Burada, insan özofagus organoidlerinin kültürü ve hava-sıvı arayüz kültürü için bir protokol sağlanmıştır. Özofagus organoidlerinin hava-sıvı arayüz kültürü, sitokinlerin özofagus epitel bariyeri üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Eozinofilik Özofajitte Epitel Bariyerini Araştırmak İçin Üç Boyutlu Hücre Kültürü Modelleri
Bu makalede
Özet
Özet
Özofagusun skuamöz epiteli doğrudan çevreye maruz kalır ve sürekli olarak gıda antijenleri ve mikroplar dahil olmak üzere yabancı antijenlerle karşı karşıya kalır. Epitel bariyerinin bütünlüğünün korunması, enfeksiyonları önlemek ve zararsız gıda kaynaklı antijenlerin neden olduğu iltihaplanmayı önlemek için kritik öneme sahiptir. Bu makale, doku homeostazı ve hastalığı bağlamında özofagusun epitel kompartmanını incelemek için hasta biyopsilerinden insan özofagus organoidleri ve hava-sıvı arayüz kültürleri oluşturmak için basitleştirilmiş protokoller sunmaktadır. Bu protokoller, son on yılda, hastadan türetilen birincil hücrelerden, organoidlerden ve hava-sıvı arayüz kültürlerinden üç boyutlu organ benzeri yapıları tanımlayan önemli bilimsel kilometre taşları olmuştur. Donörün fenotipik ve genetik özelliklerini korurken, özofagus epitelinde spesifik sitokinlerin, büyüme faktörlerinin ve sinyal yollarının işlevini üç boyutlu bir çerçeve içinde araştırma imkanı sunarlar. Organoidler, sitokin stimülasyonu sonrası transkriptom ve proteomu değerlendirerek doku mikromimarisi hakkında bilgi sağlar. Buna karşılık, hava-sıvı arayüz kültürleri, transepitelyal direnç (TEER) veya makromolekül akı ölçümleri yoluyla epitel bariyer bütünlüğünün değerlendirilmesine izin verir. Bu organoidleri ve hava-sıvı arayüz kültürlerini birleştirmek, bozulmuş özofagus epitel bariyeri koşullarında araştırmaları ilerletmek için güçlü bir araçtır.
Giriş
Özofagus iltihabı, özofagusun Th2 baskın kronik inflamatuar bir hastalığı olan eozinofilik özofajitte (EoE) gözlendiği gibi epitel bariyer bütünlüğünü 1,2,3,4,5 tehlikeye atar 6. EoE ilk olarak 1990'larda 7,8 tanımlanmıştır ve ağırlıklı olarak gıda antijenleri 9,10,11,12,13 tarafından ind....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Prosedürler Kuzeybatı ve Orta İsviçre etik komitesi (EKNZ; Proje Kimliği 2019-00273). Tüm hastalar endoskopik incelemeden önce biyopsilerin deneysel kullanımı için yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler. Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Hasta kaynaklı özofagus organoidleri için hücre izolasyonu
NOT: İnsan özofagus organoidlerinin kültürlenmesi için ortam bileşenlerinin bir listesi Tablo 1'de verilmiştir.
- Biyopsileri alın.
NOT: Bu çalışmada, biyopsi forseps ile özofagogastroduodenoskopi sırasında 2.8 m....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Özofagus organoidleri, ters çevrilmiş bir parlak alan mikroskobu ile belgelendiği gibi, sağlanan protokolün talimatlarına göre hasta biyopsilerinden ekstrakte edilen birincil hücrelerden büyüyecektir (Şekil 1). Epitelyal ASC'ler, izole edilen hücreleri bazal membran ekstraktında tohumladıktan sonra kültürün ilk iki günü içinde kendi kendini organize eden bir şekilde hücre kümeleri oluşturmaya başlar ve bir iskele görevi görür. Ters çevrilmiş parlak alan mikroskobu ile fark edilebilen hücre k.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Sağlanan prosedürler, başarı olasılığı yüksek olan hasta kaynaklı organoidlerin ve ALI kültürlerinin yetiştirilmesine izin verir. Organoid protokolü, insan özofagus organoidlerinin26 oluşumunu bildiren ilk yayınlanan protokolden ve yakın zamanda yayınlanan bir protokolden32 uyarlanmıştır. Sherill ve meslektaşları ALI model22'yi tanımladılar. Organoidler ve ALI kültür modelleri, EoE 5,26 gibi .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
SNSF'nin J.H.N.'ye verdiği 310030_219210 no'lu hibe, bu el yazmasının herhangi bir kısıtlama olmaksızın yayınlanmasını destekledi. Şekil 1 , BioRender.com yardımıyla oluşturulmuştur.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1250 ve mikro; L Griptip - Filtre | Integra | 4445 | |
| 300 & mikro; L Griptip - Filtre | Integra | 4435 | |
| 70 &mikro; M hücre süzgeci | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Askorbik Asit | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Sığır hipofiz özü | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Kalsiyum klorür | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Hücre Kültürü Çok Kuyulu Plakalar Süspansiyon kültürleri için CELLSTAR | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex Temel Membran Özü (BME), Tip 2, Pathclear R | & D Sistemleri (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO), %>99,5 BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
| Dispase I | Corning | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Otomatik Hücre Sayacı | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Hücre sayma slaydı | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü, Hücre Süzgeci Geçmeli | Kapaklı Falcon | 352235 | |
| Floresan izotiyosiyanat (FITC)-dekstran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | ortalama mol ağırlık 3000-5000 |
| Heraeus - Megafüj 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| İnsan rekombinant epidermal büyüme faktörü | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Keratinosit-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penisilin-Streptomisin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Rekombinant İnsan KGF/FGF-7 Protein R | & D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Vidalı kapaklı tüp, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Tek Kanallı EVOLVE 100-1000 & mikro; L | Integra | 3018 | |
| Tek Kanallı EVOLVE 20-200 & L | Integra | 3016 | |
| Şırınga 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Glisin max (soya fasulyesi) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Tripsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 dihidroklorür | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
Kaynaklar
- Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
- Davis, B. P., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
