Fare Yara Modelleri ve Tek Hücre Süspansiyonlarının Hazırlanması

Özet

Bu çalışma iki önemli deneysel teknik sunmaktadır: yara kapanmasını değerlendirmek için bir murin yara modelinin oluşturulması ve hücresel canlılığı korumak için murin derisinden tek hücreli süspansiyonların hazırlanması.

Özet

Akut tam kat deri yaralanmalarının yönetimi klinik uygulamada önemli bir zorluk teşkil etmektedir. Çeşitli hücre popülasyonlarını ve karmaşık yara mikro çevresini içeren yara iyileşmesinin karmaşıklığı, geleneksel deneysel yaklaşımlar kullanılarak tedavi etkilerinin ve bunların etkileşimlerinin değerlendirilmesini zorlaştırır. Tek hücreli transkriptom dizileme teknolojisi, yara iyileşmesi sırasında hücresel fonksiyonların ve mekanizmaların anlaşılmasında devrim yaratmıştır. Bununla birlikte, fare yara modelleri oluşturma metodolojilerindeki değişkenlik, deneysel sonuçları etkileyebilecek kafa karıştırıcı faktörleri ortaya çıkarmaktadır. Ayrıca, fare deri dokularını ayırma süreci, doğru transkriptom dizilimi için yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlara olan kritik ihtiyacı vurgulayan önemli teknik engeller sunar. Bu nedenle, bu çalışma, sonraki sıralama sonucunu etkileyebilecek değişkenleri ortadan kaldırırken, yara kapanmasındaki değişiklikleri doğru bir şekilde değerlendirmek için fare yara modellerinin yapısını optimize etmeyi amaçlamaktadır. Ek olarak, tek hücreli süspansiyonların hazırlanması, maliyet ve etkinliği optimize etmek için hem enzim hazırlama protokolleri hem de test kiti protokolleri kullanılarak gerçekleştirildi.

Giriş

Fare, insanlara son derece homolog genetik dizilimi, hızlı üremesi, maliyet etkinliği ve yönetilebilir boyutu^{1 nedeniyle araştırmalarda yaygın olarak tanınan bir hayvan modelidir}. Bununla birlikte, fareler ve insanlar arasında cilt yapısında farklılıklar vardır. Fareler, cildin kasılmasına katkıda bulunan ve bu türde yara iyileşmesinde çok önemli bir rol oynayan belirgin bir kutanöz zar tabakasına sahiptir. Buna karşılık, insan yara iyileşmesi öncelikle yeniden epitelizasyon ve granülasyon dokusu oluşumunu içerir¹.

Deri yapısındaki bu türler arası farklılıklara rağmen, fare modeli yara onarımı araştırmalarında tercih edilen seçenek olmaya devam ediyor ve diğer hayvan modellerine kıyasla önemli önemini koruyor^2,3. İnsan yara iyileşme süreçlerini taklit etmek için fare derisi kullanırken, etkileyen çeşitli faktörlerin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi önemlidir. Bu faktörler arasında cerrahi prosedürler için uygun bölgelerin seçilmesi, fare kılı folikül döngüsünün hesaba katılması ve kutanöz membran kasılmasının etkilerinin anlaşılması yer alır^4,5. İlgili önlemlerin uygulanması, deneysel koşulları optimize etmek ve gözlemsel sonuçların doğruluğunu artırmak için hayati önem taşır.

Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi), hücreleri geleneksel RNA dizilimine göre çok daha rafine bir seviyede sıralar ve minimum grup içi farklılıklarla numune kalitesi için çok daha yüksek bir gereksinime sahiptir. Stabil bir fare akut tam kalınlıkta cilt defekti modelini iyileştirmek için çok sayıda deney yapıldı. Bu deneyler, yara iyileşmesini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için literatürden yerleşik yöntemlerin ve yenilikçi yaklaşımların bir kombinasyonunu kullandı^2,5. Yara iyileşme modelini geliştirmek için, yara onarımı ve rejenerasyonunun fizyolojik sürecini çoğaltmak için fare tam kalınlıkta cilt eksizyonu kullanıldı. Amacı, scRNA-seq kullanılarak çeşitli tedavilerin neden olduğu potansiyel değişiklikleri değerlendirmekti. Farelerden cilt dokusu ayrışması, tek hücreli süspansiyonların hazırlanması sırasında düşük hücre canlılığı ve yüksek agregasyon oranları dahil olmak üzere zorluklar ortaya çıkarır⁶. Bu zorluklar, cihaz tıkanması ve anormal hücre yakalama gibi sorunlara neden olabilir ve bu da veri kalitesini tehlikeye atabilir. Tek hücreli dizilemenin önemli maliyeti göz önüne alındığında, tek hücreli süspansiyonun kararlılığını ve güvenilirliğini sağlamak için birden fazla ön deney yapmak çok önemlidir. Bu çalışma, doku ayrışması için en uygun yaklaşımı belirlemek için karışık enzim ayrışmasının ve doku kiti ayrışma yönteminin etkinliğini değerlendirdi^6,7. Bu çalışma, daha derinlemesine araştırmalar için sağlam bir temel oluşturmaktadır.

Protokol

Tüm prosedürler, Çin'deki Çin PLA Genel Hastanesi Yedinci Tıp Merkezi'nin Etik Komitesi tarafından onaylandı. 6 haftalık erkek C57/BL6 fareler kullanıldı.

1. Fare yara iyileşme modeli

1. Hayvan gruplaması
   1. Fareleri rastgele deney ve kontrol gruplarına atayın (her biri 6 adet). Ev fareleri, 23-25 °C'de tutulan sıcaklık, %50-60 nem ve 12 saatlik aydınlık-karanlık döngüsü ile belirli bir patojen içermeyen (SPF) hayvan tesisinde.
   2. Farelere standart yiyeceklere ve otoklavlanmış musluk suyuna sınırsız erişim sağlayın.
2. Ameliyat öncesi hazırlık
   1. Bir sınırlayıcı kullanarak veya fareyi yüzüstü konumda güvenli bir şekilde tutarak fareyi nazikçe tutun. Şırıngaya, 0.1 mL / 20 g vücut ağırlığı dozunda uygulanan, oda sıcaklığına geri getirilmiş% 1 pentobarbital sodyum yükleyin.
      NOT:% 1 pentobarbital sodyum çözeltisi karanlık bir ortamda 4 ° C'de saklanmalıdır.
   2. Farenin karnını alkollü pamuklu çubuklarla temizleyin. Şırıngayı karnın içine hafif bir açıyla yerleştirin. Mesaneye veya bağırsaklara yanlışlıkla uygulanmasını önlemek için enjeksiyondan önce aspire edin. 10 dakika bekleyin.
   3. Fare seğirmeyi durdurduktan ve artık uyaranlara yanıt vermedikten sonra, kuruluğu önlemek için her iki göze de beyaz vazelin uygulayın. Daha uzun sırt kürkünü kesmek için bir tıraş makinesi kullanın.
   4. Sırtınıza tüy dökücü krem sürün, 2 dakika bekleyin ve farenin cildine zarar vermemek için nemli gazlı bezle nazikçe silin. Tüy dökücü kremin uzun süre açık bırakılmadığından emin olun.
   5. Çevredeki cildi üç alternatif swab betadin ve% 70 alkol ile nazikçe dezenfekte edin.
   6. Otoklav cilt biyopsisi zımbası, makas, forseps ve sterilizasyon için diğer aletler. Steril bir çalışma alanı sağlayın. Sonraki ameliyatı yeni bir cerrahi bez üzerinde gerçekleştirin.
3. Tam kalınlıkta cilt eksizyonu
   NOT: Yara iyileşmesi için tedavinin etkinliğini değerlendirmek için yara ateli modeli kullanıldı.
   1. Kalıcı bir işaretleyici kullanarak, farenin sırt bölgesinin üst orta alanını 8 mm çapında bir daire ile işaretleyin.
   2. Temiz forseps kullanarak sırt derisini kaldırın ve ince cerrahi makas kullanarak ilk kesimi yapın. İlk kesimin ardından, kısmen çıkarılan cilt bölgesini forseps kullanarak tutun ve işaretli daireleri dikkatlice kesin.
   3. Özel olarak tasarlanmış paslanmaz çelik bir halka kullanın (iç çap 15 mm, dış çap 18 mm). Metal halkayı 5-0 emilmeyen dikişlerle kesi yerinin çevresine dikin, kesi yeri derisinin kasılmasını önleyin (Şekil 1A). Paslanmayı ve deformasyonu önlemek için halka malzemesi olarak paslanmaz çelik kullanın.
   4. Ameliyat sonrası ağrıyı tedavi etmek için yaranın yakınına tek bir 0.1 mL deri altı %10 buprenorfin hidroklorür seyreltme enjeksiyonu uygulayın.
   5. Tek tek kafesleri temizlemek için fareyi yeniden tanıtın. Fareyi yüzüstü pozisyona getirin. Fare bilincini geri kazanmadan önce fareyi gözetimsiz bırakmayın.
   6. Adım 1.2'de anlatıldığı gibi anesteziyi takiben yara boyutunu ölçmek için her 2 günde bir fare yarasını gözlemleyin ve fotoğraflayın.
4. Biyopsi dokusu elde etmek için yara damgası işaretlemesi
   1. Adım 1.1 ve 1.2'de açıklandığı gibi deneye hazırlanın.
   2. Daire çapı 8 mm ve kare kenar uzunluğu 10 mm olan özelleştirilmiş fare sargısı işaretleme damgaları oluşturun (Şekil 1B).
   3. Fareyi yüzüstü pozisyonda konumlandırın ve sırt derisini alkollü pamuklu çubuklarla dezenfekte edin. Damgayı mürekkebe batırın. Farenin sırtının üst-orta kısmına damga ile bir işaret yapın.
   4. Kas tabakasını tamamen açığa çıkararak cerrahi makas kullanarak sırtın tüm cilt tabakasını dairesel işaret boyunca dikkatlice çıkarın. Yaranın durumuna müdahale etmemek için yarayı pansuman yapmadan açık bırakın. Fareyi temiz ve dezenfekte edilmiş bir ortama yerleştirerek ve yaranın doğal olarak bir kabuk oluşturmasına izin vererek yaranın sterilitesini koruyun.
   5. Ameliyat sonrası ağrıyı tedavi etmek için yaranın yakınına tek bir 0.1 mL deri altı %10 buprenorfin hidroklorür seyreltme enjeksiyonu uygulayın.
   6. Tek tek kafesleri temizlemek için fareyi yeniden tanıtın. Fareyi yüzüstü pozisyona getirin. Fare bilincini geri kazanmadan önce fareyi gözetimsiz bırakmayın.
   7. Adım 1.2'de anlatıldığı gibi anesteziyi takiben yara boyutunu ölçmek için her 2 günde bir fare yarasını gözlemleyin ve fotoğraflayın.
   8. Tedavi uygulamasını 1.4'te tarif edildiği gibi gerçekleştirin
5. Tedavi uygulaması
   1. Fare bilincini geri kazandıktan 4 saat sonra, 1.2.2-1.2.3 adımlarında anlatıldığı gibi anestezi uygulayın.
   2. İstenilen tedaviyi deri altına enjekte edin, burada tedavi grubu için insizyon bölgesi çevresinde 200 μL PBS içinde çözülmüş 100 μg insan göbek kordonu mezenkimal kök hücre türevi eksozom (hucMSC-Exo).
   3. Kontrol grubu için insizyon bölgesinin etrafına deri altından 200 μL PBS enjekte edin.
   4. 1.5.2 ve 1.5.3 adımlarını 14 güne kadar her iki günde bir tekrarlayın. Enjeksiyon bölgesinde herhangi bir şişlik, kızarıklık veya enfeksiyon belirtisi olup olmadığını kontrol edin.

2. Tek hücreli RNA dizilimi için hazırlık

1. Doku toplama ve hazırlama
   1. Anesteziyi adım 1.2.2-1.2.3'te anlatıldığı gibi gerçekleştirin.
   2. Temiz forseps kullanarak sırt derisini kaldırın ve kabukları çıkarın. Yaranın yakınındaki cildi yaklaşık 2^cm2 kesin, yağ dokusunu ve büyük kan damarlarını kesin.
   3. Steril forseps ile deri biyopsisini önceden soğutulmuş 4 mL PBS ile doldurulmuş 6 oyuklu bir plakanın kuyusuna aktarın.
   4. Biyopsiyi görünür kan kalmayana kadar 4 mL PBS ile doldurulmuş yeni kuyucuklara (6 oyuklu plaka) sırayla aktararak PBS ile yıkayın.
   5. Cildi bir neşter ile yaklaşık 2 mm büyüklüğünde parçalar halinde kesin, daha fazla% 0.04 BSA içeren DPBS'de yıkayın ve kalıntıları temizleyin.
2. Enzimatik ayrışma (Şekil 2)
   1. 1 mL Kollajenaz I (10 mg / mL), 1 mL Kollajenaz IV (5 mg / mL), 1 mL Kollajenaz D + Dispas II (15 mg / mL), 1 mL DNaz I (5 mg / mL) ve 6 mL DPBS'yi sindirim solüsyonunu hazırlamak için steril bir konik tüpte birleştirin. Homojenliği sağlamak için bileşenleri iyice karıştırın.
   2. Sindirim solüsyonunu önceden ısıtmak için konik boruyu 10 dakika boyunca 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin.
   3. Dokuya 2.5 mL sindirim çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 70 dakika sindirin, iyice karıştırmak için test tüpünü her 10 dakikada bir çevirin.
   4. Yıkama tamponu ile 70 μm'lik bir süzgeci önceden ıslatın (PBS'de %0,2 BSA). Ayrışmış hücreler ve artık doku parçaları dahil olmak üzere reaksiyon karışımını, süzgeç üzerinde 1 mL geniş delikli bir pipet ucu kullanarak aktarın.
   5. Bu karışımı önceden ıslatılmış 70 μm hücre süzgecinden 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün.
   6. Reaksiyon karışımını sindirilmiş doku ile 300 x g'da, oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti (hücreleri) bir sonraki ayrışma adımı için saklayın.
3. Kırmızı kan hücresi parçalanması
   1. Kırmızı kan hücresi lizis çözeltisini (10x) 1:10 oranında çift damıtılmış su ile seyreltin. Hücreleri konik bir tüpte 1: 10 oranında 1x kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi ile seyreltin.
   2. Karışımı 5 saniye vorteksleyin, oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin ve ardından 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin, hücreleri eşit hacimde DPBS'de yeniden süspanse edin ve buz üzerinde saklayın.
4. Filtrasyon
   1. Hücre süspansiyonunu alın ve 40 μm'lik bir süzgeçten geçirerek yeni bir konik tüpe süzün.
   2. Kalan hücrelerin toplanmasını sağlamak için tüpü 2x 4.5 mL RPMI (%10 FCS) ile durulayın.
   3. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dakika santrifüjlemeye devam edin.
   4. Süpernatanı atın, peleti hafifçe vurun ve hücreleri 50 μL% 0.04 BSA PBS'de geniş delikli uçlarla yeniden süspanse edin. Bu işlem boyunca hücreleri buz üzerinde tutun.
5. Ölü hücre uzaklaştırma
   1. 1 adet bağlayıcı tampon elde etmek için ölü hücre temizleme kiti 20x stok tamponunu nükleaz içermeyen su ile 1:20 oranında karıştırın.
   2. Numuneyi 300 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve 60 mg cilt numunesi için 10 μL ölü hücre giderme mikro boncukları ekleyin.
   3. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 500 μL'ye ulaşana kadar stok tamponu ekleyin. Numuneyi kitte hazırlanan kolona yükleyin ve ayrıştırıcıya takın.
   4. Canlı hücreleri ayırmak için ayrıştırıcı programını çalıştırın. Program sona erdikten sonra, süspansiyonu 30 μm'lik bir filtreden süzün ve eşit hacimde D-PBS.
      ile seyreltin NOT: Damlama hızı gözle görülür şekilde yavaşlarsa, yabancı maddelerin gözenekleri tıkamasını ve hücre iyileşmesini etkilemesini önlemek için sütunu derhal değiştirin.
   5. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak Akridin Portakal / Propidyum İyodür (AO / PI) boyama ve hücre sayımı gerçekleştirin. Aşağıdaki kabul kriterlerini kullanın: hücre canlılığı %85≥, hücre agregasyon oranı < %20 ve görünür kırmızı kan hücreleri veya hücre parçaları yok.
6. Çok dokulu ayrışma kiti için ayrışma prosedürü (Alternatif)
   1. 2.5 mL RPMI 1640, 100 μL Enzim D, 50 μL Enzim R ve 12.5 μL Enzim A1'i yumuşak bir MACS C tüpüne (Çoklu Doku Ayrışma Kitinden bileşenler) karıştırın.
   2. Dokuyu enzim karışımını içeren yumuşak MACS C tüpüne aktarın ve sıkıca kapatın.
   3. Tüpü 37 ° C'de 90 dakika boyunca bir su banyosuna yerleştirin ve ayrışma çözeltisine yeterli doku maruziyetini sağlamak için her 10 dakikada bir hafifçe ters çevirin.
   4. Ayrışma solüsyonunu atın ve dokuları DPBS ile yıkayın.
   5. Tek hücreli süspansiyonları sırayla 70 μm ve 40 μm hücre süzgeçlerinden geçirin ve 4 °C'de 300 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
   6. Adım 2.3 ile aynı prosedürü izleyerek kırmızı kan hücresi lizis reaktifini kullanarak kırmızı kan hücrelerini parçalayın.
   7. Adım 2.5^{8'deki prosedürün aynısını izleyerek ölü hücre temizleme kitini kullanarak ölü hücreleri çıkarın}.
   8. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak AO/PI boyama ve hücre sayımı gerçekleştirin. Aşağıdaki kabul kriterlerini kullanın: hücre canlılığı %85≥, hücre agregasyon oranı < %20 ve görünür kırmızı kan hücreleri veya hücre parçaları yok.

Sonuçlar

Prosedürün birden fazla varyasyonu araştırılmıştır. Yara iyileşme sürecine minimum düzeyde müdahale ettikleri ve yara bütünlüğünü kaşınma ve dikiş gibi etkilerden korudukları için damgalama protokolleri tercih edilmiştir. Bu yaklaşımın amacı, sonraki sekanslama aşaması için tek hücre düzeyinde gürültü oluşmasını önlemektir. Farelerin her iki yanına yara oluşturulması, fare derisinin doğal elastikiyeti nedeniyle yara alanında belirgin farklılıklara yol açmıştır (Şekil 3A,B). ...

Tartışma

Protokolün başarısı için birkaç önemli adım gerekliydi. Bu adımlar, kapsamlı tıraş ve temizlik yoluyla yara bölgesinin hassas bir şekilde hazırlanmasını, belirli boyut ve derinlikte standartlaştırılmış yaralar oluşturulmasını ve enfeksiyonları izlemek ve uygun tedavileri uygulamak için yara sonrası özenli bakımı içeriyordu. Bu prosedürlerin standardizasyonu, deneysel koşullar arasında tutarlılığı sağladı ve böylece sonuçların güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini artırdı¹⁰.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 75 Alcolchol	Liuhe	JIUJING500ML
C57 / BL6J fareler	Charles River Laboratories
Kollajenaz D + Dispase II	Roche	11088858001
Kollajenaz I	Roche	5349907103
Kollajenaz IV	Roche	5267439001
Pamuklu Çubuklar	Haishi	MIANQIAN
Ölü Hücre Temizleme Kiti	Miltenyi Biotec	130-090-10
DNase I	Roche	10104159001
gentleMAC Ayrıştırıcı	Miltenyi Biotec	130-093-235
Tıbbi naylon iplik	Jinlong	HM507
Çoklu Doku Ayrışma Kiti 1	Miltenyi Biotec	130-110-201
yumruk biyopsi iğnesi	Integra Miltex
kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi	Miltenyi Biotec	130-094-183
Cerrahi Makas	Jinglu	JIANDAO
Beyaz vazelin	Shangyuan	BAIFANSHILIN