Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Summary

Mini-Tn7 tabanlı bir ekspresyon sistemi kullanarak bir akış pompası geninin tek kopyalı kromozomal tamamlayıcısı için tasarlanmış bir akış eksikliği olan Acinetobacter baumannii suşuna kolay bir prosedür tarif ediyoruz. Bu hassas genetik araç, çoklu ilaca dirençli patojenlerde akış pompalarının karakterizasyonu için anahtar olan kontrollü gen ekspresyonuna izin verir.

Abstract

Acinetobacter baumannii , antibiyotiklere karşı yaygın direnci nedeniyle zorlu bir Gram-negatif patojen olarak kabul edilmektedir. Yeni ve etkili terapötik seçenekler tasarlamak için bu direncin arkasındaki mekanizmaları anlamak çok önemlidir. Ne yazık ki, A. baumannii'deki bu mekanizmaları araştırma yeteneğimiz, uygun genetik manipülasyon araçlarının yetersizliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, fonksiyonel RND tipi akış mekanizmalarından yoksun bir A. baumannii suşunda tek kopya gen ekspresyonu elde etmek için kromozomal mini-Tn7 tabanlı bir sistemi kullanma yöntemlerini açıklıyoruz. Yüksek kopya sayılı plazmitlerde RND akış operonlarının varlığı genellikle bakteri hücreleri tarafından zayıf bir şekilde tolere edildiğinden, tek kopya ekleme ve indüklenebilir akış pompası ekspresyonu oldukça avantajlıdır. Ayrıca, rekombinant mini-Tn7 ekspresyon vektörlerinin, artan akış duyarlılığına sahip bir vekil A. baumannii konağının kromozomuna dahil edilmesi, diğer akış pompalarından kaynaklanan parazitlerin önlenmesine yardımcı olur. Bu sistem sadece karakterize edilmemiş bakteriyel akış pompalarını araştırmak için değil, aynı zamanda bu pompaları hedef alan potansiyel inhibitörlerin etkinliğini değerlendirmek için de değerlidir.

Introduction

Acinetobacter baumannii, tüm antibiyotik sınıflarına karşı kapsamlı direnci nedeniyle Dünya Sağlık Örgütü'nün en öncelikli patojenidir¹. Çoğunlukla hastanede yatan, yaralanan veya bağışıklığı baskılanmış kişileri etkileyen fırsatçı bir patojendir. A. baumannii, en alakalı olanı Direnç-Nodülasyon-Bölümü (RND) ihracatçı ailesidir². Bu akış pompalarının mekanik olarak nasıl çalıştığını anlamak, kişinin hedeflenen terapötik seçeneklerin geliştirilmesine olanak sağlayacaktır.

Hücresel süreçlerin spesifik olarak ayırt edilebilmesinin yaygın bir yolu, genetik manipülasyondur. Bununla birlikte, A. baumannii genetik çalışmaları için mevcut araçlar sınırlıdır ve deneysel tasarımı daha da karmaşık hale getirmek için, klinik izolatlar genellikle genetik manipülasyonlarda seçim için rutin olarak kullanılan antibiyotiklere dirençlidir³. Özellikle akış pompalarını incelerken karşılaşılan ikinci bir engel, genellikle bilinmeyen faktörler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmeleridir ve bu da işlevi tek bir pompaya doğru bir şekilde izole etmeyi ve atfetmeyi^{zorlaştırır 4}. Araştırma araç kutusunu genişletme ihtiyacını görerek, seçim işaretçisi ^5,6,7'nin kaldırılmasına izin veren bir Flp rekombinaz hedef (FRT) kaseti içeren mini-Tn7 tabanlı, tek kopya ekleme, indüklenebilir bir ifade sistemi geliştirdik (Şekil 1). İlk olarak Pseudomonas ^8,9,10 için oluşturulan bu zarif klonlama ve ekspresyon sistemi, A. baumannii'nin (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: bundan böyle A. baumannii AB258 olarak anılacaktır) RND akış pompası eksikliği olan bir suşuna tek kopyalı akış pompası tamamlayıcıları oluşturmak için kullanıldı¹¹. Bir seferde bir akış pompasını inceleyebilmek ve bakteri hücrelerini yüksek kopya ekspresyon ile boğmamak (genellikle plazmid bazlı ekspresyon sistemlerinde görüldüğü gibi), her bir akış pompasının kritik, fizyolojik yönleri hakkında minimum parazit ve azaltılmış komplikasyonlarla daha iyi öğrenilebilir.

Bu makale, mini-Tn7 sisteminin, 9 gün boyunca gerçekleştirilen bir dizi karmaşık olmayan adımla A. baumannii AB258'in kromozomuna silinmiş bir gen, RND akış pompası adeIJK'yi tamamlamak için nasıl kullanılacağını açıklamaktadır⁷. İlk adım seti, iyi korunmuş glmS geninin akış aşağısındaki tek attTn7 ekleme bölgesinde mini-Tn7 tabanlı ekleme plazmidine (Şekil 2A) klonlanan silinmiş akış pompası genlerini yeniden tanıtır (Şekil 3A). Bu işlem, Tn7 güdümlü yerleştirme için gerekli olan transpozaz genlerini kodlayan replikatif olmayan bir yardımcı plazmit (Şekil 2B) ile kolaylaştırılır. İkinci adım seti, işaretlenmemiş bir suş oluşturmak için FRT bölgeleri (Şekil 3B) ile çevrili gentamisin geninin Flp rekombinaz aracılı çıkarılması için bir eksizyon plazmidi (Şekil 2C) kullanır. Bu sistem, antibiyotik direnci ile ilgili olarak RND akış pompalarının temel rollerini ve olası inhibitörlerini aydınlatmak için kullanılsa da, ilgilenilen herhangi bir geni araştırmak için kullanılabilir.

Protocol

1. Deneysel hazırlık

1. Plazmid pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm^9'u (ekleme plazmidi, Şekil 2A) ilgilenilen gen ile saflaştırın.
   NOT: Burada ilgilenilen gen adeIJK'dir. Nihai plazmit konsantrasyonu ≥100 ng/μL olmalıdır.
2. Yardımcı plazmidi (pTNS2)⁹ ve eksizyon plazmidini (pFLP2^ab)⁶ (Şekil 2B,C, sırasıyla), ideal olarak ≥100 ng/μL'lik bir nihai plazmit DNA konsantrasyonuna kadar saflaştırın.
3. 50 mL steril ultra saf su ve 25 mL steril LB (Lennox) suyu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
4. Her biri aşağıdaki katkı maddelerini içeren en az 10 LB agar plakası hazırlayın: sade (katkı maddesi yok), 50 μg/mL'de gentamisin (Gm), 200 μg/mL'de karbenisilin (Cb) (ampisilin direnç geni yoluyla seçim için) ve %5 sükroz (bkz.
5. LB agar üzerine yerleştirmek için kullanılacak suşu çizgiden çıkarın ve 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin. Burada A. baumannii AB258 kullanılır.
   NOT: Bu protokol, mümkün olduğunca steril bir ortamda, tezgahta bir Bunsen brülörü veya biyolojik güvenlik kabini kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Tüm sarf malzemelerinin (pipet uçları, aşılama halkaları, mikrofüj tüpleri vb.) steril olması gerekir.

2. Kültür hazırlığı

1. Tek bir A. baumannii AB258 kolonisini, steril bir aşılama döngüsü veya steril ahşap aşılama çubuğu kullanarak steril bir 13 mL kültür tüpünde 4 mL LB suyuna aşılayın.
   NOT: Bir numune ve bir kontrol için tek bir 4 mL kültür kullanılır. İhtiyaç duyulan numune sayısına bağlı olarak kültür sayısını artırın.
2. Gece boyunca 37 °C'de çalkalayarak (250 rpm) inkübe edin.
3. 3. adımda kullanmak için gece boyunca 4 °C'de bir şişe steril damıtılmış su (25-50 mL) yerleştirin.

3. Elektroyetkin hücrelerin hazırlanması

1. Tüm steril 1.5 mL mikrofüj tüplerini (kültür başına iki adet) ve steril elektroporasyon küvetlerini (kültür başına iki adet) buz üzerine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız). Numuneleri prosedür boyunca mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.
2. 4 °C'de saklanan steril su şişesini buzun üzerine koyun.
3. Gece boyunca bakteri kültürünün 1.5 mL'sini 1.5 mL'lik mikrofüj tüplerinden birine aktarın.
4. Hücreleri peletlemek için 13.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
   NOT: Santrifüjleme ideal olarak 4 °C'de gerçekleştirilir, ancak ortam sıcaklığında santrifüjleme kabul edilebilir ve zararlı değildir.
5. 1 mL'lik bir pipet kullanarak, hücre peletini bozmadan tüm süpernatanı çıkarın.
6. Aynı mikrofüj tüpüne 1.5 mL daha bakteri kültürü ekleyin. 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin, ardından tüm süpernatanı çıkarın.
7. Kalan 1 mL kültürle 3.6 adımını son bir kez tekrarlayın.
8. Hücre peletine 1 mL buz gibi steril su ekleyin ve pelet artık mikrofüj tüpünün dibinde kalmayana kadar hafif pipetleme ile yeniden süspanse edin.
9. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin.
10. 1 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın. Süpernatanı, özellikle hücrelerin daha az kompakt topaklar oluşturma eğiliminde olduğu sonraki yıkama adımlarında dökmeyin.
11. Bu yıkama adımını buz gibi steril suyla, 3.8'den 3.10'a kadar olan adımları iki kez daha tekrarlayın.
12. Son hücre peletini 200 μL buz gibi steril suda nazikçe yeniden süspanse edin.
13. Son hücre süspansiyonunun 100 μL'sini ikinci buz gibi soğuk 1.5 mL mikrofüj tüpüne aktarın. Bu ikinci alikot, elektroporasyon için negatif kontrol olacaktır. Hücre örneklerini buz üzerinde tutun.

4. Elektroporasyon

1. Her numune için 1 mL LB et suyu ve bir LB + Gm⁵⁰ agar plakası (adım 1.4'te hazırlanmıştır) önceden ısıtın ve 37 °C'ye ayarlanmış statik bir inkübatörde kontrol edin.
2. 5 μL veya daha az birleşik bir hacimde, pTNS2 yardımcı plazmidinin her birine 100-200 ng ekleyin ve pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK ekleme plazmiti, elektroyetkin hücrelerin bir alikotuna ekleyin.
3. Plazmitlerin elektroyetkin hücrelerle kabarcıklar oluşturmadan tam olarak karışmasını sağlamak için parmak ucuyla hafifçe vurarak karıştırın.
4. Negatif kontrol hücresi alikotuna eşdeğer hacimde steril damıtılmış su ekleyin ve yukarıdaki gibi hafifçe karıştırın.
5. Numuneleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
6. Tüm hücre örneğini buz gibi bir elektroporasyon küvetine aktarın, ardından küveti tekrar buzun üzerine yerleştirin. Negatif kontrol hücresi örneği için tekrarlayın.
7. Hücre örneğini elektroporate edin.
   1. Elektroporatörü açın ve 2.0 kV'a (25 μF, 200 Ω) ayarlayın (bkz.
   2. Yapışan buz veya nemi gidermek için küvetin yüzeyini yumuşak bir bezle silin.
   3. Küveti elektroporatöre yerleştirin ve elektrik çarpmasını sağlayın.
   4. Küvetteki hücrelere hemen 0,9 mL önceden ısıtılmış LB suyu ekleyin ve hücreleri ortamla karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
   5. Tüm hücre süspansiyonunu yeni bir 1.5 mL mikrofüj tüpüne (oda sıcaklığı) aktarın.
   6. Elektroporatör üzerindeki zaman sabiti değerini kontrol edin; En iyi sonuçlar için bu değer 4 ile 6 arasında olmalıdır.
8. Negatif kontrol hücresi numunesi için elektroporasyon prosedürünü tekrarlayın (adım 4.7.1 ila adım 4.7.6).
9. Hücre geri kazanımına izin vermek için elektroporasyonlu numuneleri 37 °C'de 250 rpm'de 1 saat inkübe edin.
10. Bir aşılama yayıcı kullanarak, her bir elektroporasyonlu hücre örneğinin 100 μL'sini önceden ısıtılmış bir LB + Gm⁵⁰ agar plakasına yayın.
    1. Hücreleri peletlemek için kalan numuneleri 13.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
    2. Bir pipet kullanarak tüm süpernatantı çıkardıktan sonra, hücreleri 100 μL LB et suyunda yeniden süspanse edin.
    3. Her bir numunenin tamamını önceden ısıtılmış ayrı ayrı LB + Gm⁵⁰ agar plakalarına yayın.
       NOT: Elektroporasyon verimliliği gerilime bağlı olabilir. Bir suşun ilk kez elektropolasyonu yapılırken, elde edilen plakaların izole kolonilere sahip olduğundan emin olmak için elektroporasyon numunesinin farklı hacimlerini ve hatta seyreltmelerini plakalamak bilgilendirici olabilir.
11. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.

5. PCR tabanlı tarama için dönüştürülmüş kolonilerin seçilmesi

1. Elektroporasyon plakalarını kontrol edin. Negatif kontrolün kolonisi olmamalıdır; Numunenin farklı kolonileri olmalıdır.
   NOT: Kolonili plakalar, bu adımda ve kolonili veya yamalı agar plakalarının üretildiği sonraki tüm adımlarda, devam etmeden önce 4 °C'de 3 güne kadar saklanabilir.
2. Steril kürdan kullanarak, LB + Gm⁵⁰ agar plakalarından 10 adede kadar tek koloni alın ve bunları taze bir LB + Gm⁵⁰ agar plakasına yamalayın.
3. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.

6. Koloni PCR ile kromozomal insersiyonun doğrulanması

1. Yamalı kolonileri içeren LB + Gm⁵⁰ agar plakalarını inkübatörden çıkarın.
2. Steril bir kürdan veya steril pipet ucu kullanarak, bir yamadan küçük bir kısmı (yaklaşık büyük bir koloni büyüklüğünde) 20 mL'lik bir PCR tüpünde 0.2 μL steril damıtılmış suya çıkarın; İyice karıştırın. Hücreler kürdandan salınırken su numunesi gözle görülür şekilde bulanıklaşmalıdır. Taranması gereken herhangi bir sayıda numune hazırlayın, ancak 6 yeterli olmalıdır.
3. Bakteriyel süspansiyonu içeren PCR tüpünü 100 °C'de 5-10 dakika inkübe edin.
4. Bir mini santrifüj kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), hücresel kalıntıları peletlemek için numuneyi 2 dakika boyunca sabit maksimum hızda döndürün.
5. Süpernatanı yeni bir 0.2 mL PCR tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Bu numune, PCR reaksiyonu için şablon DNA'yı içerir.
   NOT: Bu şablon DNA, PCR'ye devam etmeden önce -20 °C'de saklanabilir.
6. 1x polimeraz tamponu, 200 μM dNTP'ler, 0.18 μM ABglmS2_F_New ileri primer, 0.18 μM Tn7R ters primer (Tablo 1), 1 U Taq DNA polimeraz ve 1 μL içeren bir PCR reaksiyon karışımı hazırlayın hazırlanan şablon DNA toplam 25 μL hacimde. Şablon DNA hariç tümü dahil olmak üzere şablonsuz bir kontrol (NTC) hazırlayın (bkz.
7. Reaksiyon koşullarını bir termal döngüleyiciye girin: 2 dakika boyunca 95 °C; 30 sn için 95 °C, 30 sn için 49 °C ve 30 sn için 72 °C olmak üzere toplam 35 döngü; 10 dakika boyunca 72 °C; 12 °C tutun. Örnekleri çalıştırın.
8. DNA yükleme boyasının 1x'lik bir nihai konsantrasyona eklenmesini takiben,% 2'lik bir agaroz jel üzerine her bir PCR reaksiyonunun 10 μL'sini yükleyin ve 40 dakika boyunca 80 V'ta çalıştırın. Bu primer çifti için beklenen amplikon boyutu 382 bp'dir. NTC'nin bantları olmamalıdır.
9. Beklenen PCR ürününü üreten numuneleri tanımlayın. PCR pozitif yamaların herhangi birinden LB + Gm⁵⁰ agar plakaları üzerinde bir çizgi plakası hazırlayın; 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin. Amaç, bu işaretli suşu korumak için bir gliserol stoğunun hazırlanması için ve işaretsiz bir suş oluşturmak için bir başlangıç noktası olarak tek kolonili bir plaka oluşturmaktır (aşağıda açıklanmıştır).

7.pFLP2 ab kullanılarak Gm^R işaretleyicisinin çıkarılması

1. Adım 2'de belirtilen prosedürü izleyin: Kültür hazırlama. Gece kültürünü hazırlamak için kullanılan numune, adım 6.9'da ayrı koloniler oluşturmak için hazırlanan LB + Gm⁵⁰ agar plakalarından tek bir kolonidir.
2. Adım 3'te belirtilen prosedürü izleyin: Elektrokompetan hücrelerin hazırlanması. Elektroporasyon için gece kültüründen hücreleri hazırlayın.
3. Adım 4'te belirtilen prosedürü izleyin: Elektroporasyon. Burada, hücrelere sokulacak plazmit, ilgilenilen kromozomal olarak yerleştirilmiş geni çevreleyen gentamisin direnç genini ortadan kaldıracak olan pFLP2^ab'dir (100-200 ng).
4. Hücreler 1 saat boyunca iyileştikten sonra (adım 4.9), elektroporasyonlu hücre numunesinin 100 μL'sini önceden ısıtılmış bir LB + Cb²⁰⁰ agar plakasına (adım 1.4'te hazırlanır) yayın. Bu seçici basınç, yalnızca pFLP2^ab eksizyon plazmidini barındıran hücrelerin büyümesini sağlar.
5. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
6. Plakada koloni olup olmadığını kontrol edin. Negatif kontrol plakasında koloni olmamalıdır; LB + Cb²⁰⁰ agar numune plakası farklı kolonilere sahip olmalıdır.
7. Steril kürdan kullanarak, 20'ye kadar izole koloniyi bir LB + Cb²⁰⁰ agar plakasına ve bir LB + Gm⁵⁰ agar plakasına çapraz yamalayın.
8. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
9. Plakalarda yama olup olmadığını kontrol edin. LB + Cb²⁰⁰ agar plakasında büyüyen, ancak LB + Gm⁵⁰ agar plakasında büyümeyen klonlar, gentamisin direnç genini orijinal ek parçadan çıkarmıştır.
10. pFLP2^ab plazmidinin bakterilerden atılmasını zorlayan% 5 (a / h) sükroz ile desteklenmiş ayrı LB agar plakalarına çizilmeye duyarlı karbenisiline dirençli ve gentamisine duyarlı yamaları seçin. En fazla 10 koloni seçin.
11. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
12. Koloniler için plakaları kontrol edin.
13. pFLP2^ab plazmit kaybının son bir teyidi olarak,% 5 sükroz plakalarından izole edilmiş 4-6 koloniyi bir LB + Cb²⁰⁰ agar plakasına ve bir LB agar plakasına çapraz yamalayın.
14. Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
15. LB agar plakasında büyüyen ve bu işaretsiz suşu korumak için bir gliserol stoğunun hazırlanması için karbenisiline duyarlı bir klon seçin.
    1. İşaretlenmemiş suşun genetik doğrulaması, gentamisin direnç genini hedef alan primerler kullanılarak koloni PCR (adım 6: Koloni PCR ile kromozomal insersiyonun doğrulanması) ile gerçekleştirilebilir.
    2. 1x polimeraz tamponu, 200 μM dNTP, 0.18 μM Gm_F ileri primer, 0.18 μM Gm_R ters primer (Tablo 1), 1 U Taq DNA polimeraz ve 1 μL toplam 25 μL hacimde hazırlanan şablon DNA içeren bir PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. Şablon DNA hariç tümünü içeren şablonsuz bir kontrol (NTC) hazırlayın, ve işaretli suştan DNA kullanılarak pozitif bir kontrol.
    3. Reaksiyon koşullarını bir termal döngüleyiciye girin: 2 dakika boyunca 95 °C; 30 sn için 95 °C, 30 sn için 50 °C ve 40 sn için 72 °C olmak üzere toplam 35 döngü; 10 dakika boyunca 72 °C; 12 °C tutun. Örnekleri çalıştırın.
    4. DNA yükleme boyasının 1x'lik bir nihai konsantrasyona eklenmesini takiben,% 1'lik bir agaroz jel üzerine her bir PCR reaksiyonunun 10 μL'sini yükleyin ve 40 dakika boyunca 80 V'ta çalıştırın. Bu primer çifti için beklenen amplikon boyutu 525 bp'dir. Pozitif kontrol tek bir banda sahip olmalıdır; numuneler ve NTC'de bant olmamalıdır.

Results

Kromozomal yerleştirme prosedürü, seçici bir agar plakasında büyüyen bir sonuç kolonisi görmek için 3 gün boyunca toplam sadece 2 saat sürer (Şekil 1A-C). Dönüşüm plakasında beklenen koloni sayısı suşa bağlıdır: Tn7'nin attTn7 bölgelerine yerleştirilmesi spesifik ve verimli olduğu için 20-30 hatta yüzlerce koloni görülebilir⁹. Dönüşüm plakası kolonilerinin seçici ortama yamalanması (Şekil 4A), dönüştürülmüş suşu korur ve koloni PCR taraması için başlangıç materyali sağlar (Şekil 1E ve Şekil 4B). Kolonilerin PCR ile taranması minimumda tutulabilir - 10'dan fazla koloninin işlenmesi gerekmemelidir ve çoğu yerleştirme için pozitif sonuç vermelidir. Tarama primerleri, ABglmS2_F_New ve Tn7R (Tablo 1) için PCR ürünü 382 bp'dir (Şekil 4B şeridi 4); reaksiyon için negatif kontroller arasında vahşi tip A. baumannii ATCC 17978 (Şekil 4B şeridi 2), AB258 (Şekil 4B şeridi 3) ve şablon yok (Şekil 4B şeridi 5) bulunur. PCR pozitif olan koloniler, tamamlanmış, işaretli suşları temsil eder.

Gentamisin direnç geninin çıkarılması (işaretsiz) 3 saatten az sürer, eksizyon plazmidi ile dönüştürülen hücrelerin seçici kaplama yoluyla seçilmesi gerektiğinden 6 gün sürer ve daha sonra eksizyon plazmitinin bakterilerden iyileştirilmesi gerekir (Şekil 1F). Flp-FRT rekombinasyon bazlı eksizyon kesin ve etkilidir ve transformasyon plakasında ≥20 koloni ile sonuçlanmalıdır. Karbenisilin (eksizyon plazmidi tarafından verilen β-laktam direnci seçilerek) ve gentamisin (gentamisin direncinin kaybını arayan) üzerine çapraz yamalı kolonilerin tümü sırasıyla karbenisiline dirençli ve gentamisine duyarlı olmalıdır. Eksizyon plazmidi, %5 sükroz agar plakalarında büyüyerek bakterilerden dışarı atılır. Sükroz üzerindeki büyüme, hücreleri pFLP2^ab'yi ortadan kaldırmaya zorlar, çünkü plazmit üzerindeki sakB geni, sükrozun bakteriler için toksik bir polisakkarit olan levanlara dönüşümünü teşvik eder^12,13. % 5 sükroz ortamında büyüyen tüm koloniler daha sonra sadece düz LB agar plakalarında büyümelidir; Karbenisilin agar plakalarında büyüme olmamalıdır. Düz LB agar plakalarında büyüyen koloniler, işaretlenmemiş suşları temsil eder. Gentamisin belirtecinin kaybının doğrulanması, Gm_F ve Gm_R primerleri kullanılarak koloni PCR ile sağlanabilir (Tablo 1 ve Şekil 5). Bu primer çifti, yalnızca pozitif kontrolde 525 bp'lik bir amplikon verir (başlangıçta oluşturulan işaretli gerinim, Şekil 5 şerit 4); vahşi tip ATCC 17978 (Şekil 5 şerit 2), AB258 (Şekil 5 şerit 3), test edilen herhangi bir koloni (Şekil 5 şerit 5) ve şablonsuz kontrol (Şekil 5 şerit 6) amplifikasyon göstermemelidir.

İşaretlenmemiş suş onaylandıktan sonra, fonksiyonel testler fenotipik tahlillerle başlayabilir. Burada, bariz ilk seçenek, bir dizi antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) belirlemektir: siprofloksasin, AdeIJK'nin bilinen bir substratıdır, tetrasiklin AdeIJK tarafından uzaklaştırılabilir (ana akış pompası AdeAB'dir) ve kanamisin A. baumannii ATCC 17978 ^2,14 üzerinde nispeten küçük bir etkiye sahiptir. CLSI yönergelerine¹⁵ göre et suyu mikro seyreltme yöntemi kullanılarak, 50 μM IPTG'nin yokluğunda ve varlığında her bir antibiyotikle tamamlanmış işaretlenmemiş AB258::adeIJK suşuna meydan okundu; vahşi tip suşu ATCC 17978 ve RND akış eksikliği olan suşu AB258 kontrol olarak dahil edildi (Tablo 2). Genel olarak, MIC değerlerinde görülen eğilim, AB258::adeIJK'nin siprofloksasin ve tetrasikline duyarlılığının azalması ve akış pompasının indüklenmesi ile adeIJK'nin yerleştirilmesinin başarılı olduğunu doğrular.

Şekil 1: Prosedüre genel bakış. (A) Tamamlanacak A. baumannii suşunun bir gece kültürü hazırlanır. (B) Gece kültüründen elde edilen hücreler santrifüj yoluyla 3 kez su ile yıkanır ve buz üzerinde tutulur. (C) Dağıtım ve yardımcı plazmitler hücrelere eklenir ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Numune elektroporasyona tabi tutulur, LB ortamı eklenir ve hücrelerin 37 °C'de 1 saat iyileşmesine izin verilir. 100 μL'lik bir hücre alikotu LB + Gm⁵⁰ agar plakalarına yayılır ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edilir. (D) Dönüşüm plakasından koloniler bir LB + Gm⁵⁰ agar plakasına yamalanır ve gece boyunca 37 °C'de büyütülür. (E) Yamalı koloniler, kromozomal yerleştirme bölgesini kapsayan bir amplifikasyon ürününün varlığını taramak için PCR için hazırlanır. PCR amplifikasyonu, agaroz jel elektroforezi ile görselleştirilir. PCR pozitif numuneler, ilgilenilen genin kromozoma başarılı bir şekilde yerleştirilmesini ve belirgin bir suşun oluşturulmasını temsil eder. (F) Gentamisin için pozitif bir koloni, gentamisin kasetini kromozomal yerleştirmeden çıkarmak için pLFP2^ab plazmidinin elektroporasyonu ile adımlarda (AC) olduğu gibi hazırlanır. LB + Cb²⁰⁰ agar üzerindeki seçici kaplama, plazmidin alımını doğrular. LB + Cb²⁰⁰ ve LB + Gm⁵⁰ agar plakaları üzerindeki yinelenen yama, Cb^R ve Gm^S olan kolonileri ortaya çıkarır ve bu da yerleştirmeden gentamisin kasetinin kaybını doğrular. Seçilen Cb^R kolonilerinin %5 sükroz üzerinde büyümesi, hücrelerden pLFP2^ab plazmitini iyileştirir. % 5 sükroz plakasından koloniler, istenen Cb^S ve GM^S kolonilerini ortaya çıkarmak ve işaretsiz suşun oluşumunu doğrulamak için LB + Cb²⁰⁰ agar ve LB agar üzerine yamalanır. Gm⁵⁰, 50 μg/mL'de gentamisin; Cb^{200, 200} μg/mL'de karbenisilin; ^R, dayanıklı; ^S, hassas. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bu protokolde kullanılan plazmitler. (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (insersiyon plazmidi), (B) pTNS2 (yardımcı plazmit) ve (C) pFLP2^ab (eksizyon plazmidi) genel plazmit haritaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Ekleme ve işaretleme şeması. (A) Yerleştirme. A. baumannii kromozomundaki tek Tn7 yerleştirme bölgesi, glmS2 geninin sonundan 24 bp uzakta bulunur. İnsersiyon plazmidi ve yardımcı plazmidin birlikte elektroporasyonu, ilgilenilen genin (sokulan gen, mor) insersiyon kasetinin geri kalanıyla birlikte tamamlanmasına izin verir (marker eksizyonu için FRT bölgeleri, sarı; gentamisin direnci için accC1 geni, yeşil; indüklenebilir ekspresyon için lacIq geni, mavi) kromozoma. (B) İşaretin kaldırılması. Tamamlayıcı, işaretli insersiyon suşunun pFLP2^ab eksizyon plazmidi ile elektroporasyonu, gentamisin direnç geninin (accC1, yeşil) Flp-FRT rekombinasyonu (FRT bölgeleri, sarı) yoluyla çıkarılmasını kolaylaştırır ve işaretsiz bir suş oluşturur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Koloni PCR ile dönüşüm, yama ve yerleştirme onayı. (A) yamalamadan sonra transformasyon kolonilerinin büyümesinin ve (B) kromozomal insersiyonu doğrulamak için ABglmS_F_New (gri) ve Tn7R (turuncu) primerleri ile koloni PCR amplifikasyonunun temsili sonucu. Şerit 1: Düşük moleküler ağırlıklı DNA merdiveni; Şerit 2: ATCC 179798; Şerit 3: AB258; Şerit 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Şerit 5: şablonsuz kontrol. Beklenen 382 bp bandı etiketlendi. Gentamisin spesifik primerlerin (Gm_F ve Gm_R, yeşil) kromozomal insersiyonu doğrulamak için de kullanılabileceğini unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Koloni PCR ile belirteç kaybının doğrulanması. pFLP^ab bazlı eksizyon yoluyla antibiyotik belirtecinin kaybını doğrulamak için gentamisine özgü primerler (Gm_F ve Gm_R) ile koloni PCR amplifikasyonunun temsili sonucu. Şerit 1: düşük moleküler ağırlıklı DNA merdiveni; Şerit 2: ATCC 179798; Şerit 3: AB258; Şerit 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Şerit 5: AB258::adeIJK; Şerit 6: şablonsuz kontrol. Beklenen 525 bp bandı etiketlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Suşlar, plazmitler ve primerler	İlgili özellikler	Referans
Leke
A. baumannii ATCC 17978 Serisi	Tip gerinim	ATCC (ATCC)
A. baumannii ATCC 17978 AB258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
Plazmid
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC	GmR, AmpR	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	GmR, AmpR, adeIJK	Bu çalışma
pTNS2	AmperR	9
pFLP2ab	pWH1266 orijini veya replikasyonu, sacB, AmpR	7
Astar	Sıra (5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
Tn7R	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	Bu çalışma
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	Bu çalışma

Tablo 1: Bu protokolde kullanılan bakteri suşları, plazmitler ve primerler. Gm, gentamisin; Amp, ampisilin; ^R, dayanıklı.

	Siprofloksasin		Tetrasiklin		Kanamisin
IPTG (IPTG)	−	+	−	+	−	+
ATCC 17978 Serisi	0.250	Nd	0.500	Nd	1.5	Nd
AB258 Serisi	0.031	Nd	0.063	Nd	4	Nd
AB258::adeIJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
Katlama değişikliği		4.01		4.03		0.25

Tablo 2: Eklenen genlerin işlevselliğinin antibiyotik duyarlılığı yoluyla test edilmesi. A. baumannii ATCC 17978, AB258, indüklenmemiş AB258::adeIJK ve IPTG ile indüklenen AB258::adeIJK için minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) değerlerinin siprofloksasin, tetrasiklin ve kanamisin ile karşılaştırılması. Katlama değişimi = indüklenmiş (+ IPTG)/indüklenmemiş (− IPTG); nd = belirlenmedi.

Discussion

A. baumannii'de indüklenebilir tek kopyalı bir gen ekspresyon sisteminin kromozomal eklenmesi için bu prosedür teknik olarak basit ve emek yoğun olmasa da, vurgulanması gereken birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, ortamın buz gibi soğuk su ile değiştirilmesi sırasında hücreler kırılgan hale geldiğinden, yetkin hücrelerin hazırlanması mümkün olduğunca buz üzerinde yapılmalıdır. İdeal olarak, santrifüj adımları 4 °C'de gerçekleştirilir, ancak oda sıcaklığında santrifüjleme kabul edilebilir. Suyla yıkama sırasında hücrelerin artan kırılganlığı göz önüne alındığında, nazik pipetleme de kritik öneme sahiptir. İkincisi, elektroporasyon iyonların varlığına duyarlıdır. Hücrelerin birden fazla peletleme turu ile yıkanması ve suda yeniden süspanse edilmesi, ortamın tamamen çıkarılmasını sağlar. Ayrıca, plazmitler taze olarak saflaştırılmalıdır ve plazmit DNA konsantrasyonu yeterince yüksek olduğu sürece standart kit elüsyon tamponlarında (normalde TE tamponu) ayrıştırılabilir. Numunenin iyonik kuvvetini çok düşük tutmak için 100 μL hücre süspansiyonuna <5 μL plazmit eklemeyi hedefliyoruz, ancak 10 μL'ye kadar tolere edilmelidir. Üçüncüsü, eklenen antibiyotiğin etkinliğini sağlamak için gerektiğinde seçici agar plakaları hazırlanmalıdır. Eksizyon plazmidinin dönüşümü sırasında seçim için normal ampisilin yerine karbenisilin, pFLP2^ab kullanıldığına dikkat edin. A. baumannii, aminopenisilinlere (ampisilin) karşı doğal olarak ^{dirençlidir16}; Bir karboksipenisilin (karbenisilin) ikame edilmesi, plazmid kodlu β-laktamaz ile sürekli seçime izin verir.

Deneysel protokolün optimizasyonu daha inceliklidir ve farklı Acinetobacter türleri (hatta aynı tür içindeki genetik olarak manipüle edilmiş suşlar) ve muhtemelen laboratuvarda kullanılan belirli reaktifler arasında değişecektir. Örneğin, elektroporasyon için kullanılan voltaj 1,8 ile 2,5 kV arasında değişebilir ve PCR için kullanılan DNA polimeraza bağlı olarak termodöngü koşullarının biraz değiştirilmesi gerekebilir. Elektroporasyondan sonra hücrelerin zayıf bir şekilde büyüyüp büyümediğini göz önünde bulundurmak için yararlı ipuçları, agar plakalarındaki gentamisin konsantrasyonunun 50 μg/mL'den 30 μg/mL'ye düşürülmesini ve/veya agar plakalarının inkübasyon süresinin ≥24 saate uzatılmasını içerir. Gentamisin kasetini çıkarma adımlarıyla ilgili olarak, karbenisilin direnci devam ederse,% 10 sükroz içeren LB agar plakaları kullanılarak ve / veya ≥24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edilerek daha iyi başarı elde edilebilir.

Literatürde elektroporasyon ile kullanım için çok sayıda A. baumannii hücre hazırlama yöntemi bulunabilir, ancak bunlar genellikle ilk gece kültüründen sonra bir alt kültürleme aşaması ve daha sonra öngörülen bir optik yoğunluğa kadar uzun bir büyüme aşaması içerir. Basit bir gece kültürünün de aynı derecede etkili bir şekilde kullanılabileceğini gördük. A. baumannii'nin elektroporasyonu iyi tanımlanmıştır ve okuyucular burada^protokolün bu özel yönü hakkında daha fazla bilgi edinebilirler ^17,18. Bu mini-Tn7 kromozomal gen tamamlama sisteminin, plazmid bazlı bir tamamlama sistemi ile karşılaştırıldığında en önemli avantajları, IPTG ile kontrol edilebilen lacI^q baskılayıcı sistemi aracılığıyla tamamlanan genin ekspresyon seviyesini düzenleme yeteneği ve gentamisin belirtecini (aacC1 geni) yan FRT siteleri. Hücrelerin akış pompalarının ekspresyonuna toleransının, takılan pompaya bağlı olarak değişebildiği gözlemlenmiştir. Örneğin, hücreler AdeABC veya AdeFGH ile karşılaştırıldığında AdeIJK ekspresyonuna daha duyarlıdır; bu, kültür koşullarında IPTG konsantrasyonunun değiştirilmesiyle ele alınabilir. Antibiyotik belirtecinin çıkarılması, sabit seçim baskısı nedeniyle suş için mutasyon riskini azaltır ve ayrıca sınırsız antibiyotik duyarlılık araştırmalarına izin verir³.

Bu mini-Tn7 sistemi Pseudomonas ^9,10, Yersinia⁹, Burkholderia¹⁹, Xanthomonas²⁰ ve Acinetobacter ^5,6,21,22 türlerinde başarıyla kullanılmıştır, ancak bazı sınırlamalar mevcuttur. Örneğin, A. baumannii'de genom^5'te yalnızca bir fonksiyonel attTn7 ekleme bölgesi vardır, bu nedenle birden fazla delesyon ile bir suş oluşturulabilir, ancak bir seferde yalnızca bir gen tamamlanabilir. Ayrıca, bu sistemin Gram-pozitif bakteriler için etkili olduğu henüz kanıtlanmamıştır¹⁰.

RND akış pompaları, A. baumannii'de antibiyotik direncinin önemli kolaylaştırıcılarıdır. Onları bu kadar güçlü yapan şey, iç ve dış zarlar boyunca uzanan ve antibiyotiklerin periplazmadan hücre dışına çıkarılmasına izin veren üç parçalı yapılarıdır. En çok çalışılan ve her yerde bulunan RND pompalarının - AdeABC, AdeFGH ve AdeIJK olarak adlandırıldığı - tüm sınıfları kapsayan antibiyotikleri ortadan kaldırdığı gösterilmiştir. Akış pompası işlevinin ayrıntılı olarak aydınlatılması, çoklu ilaca dirençli suşlara karşı yeni terapötik seçenekler tasarlamak için iyi bir başlangıç noktası sağlayacaktır. AB258 üçlü RND pompa silme geriliminin kullanılması ve her seferinde bir pompanın tamamlanması, her pompanın diğerlerinden bağımsız olarak incelenmesine olanak tanır ve her biri için benzersiz alt tabaka profillerini ve en etkili inhibitörleri ayırt eder. Tabii ki, akış pompalarının bakterinin normal işlevinde "günlük" bir rolü de vardır. Bu rollerin anlaşılması, pompaların dolaylı olarak sakatlanmasına yol açabilir ve bu da antibiyotik akışını kesebilir ve muhtemelen çok ilaca dirençli bakterileri bir kez daha yaygın olarak kullanılan antibiyotiklere duyarlı hale getirebilir. Genel olarak, mini-Tn7 sistemi, ayrıntılı çalışma veya yardımcı belirteçler için ilgilenilen herhangi bir geni, örneğin mikroskobik görüntüleme için floresan proteinleri tanıtmak için kullanılabilir⁶.

Çoklu ilaca dirençli bakterilerin artan prevalansı hepimiz için bir endişe kaynağıdır. A. baumannii gibi patojenlerde akış pompaları tarafından sağlanan koruyucu mekanizmaları anlamak, ciddi enfeksiyonlarla mücadele için kritik öneme sahiptir. Bu kromozomal tek kopya gen ekspresyon sistemi, mekanik çalışmalar için olduğu kadar akış pompası fonksiyonunu engellemek için inhibitörleri tanımlamak için de güçlü bir araçtır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tüpü	VWR	20170-012	Koloni kaynatma preparatları ve PCR reaksiyonları için
1.5 mL mikrofüj tüpleri	Sarstedt	72-690-301	Genel kullanım
13 mL kültür tüpleri, Pyrex	Fisher	14-957K	Sıvı kültür kapları
6x DNA yükleme tamponu	Froggabio	LD010	Agaroz jel elektroforezi numune yükleme boyası
Asetik asit, buzul	Fisher	351271-212	Agaroz jel çalışan tampon bileşeni
Agar	Bioshop	AGR003	Katı büyüme ortamı
Agarose	BioBasic	D0012	PCR reaksiyon ürünlerinin elektroforetik olarak ayrılması; 0.8 & ndash konsantrasyonda kullanılır; % 2
agaroz jel elektroforez ünitesi	Fisher	29-237-54	Agaroz jel elektroforezi; PCR reaksiyon ürünlerinin ayrılması
Karbenisilin	Fisher	50841231	Seçici medya
Kültür tüpü kapakları	Fisher	13-684-138	13 mL kültür tüpleri için paslanmaz çelik kapak
Deoksinükleotid trifosfat (dNTP) seti	Biyotemel	DD0058	PCR reaksiyon bileşeni; her biri 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP olarak tedarik edilir; karıştırılmış ve seyreltilmiş her dNTP 10 mM
Kuru banyo/blok ısıtıcı	Fisher	88860023	Isotemp dijital kuru banyo Kaynatma müstahzarları için
Elektroporasyon küvetleri	VWR	89047-208	Yuvarlak kapaklı 2 mm elektroporasyon küvetleri
Elektroporatör	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz elektroporatör
Etidyum bromür	Fisher	BP102-1	Agaroz jel içinde PCR reaksiyon ürünlerinin ve DNA markörünün görselleştirilmesi
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agaroz jel çalışan tampon bileşeni
Gentamisin	Biobasic	GB0217	Seçici ortamların hazırlanması için
Gliserol	Fisher	G33	Ultra düşük dondurucuda uzun süreli depolama için bakteri stoklarının hazırlanması
İnkübatörde (çalkalama)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Sıvı kültür büyümesi için İnkübatör Çalkalayıcı
İnkübatör (statik)	Fisher	11-690-550D	Isotemp İnkübatör Fırını Katı (LB agar) kültür büyümesi için Model 550D
Aşılama döngüsü	Sarstedt	86.1562.050	Agar plakalarına çizgi kolonileri Aşılama
yayıcı	Sarstedt	86.1569.005	Yayılması agar plakalarına kültür
Lizojen et suyu (LB) suyu, Lennox	Fisher	BP1427	Sıvı büyüme ortamı (20 g/L: 5 g/L sodyum klorür, 10 g/L tripton, 5 g/L maya özütü)
Mikrofüj	Fisher	75002431	Numunelerin santrifüjlenmesi için Sorvall Legend Micro 17
Mini santrifüj	Fisher	S67601B	0.2 mL PCR tüplerinin santrifüjlenmesi
Petri kapları	SPL Yaşam Bilimleri	10090	Katı büyütme ortamları (agar plakaları) için: 90 x 15 mm
Pipetler	Mandel	Çeşitli	Gilson tek kanallı pipetler (P10, P20, P200, P1000)
Güç kaynağı	Biorad	1645050	PowerPac Elektroforez Primerleri için temel güç kaynağı
	IDT	NA	PCR reaksiyon bileşeni; ilgilenilen gene özgü; 100 & mu'da hazırlanmış; Ürün teknik özellik sayfasında belirtildiği gibi
M Sükroz	BioBasic	SB0498	Dönüştürülmüş A. baumannii Taq DNA polimerazdan pFLP2ab plazmitinin çıkarılması için karşı seçici ortamın hazırlanması için
			PCR reaksiyon bileşeni; polimeraz 10x tampon ile birlikte verilir
Termal döngüleyici	Biorad	1861096	PCR için Model T100
Kürdan	Fisher	S24559	Kolonileri agar plakalarına yamalamak için
Trizma tabanı	Sigma	T1503	Agaroz jel çalışan tampon bileşeni
Ultra saf su	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ su arıtma sistemi: ortam ve çözelti hazırlama ve hücre yıkama için ultra saf su
Geniş aralıklı DNA işaretleyici	Biobasic	M103R-2	Bir agaroz jel üzerinde PCR ürünlerinin boyut tayini
Ahşap aşılama çubukları	Fisher	29-801-02	Agar plakalarından kolonilerle kültürlerin aşılanması