Burada hemostatik trombüs oluşumu için bir ponksiyon yarası prosedürü sunulmaktadır. Oluşan trombüsler büyüktür ve yüzlerce mikron çapındadır. Bu nedenle, hacim görüntüleme yaklaşımları uygundur. Geniş alanlı transmisyon elektron mikroskobunun birçok kişi için mevcut olan yüksek çözünürlüklü bir yaklaşım olarak monte edilmesini ve hazırlık protokolünü detaylandırmasını öneriyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Delinme Yara Hemostazı ve Montajlı Geniş Alan Elektron Mikroskobu Analizi için Örneklerin Hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Vasküler hasarın normal fizyolojik kontrol süreci olan hemostaz, insan yaşamı için temeldir. Hepimiz zaman zaman küçük kesikler ve delinme yaraları alırız. Hemostazda, kendi kendini sınırlayan trombosit agregasyonu, kanamanın durmasının deliğin dışarıdan kapatılmasından kaynaklandığı yapılandırılmış bir trombüs oluşumuna yol açar. Bu yapının ayrıntılı karakterizasyonu, tıkayıcı pıhtılaşmaya yol açan aşırı trombosit agregasyonu vakası olan hemostaz ve tromboz arasında ayrımlara yol açabilir. Burada, ince kesitli elektron mikroskobunun hemostatik trombüsün içini görselleştirme yeteneğinden yararlanan, ponksiyon yaralı trombüs yapısına yönelik görüntülemeye dayalı bir yaklaşım sunulmaktadır. Herhangi bir görüntülemeye dayalı deney protokolündeki en temel adım, iyi bir numune hazırlamadır. Protokol, sonraki elektron mikroskobu için farelerde delinme yaraları ve trombositten zengin trombüslerin hazırlanması için ayrıntılı prosedürler sağlar. Oluşan delinme yara trombüsünün yerinde fiksasyonu ve daha sonra elektron mikroskobu için boyama ve gömme için işlenmesi için ayrıntılı bir prosedür verilmiştir. Elektron mikroskobu, ardışık kesitleme ile birleştirildiğinde, trombüs iç kısmının ayrıntılarını yüksek çözünürlükte görselleştirme yeteneği nedeniyle son görüntüleme tekniği olarak sunulmaktadır. Bir görüntüleme yöntemi olarak elektron mikroskobu, tarafsız örnekleme ve 2 veya 3 boyutta nanometreden milimetreye kadar ölçeklenen deneysel bir çıktı verir. Tüm delinme yara trombüsü kesitlerinin nanometre ölçeğinde görüntülemesini sağlamak için yüzlerce çerçevenin harmanlanabileceği geniş alanlı elektron mikroskobunu destekleyecek uygun ücretsiz elektron mikroskobu yazılımından bahsedilmektedir. Bu nedenle, görüntü dosyasının herhangi bir alt bölgesi, tam kesit bağlamına kolayca yerleştirilebilir.
Giriş
Kanamanın durmasına yol açan bir delinme yarası trombüsünün oluşumu hayattaki en önemli olaylardan biridir1. Ancak bu gerekliliğe rağmen, trombüs oluşumu sırasında yapısal olarak ne olduğu, bir damarda, bir arterde, bir aterosklerotik olayda veya tıkayıcı bir pıhtı olsun, bilgi çözünürlük ve görüntüleme derinliği ile sınırlıdır. Konvansiyonel ışık mikroskobu, Z1'de 200 ila 300 μm olmak üzere tam formda bir ponksiyon yara trombüsü ile karşılaştırıldığında derinlik açısından ve trombosit organellerinin boyutu ve aralıkları ile karşılaştırıldığında, genellikle 30 nm2'den daha az çözünürlük ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneyler, Arkansas Tıp Bilimleri Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Burada 8-12 haftalık, vahşi tip erkek ve dişi C57BL/6 fareler kullanıldı. Bu fareler, çok az yağ birikimi olan genç yetişkinlerdir. Aynı prosedürler, von Willebrand faktörü veya trombosit glikoprotein VI (GPVI) gibi hemostaz için önemli olan çeşitli proteinler için fare mutantları için de geçerlidir5,6. Kullanılan tüm ekipman, cerrahi aletler, reaktifler ve diğer malzemeler Şekil 1'de gösterilmiş ve
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Delinme yarası kanama süresi üzerindeki ilaç etkilerinin kantitatitasyonu
Delinme yarası kanama süreleri, farelerde kolayca gerçekleştirilebilecek bir ilaç riskinin fizyolojik bir modelini sağlar. Bir delinme yarası deneyinden elde edilen sonuçlar tahmine dayalıdır. Burada dabigatran doz-yanıt kanama eğrisi gösteriliyor. Bir trombin inhibitörü olan dabigatran, DOAC12 olarak adlandırılan oral doğrudan etkili bir anti-pıhtılaştırıcı olarak kullanılır. Juguler ven ponksiyon yara m.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Şah damarlarında ve femoral arterlerde hemostatik trombüs oluşturulması, in situ perfüzyon fiksasyonu ve montajlı geniş alan transmisyon elektron mikroskobu için örnek işleme için ayrıntılı bir ponksiyon yarası prosedürü sunuyoruz. Genel prosedürler, ultrastrüktürel analiz için hemostatik trombüs oluşturmak ve deneysel farelerde, örneğin farklı tip ve dozajlarda farmasötik ilaçlarla tedavi edilen farelerde kanama sürelerini karşılaştırmak için yararlıdır. Kontrol vahşi tip farel.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların bu çalışma ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, Arkansas Tıp Bilimleri Üniversitesi'ndeki meslektaşlarına (Jerry Ware ve Sung W. Rhee), Pennsylvania Üniversitesi'ne (Tim Stalker ve Lawrence Brass), Kentucky Üniversitesi'ne (Sidney W. Whiteheart ve Smita Joshi) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Biyogörüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü'ne (Richard D. Leapman ve Maria A. Aronova) çok şey öğrendik. Yazarlar, Amerikan Kalp Derneği ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü'ne (R01 HL119393, R56 HL119393, R01 BS'ye 155519 ve NIH hibelerinden R01 HL146373 ve R35 HL150818) mali destek için takdirlerini ifade etmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.9 Normal Salin | Solüsyonu Medline | BHL2F7123HH | |
| 27G x 3/4 EXELint kafa derisi damar seti | Medline | NDA26709 | |
| 30G x 1/2 EXELint hipodermik iğneler | Medline | NDA264372 | |
| 33G x 1/2 EXELint özel hipodermik iğneler | Medline | NDA26393 | |
| 50 mL Konik Tüpler | Fisher Scientific | 06-443-20 | |
| Alkol Hazırlama Pedleri (%70 İzopropil Alkol) | Medline | MDS090670Z | |
| Alüminyum Folyo | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Hayvan Isıtma Plakası | Physitemp Aletleri | HP-1M | |
| Araldite GY 502 | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 10900 | |
| Axiocam 305 Renkli R2 Mikroskopi Kamerası | Carl Zeiss Mikroskobu | 426560-9031-000 | |
| BD Luer-Lok Şırıngalar, 20 mL | Medline | B-D303310Z | |
| Kalsiyum | Klorür Fisher Scientific | C79-500 | |
| Hücre Kültürü Kapları 35mm x 10mm | Corning Inc. | ||
| Pamuk Uçlu Aplikatörler | Medline | MDS202055H | |
| DMP-30 Aktivatör Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 13600 | |
| Dodecenyl Süksinik Anhidrit / DDSA | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 13700 | |
| Pansuman Forseps, 5", kavisli, tırtıklı, dar uçlu | Integra Miltex | 6-100 | |
| Pansuman Forseps, 5", standart, tırtıklı | Integra Miltex | 6-6 | |
| EMBED 812 Reçine Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 14900 | |
| Etil Alkol, susuz 200 kanıt | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15055 | |
| Fisherbrand 4 Tüp Rafı | Fisher Scientific | 03-448-17 | |
| Fisherbrand Dijital Zamanlayıcı | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Fisherbrand Tek Şırınga İnfüzyon Pompası | Fisher Scientific | 7801001 | |
| Gazlı Bez Süngerler 2 "x 2" - 4 Katlı | Medline | NON26224H | |
| Glutaraldehit (% 10 Çözelti) | Elektron Mikroskobu Sciences | 16120 | |
| İzofluran Sıvı İnhalan Anestezi, 100 mL | Medline | 66794-017-10 | |
| Kuyumcu Tarzı Mikro-İnce Forseps, Stil 5F | Integra Miltex | 17-305 | 2 çifte ihtiyacınız var. |
| L/S Pompa Borusu, Silikon, L/S 15; 25 Ft | VWR | MFLX96410-15 | |
| L-Aspartik Asit | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Kurşun Nitrat | Fisher Scientific | L-62 | |
| Malakit Yeşili 4 | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 18100 | |
| Masterflex L/S Kolay Yükleme II Pompa Kafası | VWR | MFLX77200-62 | |
| Masterflex L/S Değişken Hızlı Dijital Sürücü | VWR | MFLX07528-10 | |
| MSC Xcelite 5" Tel Kesiciler | Fisher Scientific | 50-191-9855 | |
| Osmiyum Tetroksit %4 Sulu Çözelti | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 19150 | |
| Paraformaldehit (%16 Çözelti) | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15710 | |
| Physitemp Sıcaklık Kontrol Cihazı | Physitemp Aletleri | TCAT-2LV | |
| Potasyum Ferrosiyanür | Sigma-Aldrich | P-8131 | |
| Propilen Oksit, ACS Reaktif | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 20401 | |
| Pyrex Cam Beherler | Fisher Scientific | 02-555-25B | |
| Fareler için Rektal Sıcaklık Probu | Physitemp Aletleri | RET-3 | |
| Scotch Magic Görünmez Bant, 3/4 "x 1000" | 3M Şirket | 305289 | |
| Sodyum Kakodilat Tamponu 0.2M, pH 7.4 | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 11623 | |
| SomnoFlo Düşük Akışlı Elektronik Buharlaştırıcı | Kent Scientific | SF-01 | |
| Fareler için SomnoFlo Başlangıç Kiti | Kent Scientific | SF-MSEKIT | |
| Paslanmaz Çelik Minutyin | Pimleri Güzel Bilimler Araçlar | 26002-10 | |
| Stereomikroskop steREO Discovery.V12 | Carl Zeiss Mikroskobu | 495015-9880-010 | |
| Sylgard 184 Silikon Elastomer | Dünyası Hassas Aletler | SYLG184 | silikon mat |
| Tanik Asit | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 21700 | |
| Tiyokarbohidrazid (TCH) | Sigma-Aldrich | 88535 | |
| Uranil Asetat Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 22400 | |
| Vannas Yaylı Mikro Makas | Güzel Bilim Araçları | 15000-08 | |
| Von Graefe Göz Sargısı Forseps, 2.75", Kavisli, Tırtıklı | Integra Miltex | 18-818 | 2 çifte ihtiyaç var. |
| Wagner Makas | Güzel Bilim Araçları | 14068-12 | |
| Wahl MiniFigura Hayvan Düzeltici | Braintree Scientific | CLP-9868 | |
| Zen Lite Yazılımı | Carl Zeiss Mikroskopi | 410135-1001-000 |
Kaynaklar
- Rhee, S. W., et al. Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates. Comm Biol. 4 (1), 1090(2021).
- Pokrovskaya, I. D., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
