Otomatik Üç Boyutlu Nöron Rekonstrüksiyon Yazılımı Kullanılarak Dendritik Omurga Ölçümü

Dendritik dikenler, genellikle glutamaterjik sinapsların ^1,2 post-sinaptik bölgesini içeren dendritlerin çıkıntılarıdır. Dendritik dikenler, sinaptik plastisite alanında özellikle ilgi çekicidir. Sinaptik kuvvet değiştiğinde omurgalar sıklıkla değişir, uzun süreli sinaptik güçlenmede daha büyük ve daha güçlü hale gelir veya uzun süreli sinaptik depresyonda daha küçük ve daha zayıf hale gelir 3,4,5,6,7. Sinaptik plastisitenin ötesinde, dendritik dikenlerin profili yaşam boyu değişir. Erken gelişimde, bir dendritik omurga oluşumu ve büyümesi dönemi vardır, ardından kararlı bir duruma ulaşana kadar dendritik omurga budaması^{yapılır 8,9,10}. Yaşlanan beyinde omurga kaybı, beyin küçülmesine ve bilişsel gerilemeye eşlik eder¹¹. Ek olarak, birçok nörolojik, nörodejeneratif ve psikiyatrik bozukluk anormal dendritik dikenler ile karakterizedir. Şizofreniden etkilenen bireylerde çoklu beyin bölgeleri, muhtemelen değişmiş sinaptik budamadan kaynaklanan daha az dendritik dikene sahiptir¹². Otizm spektrum bozuklukları ayrıca dendritik omurga patolojileri ile karakterizedir¹³. Dendritik omurga kaybı, hem Alzheimer hem de Parkinson hastalığının ayırt edici özelliğidir^14,15. Dendritik omurga özelliklerine ilişkin araştırmaları kapsayan çok çeşitli araştırma konuları göz önüne alındığında, doğru omurga ölçümü için teknikler büyük önem taşımaktadır.

Boyama, yani Golgi yöntemi veya boya dolgusu yoluyla nöronların etiketlenmesi veya floresan proteinlerin eksprese edilmesi, dendritik omurga görselleştirmesi için yaygın yöntemlerdir 16,17,18. Görselleştirildikten sonra, dikenler çeşitli ücretsiz ve ticari olarak temin edilebilen yazılım istemcileri ile analiz edilebilir. Analizin istenen çıktısı, hangi yazılımın en çok kullanılacağını belirlemede önemli bir faktördür. Fiji, dendritik omurga yoğunluğuna odaklanan sorular için uygun bir yazılım seçeneğidir. Bununla birlikte, bu teknik büyük ölçüde, önyargı potansiyelini ortaya çıkarabilecek zaman alıcı manuel saymaya dayanır. SpineJ gibi yeni eklentiler, otomatik nicelemeye izin vererek ayrıca daha doğru omurga boynu analizine olanak tanır¹⁹. Bu yaklaşımların bir dezavantajı, SpineJ iki boyutlu görüntü yığınlarıyla sınırlı olduğundan, omurga hacmini belirlemek için üç boyutlu bir analizin kaybıdır. Ek olarak, omurga alt tipi bilgisinin elde edilmesi bu süreçlerle zorlaşır. Dört baskın omurga alt tipi, ince, mantar, güdük ve filopodia, hepsi bireysel işlevleri çağrıştırır ve büyük ölçüde morfoloji²⁰ ile sınıflandırılır. İnce dikenler, uzun bir boyun ve tanımlanmış bir kafa ile karakterizedir²¹. Mantar dikenleri çok daha büyük ve belirgin bir omurga kafasına^{sahiptir 22}. Güdük omurgalar kısadır ve baş ile boyun arasında çok az fark vardır²³. Filopodia, uzun, ince boyunlu ve açıkça gözlemlenebilir bir başı olmayan olgunlaşmamış dikenlerdir²⁴. Sınıflandırma değerli bilgiler sağlarken, dikenler bir boyut sürekliliği üzerinde bulunur. Kategorilere ayırma, morfolojik ölçüm aralıklarına^{dayanmaktadır 25,26}. Sınıflandırma için omurgaların manuel olarak ölçülmesi, bu yaklaşımdaki araştırmacılar için lojistik yükü artırır.

Özellikle üç boyutlu dendritik omurga analizine odaklanan diğer yazılım seçenekleri, omurga hacmi ve alt tip özellikleri 27,28,29,30,31 ile ilgili araştırmalar için daha uygundur. Zayıf z-düzlemi çözünürlüğü ve smear gibi üç boyutlu analizin sunduğu zorluğa rağmen, bu yazılım seçenekleri, dendritlerin ve dendritik dikenlerin kullanıcı güdümlü yarı otomatik bir şekilde güvenilir üç boyutlu yeniden yapılandırılmasına izin verir. Tanımlanan omurgaların alt tiplerine göre otomatik olarak sınıflandırılması da bu omurga analizi yazılım paketlerinin bazılarında bulunan bir özelliktir. Bu, potansiyel iş yükü ve deneysel önyargı endişelerini iyileştirebilir. Neurolucida 360, güvenilir ve tekrarlanabilir üç boyutlu dendritik omurga tanımlaması ve sınıflandırmasına olanak tanıyan, ticari olarak temin edilebilen bir yazılımdır³². Burada, bu yazılımı kullanarak sabit dokuyu etkili bir şekilde hazırlamak, görüntüler elde etmek ve nihayetinde dendritik dikenleri ölçmek ve sınıflandırmak için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.

Tüm hayvan prosedürleri, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Intramural Araştırmalarında Hayvanları Kullanma Yönergelerini takip etti ve Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. Sabit hipokampal dilimlerin hazırlanması

1. Fareleri intraperitoneal Ketamin / Xylazine enjeksiyonu ile uyuşturun (Ketamin: 100 mg / kg; Ksilazin: 8 mg / kg). Anesteziyi kuyruk tutamıyla doğrulayın ve fareyi perfüzyon plakasına yapıştırın.
2. Büyük cerrahi makas kullanarak, göğüsteki deriyi ve kürkü çıkarın, bu da alttaki göğüs kafesinin daha kolay görüntülenmesini sağlar.
3. Karaciğer ve diyaframdan kaçınarak göğüs kafesinin genişliğinin altında yatay bir kesim yapın. İnce forseps kullanarak, ksifoid sürecini yukarı çekin ve göğüs kafesinin her iki yan tarafını kesin. Göğüs kafesini boyun bölgesine doğru çevirin ve hemostat forseps kullanarak yerine kenetleyin.
4. Kalbin sol ventrikülüne 21 G'lik bir kelebek iğne yerleştirin ve yaklaşık 5 mL / dk'da 1x PBS oda sıcaklığında perfüze etmeye başlayın. Küçük bir cerrahi makasla sağ kulakçıkta küçük bir kesi yapın. Atriyumdan çıkan çözelti berraklaşana kadar PBS ile perfüzasyon yapın.
5. Tüpe kabarcık girmediğinden emin olmak için perfüzyon pompasını kapatın. Boruyu PBS'den PBS'deki buz gibi soğuk %4 paraformaldehite (PFA) yerleştirin. Hayvan tamamen sertleşene kadar, yaklaşık 25 mL PFA ile 5 mL / dk oranında perfüz.
   NOT: Optimum sabitleme için PFA'nın taze olduğundan emin olun (stok 1°C'de saklanırsa 4 haftadan eski olmamalıdır).
6. Cildi kafatasının yüzeyinden küçük bir cerrahi makasla çıkarın. Kafatasının merkezi çatlağı boyunca küçük cerrahi makasla orta sagital bir kesim yapın. Koku soğancığına ve beyincik üzerinde rostral yanal kesimler yapın.
7. Beyni ortaya çıkarmak için kafatasını ince forseps ile açın. Bir spatula kullanarak beyni koku alma ampullerinden nazikçe çıkarın ve gece boyunca PBS'de %4 PFA'ya yerleştirin.
   NOT: Daha kapsamlı bir kemirgen perfüzyonu protokolü için lütfen Gage ve ^ark.33'e bakın.
8. 1 gün boyunca PBS'deki %4 PFA'yı %15 sükroz ile değiştirerek sabit beyni kriyoprotekte edin. Bunu takiben,% 15 sakarozu% 30 sükroz ile PBS çözeltisinde 1 gün boyunca beyin çözelti içinde batana kadar değiştirin.
9. Beyni sükroz çözeltisinden çıkarın ve PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Bir neşter bıçağı kullanarak beyincik ve koku soğancığını kesin.
10. Numune tutucu yüzeyine 1-2 cm çapında küçük bir miktar optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) yerleştirin. Beyni, OCT'deki kaudal kesim yüzeyi ile numune tutucuya koronal olarak monte edin. Numune tutucuyu gözle görülür şekilde donana kadar, yaklaşık 5-7 dakika toz haline getirilmiş kuru buza yerleştirerek beyni hızlı bir şekilde dondurun.
11. Düzgün kesitler oluşturmak için kriyostatın bıçak açısının 0° ile 5° arasında ayarlandığından emin olun. Optimum dilim düzleştirme için rulo plaka açısını ayarlayın. Özel talimatlar için lütfen ekipman kılavuzuna bakın.
12. Örnek tutucuyu, beynin ventral yüzeyi bıçağa en yakın olacak şekilde kriyostata yerleştirin. Beyni 30 μm dorsal hipokampal bölümlere ayırın ve tüm dilimleri rostral hipokampusa atın.
    NOT: Protokolün bu kısmı, istenen herhangi bir beyin bölgesine uyarlanabilir. Adım 1.9-1.12, ilgilenilen bölgeye bağlı olarak değişecektir.
13. Dorsal hipokampal dilimleri PBS'ye aktarın. Bir boya fırçası kullanarak, hipokampal bölümleri bir mikroskop lamına nazikçe monte edin. Fazla solüsyonu pamuklu çubuklarla veya hassas görev mendilleriyle çıkarın.
14. Tüm beyin dilimlerini kaplayan mikroskop lamına 100 μL sert ayarlı montaj ortamı uygulayın. Kabarcıkları önlemek için, lameli forseps kullanarak montaj ortamına yavaşça indirin. Kabarcıklar oluşursa, kaçmalarına izin vermek için lamellere forseps ile hafifçe vurun. Görüntülemeden önce slaytların gece boyunca ayarlanmasına izin verin.

2. Yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme

1. Floresan hücreleri tanımlamak için düşük büyütmeli göz mercekleri kullanın. 63x (NA = 1.4) veya daha yüksek bir hedefe geçin ve hedefe uygun daldırma ortamı uygulayın.
   NOT: En iyi sonuçlar için, 63x veya daha yüksek objektife sahip bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın.
2. Görüntü elde etmek için sınırlı örtüşme ile iyi etiketlenmiş dendritik segmentleri tanımlayın. Floresan dendritlerin doygun olmadığından emin olmak için lazer gücünü ve kazancını ayarlayın. Ek olarak, tarama hızını azaltmak daha iyi görüntü çözünürlüğü sağlayabilir.
3. Gelecekteki analizler için tüm dendritik segmentleri kapsayan z-yığınları edinin. 10 μm'den daha büyük Z-yığınları, z-düzleminde dendritik örtüşme potansiyeli nedeniyle istenmeyen bir durumdur.
   NOT: Mevcut en küçük z adımlı boyutu (0.2-0.7 μm) ve 1 havadar birim iğne deliği boyutunu kullanın. Daha küçük adım boyutu, z-yığınında daha fazla görüntü ile sonuçlanır ve birçok mikroskobun sınırlı Z çözünürlüğünü telafi eder.
4. İsteğe bağlı: Varsa, görüntüleri dekonvole etmek için mikroskobun ilgili evrişim çözme yazılımı işlevselliğini kullanın. Bu, daha yüksek çözünürlüklü görüntülere izin verecektir.

3. Dendritik omurga ölçümü

1. Neurolucida 360'ı açın (v2022.1.1 veya üstü). Görüntü dosyasını omurga analiz yazılımında açın (Dosya > Görüntüyü > Aç). Görüntü dosyasının ana pencerede ve 3B Ortamda görünür olduğundan emin olun. 3B ortam penceresi görünmezse, İzleme sekmesindeki ana pencerenin üst araç çubuğundaki 3B Ortam'a sol tıklayın (Ek Şekil 1)
   NOT: Protokolün bu bölümü, yalnızca fare dokusundan elde edilen dendritler için değil, herhangi bir dendritik görüntü için uyarlanabilir.
2. 3B Ortam penceresinin Görüntü Görüntüsünü Değiştir sekmesindeyken, görüntünün Görüntüyü Farklı Görüntüle kutusunda 3B Ses Düzeyi olarak görüntülendiğinden emin olun. Görüntü sekmesinin Görüntü Yığını Ayarları kutusunda, Yüzeyi Farklı Göster açılır menüsünde Maksimum Projeksiyon'u seçin. (Ek Şekil 2)
3. İzleme için uygun bir dendritik segment belirleyin.
   1. 3B Ortam penceresinin üst araç çubuğundaki Pivot Noktasını Taşı aracını sol tıklatın. Yeni bir pivot noktası ayarlamak için istediğiniz dendrite sol tıklayın. Bu, etkili yakınlaştırmayı etkinleştirmek için yönü değiştirecektir.
   2. Reset Orientation (Yönlendirmeyi Sıfırla) simgesine sol tıklayarak orijinal yönlendirmeyi yeniden oluşturun. Pivot noktasını ayarladıktan sonra, dendriti izlemeye başlamak için Pivot Noktasını Taşı aracına sol tıklayın. (Ek Şekil 2).
      NOT: İdeal dendrit, koordinat düzlemlerinin herhangi birinde diğer dendritlerle sınırlı örtüşme olan ve başka bir dendrit ile kesişmeyen veya altındaki bir başkasıyla yüzeysel olmayan dendrittir. Komşu dikenlerin izlenen dendrite uygun olmayan şekilde atanmasını önlemek için XY düzlemindeki diğerlerine düşük yakınlıktaki dendritler de tercih edilir. Somadan farklı kalınlık, düzen ve mesafelerdeki dendritlerin farklı dendritik omurga yoğunluklarına sahip olduğuna da dikkat edilmelidir^34,35. Bunun deneysel tasarımda hesaba katılması gerekir. İkincil dereceden dendritler <1.5 μm kalınlıkta izleme için ideal adaylardır (Şekil 1).
4. 3D Ortam penceresinin Ağaç sekmesine sol tıklayın. İzleme modu için User-Guides'ı ve User-Guided Tracing Options'daki yöntem olarak Directional Kernels'i sol tıklayın.
5. İzlemeye başlamak için dairesel bir çekirdek göründüğünde dendrite sol tıklayın. İmleci dendritik segment boyunca hareket ettirin. Bu, çekirdekleri otomatik olarak dolduracaktır. Çekirdekler otomatik olarak doldurulmuyorsa, adım 3.51'e bakın.
   1. Çekirdekler dolana kadar imleci dendrit üzerinde yavaşça ileri geri hareket ettirin. Mevcut algılanan çekirdekleri korumak için sol tıklayın. Çekirdeklerin doldurulması durursa, bir çekirdek dendritin daha aşağısına dolduğunda manuel olarak yerleştirmek için sol tıklayın. İzlemeyi sonlandırmak için sağ tıklayın. İzlenen dendritin en az 7 μm uzunluğunda olduğundan emin olun (Ek Şekil 3).
6. 3B Ortamın üç yönünü de (eğim, sapma ve yuvarlanma) kullanarak, 3B Ortam penceresini sol tıklatıp sürükleyerek dendritik izlemenin doğruluğunu doğrulayın. Dendritik izlemenin dendrit üzerindeki uygun konumun dışında olduğu noktaları belirleyin. Yukarıdan aşağıya doğru bir şekilde izlendiği durumlar olabilir, ancak z boyutunda noktalar dendrit üzerinde değildir (Şekil 2).
7. Düzgün izlenmeyen dendritik segmentleri düzeltmek için, Ağaç menüsündeki Düzenle sekmesine sol tıklayın. İlgilendiğiniz dendriti sol tıklayın, ardından Noktalar'ı sol tıklayın.
8. Yanlış yerleştirilmiş noktaları tıklama ve sürükleme yoluyla dendrit segmentine geri taşıyın. Noktayı sol tıklatıp Sil düğmesini tıklatarak yabancı noktaları silin. Dendrit yeterince doldurulmamışsa noktaların boyutunu değiştirin. Noktanın boyutunu değiştirmek için, bir noktaya sol tıklayın ve boyutu değiştirmek için kalınlık kaydırıcısını ayarlayın (Ek Şekil 4).
   NOT: Yetersiz doldurulmuş dendritler, dendritik segmentin bileşenleri olan yanlış dikenlerin tanımlanmasına neden olabilir. Tersine, dendritlerin aşırı doldurulması gerçek dikenleri gizleyebilir.
9. Adım 3.10'da omurga tanımlamasına geçmeden önce görüntüdeki birden fazla dendrit için 3.3-3.8 adımlarını tekrarlayın.
10. 3D Ortam penceresindeki Omurga sekmesine sol tıklayın. Dış aralık, minimum yükseklik ve minimum voksel sayısı için algılama ayarlarını yapın. Hazırlığa bağlı olarak, değişiklikler için açık ve spesifik bir gerekçe olması durumunda önceden ayarlanmış değerlerin değiştirilmesi gerekebilir. Önceden ayarlanmış koşullar Dış Aralık: 2,5 μm, Minimum Yükseklik: 0,3 μm, Minimum Voksel Sayısı: 10 Voksel'dir.
    NOT: Hücre kültürleri ve akut dokular gibi farklı preparatlar ve farklı gelişimsel zaman noktaları, mevcut literatürden türetilmesi gereken farklı kriterler gerektirecektir. Algılama ayarlarının değiştirilmesinin sonuçları önemli ölçüde değiştirebileceğini unutmamak da çok önemlidir. Örneğin, daha yüksek bir minimum yükseklik kısa dikenleri hariç tutabilir. Algılama ayarları, deneyin tüm seyri boyunca tutarlı kalmalıdır.
11. Dedektör Hassasiyetini %70'e ayarlayın ve Tümünü Algıla'ya sol tıklayın. Bu, tüm dendritler üzerindeki bu dedektör hassasiyeti tarafından tanımlanan dikenleri dolduracaktır. Dikenlerin dendrite özgü bir şekilde seçilmesi isteniyorsa, En Yakın Daldaki Tümünü Algılamak için Görüntüye Tıklayın kutusuna sol tıklayın ve farklı dedektör hassasiyetlerine sahip her bir dendrite manuel olarak sol tıklayın.
    NOT: Bu aşamada, dendritik dikenlerin tümünün çoğalmaması normaldir. Benzer şekilde, diken olmayanlar uygunsuz şekilde doldurulabilir. Başlangıçtaki %70 hassasiyet de esnektir; Bu, hazırlığa bağlı olarak değişebilir.
12. Dendriti her üç yönde de tıklayıp sürükleyerek bu dedektör hassasiyeti tarafından seçilen dikenleri inceleyin. Tespit edilen dikenlerin çoğu tam olarak doldurulmamışsa, adım 3.12.1'e geçin. Tespit edilen dikenler aşırı doldurulmuşsa, adım 3.12.2'ye geçin. Tespit edilen dikenler yeterince doldurulmuş gibi görünüyorsa, adım 3.13'e geçin.
    1. Dedektör Hassasiyetini %5-%10 oranında artırın ve Tümünü Algıla'ya tekrar sol tıklayın. Bu, daha önce tespit edilen tüm dikenleri daha yüksek hassasiyette yenileriyle değiştirecektir. Tespit edilen dikenler yeterince dolana kadar gerektiği kadar tekrarlayın.
    2. Dedektör Hassasiyetini %5-%10 oranında azaltın ve Tümünü Algıla'ya tekrar sol tıklayın. Bu, daha önce tespit edilen tüm dikenleri daha düşük hassasiyette yenileriyle değiştirecektir. Tespit edilen dikenler yeterince dolana kadar gerektiği kadar tekrarlayın.
13. 3B Ortamın Omurga sekmesinde Mevcut Omurgaları Koru'ya sol tıklayın. En Yakın Şubede Tümünü Algılamak için Görüntüye Tıklayın seçiliyse, seçimini kaldırın.
    NOT: Mevcut Dikenleri Koru seçeneğini işaretleyerek, yeni tanımlanan dendritik dikenlerin manuel olarak daha önce tanımlanmış dikenlerin üzerine yazmamasını sağlar. Önceki çalışmanın üzerine yazmamak için devam etmeden önce bu kutunun seçili olduğundan emin olun.
14. Pivot Noktasını Taşı'ya sol tıklayın ve pivot noktasını ayarlamak için daha fazla omurga algılaması gerektiren dendrite sol tıklayın.
    1. Pivot Noktasını Taşı seçimini kaldırın. Doldurulmamış bir dendritik omurgayı tanımlayın. Dedektör Hassasiyetini önceki algılamanın %10-20 ötesine çıkarın ve omurgaya sol tıklayın. Tespit edilen omurga yetersiz veya aşırı doluysa, adım 3.14.3 veya 3.14.4'e geçin. Omurga tam olarak yerleşmezse, Seçilen konumda bir omurga tespit edilemiyor mesajı görünecektir. Bu durumda, adım 3.14.2'ye geçin.
    2. Omurga tespit edilene ve yeterince doldurulana kadar Dedektör Hassasiyetini kademeli olarak, muhtemelen %100'ün üzerine çıkarın. Omurga tespit edilmiş ancak yetersiz doldurulmuşsa, adım 3.14.3'e geçin. Omurga aşırı doldurulmuşsa, adım 3.14.4'e geçin (Şekil 3).
    3. Düzenle sekmesine sol tıklayın ve az doldurulmuş sırta sol tıklayın. Kaldır'a sol tıklayın. Düzenle sekmesinin seçimini kaldırın. Hassasiyeti %5-10 oranında artırın ve omurgaya sol tıklayın. Omurga hala yetersiz doldurulmuşsa bu adımı tekrarlayın.
    4. Düzenle sekmesine sol tıklayın ve aşırı doldurulmuş sırta sol tıklayın. Kaldır'a sol tıklayın. Düzenle sekmesinin seçimini kaldırın. Hassasiyeti %5-10 oranında azaltın ve omurgaya tıklayın. Omurga hala aşırı doluysa bu adımı tekrarlayın.
15. Görsel tanımlama ile tanımlanan tüm dikenler tespit edilene kadar 3.14-3.14.4 adımlarını tekrarlayın. Komşu dendritlere ait herhangi bir diken, gerçek sinyale karşılık gelen yanlış dikenler veya omurga olarak yanlış etiketlenmiş potansiyel dendrit segmentleri için dendriti iki kez kontrol edin. Remove (Kaldır ) işleviyle bu sahte dikenleri silin.
16. Dendrit üzerinde tanımlanan dikenleri inceleyin. Bazı durumlarda, birden fazla diken tek bir konglomera omurga olarak görünebilir. Bir omurga iki kişiyi kapsıyor gibi görünüyorsa, Düzenle sekmesine sol tıklayın. Sırtı sol tıklatın ve Seçimi Gizle'yi sol tıklatın. Bir konglomera omurgasını onayladıktan sonra, Düzenle sekmesinde Seçimi Göster'e sol tıklayın ve Böl'ü seçin. Bir konglomerada ikiden fazla diken varsa, bu adımın tekrarlanması gerekebilir (Şekil 4).
    NOT: Konglomera omurgası adım 3.16'dan sonra ayrılmazsa, omurgayı çıkarın. Ardından, daha düşük bir hassasiyette konglomeranın daha yoğun omurgasını seçin. Daha yoğun omurga dolduğunda, diğer doldurulmamış omurgayı seçmek için hassasiyeti artırın. Alternatif olarak, konglomera omurgasını silmek ve ardından hassasiyeti artırmak, uygun bölünmeye izin verebilir.
17. Görsel olarak tanımlanabilir tüm dikenler algılanıp uygun şekilde doldurulduktan sonra, Omurga sekmesinde, dikenleri dört alt türe ayırmak için Tümünü Sınıflandır'a sol tıklayın: ince, mantar, güdük ve filopodia (Şekil 5).
    NOT: Omurga sınıflandırma parametreleri, Omurga sekmesindeki Sınıflandırma kutusunun Ayarlar penceresinden değiştirilebilir. Dedektör ayarlarında olduğu gibi, mevcut parametreleri değiştirmek için net bir gerekçe şiddetle tavsiye edilir. Önceden ayarlanmış değerler baş-boyun oranı: 1.1, uzunluk-kafa oranı: 2.5, mantar kafası boyutu: 0.35 μm, Filopodium Uzunluğu - 3 μm'dir.
18. 3D Environment (3B Ortam) penceresinin üst araç çubuğunda, Save and View in Neurolucida Explorer'ı seçin. Neurolucida Explorer, verilerin izlemelerden toplandığı yerdir. Çalışma, tüm izleri ve dikenleri içeren bir .dat dosyası olarak kaydedilecektir.
19. Görünüm sekmesindeki Explorer penceresinde, tüm dendritleri ve dikenleri vurgulamak için Tümünü Seç'e sol tıklayın.
20. Üst araç çubuğundaki Analiz sekmesine sol tıklayın. Yapı açılır menüsünü sol tıklayın. Sol tıklama Dallı Yapı Analizi.
21. İlgilenilen değişkenlere bağlı olarak, analizlerden herhangi biri seçilebilir. Omurga yoğunluğu ve ortalama omurga hacmi etrafında odaklanan sorular için en yararlı ikisi, Her Dendrit > Her Ağaç ve Omurga Detayları > Dikenler'dir. Tamam'ı seçtiğinizde veriler iki ayrı pencerede görünür.
22. Daha fazla derleme ve analiz için verileri bir elektronik tabloya kopyalayın.
    NOT: Tek tek ağaç dendrit ile ayrılacak, ancak omurga hacmi olmayacaktır. Elektronik tablodaki sıralama işlevi kullanılarak, omurga ayrıntıları özelliklere göre filtrelenebilir.

Bu analiz yönteminin etkin bir şekilde kullanılması, izleme için dendritik segmentlerin seçimi ile başlar. Şekil 1'de açıklandığı gibi, izleme için ideal dendritler diğer dendritlere yakın değildir. Paralel olarak çalışan dendritler, komşu bir dendritten dikenlerin yanlış tanımlanmasına neden olabilir. Farklı bir z-düzleminde doğrudan kesişen veya dik olarak çalışan dendritler, doğru dendritik izlemeye de önemli zorluklar katar. Dendrit kalınlığındaki farklılıklara dikkat etmek de önemlidir. Daha önce bildirildiği gibi, değişen kalınlıktaki dendritler ile omurga yoğunluğunda önemli farklılıklar vardır36. Aynı dendritte, dallanma noktasından37 artan mesafe ile de farklılıklar olabilir. Aynı düzen ve kalınlıkta, ideal olarak benzer dallanma noktası kökenlerine sahip dendritlerin izlenmesi, dendritik omurga yoğunluğunun mevcut heterojenliğini kontrol edebilir. Bazı preparatlarda dallanma noktasının belirlenmesi mümkün olmayabilir, ancak dendritin kalınlığı dendrit izlemede her zaman kontrol edilebilir bir faktör olmalıdır. Dendritik segmentlerin doğru bir şekilde izlenmesi, bu analizden doğru sonuçlar elde etmek için hayati önem taşır. İzlenen dendritin tüm noktalarının gerçekten dendrit içinde olduğundan emin olmak gerekir. Üç boyutlu dendritin farklı yönlerden görüntülenmesi bu sürece yardımcı olabilir. Şekil 2A,B'de gösterildiği gibi, yukarıdan aşağıya görünüm, düzgün bir şekilde izlenen bir dendrit gibi görünen şeyi gösterir. Yandan görünümde; Bununla birlikte, dendritin kendisinde çok sayıda nokta bulunmaz. Bu sorunlar, Şekil 2C'nin yandan görünümünde mevcut değildir. İzleme sırasında dendritlerin uygun şekilde doldurulmasını sağlamak da hayati önem taşır. Yetersiz doldurulmuş bir dendrit, dendrit parçalarının uygunsuz bir şekilde diken olarak tanımlanmasına neden olabilir. Aşırı doldurulmuş bir dendrit, minimum yükseklik eşiği nedeniyle gerçek dikenlerin tanımlanmasını engelleyebilir. Kullanıcı kılavuzlu izlemenin bu manuel değerlendirmesi, doğru dendritik omurga analizine izin vermek için kritik öneme sahiptir.

Dendritik dikenlerin tanımlanması ayrıca kullanıcı rehberliğinde bir yaklaşım gerektirir. Tek tip dedektör hassasiyet eşiğini ayarlamak için "Tümünü Algıla" işlevini kullanmak birçok nedenden dolayı yetersizdir. "Tümünü Algıla" özelliğini kullanmak, en bariz şekilde belirgin dikenleri tanımlamak için kullanışlıdır, ancak doğrulamak için bu dikenlerin dolgusu kontrol edilmelidir. Başlangıçta "Tümünü Algıla" ile tanımlanan dikenler yetersiz doldurulmuş olabilir. Bunu düzeltmek için, tanımlanan omurga ayrı ayrı silinmeli ve daha sonra daha yüksek bir dedektör hassasiyetinde manuel olarak yeniden tanımlanmalıdır (Şekil 3A-C). Bu, omurganın yeterince doldurulmasını sağlar. Manuel olarak hesaba katılması gereken omurgalar için gerekli dedektör hassasiyetinde önemli bir heterojenlik vardır. Tümünü algılamak için dedektör hassasiyetini artırmak, manuel düzeltme gerektiren aşırı dolu dikenlere neden olabilir (Şekil 3D). Uygun olmayan dedektör hassasiyeti ile ilgili ek bir sorun, birden fazla dikeni kapsayan dolu bir dendritik omurga olan bir konglomera omurgasının uygunsuz bir şekilde oluşturulmasıdır. Birbirine yakın iki diken, tek bir konglomera omurgasında yanlış bir şekilde birleştirilebilir (Şekil 4A,B). Omurga algılama yazılımı, aşırı doldurma ile birleştirilen dikenleri ayırmak için kullanılabilen bir "Split" özelliğine sahiptir. "Bölme" özelliği, tek tek dikenlerin konglomera omurgasından kolayca oluşturulmasına izin verir (Şekil 4C). Doğru dendrit izleme ve dendritik omurga dolgusu, omurga alt tiplerine doğru sınıflandırma sağlar. Omurga sınıflandırması, dolu dikenlerden morfolojiye ve dendritlerden uzaklığa dayanır, bu nedenle süreçteki her adım morfolojik sınıflandırmada bir rol oynar (Şekil 5).

Manuel seçim ve eşikleme gerekliliği nedeniyle, tüm analizler için tek tip bir standardın izlenmesi çok önemlidir. Bu, özellikle birden fazla kullanıcının veri analizine katkıda bulunması durumunda geçerlidir. Analiz yapan tüm araştırmacıların aynı standardı takip ettiğinden emin olmak için, araştırmacılar aynı izlenen dendritlerden gelen verileri karşılaştırmalıdır. Bu, her araştırmacının dikenleri paylaşılan, tek tip kriterlere dayalı olarak kör bir şekilde tanımlamasını sağlayarak deneyci yanlılığı potansiyelini azaltabilir. Yorgunluk nedeniyle tek bir araştırmacıdan günler arasında ve hatta aynı gün içinde yanlılık olasılığı da vardır. Bu, veri analizi süreci boyunca izlenmelidir. Analizin geçerliliğini daha da sağlamak için, ilk sonuçların literatürde yayınlananlarla karşılaştırılması, protokolün etkin bir şekilde takip edilmesini sağlar. Bu karşılaştırmanın yalnızca hazırlık ve parametrelerin paylaşılması durumunda etkili olacağını unutmamak önemlidir. Boyama, floresan sinyallerin alınması, dendritlerin sırası ve kalınlığı veya beyin bölgesindeki farklılıklar farklı sonuçlara katkıda bulunabilir 8,36. Yayınlanmış sonuçların eksik olması durumunda, omurga tanımlamasını doğrulamak için birden fazla araştırmacının kullanılması, analizin güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği konusunda daha fazla güven sağlar. Bu makaleye ek bir analiz klasörü dahil edilmiştir. Bu klasör, dendritik segmentlerin, izlenen dendritlerin, tanımlanmış ve sınıflandırılmış dikenlere sahip izlenen dendritlerin örnek görüntülerinin dosyalarını ve veri çıktısını içerir (Ek Tablo 1, Ek Dosya 1, Ek Dosya 2, Ek Dosya 3 ve Ek Dosya 4). Yeni kullanıcılar, bu belgede açıklanan yordamları uygulamak için bu veri kümesi üzerinde eğitim alabilir. Sağlanan örnek veri kümesinin 'u içinde kullanıcı tarafından oluşturulan sonuçlar, analiz standardının yeniden üretilmesi için kabul edilebilir olarak kabul edilir. Tamamen dolu bir omurganın potansiyel olarak öznel kriterleri ve otomatik olarak tespit edilen omurgaların manuel olarak incelenmesi ihtiyacı nedeniyle, araştırmacılar arasındaki ve araştırmacılar arasındaki varyans, analizin normal bir parçasıdır. Oluşturulan sonuçlar bu eşiği aşarsa; Bununla birlikte, farklı omurga hacimlerinin yanı sıra yanlış şekilde dahil edilen veya dışlanan omurgaların örneklerini belirlemek için yan yana bir karşılaştırma yapılmalıdır. Örnek veri kümesi daha sonra kabul edilebilir eşiğe ulaşılana kadar yeniden analiz edilebilir.

Şekil 1: Dendritik omurga analizi için dendritlerin seçilmesi. (A) THY1-YFP transgenik fare serisindeki CA1 proksimal dendritlerinden alınan z-yığını konfokal görüntülerin 3D hacimli gösterimi. Mavi ovallerde daha kalın birincil dendritler ve pembe ovallerde daha ince, ikincil ve üçüncül dendritler ile dendrit düzeninin heterojenliğine dikkat edin. (B) Dendrit izlemesi için ideal adaylar yeşil ovallerle gösterilir. Kalınlığa ve sınırlı kesişmelere, örtüşmelere ve diğer dendritlere yakınlığa dikkat edin. Kırmızı oval, yüksek kesişmeler, örtüşmeler ve diğer dendritlere yakınlık nedeniyle dendritik izleme için kaçınılması gereken dendritik segmentleri belirtir. Daha kalın, birincil dendritler de izleme için uygun adaylar değildir. Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Dendritik segmentlerin doğru bir şekilde izlenmesi. (A) THY1-YFP transgenik fare hattındaki CA1 proksimal dendritlerinden alınan z-yığını konfokal görüntülerinin, kullanıcı kılavuzlu yönlü çekirdek yöntemi ile izlenecek 3D hacimli gösterimi. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Zayıf dendrit izleme örneği. Dendrit, yukarıdan aşağıya görünümde düzgün bir şekilde izleniyor gibi görünüyor. Yandan görünüm, dendritin dendritten sapan noktalarla yanlış bir şekilde doldurulduğunu gösterir. (C) Uygun bir dendrit izleme örneği. Yukarıdan aşağıya görünüm B'ye benzer görünür, ancak yan görünüm önemli ölçüde farklılık gösterir. C'deki dendrit, dendritten herhangi bir sapma olmadan tamamen doldurularak belirtildiği gibi uygun şekilde izlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Manuel seçim kullanılarak dendritik dikenlerin doğru şekilde doldurulması. (A) Manuel algılamayı bekleyen bir omurganın THY1-YFP transgenik fare hattındaki CA1 proksimal dendritlerinden alınan z-yığını konfokal görüntülerinin 3D hacimli gösterimi. Ölçek çubuğu = 0,5 μm. (B) Yetersiz doldurulmuş bir dendritik omurga örneği. Eksik doldurma nedeniyle hala görülebilen önemli bir floresan sinyali var. (C) Uygun şekilde doldurulmuş bir dendritik omurga örneği. Dolgunun dış kısmında zar zor görülebilen bir "korona" sinyalinin varlığı, dendritik dikenleri doğru bir şekilde doldurmak için standarttır. (D) Aşırı doldurulmuş bir dendritik omurga örneği. Dedektör hassasiyeti çok yüksektir ve bu da omurganın aşırı dolmasına neden olur. Dolgu, floresan sınırlarının ötesine geçti ve neredeyse algılanamayan bir korona var. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Bölünen konglomera dendritik dikenler. (A) THY1-YFP transgenik fare hattındaki CA1 proksimal dendritlerinden alınan z-yığını konfokal görüntülerin yakın mesafede iki diken ile 3D hacimli gösterimi. Ölçek çubuğu = 0.15 μm. (B) Bir konglomera dendritik omurga olarak yanlış doldurulmuş iki bağımsız diken örneği. (C) "Bölme" özelliğinin kullanılmasını takiben, konglomera omurgası iki ayrı uygun şekilde doldurulmuş dendritik dikene bölünür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Dendritik omurganın tanımlanması ve alt tiplere ayrılması. (A) Dendritik omurga ölçümü ve sınıflandırması için izole edilmiş izlenen bir dendritik segmentin THY1-YFP transgenik fare hattındaki CA1 proksimal dendritlerinden alınan z-yığını konfokal görüntülerinin 3D hacimli gösterimi. Ölçek çubuğu = 5 μm. (B) Uygun doldurma ve ayrılmayı sağlamak için tüm dendritik dikenlerin tanımlandığı ve incelendiği izlenen dendritik segment. Yazılım, bu adımda belirlenen dikenlere keyfi olarak renkler atar. (C) Tanımlanan tüm dendritik dikenlerin, yazılımda tanımlanmış parametreler kullanılarak alt tiplere sınıflandırılması. Mavi = mantar, sarı = ince ve yeşil = küt. Bu dokunun yaşı nedeniyle filopodia mevcut değildir. (D) Mantar, ince ve güdük dikenlerin doldurulmamış (üstte) ve dolgulu (altta) temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 0,3 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: 3D Ortama Erişim. Yazılım arayüzünde görüntülenen Z-konfokal görüntü yığını. Ana görüntüleyicideki İzleme sekmesinden 3B Ortam navigasyonu sarı renkle vurgulandı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: 3D Ortam için görüntü parametreleri ve yönlendirme ayarları. Konfokal z-stack görüntüleri için 3D Ortam görüntüleyici. Vurgulanan Görüntüyü Değiştir sekmesindeki sarı oklarla gösterilen parametreler, Görüntüyü Farklı Görüntüle: 3D Hacim ve Yüzeyi Farklı Göster: Maksimum Projeksiyon olarak ayarlanır. Pivot Noktasını Taşı ve Yönü Sıfırla sarı oklarla tanımlanır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Dendrit segment izleme. (A) Dendrit izleme için 3D hacimli z-yığını konfokal görüntüler. Ağaç sekmesi, kullanıcı kılavuzlu ve yönlü çekirdeklerin tümü seçiliyken, izleme, ilk çekirdeğin sol tıklama ile dendrit üzerine yerleştirilmesiyle başlar. (B) İmleç hareketini takiben yönlü çekirdeklerin dendrit boyunca yayılması. (C) Dendritin daha aşağısına sol tıklamak, yönlü çekirdekleri doldurur. (D) Dendrite'i doldurmayan yönlü çekirdek örneği. Bunun yerine, segmentin daha aşağısında yalnız bir çekirdek bulunur. (E) Yalnız çekirdeğe sol tıklamak, iki nokta arasındaki dendriti doldurur. Sağ tıklatma izlemeyi sonlandırır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: İzlenen dendritlerdeki noktaların ayarlanması. (A) İzlenen dendrit segmenti bekleme noktası ayarı. Dendrit düzenleme, "Ağaç" sekmesinin ve "Düzenle" sekmesinin seçilmesini gerektirir. Her ikisi de sarı renkle vurgulanmıştır. Dendrit, sol tıklama ile düzenleme için seçildi. (B) Sarı ile vurgulanan noktalar sekmesinin seçilmesi, dendrit segmenti üzerindeki tek tek noktaların seçilmesine izin verir. Yeşil nokta 1.2 μm kalınlığa sahiptir. (C) Dendriti daha doğru bir şekilde doldurmak için ayarlanmış nokta. Yeşil noktanın yeni kalınlık değeri 0,6 μm'dir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Örnek görüntü analizi sonuçları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Dendritler ve spines.dat ile örnek görüntü izlemeleri Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: dendrites.dat ile örnek izlemeler Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Örnek dendrit görüntüsü file.czi Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: Örnek dendrit görüntüsü file.jpx Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.