Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Murin Supraklaviküler Kahverengi Yağ Dokusunun Diseksiyonu, Histolojik İşlemi ve Gen Ekspresyon Analizi

3.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66475

⸱

29 Mart 2024

 ,  ,  ,  , 
1Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 2Department of BioSciences, Rice University

Bu makalede

Özet

Burada, murin supraklaviküler kahverengi yağ dokusunun diseksiyonu ve histolojik ve gen ekspresyon analizlerinin yapılması için pratik bir prosedür sunuyoruz.

Özet

Kahverengi yağ dokusu (BAT) aracılı termojenez, metabolizmanın düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ve morfolojisi ve işlevi, farelerde ve insanlarda çevresel uyaranlardan büyük ölçüde etkilenebilir. Şu anda, farelerin üst dorsal kanadındaki iki kürek kemiği arasında bulunan murin interskapular BAT (iBAT), araştırma laboratuvarları tarafından BAT fonksiyonunu incelemek için kullanılan ana BAT deposudur. Son zamanlarda, farelerde, insan supraklaviküler kahverengi yağ dokusuna benzer bir tane de dahil olmak üzere, daha önce bilinmeyen birkaç BAT deposu tanımlandı. iBAT'tan farklı olarak, murin supraklaviküler kahverengi yağ dokusu (scBAT) boynun orta tabakasında bulunur ve bu nedenle kolayca erişilemez.

Yeni tanımlanan fare scBAT'ın çalışmasını kolaylaştırmak için, burada sunulan, bozulmamış scBAT'ı doğum sonrası ve yetişkin farelerden ayırma adımlarını detaylandıran bir protokoldür. scBAT'ın diğer yağ depolarına göre küçük boyutu nedeniyle, prosedürler özellikle scBAT'ı işlemek için değiştirilmiş ve optimize edilmiştir. Bu modifikasyonlar arasında, sonraki qPCR analizinin verimliliğini artırmak için donmuş scBAT örneklerinin hassasiyetini ve homojenizasyonunu artırmak için doku toplama sırasında bir diseksiyon mikroskobunun kullanılması yer almaktadır. Bu optimizasyonlar ile farelerde scBAT'ın tanımlanması, morfolojik görünümü ve moleküler karakterizasyonu belirlenebilir.

Giriş

ABD'de ve dünya çapında artan obezite prevalansı, etiyolojisini anlama ve potansiyel tedavileri belirleme konusunda büyük ilgi uyandırmıştır 1,2. Yağ dokusu metabolizmada hayati bir rol oynar ve yağ dokusunun düzensizliği obezite gelişimine yol açabilir. Genel olarak beyaz ve kahverengi yağ dokusu olmak üzere iki tip yağ dokusu vardır. Beyaz yağ dokusu (WAT) kimyasal enerjiyi depolayabilir ve endokrin faktörleri salgılayabilirken, kahverengi yağ dokusu (BAT) soğukta ısı üretmek ve vücut ısısını korumak için kimyasal enerji kullanabilir 3,4. Bu eşsiz yetenek nedeniyle, BAT'ın aktivasyonu ayrıca enerji harcamasını artırabilir ve insülin duyarlılığını artırabilir5.

BAT, işlevini, ayrılma proteini 1'in (UCP1)6 aracılık ettiği bir süreç olan titremeyen termojenez yoluyla gerçekleştirir. Fareler ve insanlar da dahil olmak üzere memeliler, değişen miktarlarda BAT'ye sahiptir. BAT'ın klasik görüşü, bu yağ dokularının farelerde ve bebeklerde yetişkin insanlara göre daha bol olduğudur. Kürek kemiği arasındaki üst dorsal kanatta bulunan iBAT, farelerde en çok çalışılan BAT deposudur. Radyoizotop görüntüleme ve biyopsi testleri uygulayarak, son çalışmalar yetişkin insanlarda birkaç BAT deposu tanımladı. Derin boyun ve supraklaviküler bölgede bulunan depolar da dahil olmak üzere bazıları daha önce farelerde veya diğer model hayvanlardatanımlanmamıştı 7,8,9,10,11. Bu BAT depoları arasında yetişkin insanlarda en sık görülen depo scBAT deposudur. İnsanlarda yeni bulunan bu BAT depolarının kökenini ve moleküler katkısını daha iyi anlamak için, farelerde genetik ve moleküler manipülasyonların bu depoların işlevsel rolünü izlemesine ve test etmesine izin veren eşdeğer depoları tanımlamak önemlidir. Bu nedenle, biz ve diğerleri, scBAT 12,13, torasik perivasküler BAT 14,15, perirenal BAT16 ve periaortik BAT17 dahil olmak üzere farelerde farklı anatomik konumlarda daha önce bilinmeyen birkaç BAT deposu belirledik. Fare scBAT anatomik olarak insan scBAT'a benzer ve morfolojik olarak klasik iBAT'a benzer ve yüksek UCP112 seviyelerini ifade eder.

Kolayca diseke edilebilen fare iBAT'ın aksine, scBAT fare boynunun ara katmanında, tükürük bezlerinin altında ve dış şah damarı boyunca bulunur. Bu deponun histolojik ve moleküler analizler için izolasyonu zor olabilir. Burada, doğum sonrası ve yetişkin farelerden scBAT'ın diseke edilmesi ve bu deponun histoloji ve gen ekspresyon analizi için işlenmesi prosedürünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan prosedürleri, Baylor Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Tüm prosedürler 3 haftalık ve 3 aylık C57BL / 6J erkek fareler üzerinde gerçekleştirildi. Diseksiyondan önce, tüm farelere onaylanmış kemirgen karbondioksit ötenazi prosedürü kullanılarak ötenazi yapıldı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. scBAT diseksiyonu

  1. Fare karkasını tezgahın üzerine yerleştirin ve cerrahi makası ve ince uçlu forsepsleri %70 etanol ile temizleyin.
  2. Kürkü ıslatmak ve kürk kontaminasyonunu en aza indirmek için farenin karın boynuna %70 etanol püskürtün.
  3. Köprücük kemiği boyunca yaklaşık 1,5 cm'lik iki taraflı bir kesi yapın.
  4. Önceki insizyonun uçlarından, yaklaşık 1 cm uzunluğunda, kulaklara doğru uzunlamasına kesin. Bu, boyun çevresinde kare şeklinde U şeklinde bir kesi oluşturacaktır (Şekil 1A,B).
    NOT: scBAT boynun orta tabakasında yer alır. Bu aşamada deri, deri altı yağ dokusu ve tükürük bezlerinden oluşan yüzeysel tabaka açığa çıkar. Ara tabaka, scBAT ile birlikte juguler venleri ve boyun kaslarını içerir. Derin boyun BAT ile atardamar ve şah damarlarını içeren boynun derin tabakası, iskelet kası çıkarılarak açığa çıkarılır.
  5. Fareyi diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve açıkta kalan boynu odağa getirin (Şekil 1C).
    NOT: Bu eklenen adım, scBAT'ın küçük boyutu göz önüne alındığında gerekli olan doku toplama hassasiyetini büyük ölçüde artırır.
  6. Kesilen cilt bölümlerini forseps ile kaldırarak tükürük bezlerini tamamen ortaya çıkarın.
  7. Cerrahi makas ve forseps kullanarak tükürük bezlerini köprücük kemiği çevresindeki dokuya ve birbirine bağlayan dokuyu ayırın.
  8. Tükürük bezlerini kaldırarak scBAT depolarını açığa çıkarın. Dış juguler ven boyunca ve muhtemelen tükürük bezlerinin alt tarafına bağlı olan BAT'ı arayın. Çevreleyen dokuya karşı öne çıkan turuncumsu rengiyle tanımlayın.
  9. Hedef yağ dokusunu forseps ile tutun ve tükürük bezlerinden nazikçe soyun.
  10. Tükürük bezlerinden ayrıldıktan sonra, boynun her iki tarafındaki depolar tamamen çıkarılana kadar scBAT'ı dış juguler venden ve boynun kas sisteminden ayırmaya devam edin.
  11. Kalan bağ dokusunu çıkarmak için forseps kullanarak diseke edilen her scBAT örneğini diseksiyon mikroskobu altında (Şekil 1D,E) inceleyin.
  12. Her numuneyi 10 mL fosfat tamponlu salin solüsyonu (PBS) içeren bir cam sintilasyon şişesine yerleştirin ve fareyi mikroskop altından çıkarın.

2. scBAT'ın işlenmesi ve hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması ( Şekil 2A'da gösterilmiştir)

  1. PBS'yi (adım 1.12) 10 mL soğuk %4 paraformaldehit (PFA) ile değiştirin ve şişeyi scBAT'ı sabitlemek için gece boyunca 4 °C'de sallanan bir nutatör üzerine yerleştirin.
    NOT: Perfüzyon fiksasyonu, immünohistokimya analizi için daha fazla işleme ihtiyaç duyulduğunda doğum sonrası, özellikle yetişkin farelerde uygulanabilir.
  2. Ertesi gün, PFA çözeltisini steril bir transfer pipeti ile flakondan çıkarın ve 10-15 mL PBS ile değiştirin. Şişeyi bir nutator üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sallayın. PBS'yi %0.85 salin solüsyonu ile değiştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika daha sallamaya devam edin.
    NOT: Tuzlu su çözeltisi, DEPC ile arıtılmış suda (RNaz içermeyen) %0.85 salindir (NaCl) w/v'dir. PBS, bu ve sonraki adımda salin çözeltisi ile ikame edilebilir.
  3. %0.85 salini bir transfer pipeti ile çıkarın ve şişeye 10 mL %70 Etanol/%0.85 salin solüsyonu ekleyin. Şişeyi gece boyunca veya parafin yerleştirmeye hazır olana kadar 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın.
    NOT:% 0.85 salin mevcut değilse PBS kullanılabilir. scBAT, daha kolay kesitleme ve daha iyi korunmuş doku morfolojisi için mümkün olan en kısa sürede işlenmelidir.
  4. Parafin yerleştirmeden önce, dokudan suyu çıkarmak için bir dizi etanol değişimi yoluyla scBAT'ı kurutun.
    1. Başlamak için, bir transfer pipeti ile flakondan% 70 etanol /% 0.85 salin çıkarın ve şişeyi oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir nutatör üzerinde sallayarak 10-15 mL% 95 Dehidrant Alkol ekleyin. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
      NOT: Etanol, kurutucu alkol çözeltileri yerine kullanılabilir.
    2. Ardından, %95 Dehidrant Alkolü 10-15 mL %100 Dehidrant Alkol ile değiştirin ve 1 saat boyunca bir nutatör üzerinde sallamaya devam edin. Yeni %100 Kurutucu Alkol ile yeniden doldurun ve şişedeki scBAT miktarına bağlı olarak birkaç saat veya gece boyunca sallanmaya devam edin.
  5. Gömme için scBAT'ı temizlemek için, şişeye 10 mL toluen ekleyin ve scBAT şeffaf olana kadar yaklaşık 6-8 saat bir nutatör üzerinde sallamaya devam edin.
    NOT: Tatmin edici bir takas elde etmek için gereken süre, scBAT'ın boyutuna bağlıdır. Öğleden sonra sızma ve gömmenin gerçekleşebilmesi için sabahları hemen temizlemeye başlanması önerilir.
  6. scBAT'ı parafin mumuna gömmek için tolueni çıkarın ve şişeye 10 mL erimiş infiltrasyon parafin mumu ekleyin. Şişeyi 65 °C'de 1 saat fırına koyun. Bu adımı yeni balmumu ile tekrarlayın.
    NOT: Balmumunun tamamen sıvı olduğundan emin olmak için gömme başlamadan önce balmumu peletlerini bir gece fırında eritmeye başlayın.
  7. İnfiltrasyon parafin mumunu gömülü parafin mumu ile değiştirin ve şişeyi 1 saat boyunca aynı sıcaklığa yerleştirin. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
    NOT: Sızma aşaması kesintiye uğrayabilir ve daha sonra devam edebilir. Şişeyi fırından çıkarın ve devam etmeye hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın.
  8. Dokuyu önce bir doku gömme kalıbına yerleştirerek gömün, kalıba erimiş gömme mumu ekleyin ve dokuyu bir stereomikroskop altında yeniden yönlendirin. Ardından, balmumunun üzerine bir gömme kaseti yerleştirin ve dolana ve gömme kapağı balmumu bloğuna sabitlenene kadar üstüne gömme balmumu dökmeye devam edin. Metal kalıbı çıkarmadan önce balmumunun sertleşmesini ve büzülmesini sağlamak için bloğu gece boyunca 4 °C'lik bir buzdolabına aktarın.
  9. scBAT'ı 5-6 μm18 kalınlığa kadar bir mikrotomla, mikroskop lamı başına üç ila dört bölüm olacak şekilde bölümlere ayırın ve doku kesitlerinin düzleşmesine izin vermek için ~42 °C'de ılık bir parafin bölümü yüzdürme banyosuna yerleştirin.
  10. Bölümleri slaytlara aktarın ve suyun slaytlardan damlamasını sağlamak için slaytları yüzdürme banyosuna dik olarak yerleştirin.
  11. Slaytları paslanmaz bir boyama rafına aktarın ve rafı gece boyunca kuruması için bir slayt kurutma tezgahına yerleştirin.
    NOT: Parafin slaytları, daha fazla işlem yapılmadan önce oda sıcaklığında uzun süre saklanabilir.
  12. H&E boyamayı gerçekleştirin19. Başlamak için, slaytları bir boyama rafına yerleştirin, ardından rafı 40 saniye boyunca ksilen içeren bir boyama kavanozuna yerleştirin. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
    NOT: Parafin iki aşamadan sonra hala görünüyorsa, devam etmeden önce tamamen çözünmesini bekleyin.
  13. Dokuyu yeniden sulandırmak için, sürgülü rafı iki 20 s aşaması için %100 Dehidrant Alkol ile doldurulmuş bir boyama kavanozuna yerleştirin, ardından %95 Dehidrant Alkolde 15 s'lik bir aşama ve ddH2O'dason 15 s'lik bir durulama.
  14. Nükleer boyama elde etmek için slaytları 75 saniye boyunca hematoksilen çözeltisi ile dolu bir boyama kabına yerleştirin, ardından slaytları bir boyama kabında ddH2O ile 45 saniye durulayın.
    NOT: İstenilen leke rengine bağlı olarak süre ayarlanabilir.
  15. Slaytları 15 saniye boyunca HCl-etanol çözeltisi ile doldurulmuş bir boyama kabına daldırarak boyamayı ayırt edin, ardından slaytları 15 saniye boyunca başka bir ddH2O durulamaya aktarın.
    NOT: HCl-etanol çözeltisi, yayınlanmış bir yönteme19 göre hazırlanır.
  16. Sitoplazmik boyama için, slaytı 15 saniye boyunca bir Eosin Y karşı boyama çözeltisine yerleştirin.
  17. Dehidrasyonu bitirmek için slaytları her biri 15 saniye boyunca üç ardışık %95 Dehidrant Alkol çözeltisi aşamasına daldırarak dokuyu kurutun, ardından iki ardışık %100 Dehidrant Alkol banyosu - ilki 15 s ve ikincisi 45 s için.
  18. Son olarak, dokuyu organik çözücülere yeniden alıştırmak için slaytları 45 saniye boyunca bir ksilen banyosuna aktarın. Bu adımdan sonra boyama tamamlanır; Dokuyu çözeltiden çıkarın.
  19. Her kızağa montaj ortamı uygulayın ve kimyasal bir davlumbazın içine lamel uygulayın. Görüntülemeden önce gece boyunca kurutun. Görüntüleme sonuçları Şekil 2B'de gösterilmiştir.

3. scBAT'ın gen ekspresyon analizi

  1. Doku Toplama (öğütme)
    1. ScBAT'ı diseksiyon ettikten sonra, dokuyu hemen bir mikrosantrifüj tüpüne koyun, tüpün üstüne steril bir iğne ile bir delik açın ve sıvı nitrojen içinde dondurun.
      NOT: Burada özetlenen protokolün ana adımları Şekil 3A'da gösterilmektedir. Sıvı nitrojene düşürmeden önce tüpün üst kısmına bir delik açmak, ani basınç değişimi nedeniyle tüpün patlamasını önler.
    2. Plastik bir kabı sıvı nitrojenle doldurun ve ıslanması için bir havaneli ve ince bir spatula bırakın.
      NOT: Dokunun çözülmesini önlemek için tüm prosedür boyunca tüm aletlerin ve doku örneklerinin sıcaklığını mümkün olduğunca soğuk, sıvı nitrojen sıcaklığına yakın tutmak önemlidir. Çözülmüş yağ dokusu çok yapışkandır ve pudralamayı daha zor hale getirir. Aletleri ve s'yi yalnızca kullanımdan hemen önce sıvı nitrojen banyolarından çıkarın.
    3. Her seferinde bir çırpıda donmuş doku örneği alın ve mikrosantrifüj tüpünden harca dökün.
    4. Harca az miktarda sıvı nitrojen ekleyin, ardından donmuş dokuyu tamamen toz haline gelene kadar öğütmek için havaneli kullanın.
      NOT: Doku herhangi bir noktada yumuşamaya veya yapışkan hale gelmeye başlarsa, çözülüyor demektir; Harcın içine daha fazla sıvı nitrojen dökün.
    5. Toz haline getirilmiş dokuyu dikkatlice kazımak ve mikrosantrifüj tüpüne geri aktarmak için ince spatulayı kullanın. Bir spatula ile aktarmadan önce kalan doku parçalarını toplamak için kazıma sırasında harca sıvı nitrojen dökün. Harçtan tüm doku çıkarılana kadar transfer adımlarını tekrarlayın.
    6. Bir sonraki numuneyi öğütmek üzere boşaltmadan önce harcı hafif hizmet tipi bir doku sileceği ve %70 etanol ile temizleyin. Toz halindeki dokuyu -80 °C'lik bir dondurucuda uzun süre saklayın.
  2. Toplam RNA izolasyonu
    1. Hazırlık
      1. RNase'i çıkarmak için çalışma tezgahını, pipetleri, uç tutucuları ve tüp raflarını hem %70 etanol hem de yüzey dekontaminantı ile temizleyin.
      2. Santrifüj makinesini 4 °C'ye ulaşacak şekilde çalıştırın.
      3. Elüsyon çözeltisini 70 °C'ye ısıtın.
      4. DNaz I'i, numune başına 5 μL sulandırılmış DNaz I'i 75 μL DNaz seyreltme çözeltisi ile karıştırarak seyreltin. DNase I çözeltisini kullanana kadar buzun üzerine yerleştirin.
    2. Prosedür
      1. Her numune için iki mikrosantrifüj tüpünü, iki kolon tutma tüpünü (iki kapaksız dereceli mikrosantrifüj tüpü) ve bir bağlayıcı mini kolonu etiketleyin.
      2. Her numuneye 500 μL RNA izolasyon çözeltisi ekleyin ve 30 saniye boyunca bir pelet havaneli motoru kullanarak sonikat yapın.
      3. Her numune için bir şırınga alın ve dokuyu daha da parçalamak için 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyin. Şırıngadan sonra katı madde görünmediğinden emin olun.
      4. 250 μL kloroform ekleyin ve numunelerin oda sıcaklığında inkübe etmesi için 5 dakika beklerken ara sıra vorteks yapın.
      5. 21.000 × g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
      6. Üst sulu kısmı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve eşdeğer miktarda %70 etanol (~500 μL) ekleyin.
        NOT: Üst sulu kısım berrak olmalı, alt kısım kırmızı RNA izolasyon solüsyonu olmalı ve iki tabaka arasında bazı istenmeyen katılar bulunmalıdır.
      7. 500 μL yeni lizatı bağlama kolonuna aktarın. 60 saniye boyunca 18.000 × g'da santrifüjleyin ve ardından süzüntüyü atın.
      8. Tüm RNA'yı bağlanma kolonuna almak için kalan lizat ile önceki adımı tekrarlayın.
      9. Bağlama kolonuna 700 μL düşük sertlikte yıkama ekleyin, 30 saniye santrifüjleyin ve süzüntüyü atın.
      10. Her bağlama kolonuna 80 μL seyreltilmiş DNaz I ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
      11. 700 μL yüksek sıkılıkta yıkama ekleyin, 30 saniye santrifüjleyin ve süzüntüyü atın.
      12. 700 μL düşük sıkılıkta yıkama ekleyin, 60 saniye santrifüjleyin ve süzüntüyü atın.
      13. Bağlama kolonlarını 2. yeni kapaksız kolon tutma tüpüne taşıyın ve tüm sıvıların ciltleme kolonundan çıkarıldığından emin olmak için 2 dakika santrifüjleyin.
      14. Bağlayıcı kolonları yeni bir mikrosantrifüj tüpüne taşıyın ve 30 μL ısıtılmış elüsyon çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin.
      15. Mikrosantrifüj tüpünün dibinde ayrıştırılmış RNA'yı toplamak için 2 dakika santrifüjleyin.
      16. Bir spektrofotometre kullanarak toplam RNA konsantrasyonunu ölçün.
        NOT: 2.0'ın altında 260/280 değeri veya 1.8'in altında 260/230 değeri ile gösterilen toplam RNA saflığı düşükse, 3.2.2.12. adımından sonra numuneler bir kez daha düşük sıkılıkta yıkama ile yıkanabilir ve ardından 3.2.2.13 adımına geçmeden önce %80 etanol ile yıkanabilir.
      17. RNA'yı -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
    3. Ters transkripsiyon (RT)
      1. Bir PCR tüp şeridinde, DEPC ile muamele edilmiş suda seyreltilmiş 0.5-1 μg toplam RNA'yı, her RNA örneği için farklı bir kuyucuğa toplam 8 μL'ye ekleyin.
        NOT: Ters transkripsiyon için kullanılan RNA miktarı, üreticinin talimatlarına göre büyütülebilir veya küçültülebilir.
      2. PCR tüpündeki her numuneye 1 μL Oligo dT ve 1 μL dNTP ekleyin. Toplam hacmin numune başına 10 μL olduğundan emin olun.
      3. PCR tüp şeridini bir termocycler'a yerleştirin ve 65 dakika boyunca 5 °C'ye, ardından süresiz olarak 4 °C'ye ayarlayın.
      4. 65 °C'de 5 dakika sonra PCR tüp şeridini çıkarın ve tüpü en az 2 dakika buz üzerine yerleştirin. Buz üzerinde inkübasyondan sonra beş reaktif ekleyin: 4 μL 5x First-Strand tamponu, 2 μL 25 mM MgCl2, 2 μL 0.1 M DTT, 1 μL RNaz inhibitörü ve 1 μL ters transkriptaz her numuneye. Toplam hacmin şimdi numune başına 20 μL olduğundan emin olun.
      5. PCR tüp şeridini tekrar termocycler'a yerleştirin ve programı 50 dakika boyunca 50 °C'ye, ardından 85 dakika boyunca 5 °C'ye, ardından süresiz olarak 4 °C'ye ayarlayın.
      6. Program 4 °C'ye ulaştığında, şeridi çıkarın ve 1 μL Ribonükleaz H (RNase H) ekleyin.
        NOT: RNase H, RT reaksiyonunda kalan herhangi bir RNA şablonunu çıkarmak için kullanılır; bu adımda, istenen RNA zaten cDNA'ya dönüştürülmelidir.
      7. Şeridi tekrar termodöngüleyiciye yerleştirin ve 37 °C'de 20 dakika ve ardından süresiz olarak 4 °C çalıştırın.
      8. Ters transkripsiyon tamamlandı; bir spektrofotometre kullanarak cDNA konsantrasyonunu ölçün.
      9. cDNA'yı 250 ng / μL'ye seyreltin; cDNA'yı -80 °C veya -20 °C dondurucuda saklayın.
    4. Kantitatif PCR (qPCR)
      1. 96 oyuklu qPCR plakasındaki her primer ve numunenin konumunu düzenlemek için bir elektronik tablo yapın.
        NOT: Primerlerden birinin, 36B4 gibi diğer tüm ilgili genlerin ekspresyonunu normalleştirmek için bir referans gen olması gerekir.
      2. Her "astar + numune" kombinasyonu için bir astar ana karışımı yapın. Her bir qPCR reaksiyon kuyusuna 3 μL Moleküler Biyoloji Sınıfı Su, 5 μL qPCR enzim ana karışımı, 0.5 μL ileri primer ve 0.5 μL ters primer ekleyin, bu da reaksiyon başına 9 μL'ye kadar ekler. Reaksiyon kuyusu başına toplam 10 μL yapmak için reaksiyon başına 1 μL cDNA ekleyin.
        NOT: Standart, her bir "primer + numune" kombinasyonu için üç teknik kopyaya sahip olmaktır, bu nedenle her bir ana karışım yukarıdaki miktarların 4 katı olmalıdır.
      3. Her primer ana karışımına her replikat için 1 μL cDNA ekleyin. Her bir ana karışım 4x ise, her bir numune cDNA'sının 4 μL'sini kendi etiketli tüplerine pipetleyin.
      4. Son olarak, her reaksiyonun 10 μL'sini pipetleyin, elektronik tablo tarafından belirlenen konumlarda 96 oyuklu qPCR plakasına karıştırın.
      5. Plakayı kalın bir yapışkan conta ile kapatın ve ardından 96 oyuklu plakayı 450 × g'da 20 °C'de 2 dakika santrifüjleyin.
        NOT: Numunelerin termodöngü sırasında buharlaşmasını önlemek için plakanın tamamen sızdırmaz olması çok önemlidir. Contayı plakaya, özellikle kenarlara bastırmak için hafif hizmet tipi kağıt mendil silecekleri kullanın.
      6. Plakayı gerçek zamanlı bir PCR cihazında çalıştırın. PCR reaksiyonunu üreticinin talimatlarına göre programlayın: 50 °C'de 2 dakika, ardından 95 °C'de 2 dakika daha ve son olarak 95 °C'de 15 sn ve 60 °C'de 30 s'lik 40 döngü. qPCR gen ekspresyon analizinin sonuçları Şekil 3B'de gösterilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sırtın deri altı tabakasında iki kürek kemiği arasında yer alan iBAT'tan farklı olarak, scBAT boynun orta tabakasında yer alır ve dış juguler ven boyunca büyüdükçe iskelet kası katmanları ile tükürük bezi arasında derinlere uzanır (Şekil 1A). scBAT'ı diseksiyon yapmak iBAT kadar kolay değildir. Burada, postnatal ve yetişkin farelerden sağlam scBAT'ın diseksiyonu için önemli adımları içeren ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz (Şekil 1B,C

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolde, H&E ve gen ekspresyon analizleri için scBAT'ın diseksiyonu ve işlenmesi prosedürlerini ayrıntılı olarak sunuyoruz. scBAT boynun orta tabakasında bulunduğundan ve büyük damarlar boyunca uzandığından, bu deponun izolasyonu hassas bir teknik gerektirir. Özellikle, depoyu net bir şekilde görebilmek için, fareyi boyun açıldıktan sonra diseksiyon mikroskobu altına yerleştirmenizi öneririz. Tükürük bezinden ve çevresindeki damarlardan scBAT'ı soymak için bir çift süper ince nokta forseps kullanarak, damarların de...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, NIH'nin NIDDK tarafından R01DK116899 Numaralı Ödül altında, USDA/ARS Ödül Numarası 3092-51000-064-000D altında ve Baylor Tıp Fakültesi Kardiyovasküler Araştırma Enstitüsü'nden bir pilot ödül tarafından desteklenmektedir. Akış şemaları BioRender kullanılarak üretildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%95 Kurutucu Alkol (Flex 95)Epredia8201
%100 Kurutucu Alkol (Flex 100)Epredia8101
96 oyuklu PCR plakasıBio-RadMLL9601
Aurum Bağlayıcı Mini SütunBio-Rad7326826
Aurum Yüksek Sıkılıkta YıkamaBio-Rad7326803
Aurum Düşük Sıkılıkta YıkamaBio-Rad7326804
Taban Kalıpları (gömme için)Tissue-Tek4122
BD PrecisionGlide İğne 21g x 1 1/2"Becton Dickinson305167
C1000 Dokunmatik Termal DöngüleyiciBio-Rad1840148
Kapaksız Mikrosantrifüj Tüpleri 2 mLFisherbrand02-681-453
Santrifüj Eppendorf5430R
CFX Opus 96 Gerçek Zamanlı PCR CihazıBio-Rad12011319
KloroformTermo Bilimsel Kimyasallar383760010
Cytoseal 60 Düşük viskoziteli montaj ortamıEpredia83104
DEPC ile Arıtılmış SuAmbion9906
Diseksiyon MikroskobuNikon
DNaz Seyreltme ÇözeltisiBio-Rad7326805
DNaz IBio-Rad7326828
dNTP'lerInvitrogen18427013
Elüsyon çözeltisiBio-Rad7326801
EM 400 gömme ortamı parafinLeica Biosystems3801320
Eosin Y (% 0,5 a/h)RICCA2858-16
Formül R Sızma ortamı parafinLeica Biosystems3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349Bio ExpressS-3200-2
Solungaç # 3 HematoksilenSigma-AldrichGHS332-1L
HCl (HCL-Etanol için)Fisher ChemicalA142212
IP VI Gömme KasetleriLeica Biosystems39LC-550-5-L
Koptec'in Saf Etanolü - 200 Korumalı (%70 Etanol için)Decon LabsV1001
MgCl2 (25 mM)Thermo Fisher ScientificR0971
Mikrosantrifüj Tüpleri 1.7 mLAvantor87003-294
Microseal 'B' Contalar (uyumlu contalar)Bio-RadMSB1001
MikrotomLeica BiosystemsRM2245
Moleküler Biyoloji Sınıfı SuCorning46-000-CM
Harç Coors TekThomas Scientific60310
NaCl (%0.85 tuzlu su için)Fisher BioreagentsBP358-212
NanoDrop SpektrofotometreNanoDrop TeknolojileriND-1000 UV/Vis
Oligo dTInvitrogen18418020
Parafin Bölümü Flotasyon BanyosuBoekel Scientific14792V
Paraformaldehit (PFA)Sigma-AldrichP6148-500G
PCR Tüp ŞeridiAvantor76318-802
Havaneli Coors TekThomas Scientific60311
Havaneli Pelet MotoruKimble749540-0000
Fosfat Tampon Tuzlu Su (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
Hassas Model 19 Vakumlu Fırın Thermo Fisher ScientificCAT# 51221162
Astar: 36B4  (ileri) 10 μ M
5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'		Chen laboratuvarı Oligo veritabanı
Primer: 36B4 (ters) 10 μ M
5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'		Chen lab Oligo veritabanı
Primer: Fabp4 (ileri) 10 μ M
5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'		Chen laboratuvarı Oligo veritabanı
Primer: Fabp4 (ters) 10 & mu; M
5' CCA, TCT, AGG, GTT, ATG, ATG, CTC, TTC, A, 3'		Chen lab Oligo veritabanı
Astarı: Glut 4 (ileri astar) 10 μ M
5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'		Chen laboratuvarı Oligo veritabanı
Astar: Glut 4 (ters) 10 & mu; M
5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'		Chen lab Oligo veritabanı
Primer: PPARg (ileri) 10 μ M
5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'		Chen lab Oligo veritabanı
Primer: PPARg (yedek) 10 μ M
5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'		Chen laboratuvarı Oligo veritabanı
Primer: Ppargc1a (ters) 10 μ M
5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'		Chen lab Oligo veritabanı
Primer: Ppargc1a (ileri) 10 μ M
5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'		Chen laboratuvarı Oligo veritabanı
Primer: Ucp1 (ileri) 10 μ M
5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'		Chen laboratuvarı Oligo veritabanı
Primer: Ucp1 (ters) 10 & mu; M
5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'		Chen lab Oligo veritabanı
RNA izolasyon çözeltisi (PureZol)Bio-Rad7326880
RNase Away (yüzey dekontaminant)Thermo Scientific1437535
RNase HNEBM0297S
Rnaz inhibitörü (RNase Out)İnvitrojen10777019
Sintilasyon Şişesi (cam)Elektron Mikroskobu Fen Bilimleri72632
Slayt kurutma tezgahı Elektrotermal (Cole-Parmer)MH6616
Paslanmaz boyama rafıElektron Mikroskobu Bilimleri70312-54
Stereo mikroskop (gömme için)OlympusSZ51
Sugical makasMcKesson43-1-104
Süper ince nokta Düz Diseksiyon ForsepsAvantor82027-402
Superfrost Plus Mikroskop slaytlarıFisher Scientific12-550-15
Superscript III Ters transkriptaz (5x birinci iplikli tampon ve 0.1M DTT içerir) Invitrogen18080044
SUR-VET iğneli şırınga 25 G x 5/8", 1 mLTerumo100281
SYBR Green (qPCR enzim ana karışımı)Applied BiosystemsA25778
Tissue-Tek Manuel Slayt Boyama Seti (kavanoz)Elektron Mikroskobu BilimleriSKU: 62540-01
ToluenFisher KimyasalT324-1
Transfer pipetiAvantor414004-005
KsilenFisher KimyasalX3P-1GAL
SMZ1500

Kaynaklar

  1. Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217(2022).
  2. Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
  3. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  4. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
  5. Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530(2021).
  6. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  7. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  8. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  9. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  10. Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
  11. Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
  12. Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166(2017).
  13. Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370(2021).
  14. Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
  15. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
  16. de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
  17. Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
  18. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796(2017).
  19. Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Doku DiseksiyonuHematoksilin Eozin BoyamaRNA İzolasyonuKantitatif PCRDiseksiyon MikroskobuMurin Adipoz Dokusu
Murin Supraklaviküler Kahverengi Yağ Dokusunun Diseksiyonu, Histolojik İşlemi ve Gen Ekspresyon Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.