV'de tutuldu. Yüksek güçlü yapılandırma için numune bütünlüğünden ödün verilir. PORT hızı 100 kHz'de ve hat hızı 100 Hz'de tutuldu. Ölçek çubuğu 200 nm. Görüntülemeden sonra sapma duyarlılığı elde etmek için bir kuvvet eğrisi alındı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Hassas biyolojik numuneleri görüntülerken, AFM'deki rezonans dışı kılavuz çekme görüntüleme modları, uç-numune etkileşim kuvvetlerini¹⁰ doğrudan kontrol edebildikleri için özellikle kullanışlıdır. Bunlar arasında PORT modu, ulaşabileceği daha yüksek salınım oranları nedeniyle öne çıkıyor ve bu da daha yüksek tarama hızlarına olanak tanıyor. PORT, konsolu doğrudan ve yalnızca bir lazerle çalıştırdığından, özellikle yüksek rezonans frekanslarına sahip ultra kısa konsollar kullanıldığında, geleneksel rezonans dışı dokunma modlarından çok daha yüksek frekanslarda uyarılmaya izin verir⁵. Bununla birlikte, HS-AFM için PORT kullanırken, iyi görüntüleme kalitesi elde etmek için görüntüleme parametrelerine dikkat edilmelidir.

Şekil 2'de gösterildiği gibi, aynı anda PORT oranlarını yükseltmeden tarama hızlarını artırmak, düşük kaliteli görüntülemeye yol açacaktır. İlk olarak, piksel başına birden az salınım döngüsüyle sonuçlanan PORT hızları, görüntü kalitesini önemli ölçüde azaltacaktır. Görüntüleme hızı, doğal olarak, konsolun uygun uç-numune kuvveti kontrolü ile yüzeyi problama hızı ile sınırlıdır. PORT'ta, geri besleme kontrolü her salınım döngüsünün³⁴ sonunda ayrı ayrı hareket eder. Bu sınırlı örnekleme hızı, geri besleme döngüsünde saf bir gecikmeye neden olur ve böylece elde edilebilir geri besleme bant genişliğini sınırlar. Topografya değişim hızı, PORT örnekleme hızında izlenemeyecek kadar hızlı hale gelirse, topografya artık geri besleme döngüsü tarafından doğru bir şekilde algılanamaz veya izlenemez. Bu nedenle, numuneyi daha yüksek yüzey hızlarında aslına uygun olarak çözmek için PORT hızının artırılması gerekir. Bununla birlikte, konsolun rezonans frekansı, kullanabileceğimiz maksimum PORT oranını içsel olarak sınırlar. PORT hızı, konsolun rezonans frekansına yakınsa, optik kol yöntemiyle ölçülen sapma artık uç-numune kuvvetlerini aslına uygun olarak temsil etmemektedir. Uygun bir uç-numune etkileşim eğrisi elde etmek için, hem konsolun mekanik bant genişliği hem de AFM sisteminin elektrik bant genişliği, PORT frekansının birkaç katı olan sapma eğrisinin Fourier bileşenlerini tespit edecek kadar büyük olmalıdır. Bu bant genişliklerinden herhangi biri çok düşükse, etkileşim eğrisi artık tek taraflı kesmeyi göstermez (Şekil 3A), bunun yerine gerçek uç numune etkileşimini gizleyen sinüzoidal bir davranışı (Şekil 3D) gösterir (Şekil 3E). Bu, görüntülemede zayıf kuvvet kontrolüne yol açar (Şekil 3F). Bu nedenle, yüksek rezonans frekansı sergileyen ve aynı zamanda düşük yay sabitlerine sahip olan daha küçük konsolların bile PORT hızını daha da artırması gerekir. Bu kadar yüksek PORT hızları ve tarama hızları, gerekli yüksek bant genişliklerine ve optimize edilmiş dijital sinyal işleme stratejilerine sahip dikkatli bir yazılım ve elektronik tasarım gerektiren AFM elektroniği için bir zorluk teşkil etmektedir.

PORT'un kılavuz çekme modu yüksek hızlı AFM'ye kıyasla avantajlarından biri, yüzey örnekleme hızının ayarlanabilmesidir. Kılavuz çekme modu AFM'de, yüzey örnekleme hızı, konsolun rezonans frekansı tarafından verilir. Konsol rezonans frekansının çok altındaki PORT'ta çalışırken, her yüzey örneklemesinin geçerli bir veri noktası sağladığını varsayarız. Bu nedenle, PORT algılama bant genişliği, Nyquist frekansı tarafından PORT hızının yarısında verilir. Dokunma modu durumunda, algılama bant genişliği f₀/2Q³⁵ ile verilir. PORT'taki son gelişmelerle birlikte PORT hızını kademeli olarak rezonans frekansına kadar artırabiliyoruz. Bu durumda, PORT ve kılavuz çekme modu neredeyse aynı hale gelir, çünkü bu frekanslarda PORT, Şekil 3E'de gösterildiği gibi konsoldan uca numune etkileşimini doğru bir şekilde algılayamaz. Rezonans frekansında çalışırken, PORT'un kılavuz çekme moduna kıyasla daha büyük salınım genliği bir dezavantaj haline gelir. Bu nedenle, PORT görüntüleme hızını artırma hedefi, rezonans frekansının yeterince altında PORT hızıyla çalışmayı sürdürmek için konsol rezonans frekansını artırmaya devam etmektir.

Daha hızlı tarama hızları sağlamak için PORT hızını artırdıkça, fototermal konsol uyarımına özgü başka bir sorunla karşı karşıya kalacağız: daha yüksek frekanslarda, fototermal uyarma verimliliğindeki bir azalma nedeniyle salınım genliği azalır, sonunda lazer gücünü artırmamız gereken noktaya kadar azalır, bu da numunenin sıcaklığının yükselmesine neden olur. PORT hızının arttırılması, numune hasarına yol açan azaltılmış çalıştırma verimliliğini telafi etmek için daha yüksek bir uyarma gücü gerektiğinden, lazer gücünün ve salınım genliğinin dengelenmesini engelleyecektir. Daha yüksek lazer gücü seviyelerinde, mümkün olan en düşük kuvvet ayar noktasını kullanmamıza rağmen ( Şekil 4E, F'deki sağ paneller) numuneyi artık gözlemleyemedik. Konsol salınım genliğini nasıl artıracağımız ve lazer gücünü nasıl artıracağımız konusunda dikkatli olmamız gerekiyor. Lazer gücünü artırmak için ayarlayabileceğimiz iki parametre vardır. İlk olarak, iletilen lazer güç yoğunluğunu sinüzoidal olarak değiştirmek için lazer diyotuna gönderilen sinüzoidal sinyali kontrol eden tepeden tepeye AC girişi. İkincisi, lazer diyotu iletim rejiminde ve dolayısıyla lazerde tutan DC ofset giriş voltajı. Lazere gönderilen AC sinyalinin genliğindeki bir artış, lazer eşiğini geçmemek için DC voltajında bir artış gerektirdiğinden, birincinin artması ile ikincisinin artması gerekir. Bununla birlikte, Şekil 4A'da gösterildiği gibi, yalnızca tepeden tepeye AC girişi, konsol salınım genliğini etkiler. DC gerilimleri, salınım genliklerinde değişikliklere yol açmaz (Şekil 4B). Bu nedenle, sinüzoidal çalıştırma istiyorsak, DC voltajını, diyot lazerin lazer rejiminde olmasını sağlayan minimum voltaja ayarlamamız gerekir. Alternatif olarak, tam bir sinüzoidal sürücü⁵ kullanmak yerine her salınım döngüsü sırasında lazer diyotu periyodik olarak kapatıp tekrar açarak ısınmayı en aza indirebiliriz. Fototermal uyarmada konsolu harekete geçirmek için gereken sıcaklık salınımına, döngünün bir kısmı sırasında lazerin kapatılmasıyla daha verimli bir şekilde ulaşılabilir, bu da konsolun sıcaklığını düşürür ve bu nedenle konsol bükülmesine yol açar. Bu, konsola ve numuneye iletilen enerjiyi en aza indirecek ve böylece çevredeki toplam sıcaklığı düşürerek numune ısı hasarını azaltacaktır.

Bu çalışmada, HS-PORT'ta ısı numunesi hasarını önleyen görüntüleme parametrelerinin sınırlarını ve uygun geri besleme kontrolünü gösteriyoruz. Bu sınırların anlaşılması, PORT AFM yönteminin mevcut durumunun en iyi şekilde kullanılmasına yardımcı olacak, uç-örnek etkileşimi üzerinde daha iyi kontrol sağlayacak ve bu ölçümlerdeki DNA motiflerinin doğal durumunun korunmasına yardımcı olacaktır. İyi geri besleme kontrolü ile birlikte ulaşılan yüksek tarama hızları sayesinde PORT, DNA 3PS'nin ve etkileşimlerinin net ve ayrıntılı görüntülerini elde etmemizi sağladı ^7,8,36. Artan görüntüleme hızı ve doğrudan uç numune kuvveti kontrolü²³ sayesinde, biyomoleküler düzeneklerin büyümesini ve yeniden düzenlenmesini daha hassas bir şekilde izleyebiliyor ve ayrıntılı dinamikleri gözlemleyebiliyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
AC10DS	Olympus	BL-AC10FS-A2	Üretimi Durduruldu
Biometra Kompakt XS/S	Biometra GmbH	846-025-199	Elektroforez ve nbsp; ünitesi
Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	tavlama için termodöngüleyici
Özel AFM kurulumu	Biyo-Nano Enstrümantasyon Laboratuvarı, Fakülteler Arası Biyomühendislik Enstitüsü, Mühendislik Fakültesi, Ecole Polytechnique Fé dé rale Lozan		Biyo-Nano Enstrümantasyon Laboratuvarı aracılığıyla elde edilebilir
EDTA	ITW Reaktifleri	A5097	Tavlama tamponunda
Lazer Güç Ölçer		Thorlabs PM100D	Dijital El Optik  Güç ve Enerji Ölçer Konsolu
Canlı 3AP Güç Kaynağı, MP-310	Büyük Bilim	MP-310	Elektroforez Güç
Kaynağı MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	Tavlama tamponunda
TBE	Thermo Scientific	327330010	Elektroforez için çalışan tampon
TRIS	Bio-Rad	1610719	Tavlama tamponunda