Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fototermal Rezonans Kılavuz Çekme Kullanılarak DNA Üç Köşeli Yıldız Motifi Kendi Kendine Montajın Yüksek Hızlı Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntülemesi

1.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66470

⸱

22 Mart 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne, 2Programmable Biomaterials Laboratory, Institute of Materials, School of Engineering, Ecole Poly-technique Fédérale Lausanne

Bu makalede

Özet

Burada, görüntüleme parametrelerini optimize ettiğimiz, sistem sınırlarını belirlediğimiz ve üç noktalı yıldız DNA motifi montajını görüntülemedeki potansiyel iyileştirmeleri araştırdığımız fototermal kapalı rezonans dokunma (PORT) ile biyomoleküler etkileşimleri gözlemlemek için görüntüleme protokolünü gösteriyoruz.

Özet

Yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobu (HS-AFM), sıvı ortamlarda fizyolojik koşullar altında görüntüleme yeteneği nedeniyle tek moleküllü biyolojik süreçleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için popüler bir moleküler görüntüleme tekniğidir. Fototermal kapalı rezonans kılavuz çekme (PORT) modu, konsolu kontrollü bir şekilde salmak için bir sürücü lazeri kullanır. Bu doğrudan konsol çalıştırma, MHz aralığında etkilidir. Rezonans genliği yerine zaman alanı kuvvet eğrisi üzerinde geri besleme döngüsünün çalıştırılmasıyla birleştirilen PORT, uç örnekleme kuvvetleri üzerinde doğrudan kontrol ile saniyede on kareye kadar yüksek hızlı görüntüleme sağlar. PORT'un hassas montaj dinamiklerinin görüntülenmesini ve biyomoleküller tarafından oluşturulan modellerin hassas bir şekilde izlenmesini sağladığı gösterilmiştir. Şimdiye kadar, teknik, bu çalışmada gösterilen DNA 3 köşeli yıldız motifi montaj desenleri de dahil olmak üzere çeşitli dinamik in vitro çalışmalar için kullanılmıştır. Bu protokol, bir dizi deney aracılığıyla, HS-PORT AFM görüntüleme sisteminin optimal görüntüleme parametre ayarlarını ve nihai sınırlarını ve bunların biyomoleküler montaj süreçlerini nasıl etkilediğini sistematik olarak tanımlar. Ek olarak, özellikle tarama küçük alanlarla sınırlı olduğunda, sürücü lazerinin numune ve çevresindeki sıvı üzerinde neden olduğu potansiyel istenmeyen termal etkileri araştırır. Bu bulgular, karmaşık biyolojik sistemlerin incelenmesinde PORT modunun uygulamasının ilerlemesini sağlayacak değerli bilgiler sağlar.

Giriş

Yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobu (HS-AFM) hızla büyüyen bir görüntüleme tekniğidir 1,2,3,4. Araştırmacıların biyomoleküler etkileşimleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmelerine olanak tanıyan hızlarda çalışır 5,6,7,8,9. Fototermal kapalı rezonans kılavuz çekme (PORT), tepe kuvveti dokunma10,11, darbeli kuvvet modu12,13 veya atlama modu14'e benzer bir rezonans dışı görüntüleme modudur. Bununla birlikte, tarayıcıyı dikey olarak salmak yerine, PORT, konsola odaklanan bir uyarma lazeri aracılığıyla (genellikle sıkıştırma noktasına yakın) yalnızca konsolu dikey olarak salınır. Konsol, bimorf etkisi nedeniyle deforme olur: güç modülasyonlu bir uyarma lazeri, konsolun ve kaplama malzemelerinin15 farklı termal genleşme katsayıları nedeniyle bükülen kaplanmış konsolu periyodik olarak ısıtır. Konsol ve numune ısıtması, tam bir sinüzoidal tahrik5 kullanmak yerine, her salınım döngüsü sırasında periyodik olarak kapatılıp tekrar açılan bir tahrik lazeri kullanılarak en aza indirilebilir.

DNA, birkaç yıldır biyolojik olarak ilgili, yapısal olarak ilginç ve biyokimyasal olarak yararlı motifler oluşturmak için kullanılmıştır 16,17,18,19,20. Ek olarak, DNA yapılarının AFM görüntüleme kalitesini21 karakterize etmek ve yüksek hızlı AFM22'nin uç etkisini değerlendirmek için ideal olarak uygun olduğu kanıtlanmıştır. Künt uçlu DNA üç noktalı yıldızlar (3PS), aksi takdirde karmaşık biyolojik sistemlerde benzer şekilde yapılandırılmış moleküllerin supramoleküler organizasyonunu araştırmak için programlanabilir bir model sistem olarak pratik hale geldi19. Daha önce, künt uçlu trimerik DNA monomerleri tarafından oluşturulan kafeslerin kendi kendine montajı HS-AFM23 ile izleniyordu. Sonunda, bunlar altıgen düzende büyük ağlar halinde düzenlenir. Burada, DNA 3 noktalı yıldızların19 kendi kendine birleşmesi, kendi kendine birleşmeyi ve düzeltme mekanizmalarını24 izlemek için yeterince hızlı tarama hızlarında PORT tekniği ile görüntülenirken, sürecin veya numune hasarının minimum düzeyde bozulmasını sağlar. Herhangi bir HS-AFM modunda olduğu gibi, ulaşılabilir görüntüleme kalitesi, görüntüleme hızı ve numunenin istenmeyen rahatsızlığı arasında bir denge vardır. Doğru uzlaşmayı seçerek, supramoleküler düzeneklerin kendi kendine organizasyon modellerini daha iyi anlayabiliriz. Bu nedenle bu protokol, PORT'a özgü parametreleri optimize etmek için bir model sistem olarak DNA 3PS ile benzer bir kurulum kullanacaktır. Bu, numune hasarını en aza indirirken yeterince büyük tarama boyutlarında yüksek görüntüleme hızlarında çalışmaya izin verecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Örnek ve tamponlar

NOT: Bu çalışmada kullanılan DNA karosu, Purdue Üniversitesi'ndeki Mao laboratuvarında geliştirilen 3 köşeli yıldız motifidir19,25. Bu çalışmada kullanılan tüm oligonükleotidler, gerekli malzemeleri ve reaktifleri toplayın.

  1. Tek sarmallı DNA'ları (ssDNA'lar) 1: 3: 3 molar oranda (S1 0.6 μM, S2 için 1.8 μM ve S3 için 1.8 μM) tavlama tamponunda (5 mM TRIS, 1 mM EDTA ve 10 mM MgAc2) karıştırın. DNA motifinin nihai konsantrasyonu 0.6 μM (49 ng/μL, 3PS'lik moleküler ağırlık 82020.3 g/mol) olmalıdır.
  2. DNA solüsyonunu ısıya dayanıklı bir kaba koyun ve 80 °C'ye ısıtın. DNA çözeltisini 4 saatlik bir süre boyunca 80 ° C'den 20 ° C'ye yavaşça soğutun. Bu tavlama işlemi, ssDNA oligonükleotidlerinin istenen çift sarmallı DNA motifini oluşturmasına yardımcı olur.
  3. Saflaştırma için, fazla ssDNA'ları ve istenmeyen yan ürünleri çıkarmak için tavlanmış DNA solüsyonunu %3'lük bir agaroz jel üzerine yükleyin. % 3'lük jeli yaklaşık 60 V'ta çalıştırın. 0,5x Tris-Borat-EDTA (TBE) ve 10 mM Mg (CH3COO)2 içeren bir çalışma tamponunda 2,5 saat.
  4. DNA motifini içeren jel üzerindeki bandı tanımlayın ve bulun. Bandın boyutuna bağlı olarak belirli bir konuma taşındığından emin olun.
  5. DNA motifini içeren bandı jelden dikkatlice çıkarın. Eksize edilen jel fragmanından DNA motifini, bir jel ekstraksiyon döndürme kolonuna yerleştirerek ve 3.000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyerek çıkarın.
  6. Ekstrakte edilen DNA motifindeki tamponu, bir santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak tavlama tamponu ile değiştirin. Konsantre çözelti 100 μL'den az olana kadar oda sıcaklığında (veya daha düşük) 3000 x g'da santrifüjleyin. Ardından, 300 μL tavlama tamponu ekleyin ve tamponun değiştirildiğinden emin olmak için bu adımı iki kez tekrarlayın.
  7. Görüntüleme amacıyla DNA motifini 6 nM'ye seyreltin. Konsantrasyonu doğru bir şekilde belirlemek ve ayarlamak için bir spektrofotometre veya diğer uygun yöntemler kullanın. DNA motifi artık görüntüleme için hazırdır.
    NOT: Protokoldeki tüm tamponlar pH 8.0'dır. İlgili üç bant için sıra bilgisi aşağıdaki gibidir:
    S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
    AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
    S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
    CGGTAACG (Türkçe)
    S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. Konsol ucu büyümesi

  1. SEM konsol tutucusuna konsol montajı: Konsolların temiz olduğundan ve herhangi bir kirletici madde içermediğinden emin olun. Konsolları SEM sistemi ile uyumlu uygun bir tutucuya monte edin. Özel yapım konsol tutucu tasarımı istek üzerine paylaşılabilir.
  2. Gaz enjeksiyonu: Yeni ucu büyütmek için gaz enjeksiyon sisteminde kullanılacak öncü gazı (örneğin, amorf karbon uçları için fenantren C14H10 öncüsü) ısıtın. Vakum 10-5 mbar'ın altına düşer düşmez, nozul hattında istenmeyen kalıntı hava olmadığından emin olmak için gaz enjeksiyon hattını 2 saniye boyunca 10 kez boşaltın (bu, tabanca haznesine giden valf kapalıyken yapılmalıdır).
  3. Uç konumu ayarı: Konsolun ucunu bulmak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanın. Konsol tutucuyu, yüzeye göre AFM konsol tutucusuna yerleştirildiğinde konsolun sunacağı açıya eşdeğer bir açıya (örn. bu durumda 11°) eğin, böylece büyüyen uç görüntüleme sırasında yüzeye dik olacaktır. Keskin bir karbon nano ucun yetiştirileceği konsol ucunun net bir görünümünü elde etmek için SEM'in konumunu ve odağını ayarlayın.
  4. Odaklanmış elektron demetine bağlı biriktirme (FEBID):
    1. Işın akımı (I) ve hızlanma voltajı (V), çalışma mesafesi (WD), büyütme, maruz kalan şekil, doz/biriktirme süresi ve bekleme süresi gibi seçilen yazılımda (bu durumda SmartFIB) biriktirme parametrelerini ayarlayın. AFM görüntüleme için iyi mekanik özellikler sunan, yaklaşık 130 nm uzunluklara ve 2-4 nm aralığında yarıçaplara yol açan amorf karbon uçları büyütmek için aşağıdaki parametreler kullanıldı:
      Noktayı/noktayı pozlanan şekil olarak seç
      WD = 5 mm
      I = 78 pA ve V = 5 kV
      Bekleme süresi = 1 μs
      Doz = 0.05 nC ve biriktirme süresi = 0.64 s
      Büyütme = 20000x
    2. Elektron ışınını bir noktada konsol ucuna ışınlayarak ve aynı anda öncü gazı enjekte ederek ucu büyütmek için biriktirme işlemine başlayın ve biriktirme tamamlandığında gazı kapatın. Bu durumda SmartFIB yazılımı, yukarıda belirtilen tarifi ayarladıktan sonra bunu otomatik olarak gerçekleştirir.
  5. Büyüme sonrası analiz: Yeni büyüyen ucu incelemek ve kalitesinden ve özelliklerinden (uç yarıçapı ve uzunluğu) emin olmak için büyüme sonrası SEM görüntüleme yapın. SEM görüntüleme sırasında yeniden birikmeyi önlemek için tüm öncü gazın dışarı pompalandığından emin olmak için uç büyümesinden sonra 1-2 dakika bekleyin. Numune tutucuyu SEM odasından çıkarın.
  6. Konsol geri dönüşümü: SEM sisteminde ayrıca birleşik bir odaklanmış iyon kirişi (FIB) takılıysa, daha önce büyümüş hasarlı veya kirli bir ucu, düşük FIB akımları (örneğin, konsol hasarını önlemek için 1 pA) kullanarak FIB sistemi ile frezeleyerek çıkarın. Uç çökmesini önlemek için uç sökme işlemini, uç ucundan tabana kadar enine kesit şeklinde frezeleyerek gerçekleştirin. Bu, yeni bir tane yeniden büyütmeye izin verecektir.

3. HS-AFM donanımı

  1. Görüntüleme kurulumu, özel yapım PORT kafası5, 26 (Şekil 1A), üzerinde mika bulunan bir örnek disk bulunan yüksek hızlı tarayıcı26 , uyumlu kontrolör27, yüksek hızlı görüntüleme için gereken yüksek bant genişliğine sahip yüksek voltaj amplifikatörü, AFM tabanı ve daha önce bahsedilen ekipmanı27 kontrol etmek için gerekli yazılıma sahip PC'den oluşur.
    NOT: Bu durumda, bunlar, EPFL27, 28'deki Biyo- ve Nano- Enstrümantasyon Laboratuvarı'ndan planları alınabilecek açık kaynaklı bileşenlerdir. PORT kafası ve kontrolörün29 nasıl oluşturulacağına dair atölye çalışmalarına katılmak ve LabView tabanlı yazılımı indirmek ve kullanmak da mümkündür.
  2. Ultra kısa bir konsolu (örn. AC10DS veya eşdeğeri) cımbız kullanarak konsol tutucusundaki yaylı klipsin altına dikkatlice yerleştirin. Konsol çipinin sabit ve sağlam olduğundan emin olun.
  3. Şekil 1B'de gösterildiği gibi sol sıvı erişim portundan bir şırınga kullanarak 50 μL sıvı ekleyin. Uyarma lazeri hala kapalıyken, Şekil 1A'da gösterilen AFM kafasındaki üç özel düğmeyi kullanarak okuma lazerini konsol üzerinde hizalayın. Bunu, toplamı en üst düzeye çıkarırken konsol gölgesini beyaz bir kağıt üzerinde gözlemleyerek yapın (gölge yöntemi). Ardından, iki özel düğmeyi kullanarak lazer noktasını fotodiyot üzerinde ortalayın.
  4. Uyarma VI'daki Uyarma Etkinleştirme kutusunu işaretleyerek sürücü lazerini açın ve hizalayın, böylece konsolu harekete geçirir ve salınır. Bağlı bir osiloskop üzerinde konsol uyarma sinyalini ve konsol sapma sinyalini gösterin. Sapma salınımı çok düşükse (veya yoksa), tahrik lazeri konsoldan çok uzakta olabilir. Bu durumda, gölge yöntemini kullanın ve daha kolay hizalama için saptırma lazerini kapatın. Şekil 1A'da gösterilen sürücü lazer ayar düğmelerini kullanarak salınım genliğini en üst düzeye çıkarın.
  5. PORT'taki konsol salınım genliğini ayarlamak için, yazılımın ilgili kontrolüne, Uyarma VI'da lazer diyot kontrol devresine (bundan böyle tepeden tepeye AC girişi) gönderilen tepeden tepeye voltajı girin. Lazer diyotu iletim rejiminde tutmak ve dolayısıyla lazer oluşturmak için, lazer diyot kontrol devresine (bundan böyle DC ofset girişi) bir DC voltajı ekleyin, bu da Uyarma VI'daki bir konfigürasyon kutusundan yapılır. Her ikisi de bir lazer güç ölçer ile ölçülebilen ve konsol salınım genliğini ayarlamak için kullanılan lazer gücünü de etkileyecektir.
  6. Konsolun rezonans frekansının altında olması gereken, konsola uygulanabilecek maksimum fototermal uyarma frekansını belirleyin. Rezonans frekansını bir termal ayar veya bir frekans taraması ile belirleyin. Sıvılarda rezonans frekansı yaklaşık 400 kHz (havada 1 MHz)30 olan bu çalışmada kullanılan konsollar (AC10DS), 300 kHz'in altında yarı statik bir eğilme bölgesine sahiptir5. Bu nedenle, bu sınırın altındaki (yaklaşık 100-200 kHz) PORT frekansları kullanılmalıdır.
  7. PORT hızı ve tarama hızı için görüntüleme parametrelerini ve ayarlarını sırasıyla Uyarma ve Tarama Vis'inde istenen değerlere ayarlayın (bu makalede kullanılan parametreler şekil açıklamalarında belirtilmiştir). Kurulum ve görüntüleme parametreleri yapılandırıldıktan sonra, moleküler etkileşimleri gözlemlemek ve izlemek için gerekli görüntüleme deneylerini gerçekleştirin.
    NOT: AC10DS konsolları artık satılmadığından, eşdeğeri mevcut olana kadar Fastscan D veya BioLever31 gibi bir alternatifin kullanılması gerekebilir.

4. Uygun etkileşim eğrilerinin elde edilmesi

  1. İlk olarak, s'ye yaklaşınample temas modunda Z-denetleyici VI'da Başlat'a tıklayarak Temas Moduna ayarlayın.
    1. Bu modda, AFM ucu numune ile doğrudan temas eder. Yüzeye ulaşıldığında, konsol sapma hassasiyeti kalibrasyonunu elde etmek için Ramp VI'da bir kuvvete karşı mesafe eğrisi gerçekleştirin.
    2. Ayrıca, bir interferometre ile elde edilen konsol sağlayıcı spesifikasyonlarından (daha az doğru bir şekilde) veya sapma hassasiyeti kalibrasyonundan sonra termal ayar tabanlı bir kalibrasyon yoluyla konsol yay sabitini tahmin edin. Doğru bir uç numunesi kuvvet kontrolü için hassas bir konsol kalibrasyonu şarttır.
  2. Z denetleyici VI'da Yukarı'ya tıklayarak ucun yüzeye ulaşamadığı yüzeyden Z-piezo'yu tamamen geri çektikten sonra, Z denetleyici VI'da PORT moduna geçin ve Uyarma VI onay kutusunda uyarma lazerini açın. Başlamak için, PORT modunu, bu deneysel durumda bir AC10DS konsol kullanarak 100 kHz olan Uyarma VI'da istenen frekansta çalışacak şekilde ayarlayın.
  3. Konsolsuz salınımı yakın ancak yüzeye değmeyecek şekilde kaydedin. Ardından, kaydetmek için Z kontrol cihazındaki Geri Bildirimi yüzeyle temas edecek şekilde AÇIN ve konsol yüzeyle aralıklı olarak temas ettiğinde, her ikisi de nanometre cinsinden olmak üzere konsolun salınımını elde etmek için Düzelt'e tıklayın. Gerçek etkileşim eğrisini elde etmek için serbest salınım eğrisini aralıklı temas eğrisinden çıkarın ve konsol yay sabitini (bu durumda 0,1 N/m) kullanarak bunları pN'ye dönüştürün.

5. HS-AFM görüntüleme

  1. 10 mM konsantrasyonda bir Mg(CH3COO)2 çözeltisi hazırlayın. Bir Hamilton şırınga kullanarak, hazırlanan 10 mM Mg(CH3COO)2 çözeltisinin 50 μL'sini konsol tutucunun akışkan kanalına enjekte edin ve konsolu saran bir sıvı damlası oluşturun.
  2. Z Controller VI'da Başlat'a tıklayarak konsola kademeli olarak yüzeye yaklaşın. Yüzey algılandığında, Geri Beslemeyi AÇIK konuma getirin ve ORT Kuvvet Eğrileri VI'da etkileşim eğrisinin zirvesini bulun. Uygun izlemeye izin veren en düşük kuvvet ayar noktasını bulun (kırılgan biyo-numunelerin zarar görmesini önlemek için 300 pN'nin altında).
  3. Scan VI'daki Tarama Boyutu'nu 800 nm'ye 800 nm'ye ve Çizgi Hızı'nı 100 Hz'e ayarlayın. Yüzey kalitesini kontrol etmek için Scan VI'daki Çerçeve (aşağı) oka tıklayarak yüzeyi tarayın. Herhangi bir kontaminasyon tespit edilirse, devam etmeden önce yüzeyi, konsolu ve/veya konsol tutucuyu temizleyerek sorunu çözün.
  4. Taramadan sonra, Z denetleyicisi VI'da Geri Çek'e tıklayarak konsolu yüzeyden geri çekin. Ölü hacim sorunlarını önlemek için tampon çözeltisini bir Hamilton şırınga ile konsol tutucudaki delikten çıkarın.
  5. Protokolün 1. bölümünden seyreltilmiş bir DNA 3PS çözeltisi hazırlayın. 50 μL seyreltilmiş DNA 3PS solüsyonunu konsol tutucunun özel kanalına enjekte edin.
  6. 5.2-5.3 adımlarını tekrarlayarak, 800 nm'ye 800 nm'lik bir alanı 100 Hz varsayılan hat hızında (256 satır × 256 piksel) tarayarak görüntüleme işlemini başlatın. İlk taramadan sonra, daha fazla veri toplama için Scan VI'daki görüntüleme boyutunu ve hızını belirtilen değerlere ayarlayın.
  7. Aksi belirtilmedikçe, numune hasarını/bozulmasını en aza indirmek için görüntüleme süreci boyunca uygun izleme için gereken en düşük seviyede (300 pN'nin altında) Z Denetleyici VI Ayar Noktası kutusundaki uç-numune etkileşiminin giriş kuvveti ayar noktasını tutun. Gerekli tüm numune alanları için bu işlemi tekrarlayın.

6. Görüntü işleme

  1. Özelleştirilmiş Pygwy (Python for Gwyddion) toplu işleme kodunu çalıştırmak için ortamı ayarlayın, Python ve gerekli tüm kitaplıkların olduğundan emin olun. Daha fazla bilgi Gwyddion'un web sitesinde bulunabilir:32 sisteme düzgün bir şekilde yüklenmiştir. Bu, kodun sorunsuz çalışmasını ve gerekli işlevlere erişebilmesini sağlar.
  2. Özelleştirilmiş Pygwy toplu işleme kodunu açın (istek üzerine sağlanır). Bu, görüntü işleme ve analizi için gereken araçlara ve işlevlere erişim sağlayacaktır.
  3. Görüntüler üzerinde yatay medyan çizgi düzeltmesi yaparak görüntü işlemeye başlayın. Bu adım, tarama hatlarında bulunan herhangi bir düzensizliği veya artefaktı ortadan kaldırmayı ve sonraki işleme adımlarının doğru verilere dayanmasını sağlamayı amaçlar. Düzlem arka planını kaldırdıktan sonra, çizgi düzeltmesini uygulayın. Dış etkenlerin neden olduğu istenmeyen izleri veya kusurları ortadan kaldırarak görüntüleri daha da geliştirmek için yara izi gidermeyi kullanın. Bu adım, görüntülerin genel görsel görünümünü iyileştirir.
  4. Renk yüksekliği haritasını ayarlayarak görüntülerin görünürlüğünü ve kontrastını artırın. Bu, ilgilenilen özelliklerin net bir şekilde görselleştirilmesini ve görüntülerde öne çıkmasını sağlar.
  5. Bir videoda birleştirilmesi gereken işlenmiş görüntüleri seçin. Video için istenen kare hızını belirleyin. Bu durumda, saniyede 7 kare (fps) olarak ayarlayın.
  6. Her karenin süresini hesaplayın. İşlenen görüntüleri bir videoda birleştirmek için Fiji'yi (ImageJ) kullanın. Kare hızının ve kare süresinin doğru ayarlandığından emin olun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu araştırmada, DNA 3 noktalı yıldız motiflerinin kararlı adalara dinamik montaj süreci, HS-PORT AFM'nin yetenekleri kullanılarak başarılı bir şekilde gözlemlendi. Bu teknik, bu yapıların montajını gerçek zamanlı olarak yakalamamızı sağladı. Şekil 2A,B'de, 100 kHz PORT hızı (200 nm x 100 nm tarama boyutu) için sırasıyla 800 Hz ve 800 Hz çizgi hızlarında net bir görüntü taraması elde ediyoruz. Bu, piksel başına sırasıyla 3,9 ve 1,95 salınım döngüsüne karşılık gelir. Bununla b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hassas biyolojik numuneleri görüntülerken, AFM'deki rezonans dışı kılavuz çekme görüntüleme modları, uç-numune etkileşim kuvvetlerini10 doğrudan kontrol edebildikleri için özellikle kullanışlıdır. Bunlar arasında PORT modu, ulaşabileceği daha yüksek salınım oranları nedeniyle öne çıkıyor ve bu da daha yüksek tarama hızlarına olanak tanıyor. PORT, konsolu doğrudan ve yalnızca bir lazerle çalıştırdığından, özellikle yüksek rezonans frekanslarına sahip ultra kısa kon...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok

Teşekkürler

Yazarlar, görüntü serisi işleme için Python betiğini programlamaya yardım ettiği için Raphael Zingg'e teşekkür eder. GEF, H2020 - UE Araştırma ve Yenilik Çerçeve Programı'ndan (2014-2020) fon aldı; ERC-2017-CoG; Hücre İçi; Proje numarası 773091. VC, bu projenin Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından Marie Skłodowska-Curie hibe sözleşmesi No. 754354 kapsamında fon aldığını kabul eder. Bu araştırma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından hibe 200021_182562 desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AC10DSOlympusBL-AC10FS-A2Üretimi Durduruldu 
Biometra Kompakt XS/SBiometra GmbH846-025-199 Elektroforez ve nbsp; ünitesi
Biometra TRIOBiometra GmbH207072Xtavlama için termodöngüleyici
Özel AFM kurulumuBiyo-Nano Enstrümantasyon Laboratuvarı, Fakülteler Arası Biyomühendislik Enstitüsü, Mühendislik Fakültesi, Ecole Polytechnique Fé dé rale LozanBiyo-Nano Enstrümantasyon Laboratuvarı aracılığıyla elde edilebilir
EDTAITW ReaktifleriA5097Tavlama tamponunda
Lazer Güç ÖlçerThorlabs PM100DDijital El Optik  Güç ve Enerji Ölçer Konsolu
Canlı 3AP Güç Kaynağı, MP-310Büyük BilimMP-310Elektroforez Güç
Kaynağı MgAc2ABCR GmbHAB544692Tavlama tamponunda
TBEThermo Scientific327330010Elektroforez için çalışan tampon
TRISBio-Rad1610719Tavlama tamponunda

Kaynaklar

  1. Ando, T. High-speed atomic force microscopy and its future prospects. Biophysical Reviews. 10 (2), 285-292 (2017).
  2. Uchihashi, T., Scheuring, S. Applications of high-speed atomic force microscopy to real-time visualization of dynamic biomolecular processes. Biochimica Et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 229-240 (2018).
  3. Eghiaian, F., Rico, F., Colom, A., Casuso, I., Scheuring, S. High-speed atomic force microscopy: Imaging and force spectroscopy. FEBS Letters. 588 (19), 3631-3638 (2014).
  4. Umeda, K., McArthur, S. J., Kodera, N. Spatiotemporal resolution in high-speed atomic force microscopy for studying biological macromolecules in action. Microscopy. 72 (2), 151-161 (2023).
  5. Nievergelt, A. P., Banterle, N., Andany, S. H., Gönczy, P., Fantner, G. E. High-speed photothermal off-resonance atomic force microscopy reveals assembly routes of centriolar scaffold protein SAS-6. Nature Nanotechnology. 13 (8), 696-701 (2018).
  6. Heath, G. R., Scheuring, S. High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules. Nature Communications. 9, 4983(2018).
  7. Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy in Biology. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2022).
  8. Fukuda, S., Ando, T. Faster high-speed atomic force microscopy for imaging of biomolecular processes. Review of Scientific Instruments. 92 (3), 033705(2021).
  9. Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. -C., Gladfelter, A. S., Scheuring, S. The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM. Nature Communications. 11 (1), 5062(2020).
  10. PeakForce Tapping. , Available from: https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html (2023).
  11. Wang, S., Hao, C. Principle and application of peak force tapping mode atomic force microscope. International Conference on Cognitive-based Information Processing and Applications (CIPA 2021). , Springer. Singapore. 671-679 (2022).
  12. Krotil, H. -U., Stifter, T., Waschipky, H., Weishaupt, K., Hild, S., Marti, O. Pulsed force mode: a new method for the investigation of surface properties. Surface and Interface Analysis. 27 (5-6), 336-340 (1999).
  13. Rosa-Zeiser, A., Weilandt, E., Hild, S., Marti, O. The simultaneous measurement of elastic, electrostatic and adhesive properties by scanning force microscopy: pulsed-force mode operation. Measurement Science and Technology. 8 (11), 1333(1997).
  14. De Pablo, P. J., Colchero, J., Gómez-Herrero, J., Baró, A. M. Jumping mode scanning force microscopy. Applied Physics Letters. 73 (22), 3300-3302 (1998).
  15. Umeda, N., Ishizaki, S., Uwai, H. Scanning attractive force microscope using photothermal vibration. Journal of Vacuum Science & Technology B. 9 (2), 1318-1322 (1991).
  16. Avakyan, N., Conway, J. W., Sleiman, H. F. Long-range ordering of blunt-ended DNA tiles on supported lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 139 (34), 12027-12034 (2017).
  17. Wang, R., Kuzuya, A., Liu, W., Seeman, N. Blunt-ended DNA stacking interactions in a 3-helix motif. Chemical Communications. 46 (27), 4905-4907 (2010).
  18. Parikka, J. M., Sokołowska, K., Markešević, N., Toppari, J. J. Constructing large 2D lattices out of DNA-tiles. Molecules. 26 (6), 1502(2021).
  19. He, Y., Chen, Y., Liu, H., Ribbe, A. E., Mao, C. Self-assembly of hexagonal DNA two-dimensional (2D) arrays. Journal of the American Chemical Society. 127 (35), 12202-12203 (2005).
  20. Lipid-DNA Method. , Available from: http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm (2023).
  21. Pyne, A. L. B., et al. Base-pair resolution analysis of the effect of supercoiling on DNA flexibility and major groove recognition by triplex-forming oligonucleotides. Nature Communications. 12 (1), 1053(2021).
  22. Kielar, C., Zhu, S., Grundmeier, G., Keller, A. Quantitative assessment of tip effects in single-molecule high-speed atomic force microscopy using DNA origami substrates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (34), 14336-14341 (2020).
  23. Nievergelt, A. P., et al. Large-range HS-AFM imaging of DNA self-assembly through in situ data-driven control. Small Methods. 3 (7), 1900031(2019).
  24. Caroprese, V., et al. Structural flexibility dominates over binding strength for supramolecular crystallinity. bioRxiv. , (2023).
  25. Welcome to Mao Group. , Available from: https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html (2023).
  26. Nievergelt, A. P., Andany, S. H., Adams, J. D., Hannebelle, M. T., Fantner, G. E. Components for high-speed atomic force microscopy optimized for low phase-lag. 2017 IEEE International Conference on Advanced Intelligent Mechatronics (AIM). , Munich, Germany. (2017).
  27. SPM Controller/Software. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/ (2023).
  28. Open Hardware. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/ (2023).
  29. AFM head for small cantilevers with photothermal drive. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/ (2023).
  30. AFM head for small cantilevers with photothermal drive. BioLever. , Available from: https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW (2023).
  31. BioLever. AppNano. , Available from: https://www.appnano.com/product-page/biolever (2023).
  32. Python Scripting. , Available from: http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html (2023).
  33. Stahl, S. W., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Photothermal cantilever actuation for fast single-molecule force spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 80 (7), 073702(2009).
  34. Kangül, M., Asmari, N., Andany, S. H., Penedo, M., Fantner, G. E. Enhanced feedback performance in off-resonance AFM modes through pulse train sampling. arXiv. , (2023).
  35. Giessibl, F. J. Advances in atomic force microscopy. Reviews of Modern Physics. 75 (3), 949-983 (2003).
  36. Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy (AFM). Encyclopedia of Biophysics. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Yüksek Hızlı AFMPORT ModuKendi Kendine Düzenleme GörüntülemeKantilever AktüasyonuBiyomoleküler DüzenlemeGerçek Zamanlı GörüntülemeKuvvet Eğrisi Analizi
Fototermal Rezonans Kılavuz Çekme Kullanılarak DNA Üç Köşeli Yıldız Motifi Kendi Kendine Montajın Yüksek Hızlı Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntülemesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.