Murin Supraklaviküler Kahverengi Yağ Dokusunun Diseksiyonu, Histolojik İşlemi ve Gen Ekspresyon Analizi

Summary

Burada, murin supraklaviküler kahverengi yağ dokusunun diseksiyonu ve histolojik ve gen ekspresyon analizlerinin yapılması için pratik bir prosedür sunuyoruz.

Abstract

Kahverengi yağ dokusu (BAT) aracılı termojenez, metabolizmanın düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ve morfolojisi ve işlevi, farelerde ve insanlarda çevresel uyaranlardan büyük ölçüde etkilenebilir. Şu anda, farelerin üst dorsal kanadındaki iki kürek kemiği arasında bulunan murin interskapular BAT (iBAT), araştırma laboratuvarları tarafından BAT fonksiyonunu incelemek için kullanılan ana BAT deposudur. Son zamanlarda, farelerde, insan supraklaviküler kahverengi yağ dokusuna benzer bir tane de dahil olmak üzere, daha önce bilinmeyen birkaç BAT deposu tanımlandı. iBAT'tan farklı olarak, murin supraklaviküler kahverengi yağ dokusu (scBAT) boynun orta tabakasında bulunur ve bu nedenle kolayca erişilemez.

Yeni tanımlanan fare scBAT'ın çalışmasını kolaylaştırmak için, burada sunulan, bozulmamış scBAT'ı doğum sonrası ve yetişkin farelerden ayırma adımlarını detaylandıran bir protokoldür. scBAT'ın diğer yağ depolarına göre küçük boyutu nedeniyle, prosedürler özellikle scBAT'ı işlemek için değiştirilmiş ve optimize edilmiştir. Bu modifikasyonlar arasında, sonraki qPCR analizinin verimliliğini artırmak için donmuş scBAT örneklerinin hassasiyetini ve homojenizasyonunu artırmak için doku toplama sırasında bir diseksiyon mikroskobunun kullanılması yer almaktadır. Bu optimizasyonlar ile farelerde scBAT'ın tanımlanması, morfolojik görünümü ve moleküler karakterizasyonu belirlenebilir.

Introduction

ABD'de ve dünya çapında artan obezite prevalansı, etiyolojisini anlama ve potansiyel tedavileri belirleme konusunda büyük ilgi uyandırmıştır ^1,2. Yağ dokusu metabolizmada hayati bir rol oynar ve yağ dokusunun düzensizliği obezite gelişimine yol açabilir. Genel olarak beyaz ve kahverengi yağ dokusu olmak üzere iki tip yağ dokusu vardır. Beyaz yağ dokusu (WAT) kimyasal enerjiyi depolayabilir ve endokrin faktörleri salgılayabilirken, kahverengi yağ dokusu (BAT) soğukta ısı üretmek ve vücut ısısını korumak için kimyasal enerji kullanabilir ^3,4. Bu eşsiz yetenek nedeniyle, BAT'ın aktivasyonu ayrıca enerji harcamasını artırabilir ve insülin duyarlılığını artırabilir⁵.

BAT, işlevini, ayrılma proteini 1'in (UCP1)⁶ aracılık ettiği bir süreç olan titremeyen termojenez yoluyla gerçekleştirir. Fareler ve insanlar da dahil olmak üzere memeliler, değişen miktarlarda BAT'ye sahiptir. BAT'ın klasik görüşü, bu yağ dokularının farelerde ve bebeklerde yetişkin insanlara göre daha bol olduğudur. Kürek kemiği arasındaki üst dorsal kanatta bulunan iBAT, farelerde en çok çalışılan BAT deposudur. Radyoizotop görüntüleme ve biyopsi testleri uygulayarak, son çalışmalar yetişkin insanlarda birkaç BAT deposu tanımladı. Derin boyun ve supraklaviküler bölgede bulunan depolar da dahil olmak üzere bazıları daha önce farelerde veya diğer model hayvanlarda^{tanımlanmamıştı} 7,8,9,10,11. Bu BAT depoları arasında yetişkin insanlarda en sık görülen depo scBAT deposudur. İnsanlarda yeni bulunan bu BAT depolarının kökenini ve moleküler katkısını daha iyi anlamak için, farelerde genetik ve moleküler manipülasyonların bu depoların işlevsel rolünü izlemesine ve test etmesine izin veren eşdeğer depoları tanımlamak önemlidir. Bu nedenle, biz ve diğerleri, scBAT ^12,13, torasik perivasküler BAT ^14,15, perirenal BAT¹⁶ ve periaortik BAT¹⁷ dahil olmak üzere farelerde farklı anatomik konumlarda daha önce bilinmeyen birkaç BAT deposu belirledik. Fare scBAT anatomik olarak insan scBAT'a benzer ve morfolojik olarak klasik iBAT'a benzer ve yüksek UCP1¹² seviyelerini ifade eder.

Kolayca diseke edilebilen fare iBAT'ın aksine, scBAT fare boynunun ara katmanında, tükürük bezlerinin altında ve dış şah damarı boyunca bulunur. Bu deponun histolojik ve moleküler analizler için izolasyonu zor olabilir. Burada, doğum sonrası ve yetişkin farelerden scBAT'ın diseke edilmesi ve bu deponun histoloji ve gen ekspresyon analizi için işlenmesi prosedürünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Protocol

Hayvan prosedürleri, Baylor Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Tüm prosedürler 3 haftalık ve 3 aylık C57BL / 6J erkek fareler üzerinde gerçekleştirildi. Diseksiyondan önce, tüm farelere onaylanmış kemirgen karbondioksit ötenazi prosedürü kullanılarak ötenazi yapıldı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. scBAT diseksiyonu

1. Fare karkasını tezgahın üzerine yerleştirin ve cerrahi makası ve ince uçlu forsepsleri %70 etanol ile temizleyin.
2. Kürkü ıslatmak ve kürk kontaminasyonunu en aza indirmek için farenin karın boynuna %70 etanol püskürtün.
3. Köprücük kemiği boyunca yaklaşık 1,5 cm'lik iki taraflı bir kesi yapın.
4. Önceki insizyonun uçlarından, yaklaşık 1 cm uzunluğunda, kulaklara doğru uzunlamasına kesin. Bu, boyun çevresinde kare şeklinde U şeklinde bir kesi oluşturacaktır (Şekil 1A,B).
   NOT: scBAT boynun orta tabakasında yer alır. Bu aşamada deri, deri altı yağ dokusu ve tükürük bezlerinden oluşan yüzeysel tabaka açığa çıkar. Ara tabaka, scBAT ile birlikte juguler venleri ve boyun kaslarını içerir. Derin boyun BAT ile atardamar ve şah damarlarını içeren boynun derin tabakası, iskelet kası çıkarılarak açığa çıkarılır.
5. Fareyi diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve açıkta kalan boynu odağa getirin (Şekil 1C).
   NOT: Bu eklenen adım, scBAT'ın küçük boyutu göz önüne alındığında gerekli olan doku toplama hassasiyetini büyük ölçüde artırır.
6. Kesilen cilt bölümlerini forseps ile kaldırarak tükürük bezlerini tamamen ortaya çıkarın.
7. Cerrahi makas ve forseps kullanarak tükürük bezlerini köprücük kemiği çevresindeki dokuya ve birbirine bağlayan dokuyu ayırın.
8. Tükürük bezlerini kaldırarak scBAT depolarını açığa çıkarın. Dış juguler ven boyunca ve muhtemelen tükürük bezlerinin alt tarafına bağlı olan BAT'ı arayın. Çevreleyen dokuya karşı öne çıkan turuncumsu rengiyle tanımlayın.
9. Hedef yağ dokusunu forseps ile tutun ve tükürük bezlerinden nazikçe soyun.
10. Tükürük bezlerinden ayrıldıktan sonra, boynun her iki tarafındaki depolar tamamen çıkarılana kadar scBAT'ı dış juguler venden ve boynun kas sisteminden ayırmaya devam edin.
11. Kalan bağ dokusunu çıkarmak için forseps kullanarak diseke edilen her scBAT örneğini diseksiyon mikroskobu altında (Şekil 1D,E) inceleyin.
12. Her numuneyi 10 mL fosfat tamponlu salin solüsyonu (PBS) içeren bir cam sintilasyon şişesine yerleştirin ve fareyi mikroskop altından çıkarın.

2. scBAT'ın işlenmesi ve hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması ( Şekil 2A'da gösterilmiştir)

1. PBS'yi (adım 1.12) 10 mL soğuk %4 paraformaldehit (PFA) ile değiştirin ve şişeyi scBAT'ı sabitlemek için gece boyunca 4 °C'de sallanan bir nutatör üzerine yerleştirin.
   NOT: Perfüzyon fiksasyonu, immünohistokimya analizi için daha fazla işleme ihtiyaç duyulduğunda doğum sonrası, özellikle yetişkin farelerde uygulanabilir.
2. Ertesi gün, PFA çözeltisini steril bir transfer pipeti ile flakondan çıkarın ve 10-15 mL PBS ile değiştirin. Şişeyi bir nutator üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sallayın. PBS'yi %0.85 salin solüsyonu ile değiştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika daha sallamaya devam edin.
   NOT: Tuzlu su çözeltisi, DEPC ile arıtılmış suda (RNaz içermeyen) %0.85 salindir (NaCl) w/v'dir. PBS, bu ve sonraki adımda salin çözeltisi ile ikame edilebilir.
3. %0.85 salini bir transfer pipeti ile çıkarın ve şişeye 10 mL %70 Etanol/%0.85 salin solüsyonu ekleyin. Şişeyi gece boyunca veya parafin yerleştirmeye hazır olana kadar 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın.
   NOT:% 0.85 salin mevcut değilse PBS kullanılabilir. scBAT, daha kolay kesitleme ve daha iyi korunmuş doku morfolojisi için mümkün olan en kısa sürede işlenmelidir.
4. Parafin yerleştirmeden önce, dokudan suyu çıkarmak için bir dizi etanol değişimi yoluyla scBAT'ı kurutun.
   1. Başlamak için, bir transfer pipeti ile flakondan% 70 etanol /% 0.85 salin çıkarın ve şişeyi oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir nutatör üzerinde sallayarak 10-15 mL% 95 Dehidrant Alkol ekleyin. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
      NOT: Etanol, kurutucu alkol çözeltileri yerine kullanılabilir.
   2. Ardından, %95 Dehidrant Alkolü 10-15 mL %100 Dehidrant Alkol ile değiştirin ve 1 saat boyunca bir nutatör üzerinde sallamaya devam edin. Yeni %100 Kurutucu Alkol ile yeniden doldurun ve şişedeki scBAT miktarına bağlı olarak birkaç saat veya gece boyunca sallanmaya devam edin.
5. Gömme için scBAT'ı temizlemek için, şişeye 10 mL toluen ekleyin ve scBAT şeffaf olana kadar yaklaşık 6-8 saat bir nutatör üzerinde sallamaya devam edin.
   NOT: Tatmin edici bir takas elde etmek için gereken süre, scBAT'ın boyutuna bağlıdır. Öğleden sonra sızma ve gömmenin gerçekleşebilmesi için sabahları hemen temizlemeye başlanması önerilir.
6. scBAT'ı parafin mumuna gömmek için tolueni çıkarın ve şişeye 10 mL erimiş infiltrasyon parafin mumu ekleyin. Şişeyi 65 °C'de 1 saat fırına koyun. Bu adımı yeni balmumu ile tekrarlayın.
   NOT: Balmumunun tamamen sıvı olduğundan emin olmak için gömme başlamadan önce balmumu peletlerini bir gece fırında eritmeye başlayın.
7. İnfiltrasyon parafin mumunu gömülü parafin mumu ile değiştirin ve şişeyi 1 saat boyunca aynı sıcaklığa yerleştirin. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
   NOT: Sızma aşaması kesintiye uğrayabilir ve daha sonra devam edebilir. Şişeyi fırından çıkarın ve devam etmeye hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın.
8. Dokuyu önce bir doku gömme kalıbına yerleştirerek gömün, kalıba erimiş gömme mumu ekleyin ve dokuyu bir stereomikroskop altında yeniden yönlendirin. Ardından, balmumunun üzerine bir gömme kaseti yerleştirin ve dolana ve gömme kapağı balmumu bloğuna sabitlenene kadar üstüne gömme balmumu dökmeye devam edin. Metal kalıbı çıkarmadan önce balmumunun sertleşmesini ve büzülmesini sağlamak için bloğu gece boyunca 4 °C'lik bir buzdolabına aktarın.
9. scBAT'ı 5-6 μm¹⁸ kalınlığa kadar bir mikrotomla, mikroskop lamı başına üç ila dört bölüm olacak şekilde bölümlere ayırın ve doku kesitlerinin düzleşmesine izin vermek için ~42 °C'de ılık bir parafin bölümü yüzdürme banyosuna yerleştirin.
10. Bölümleri slaytlara aktarın ve suyun slaytlardan damlamasını sağlamak için slaytları yüzdürme banyosuna dik olarak yerleştirin.
11. Slaytları paslanmaz bir boyama rafına aktarın ve rafı gece boyunca kuruması için bir slayt kurutma tezgahına yerleştirin.
    NOT: Parafin slaytları, daha fazla işlem yapılmadan önce oda sıcaklığında uzun süre saklanabilir.
12. H&E boyamayı gerçekleştirin¹⁹. Başlamak için, slaytları bir boyama rafına yerleştirin, ardından rafı 40 saniye boyunca ksilen içeren bir boyama kavanozuna yerleştirin. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
    NOT: Parafin iki aşamadan sonra hala görünüyorsa, devam etmeden önce tamamen çözünmesini bekleyin.
13. Dokuyu yeniden sulandırmak için, sürgülü rafı iki 20 s aşaması için %100 Dehidrant Alkol ile doldurulmuş bir boyama kavanozuna yerleştirin, ardından %95 Dehidrant Alkolde 15 s'lik bir aşama ve ddH_2O'dason 15 s'lik bir durulama.
14. Nükleer boyama elde etmek için slaytları 75 saniye boyunca hematoksilen çözeltisi ile dolu bir boyama kabına yerleştirin, ardından slaytları bir boyama kabında ddH₂O ile 45 saniye durulayın.
    NOT: İstenilen leke rengine bağlı olarak süre ayarlanabilir.
15. Slaytları 15 saniye boyunca HCl-etanol çözeltisi ile doldurulmuş bir boyama kabına daldırarak boyamayı ayırt edin, ardından slaytları 15 saniye boyunca başka bir ddH₂O durulamaya aktarın.
    NOT: HCl-etanol çözeltisi, yayınlanmış bir yönteme¹⁹ göre hazırlanır.
16. Sitoplazmik boyama için, slaytı 15 saniye boyunca bir Eosin Y karşı boyama çözeltisine yerleştirin.
17. Dehidrasyonu bitirmek için slaytları her biri 15 saniye boyunca üç ardışık %95 Dehidrant Alkol çözeltisi aşamasına daldırarak dokuyu kurutun, ardından iki ardışık %100 Dehidrant Alkol banyosu - ilki 15 s ve ikincisi 45 s için.
18. Son olarak, dokuyu organik çözücülere yeniden alıştırmak için slaytları 45 saniye boyunca bir ksilen banyosuna aktarın. Bu adımdan sonra boyama tamamlanır; Dokuyu çözeltiden çıkarın.
19. Her kızağa montaj ortamı uygulayın ve kimyasal bir davlumbazın içine lamel uygulayın. Görüntülemeden önce gece boyunca kurutun. Görüntüleme sonuçları Şekil 2B'de gösterilmiştir.

3. scBAT'ın gen ekspresyon analizi

1. Doku Toplama (öğütme)
   1. ScBAT'ı diseksiyon ettikten sonra, dokuyu hemen bir mikrosantrifüj tüpüne koyun, tüpün üstüne steril bir iğne ile bir delik açın ve sıvı nitrojen içinde dondurun.
      NOT: Burada özetlenen protokolün ana adımları Şekil 3A'da gösterilmektedir. Sıvı nitrojene düşürmeden önce tüpün üst kısmına bir delik açmak, ani basınç değişimi nedeniyle tüpün patlamasını önler.
   2. Plastik bir kabı sıvı nitrojenle doldurun ve ıslanması için bir havaneli ve ince bir spatula bırakın.
      NOT: Dokunun çözülmesini önlemek için tüm prosedür boyunca tüm aletlerin ve doku örneklerinin sıcaklığını mümkün olduğunca soğuk, sıvı nitrojen sıcaklığına yakın tutmak önemlidir. Çözülmüş yağ dokusu çok yapışkandır ve pudralamayı daha zor hale getirir. Aletleri ve s'yi yalnızca kullanımdan hemen önce sıvı nitrojen banyolarından çıkarın.
   3. Her seferinde bir çırpıda donmuş doku örneği alın ve mikrosantrifüj tüpünden harca dökün.
   4. Harca az miktarda sıvı nitrojen ekleyin, ardından donmuş dokuyu tamamen toz haline gelene kadar öğütmek için havaneli kullanın.
      NOT: Doku herhangi bir noktada yumuşamaya veya yapışkan hale gelmeye başlarsa, çözülüyor demektir; Harcın içine daha fazla sıvı nitrojen dökün.
   5. Toz haline getirilmiş dokuyu dikkatlice kazımak ve mikrosantrifüj tüpüne geri aktarmak için ince spatulayı kullanın. Bir spatula ile aktarmadan önce kalan doku parçalarını toplamak için kazıma sırasında harca sıvı nitrojen dökün. Harçtan tüm doku çıkarılana kadar transfer adımlarını tekrarlayın.
   6. Bir sonraki numuneyi öğütmek üzere boşaltmadan önce harcı hafif hizmet tipi bir doku sileceği ve %70 etanol ile temizleyin. Toz halindeki dokuyu -80 °C'lik bir dondurucuda uzun süre saklayın.
2. Toplam RNA izolasyonu
   1. Hazırlık
      1. RNase'i çıkarmak için çalışma tezgahını, pipetleri, uç tutucuları ve tüp raflarını hem %70 etanol hem de yüzey dekontaminantı ile temizleyin.
      2. Santrifüj makinesini 4 °C'ye ulaşacak şekilde çalıştırın.
      3. Elüsyon çözeltisini 70 °C'ye ısıtın.
      4. DNaz I'i, numune başına 5 μL sulandırılmış DNaz I'i 75 μL DNaz seyreltme çözeltisi ile karıştırarak seyreltin. DNase I çözeltisini kullanana kadar buzun üzerine yerleştirin.
   2. Prosedür
      1. Her numune için iki mikrosantrifüj tüpünü, iki kolon tutma tüpünü (iki kapaksız dereceli mikrosantrifüj tüpü) ve bir bağlayıcı mini kolonu etiketleyin.
      2. Her numuneye 500 μL RNA izolasyon çözeltisi ekleyin ve 30 saniye boyunca bir pelet havaneli motoru kullanarak sonikat yapın.
      3. Her numune için bir şırınga alın ve dokuyu daha da parçalamak için 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyin. Şırıngadan sonra katı madde görünmediğinden emin olun.
      4. 250 μL kloroform ekleyin ve numunelerin oda sıcaklığında inkübe etmesi için 5 dakika beklerken ara sıra vorteks yapın.
      5. 21.000 × g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
      6. Üst sulu kısmı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve eşdeğer miktarda %70 etanol (~500 μL) ekleyin.
         NOT: Üst sulu kısım berrak olmalı, alt kısım kırmızı RNA izolasyon solüsyonu olmalı ve iki tabaka arasında bazı istenmeyen katılar bulunmalıdır.
      7. 500 μL yeni lizatı bağlama kolonuna aktarın. 60 saniye boyunca 18.000 × g'da santrifüjleyin ve ardından süzüntüyü atın.
      8. Tüm RNA'yı bağlanma kolonuna almak için kalan lizat ile önceki adımı tekrarlayın.
      9. Bağlama kolonuna 700 μL düşük sertlikte yıkama ekleyin, 30 saniye santrifüjleyin ve süzüntüyü atın.
      10. Her bağlama kolonuna 80 μL seyreltilmiş DNaz I ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
      11. 700 μL yüksek sıkılıkta yıkama ekleyin, 30 saniye santrifüjleyin ve süzüntüyü atın.
      12. 700 μL düşük sıkılıkta yıkama ekleyin, 60 saniye santrifüjleyin ve süzüntüyü atın.
      13. Bağlama kolonlarını 2^{. yeni} kapaksız kolon tutma tüpüne taşıyın ve tüm sıvıların ciltleme kolonundan çıkarıldığından emin olmak için 2 dakika santrifüjleyin.
      14. Bağlayıcı kolonları yeni bir mikrosantrifüj tüpüne taşıyın ve 30 μL ısıtılmış elüsyon çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin.
      15. Mikrosantrifüj tüpünün dibinde ayrıştırılmış RNA'yı toplamak için 2 dakika santrifüjleyin.
      16. Bir spektrofotometre kullanarak toplam RNA konsantrasyonunu ölçün.
          NOT: 2.0'ın altında 260/280 değeri veya 1.8'in altında 260/230 değeri ile gösterilen toplam RNA saflığı düşükse, 3.2.2.12. adımından sonra numuneler bir kez daha düşük sıkılıkta yıkama ile yıkanabilir ve ardından 3.2.2.13 adımına geçmeden önce %80 etanol ile yıkanabilir.
      17. RNA'yı -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
   3. Ters transkripsiyon (RT)
      1. Bir PCR tüp şeridinde, DEPC ile muamele edilmiş suda seyreltilmiş 0.5-1 μg toplam RNA'yı, her RNA örneği için farklı bir kuyucuğa toplam 8 μL'ye ekleyin.
         NOT: Ters transkripsiyon için kullanılan RNA miktarı, üreticinin talimatlarına göre büyütülebilir veya küçültülebilir.
      2. PCR tüpündeki her numuneye 1 μL Oligo dT ve 1 μL dNTP ekleyin. Toplam hacmin numune başına 10 μL olduğundan emin olun.
      3. PCR tüp şeridini bir termocycler'a yerleştirin ve 65 dakika boyunca 5 °C'ye, ardından süresiz olarak 4 °C'ye ayarlayın.
      4. 65 °C'de 5 dakika sonra PCR tüp şeridini çıkarın ve tüpü en az 2 dakika buz üzerine yerleştirin. Buz üzerinde inkübasyondan sonra beş reaktif ekleyin: 4 μL 5x First-Strand tamponu, 2 μL 25 mM MgCl₂, 2 μL 0.1 M DTT, 1 μL RNaz inhibitörü ve 1 μL ters transkriptaz her numuneye. Toplam hacmin şimdi numune başına 20 μL olduğundan emin olun.
      5. PCR tüp şeridini tekrar termocycler'a yerleştirin ve programı 50 dakika boyunca 50 °C'ye, ardından 85 dakika boyunca 5 °C'ye, ardından süresiz olarak 4 °C'ye ayarlayın.
      6. Program 4 °C'ye ulaştığında, şeridi çıkarın ve 1 μL Ribonükleaz H (RNase H) ekleyin.
         NOT: RNase H, RT reaksiyonunda kalan herhangi bir RNA şablonunu çıkarmak için kullanılır; bu adımda, istenen RNA zaten cDNA'ya dönüştürülmelidir.
      7. Şeridi tekrar termodöngüleyiciye yerleştirin ve 37 °C'de 20 dakika ve ardından süresiz olarak 4 °C çalıştırın.
      8. Ters transkripsiyon tamamlandı; bir spektrofotometre kullanarak cDNA konsantrasyonunu ölçün.
      9. cDNA'yı 250 ng / μL'ye seyreltin; cDNA'yı -80 °C veya -20 °C dondurucuda saklayın.
   4. Kantitatif PCR (qPCR)
      1. 96 oyuklu qPCR plakasındaki her primer ve numunenin konumunu düzenlemek için bir elektronik tablo yapın.
         NOT: Primerlerden birinin, 36B4 gibi diğer tüm ilgili genlerin ekspresyonunu normalleştirmek için bir referans gen olması gerekir.
      2. Her "astar + numune" kombinasyonu için bir astar ana karışımı yapın. Her bir qPCR reaksiyon kuyusuna 3 μL Moleküler Biyoloji Sınıfı Su, 5 μL qPCR enzim ana karışımı, 0.5 μL ileri primer ve 0.5 μL ters primer ekleyin, bu da reaksiyon başına 9 μL'ye kadar ekler. Reaksiyon kuyusu başına toplam 10 μL yapmak için reaksiyon başına 1 μL cDNA ekleyin.
         NOT: Standart, her bir "primer + numune" kombinasyonu için üç teknik kopyaya sahip olmaktır, bu nedenle her bir ana karışım yukarıdaki miktarların 4 katı olmalıdır.
      3. Her primer ana karışımına her replikat için 1 μL cDNA ekleyin. Her bir ana karışım 4x ise, her bir numune cDNA'sının 4 μL'sini kendi etiketli tüplerine pipetleyin.
      4. Son olarak, her reaksiyonun 10 μL'sini pipetleyin, elektronik tablo tarafından belirlenen konumlarda 96 oyuklu qPCR plakasına karıştırın.
      5. Plakayı kalın bir yapışkan conta ile kapatın ve ardından 96 oyuklu plakayı 450 × g'da 20 °C'de 2 dakika santrifüjleyin.
         NOT: Numunelerin termodöngü sırasında buharlaşmasını önlemek için plakanın tamamen sızdırmaz olması çok önemlidir. Contayı plakaya, özellikle kenarlara bastırmak için hafif hizmet tipi kağıt mendil silecekleri kullanın.
      6. Plakayı gerçek zamanlı bir PCR cihazında çalıştırın. PCR reaksiyonunu üreticinin talimatlarına göre programlayın: 50 °C'de 2 dakika, ardından 95 °C'de 2 dakika daha ve son olarak 95 °C'de 15 sn ve 60 °C'de 30 s'lik 40 döngü. qPCR gen ekspresyon analizinin sonuçları Şekil 3B'de gösterilmektedir.

Results

Sırtın deri altı tabakasında iki kürek kemiği arasında yer alan iBAT'tan farklı olarak, scBAT boynun orta tabakasında yer alır ve dış juguler ven boyunca büyüdükçe iskelet kası katmanları ile tükürük bezi arasında derinlere uzanır (Şekil 1A). scBAT'ı diseksiyon yapmak iBAT kadar kolay değildir. Burada, postnatal ve yetişkin farelerden sağlam scBAT'ın diseksiyonu için önemli adımları içeren ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz (Şekil 1B,C). Verilen protokol kullanılarak boyun açıldıktan sonra, diseksiyon mikroskobu altında ince bir scBAT tabakası tanımlanabilir ve bağlı tükürük bezinden ve eksternal juguler venden bir çift forseps ile soyulabilir (Şekil 1D,E). Deponun morfolojisini değerlendirmek için, yeni izole edilmiş scBAT, daha önce yayınlanmış bir H&E boyama prosedürü¹⁹ (Şekil 2A) ile birlikte sağlanan işleme prosedürü kullanılarak işlendi. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, scBAT, BAT depolarına özgü doku yapılarına sahiptir ve sağlıklı doğum sonrası ve yetişkin farelerde birçok küçük, multiloküler adipositten oluşur. scBAT'deki gen ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için, sağlanan prosedürler kullanılarak izole scBAT depolarından RNA ekstrakte edildi (Şekil 3A). İlgilenilen genlerin ekspresyon seviyeleri daha sonra standart RT-qPCR yöntemleri ile değerlendirilebilir (Şekil 3A). Şekil 3B'de gösterildiği gibi, BAT gelişiminin ana düzenleyicisi olan Pparg dahil olmak üzere scBAT fonksiyonuna aracılık eden genlerin diferansiyel ekspresyon seviyeleri; Fabp4 ve Glut4, iki besin taşıyıcısı; ve termojenezde yer alan iki gen olan Ucp1 ve Ppargc1a kolayca belirlenebilir. Karşılaştırma için, izole edilmiş iBAT'tan RNA ekstrakte edildi ve yukarıda listelenen genlerin ekspresyonu da sağlanan prosedürler kullanılarak değerlendirildi (Şekil 3A). Bu genlerin ekspresyon seviyeleri, bu iki depo arasında nispeten benzerdir. (Şekil 3B).

Şekil 1: scBAT'ın anatomik yerleşimi ve diseksiyon süreci. (A) scBAT'ın boynun ara tabakasındaki konumu. (B) Deri çıkarılmadan önce ve sonra boynun yüzeysel tabakası. Ölçek çubuğu = 250 μm. Noktalı sarı çizgiler, U şeklindeki kesiyi yaptıktan sonra açığa çıkarılması gereken alanı ana hatlarıyla belirtir. (C) Diseksiyon sırasında görsel netliği artırmak için diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirilmiş bir fare karkasının görüntüsü. (D,E) 3 haftalık ve 3 aylık farelerden scBAT çıkarılmadan önce ve sonra boynun ara tabakasının temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 250 μm. Noktalı sarı çizgiler, açıkta kalan iki taraflı scBAT depolarını özetlemektedir; n = 2 olur. Kısaltmalar: scBAT = supraklaviküler kahverengi yağ dokusu; SFI = yüzeysel katman; SG = tükürük bezi; tr = soluk borusu; jv = dış juguler ven; SM = iskelet kası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: H&E boyama için scBAT işleme. (A) H&E boyama için scBAT işlemenin ana adımlarını gösteren akış şeması. Doku diseke edildikten sonra sırayla sabitlenir, kurutulur, gömülür, kesitlenir ve boyanır. (B) 3 haftalık ve 3 aylık farelerden H&E ile boyanmış scBAT'ın temsili görüntüleri; n = 3 her gelişim aşaması için; ölçek çubuğu = daha düşük büyütmeli görüntüler için 250 μm; Daha yüksek büyütmeli görüntüler için ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: scBAT = supraklaviküler kahverengi yağ dokusu; PFA = paraformaldehit; H&E = hematoksilen ve eozin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Gen ekspresyon analizi için scBAT'tan RNA'nın hazırlanması. (A) RNA izolasyonunun aşamalarını ve scBAT gen ekspresyonunun RT-qPCR analizini gösteren akış şeması. Küçük boyutu ve yumuşak dokusu nedeniyle, scBAT deposunun çırpıda dondurulması ve sıvı nitrojen içinde öğütülmesi, başarılı RNA izolasyonu için çok önemlidir. (B) 3 aylık erkek farelerden izole edilen scBAT ve iBAT'ta Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 ve Ppargc1a dahil olmak üzere işaretleyici genlerin nispi ekspresyonu, n = 5. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. 36B4 normalizasyon için temizlik geni olarak kullanıldı. Kısaltmalar: scBAT = supraklaviküler kahverengi yağ dokusu; RT-qPCR = ters transkripsiyon-kantitatif PCR; LN₂ = sıvı azot. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu protokolde, H&E ve gen ekspresyon analizleri için scBAT'ın diseksiyonu ve işlenmesi prosedürlerini ayrıntılı olarak sunuyoruz. scBAT boynun orta tabakasında bulunduğundan ve büyük damarlar boyunca uzandığından, bu deponun izolasyonu hassas bir teknik gerektirir. Özellikle, depoyu net bir şekilde görebilmek için, fareyi boyun açıldıktan sonra diseksiyon mikroskobu altına yerleştirmenizi öneririz. Tükürük bezinden ve çevresindeki damarlardan scBAT'ı soymak için bir çift süper ince nokta forseps kullanarak, damarların delinmemesine özen gösterilmelidir. Aşırı kanama, scBAT'ın yerini belirlemeyi zorlaştırabilir. H&E boyama için scBAT'ı işlemek için, protokol bölümünde gösterildiği gibi doku işleme için %4 PFA, kurutucu alkoller ve organik bir çözücü olan toluen kullanımını içerecek şekilde yayınlanmış bir protokol^19'un kullanımını küçük değişikliklerle uyarladık. Tüm prosedürün tamamlanması ~ 6 gün sürer ve H & E ile boyanmış slaytlar, boyamanın tamamlanmasından sonraki gün görüntülenebilir.

Başlangıç materyali olarak RNA'nın kullanıldığı RT-qPCR, yağ dokusu biyolojisi alanında gen ekspresyon analizi için en sık kullanılan yöntemdir. scBAT, iBAT'a kıyasla nispeten küçük bir BAT deposu olduğundan, gen ekspresyonu için yeterli RNA elde etmek zor olabilir. RNA verimini artırmak için, dondurulmuşken bir havan tokmağı ve havan kullanarak dokuyu toz haline getirerek başlayarak protokol bölümünde belirtildiği gibi sıralı lizat hazırlama adımlarının uygulanmasını öneririz. Bu lizat hazırlama yöntemini kullanarak, bir yetişkin fareden scBAT'ın gen ekspresyon analizi için yüksek verimli ve yüksek kaliteli bir RNA örneğini başarıyla elde ettik. Bu lizat hazırlama yöntemi, protein lizis tamponu kullanılarak batı lekeleme için scBAT'tan yüksek kaliteli protein lizatları elde etmek için de uygulanabilir.

Araştırmacılar, fare iBAT'ı kullanarak termojenez ve metabolizmada BAT işlevi hakkında önemli bilgiler edindiler. ScBAT da dahil olmak üzere farelerde ve insanlarda daha önce tanınmayan birkaç BAT deposunun yakın zamanda tanımlanması, BAT'ın farelerde ve yetişkin insanlarda fizyolojik katkısını tam olarak anlayabilmemiz için daha fazla çalışmaya ihtiyaç olduğunu ortaya koydu. Özellikle, bu yeni bulunan BAT depolarının termojenez ve bölgesel veya tüm vücut metabolizmasındaki kökenlerini, işlevlerini ve katılımını aydınlatan çalışmalar gereklidir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
%95 Kurutucu Alkol (Flex 95)	Epredia	8201
%100 Kurutucu Alkol (Flex 100)	Epredia	8101
96 oyuklu PCR plakası	Bio-Rad	MLL9601
Aurum Bağlayıcı Mini Sütun	Bio-Rad	7326826
Aurum Yüksek Sıkılıkta Yıkama	Bio-Rad	7326803
Aurum Düşük Sıkılıkta Yıkama	Bio-Rad	7326804
Taban Kalıpları (gömme için)	Tissue-Tek	4122
BD PrecisionGlide İğne 21g x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Dokunmatik Termal Döngüleyici	Bio-Rad	1840148
Kapaksız Mikrosantrifüj Tüpleri 2 mL	Fisherbrand	02-681-453
Santrifüj	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Gerçek Zamanlı PCR Cihazı	Bio-Rad	12011319
Kloroform	Termo Bilimsel Kimyasallar	383760010
Cytoseal 60 Düşük viskoziteli montaj ortamı	Epredia	83104
DEPC ile Arıtılmış Su	Ambion	9906
Diseksiyon Mikroskobu	Nikon
DNaz Seyreltme Çözeltisi	Bio-Rad	7326805
DNaz I	Bio-Rad	7326828
dNTP'ler	Invitrogen	18427013
Elüsyon çözeltisi	Bio-Rad	7326801
EM 400 gömme ortamı parafin	Leica Biosystems	3801320
Eosin Y (% 0,5 a/h)	RICCA	2858-16
Formül R Sızma ortamı parafin	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Solungaç # 3 Hematoksilen	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (HCL-Etanol için)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Gömme Kasetleri	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Koptec'in Saf Etanolü - 200 Korumalı (%70 Etanol için)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Mikrosantrifüj Tüpleri 1.7 mL	Avantor	87003-294
Microseal 'B' Contalar (uyumlu contalar)	Bio-Rad	MSB1001
Mikrotom	Leica Biosystems	RM2245
Moleküler Biyoloji Sınıfı Su	Corning	46-000-CM
Harç Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (%0.85 tuzlu su için)	Fisher Bioreagents	BP358-212
NanoDrop Spektrofotometre	NanoDrop Teknolojileri	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
Parafin Bölümü Flotasyon Banyosu	Boekel Scientific	14792V
Paraformaldehit (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
PCR Tüp Şeridi	Avantor	76318-802
Havaneli Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Havaneli Pelet Motoru	Kimble	749540-0000
Fosfat Tampon Tuzlu Su (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Hassas Model 19 Vakumlu Fırın	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Astar: 36B4  (ileri) 10 μ M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'			Chen laboratuvarı Oligo veritabanı
Primer: 36B4 (ters) 10 μ M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'			Chen lab Oligo veritabanı
Primer: Fabp4 (ileri) 10 μ M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'			Chen laboratuvarı Oligo veritabanı
Primer: Fabp4 (ters) 10 & mu; M 5' CCA, TCT, AGG, GTT, ATG, ATG, CTC, TTC, A, 3'			Chen lab Oligo veritabanı
Astarı: Glut 4 (ileri astar) 10 μ M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'			Chen laboratuvarı Oligo veritabanı
Astar: Glut 4 (ters) 10 & mu; M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'			Chen lab Oligo veritabanı
Primer: PPARg (ileri) 10 μ M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'			Chen lab Oligo veritabanı
Primer: PPARg (yedek) 10 μ M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'			Chen laboratuvarı Oligo veritabanı
Primer: Ppargc1a (ters) 10 μ M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'			Chen lab Oligo veritabanı
Primer: Ppargc1a (ileri) 10 μ M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'			Chen laboratuvarı Oligo veritabanı
Primer: Ucp1 (ileri) 10 μ M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'			Chen laboratuvarı Oligo veritabanı
Primer: Ucp1 (ters) 10 & mu; M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'			Chen lab Oligo veritabanı
RNA izolasyon çözeltisi (PureZol)	Bio-Rad	7326880
RNase Away (yüzey dekontaminant)	Thermo Scientific	1437535
RNase H	NEB	M0297S
Rnaz inhibitörü (RNase Out)	İnvitrojen	10777019
Sintilasyon Şişesi (cam)	Elektron Mikroskobu Fen Bilimleri	72632
Slayt kurutma tezgahı	Elektrotermal (Cole-Parmer)	MH6616
Paslanmaz boyama rafı	Elektron Mikroskobu Bilimleri	70312-54
Stereo mikroskop (gömme için)	Olympus	SZ51
Sugical makas	McKesson	43-1-104
Süper ince nokta Düz Diseksiyon Forseps	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Mikroskop slaytları	Fisher Scientific	12-550-15
Superscript III Ters transkriptaz (5x birinci iplikli tampon ve 0.1M DTT içerir)	Invitrogen	18080044
SUR-VET iğneli şırınga 25 G x 5/8", 1 mL	Terumo	100281
SYBR Green (qPCR enzim ana karışımı)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Manuel Slayt Boyama Seti (kavanoz)	Elektron Mikroskobu Bilimleri	SKU: 62540-01
Toluen	Fisher Kimyasal	T324-1
Transfer pipeti	Avantor	414004-005
Ksilen	Fisher Kimyasal	X3P-1GAL