Yöntem makalesi

Doğurganlığın Korunması Uygulanan Genç Hastalarda Yumurtalık Rezervini Değerlendirmek için Z-Skorları

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66504

⸱

25 Ekim 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Obstetrics and Gynecology, Department of Clinical Science, Intervention and Technology, Karolinska Institutet, 2Department of Gynecology and Reproductive Medicine, Karolinska University Hospital, 3Applied Tumor Genomics Research Program, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 4Department of Medical and Clinical Genetics, Medicum, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 5Children's Hospital, Pediatric Research Centre, University of Helsinki and Helsinki University Hospital, 6NORDFERTIL Research Lab Stockholm, Department of Women's, and Children's Health, Karolinska Institutet, and Karolinska University Hospital, 7Department of Obstetrics and Gynecology, Helsinki University Hospital, University of Helsinki, 8Department of Cell and Molecular Biology, Uppsala University, 9Department of Women's and Children's Health, Uppsala University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonu yoluyla doğurganlığın korunmasına ihtiyaç duyan 25 yaşın altındaki hastalarda yumurtalık rezervinin değerlendirilmesi için bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yöntem şunları içerir: (1) kortikal örneklerde yumurtalık rezervinin histolojik değerlendirmesi, (2) bir referans veri seti ile karşılaştırma ve (3) Z-skorlarının hesaplanması.

Özet

Kadınlar, yumurtalık rezervi olarak adlandırılan, yenilenemeyen bir yumurtalık folikülü havuzuyla doğarlar. Bu rezerv yumurtalıklardaki ilkel foliküllerden oluşur ve genetik ve endokrin bozukluklar, tıbbi müdahaleler ve endokrin bozucular gibi birçok faktörden etkilenebilir. Gonadotoksik tedaviler gerekli olduğunda doğurganlığın korunması önerilir. Kadınlar için tercih edilen seçenekler oosit ve embriyo kriyoprezervasyonudur. Bununla birlikte, çok genç, cinsel olarak olgunlaşmamış hastalarda, yumurtalık dokusunun kriyoprezervasyonu tek seçenektir. Dondurularak saklanmış doku örneklerinin foliküler yoğunluğunu bilmek, genç hastalar için doğurganlık danışmanlığında çok önemlidir. Bu protokol, doğurganlığın korunması geçiren 25 yaş ve altı kızlarda ve genç kadınlarda yumurtalık dokusunun kalitesini değerlendirmek için bir araç olarak kortikal folikül yoğunluğu için Z-skorlarının kullanımını göstermektedir. Hasta örneklerindeki folikül yoğunluğu, standarttan olası sapmaları tahmin etmek için Hassan ve ark. tarafından geliştirilen yaşa göre normalleştirilmiş referans standartlarla karşılaştırılır. Folikül yoğunluğu histolojik miktar tayini ile ölçülür. Bunun için, küçük bir yumurtalık kortikal dokusu parçası (~ 2 mm x 2 mm x 2 mm) Bouin veya formaldehit çözeltisine sabitlenir, parafin içine gömülür, 4 μm kalınlığında kesit alınır, hematoksilen ve eozin ile boyanır ve bir slayt tarayıcı kullanılarak sayısallaştırılır. Kortekste bulunan foliküler aşamalar ilkelden birincil foliküllere kadar değişir. Histolojik kesitlerde kortikal alan yüzey epitelinden 1 mm uzaktaydı. Folikül yoğunluğu, Schmidt ve ark. tarafından sunulan modifiye edilmiş bir formül kullanılarak hesaplanır ve Z-skoru, referans ortalama ve standart sapma kullanılarak belirlenir. Z-skoru, ölçülen değerin referans ortalamadan ne kadar saptığını gösterir ve azalmış (<-1.7 Z-skoru) yumurtalık rezervini belirler. Bu yöntemle, folikül yoğunlukları, doğurganlığın korunmasına ihtiyaç duyan genç hastalar için değerli bir yumurtalık rezervi ölçüsü olarak kullanılabilir.

Giriş

Yumurtalık, bir dış korteks ve bir iç medulladan oluşan dinamik, endokrinolojik olarak aktif bir organdır. Yumurtalıklar içinde heterojen olarak dağılmış, stromal granüloza hücreleri1 ile çevrili gonadal oosit içeren foliküllerdir. Tüm foliküller fetal gelişim sırasında zaten oluşmuştur, yaklaşık 20 haftalık gebelik haftasında zirve yapar ve ardından üstel bir düşüş olur. Doğumda korteks içinde 1-2 milyon ilkel folikül kalır ve ergenlik2'ye kadar sadece birkaç yüz bin folikül hayatta kalır. Yumurtalık rezervi olarak da adlandırılan büyümeyen folikül havuzu, diğer faktörlerin yanı sıra bir kadının doğurganlığını etkiler. Yumurtalık rezervi korteks içinde bulunur ve foliküller büyüyüp olgunlaştıkça medullaya doğru hareket eder. Bazı araştırmacılar yumurtalık rezervinin sadece ilkel foliküllerden oluştuğunu kabul ederken, diğerleri tüm unilaminar folikülleri (yani ilkel, ara ve birincil) içerir3,4,5,6. Bir kadının yaşamı boyunca, sadece 300-400 folikül olgunlaşır ve sonunda yumurtlama geçirmek için hayatta kalır. Menopoz, folikül sayısı yaklaşık bine düştüğünde başlar ve bu tipik olarak yaklaşık 50 yaşında ortaya çıkar 2,7. Şu anda, ksenotransplantasyondan sonra oosit oluşturabilen yetişkin insan yumurtalıklarında oogonial kök hücrelerin (OSC'ler) varlığı ile ilgili devam eden bir tartışma vardır. Bazı çalışmalar, ilkel germ hücrelerinin bir gen profilini ifade eden ve oositlerefarklılaşan hücrelerin izole edilmesini önerirken, diğerleri iddia edilen OSC'lerin kan damarlarının perivasküler hücreleriolduğunu göstermektedir 10,11,12.

Erken yumurtalık yetmezliği (POI), 40 yaşından önce FSH seviyelerinin yükselmesi ile adet döngüsünün kesilmesi ile tanımlanır13. POI'nin nedenleri multifaktöriyel olup idiyopatik olarak ortaya çıkabilir; Bununla birlikte, genellikle tıbbi durumların bir sonucu olarak ortaya çıkar14. Örneğin, bazı konjenital genetik durumlar, Turner sendromu15 gibi doğumda zaten azalmış bir yumurtalık rezervi nedeniyle POI ile ilişkilidir. POI, gonadotoksik tedavilerin bir yan etkisi olarak da ortaya çıkabilir, bu da özellikle çok genç hastalarda problemlidir, çünkü normal ergenliğe girememeye ve yumurtalık rezervini büyük ölçüde bozmaya neden olabilir. POI riskine ve hastanın yaşına bağlı olarak, olgun oositlerin dondurularak saklanması, in vitro fertilizasyondan sonra embriyoların dondurularak saklanması ve yumurtalık dokusunun dondurularak saklanması (OTC) gibi çeşitli doğurganlık koruma seçenekleri mevcuttur. Ergenlik öncesi hastalar için, cinsel olgunlaşmamışlıkları nedeniyle OTC tek uygun seçenektir16,17. Amerika Birleşik Devletleri'nde, OTC yoluyla doğurganlığın korunması son zamanlarda kabul edilebilir bir klinik rutin olarak kabul edilmiştir18. Bununla birlikte, OTC birçok Avrupa ülkesinde hala deneysel olarak kabul edilmektedir ve özellikle oto-transplantasyon için etik onay gereklidir19,20. Bu nedenle, OTC protokolleri için dahil etme kriterleri dikkatlice düşünülmeli ve her hasta için bir risk-fayda analizi yapılmalıdır. Gonadotoksik tedavi alan tüm çocuklar doğurganlığın korunması için uygun değildir. İsveç'te, İskandinav Pediatrik Hematoloji ve OnkolojiDerneği'nin doğurganlığın korunmasına ilişkin yönergelere uygun olarak yalnızca yüksek veya çok yüksek riskli hastaların doğurganlığın korunması önerilmektedir 21. Bu grup, (1) kök hücre nakli gerektiren veya menzil alanındaki yumurtalık ile radyasyon tedavisi alan ergenlik öncesi ve sonrası çocukları ve (2) yüksek dozda kümülatif alkilleyici kemoterapisi olan ergenlik sonrası çocukları içerir. Menarş öncesi kızlar için, çok yüksek kısırlık riski için dahil etme kriterleri, aşağıdakilerden herhangi biri ile tedavi edilenleri içerir: yumurtalığa radyasyon dozu >10 Gy veya allojenik veya otolog hematopoietik kök hücre tedavisi (HSCT). Dışlama kriterleri, ameliyat öncesi diğer antikoagülan preparatlar için ek kan ürünlerine ihtiyaç duyan veya nötrofil sayısı <1 olanları içerir. Menarş sonrası kızlar / kadınlar için, yüksek veya çok yüksek infertilite riski için dahil etme kriterleri, aşağıdakilerden herhangi biri ile tedavi edilenleri içerir: yumurtalığa radyasyon dozu >10 Gy veya allojenik HSCT, siklofosfamid >9 g / m², ifosfamid >60 g / m², prokarbazin veya nitrosourea bileşikleri (BCNU / CCNU) >360 mg / m². Dışlama kriterleri, sorumlu doktor tarafından değerlendirildiği gibi kanama riski artmış, enfeksiyon riski artmış, cerrahi komplikasyon riski artmış veya ağrı sorunları riski artmış olanları içerir.

OTC için, karın ameliyatları sırasında yumurtalık dokusu laparotomi veya laparoskopi ile tek taraflı ooferektomi veya biyopsi yoluyla toplanır. Medulla, toplanan yumurtalık dokusundan çıkarılır ve kalan korteks daha sonra doğurganlık restorasyonunda22 kullanılmak üzere kontrollü oranlı dondurma veya vitrifikasyon yoluyla kriyoprezervasyon için daha küçük parçalara ayrılır. Numuneler daha sonra hasta tedavisinden iyileşene ve bir aile kurmak isteyene kadar sıvı nitrojen içinde saklanır. Kanserin türüne bağlı olarak ve yumurtalık dokusu transplantasyonuna kontrendikasyon olmaması durumunda, doku daha sonra hormonal ve yumurtalık fonksiyonunu eski haline getirmek için çözülür ve otogreftlenir. Yetişkinlik döneminde toplanan dondurularak saklanmış yumurtalık dokusunun greftlenmesinden sonra bildirilen %50 gebelik oranı ve 200'den fazla canlı doğum ile OTC'nin başarısı kanıtlanmıştır 23,24,25. Çocukluk çağında toplanan yumurtalık dokusunun ototransplantasyonundan sonra bildirilen canlı doğumlar azdır ve şüphesiz prepubertal yumurtalık dokusunun ototransplantasyonundan sonra hiçbiri bildirilmemiştir 26,27,28,29,30. Doku kalitesi, başarılı bir fertilite restorasyonu için bir ön koşuldur31. Bu nedenle, toplanan doku örneklerinin kalitesini incelemek önemlidir.

Şu anda, yumurtalık dokusunun kalitesini tahmin etmenin bir yolu, histolojik kesitler ve foliküllerin manuel olarak sayılmasıdır. Bununla birlikte, folikül yoğunluğunun normalliğini değerlendirmek, artan yaşla birlikte rezervin doğal olarak azalması ve foliküllerin heterojen dağılımı nedeniyle zordur. Ek olarak, biyopsi boyutu ve yaşı için standardize edilmedikleri için referans değerlerle karşılaştırma yapmak zordur. AMH serum seviyeleri veya sindirilmiş dokunun kalsein veya nötr kırmızı ile boyanması gibi diğer değerlendirme seçenekleri ya iyi bilinmemiştir ya da kendi sınırlamaları ile birlikte gelir. Wallace ve Kelsey daha önce, bilinen yumurtalık patolojileri olmayan hastaların tüm yumurtalıklarından folikül sayıları hakkında veri toplayarak yaş boyunca normal yumurtalık rezervi modeli yayınladılar2. Ayrıca, biyopsiler tüm yumurtalığı temsil etmediğinden, Schmidt ve ark. kortikal biyopsilere dayanarak toplam folikül sayısını tahmin etmek için bir yöntem geliştirmiştir32. Bu yöntemin değiştirilmiş bir versiyonu ve normal yumurtalık rezervi modeli kullanılarak, 0-25 yaş arası kadınların folikül yoğunluğu için bir referans veri seti oluşturulmuştur33.

Bu makale, (1) histoloji kullanılarak foliküllerin doğrudan ölçülmesi ve (2) sonuçların Z-skorları aracılığıyla yaşa göre normalleştirilmiş standart referanslarla karşılaştırılması yoluyla küçük yumurtalık örneklerine dayalı folikül yoğunluğunun normalliğini değerlendirme stratejisini açıklamaktadır. Z-skorlarının kullanımı, bir yumurtalık biyopysinin folikül yoğunluğunun yaş ve boyuta standardize edilmiş bir referans grubu ortalaması ile ilişkisini tanımlar. Bu, doktorlar için hastalarına oto-transplantasyon ve doğurganlığın korunmasından sonra daha ileri tedavi için danışmanlık yapmada çok değerli olacaktır.

Protokol

Yapılan tüm işlemler İsveç Etik İnceleme Kurumu (Sveafertil patients, Dnr: 2019-03802) ve Helsinki Üniversite Hastanesi Etik Kurulu (HCH patients, Dnr 340/13/03/03/2015) tarafından onaylanmıştır. Araştırma hemşireleri tarafından çalışma ile ilgili yazılı ve sözlü bilgilendirme yapılmış, Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak bilgilendirilmiş onam alınmıştır. 18 yaşın altındaki hastalar için yasal vasilerden bilgilendirilmiş onam alındı. Tüm örnekler takma ad verildi ve Avrupa Genel Veri Koruma Yönetmeliği'ne (GDPR) göre işlendi. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Yumurtalık dokusunun toplanması ve işlenmesi

NOT: Yerel yönergeleri izleyerek yüksek veya çok yüksek kısırlık riski belirtisi olduğunda doğurganlığın korunması için tüm uygun hastaları tanımlayın (ör., İskandinav, Avrupa veya uluslararası özel yönergeler). Avrupa'da, reşit olmayan hastaları yalnızca doğurganlığı koruma araştırma programlarının bir parçası olarak işe alın. Ülkenizin doğurganlığın korunmasına ilişkin yönergelerini kullanarak kısırlık riskini belirleyin.

  1. Cerrahi işlemi genel anestezi altında gerçekleştirin. Anestezi indüksiyonu için intravenöz propofol (2 mg / kg), sufentanil (0.5 mikrogram / kg) ve roküronyum bromür (0.6 mg / kg) uygulayın.
    1. Hastayı 6-8 mL / kg tidal hacim ve 6-8 cm H2O pozitif ekspiratuar basınç ile entübe edin ve ventilasyon yapın İnhalasyon anestezisini sürdürmek için endotrakeal tüp yoluyla % 1 ila% 2 sevofluran verin.
    2. Yeterli kas gevşemesi sağlamak ve daha düşük karın içi insuflasyon basınçlarında laparoskopiye izin vermek için cerrahi prosedür sırasında roküronyum bromür (0.15 mg / kg) ile nöromüsküler blokajı koruyun.
    3. Azaltılmış anestezik dozu ile hızlı uyanmayı kolaylaştırmak için anestezik derinliği yönlendirmek için bispektral indeks kullanın. Rezidüel nöromüsküler bloğu sugammadeks (2-4 mg / kg) ile antagonize edin.
  2. Üç portlu bir teknik kullanarak, göbek deliğindeki periton boşluğuna 10 mm'lik bir trokar yerleştirin ve bir kamera takılı bir optik lens yerleştirin ve sol ve sağ iliak bölgelerde iki adet 5 mm'lik trokar yerleştirin (ilgili ön superior iliak omurganın 2 cm üstünde ve 2 cm medial) cerrahi enstrümantasyon ve doku alımı için doğrudan görüş altında. Normalliği doğrulamak için her iki yumurtalık da dahil olmak üzere pelvik organları inceleyin.
    1. Erişilmesi en kolay olan yumurtalığı belirleyin, ardından kavrayın. Yumurtalığın yaklaşık üçte biri kadar (veya etik izninizde belirtildiği gibi) bir hacim kesin, ardından hemostazı güvence altına almak için gerekirse diyatermi kullanın.
      NOT: Biyopsiyi yalnızca aşırı intraoperatif veya sonrası kanama için risk faktörleri veya artmış enfeksiyon riski gibi kontrendikasyonlar yoksa gerçekleştirin. Açıkça belirtin ve ülkenin dahil etme ve hariç tutma kriterlerine uyun. Kısırlık riski çok yüksekse ve/veya sadece bir parçanın kesilme riskinin çok yüksek olduğu düşünülüyorsa (örneğin kanama nedeniyle) yumurtalığın tamamı alınabilir. Dokuya zarar verebileceği için numuneyi almadan önce diatermi kullanmaktan kaçının.
  3. Ameliyathanedeyken, dokuyu CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glikoz, 36 mg/L piruvat içeren 5 mL 1x Dulbecco'nun Fosfat Tampon Salin (PBS) içeren bir tüpe yerleştirin, numune laboratuvarda hemen işlenirse 37 °C'ye ısıtılır (30 dakika içinde) veya daha uzun taşımalar sırasında (24 saate kadar) 4 °C'de tutulur.
    NOT: Taşıma çözümleri, piyasada bulunan bir dizi organ taşıma/perfüzyon çözümünün yanı sıra PBS ve MEM34 gibi basit tamponları içerir.
  4. Yumurtalık yüzeyinden yumurtalık dokusunun küçük bir parçasını (2 mm x 2 mm x 2 mm) kesin. Bu parça, yumurtalık foliküllerinin bulunduğu yumurtalığın dış kısmı olan korteksi içerir35.
    DİKKAT: Biyogüvenlik Seviye 2 uygulamalarını ve prosedürlerini kullanarak yumurtalık gibi insan dokularını kullanın.
    NOT: Özel bir üreme tıbbı ünitesi, hastaların doğurganlık restorasyonunda gelecekteki potansiyel kullanım için yumurtalık dokusunun geri kalanını klinik olarak dondurarak korur.
  5. Dokuyu oda sıcaklığında 2 saat boyunca 350 μL Bouin solüsyonuna veya gece boyunca 4 °C'de 350 μL% 4 formaldehit içine yerleştirin ve dokunun tamamen suya batırıldığından emin olun. İnkübasyondan sonra, dokuyu üç kez% 70 etanol ile yıkayın.
    1. Bouin'in solüsyonu için sarı renk kaybolana kadar yıkayın. Dokuyu parafin mumu36 içine gömün. 4 μm kalınlığında en az 30 seri doku kesiti kesin ve bunları cam slaytlar üzerine yerleştirin.
      DİKKAT: Bouin solüsyonunu ve formaldehiti kimyasal bir başlık içinde ve uygun koruyucu ekipmanla kullanın.
      NOT: Formaldehit, dokuda büzülme ile ilgili artefaktlara yol açabilir. Bu nedenle Bouin'in çözümü, histolojiyi korumak için tercih edilen seçimdir. Bununla birlikte, Bouin'in çözümü ek riskler taşır ve bu da birçok kurumun formaldehit37 kullanımını tercih etmesine neden olur.

2. Hematoksilen ve Eozin (H & E) boyama





    1. &E


  2. figure-protocol-1
    figure-protocol-2

  3. figure-protocol-3

    1. figure-protocol-4

    2. figure-protocol-5

  4. figure-protocol-6

Sonuçlar

Yumurtalık folikülleri, slaytların başarılı bir şekilde kesilmesi, boyanması ve taranmasından sonra ölçülür. Foliküllerin farklı aşamaları ve sağlığı ayırt edilir ve daha fazla analiz edilir. Şekil 4A'da, bir yetişkinden Bouin ile sabitlenmiş bir yumurtalığın HE ile boyanmış bir kesiti, kortikal ve medüller doku örnekleriyle birlikte gösterilmektedir. Şekil 4B , bir yüzey epitel örneği ile bir çocuğun yumurtalığının temsili bir resmini göstermektedir. Yumurtalık rezervi (yani büyümeyen folikül havuzu) ve küçük büyüyen foliküller kortekste bulunur. Sanal bir mikroskop kullanılarak, foliküller büyütülür ve sadece yumurtalık rezervinin dahil edilmesini sağlamak için sınıflandırılır. Şekil 5 , Bouin'in (Şekil 5A) ve formaldehitle sabitlenmiş (Şekil 5B) yumurtalık kortikal dokularında bulunan ve sayılan foliküllerin aşamalarını temsil eder: (1) ilkel foliküller (yaklaşık 40 μm çapında), (2) ara ve (3) birincil. Folikül 4-6, onlara doğru bir olgunlaşma aşaması atanamaması nedeniyle sayımdan çıkarılacak folikül örnekleridir. Şekil 6 , folikül yokluğu veya az sayıda folikül olan yumurtalık kortikal dokularının (Şekil 6A) ve orta ila yüksek sayıda folikül içeren yumurtalık dokularının (Şekil 6B) temsili görüntülerini göstermektedir. Şekil 7 , sadece medüller dokunun varlığı (Şekil 7A) veya düşük doku kalitesi (Şekil 7B) nedeniyle dışlanacak doku kesitlerinin temsili görüntülerini göstermektedir. Şekil 2 , Follicle Z-skor hesaplayıcı Excel dosyasının ekran görüntülerini göstermektedir. Hesaplanan sayılar ve ilişkili Z-skorları, girilen verilerden otomatik olarak hesaplanır. Bir Z-skoru <1.7, Turner sendromu16 olan hastaların eğri-alıcı işletim karakteristiği (AUC-ROC) eğrisi altındaki alana bağlı olarak azalmış yumurtalık rezervini gösterir.

figure-results-1
Şekil 1: QuPath yazılım kullanımının ekran görüntüleri. (A) QuPath'te bir görüntü dosyasını açma işlemini görüntüleme ve görüntü türünü ayarlama. (B) Yazılım içindeki elips aracını kullanarak foliküllere açıklama ekleme. (C,D) Açıklamalı görüntülerdeki oositlerin ortalama çapının ölçülmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Folikül Z-skoru hesaplayıcı Excel dosyasının ekran görüntüleri. (A) "mm³ cinsinden foliküller" sayfası, numune kimliği, yaş, Ninci bölüm, son folikül sayısı, alan, ortalama oosit çapı, kesit kalınlığı ve sayılan her N'inci bölüm için verilerin girileceği alanları (yeşil hücreler) gösterir. Folikül yoğunluğu (folikül/mm³), gerekli tüm veriler girildiğinde otomatik olarak hesaplanır; Herhangi bir veri eksikse boş kalır. (B) "Z-skoru (mm³ başına folikül)" sayfası, "mm³ cinsinden foliküller" sayfasından kimlik, yaş ve folikül/mm³ verilerini birbirine bağlar ve numune için Z-skorunu otomatik olarak hesaplar. Karşılık gelen referans değerleri sağdaki tabloda görünür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: ImageJ yazılımının kullanımının ekran görüntüleri. (A) Bir görüntüyü QuPath'ten ImageJ'ye aktarma. (B) ImageJ içinde görüntü türünü ayarlama. (C) Ölçüm için ölçeğin oluşturulması. (D,E) Görüntünün parlaklığını/kontrastını ve eşiğini otomatik olarak ayarlama. (F) Ayarlanan görüntüdeki alanın ölçülmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Yumurtalık dokusunun temsili görüntüleri. (A) Cinsiyet değiştirme ameliyatı geçiren bir yetişkinden alınan bir yumurtalık görüntüsü. Daha yüksek bir somatik hücre yoğunluğuna sahip olan ve yumurtalık rezervini içeren korteks, daha düşük yoğunluklu ve daha büyük somatik hücrelerle karakterize edilen ve genellikle daha fazla damar içeren medüller doku ile birlikte görülebilir. (B) Doğurganlığın korunduğu bir çocuğa ait bir yumurtalık görüntüsü. Korteks, yüzey epitelinden 1 mm uzakta ölçülerek belirlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Farklı solüsyonlarla sabitlenmiş yumurtalıktaki foliküllerin temsili görüntüleri. (A) Bouin çözeltisi ve (B) çeşitli aşamalarda% 4 formaldehit ile sabitlenen foliküller: (1) ilkel evre folikülü, (2) ara evre folikülü, (3) birincil aşama folikülü. Foliküller (4) ila (6), görünür sitoplazmanın olmaması nedeniyle dışlanır. Formaldehit fiksasyonunda yaygın olan artefaktlar arasında bazal membranın dokudan ayrılması (yeşil oklarla gösterilir) ve piknotik granüloza hücreleri (sarı noktalarla gösterilir) bulunur. Ölçek çubukları 50 μm'yi temsil eder. Bu rakam Björvang ve ark.39'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Bir çocuk yumurtalığının kortikal biyopsilerinin temsili görüntüleri. (A) Düşük folikül sayısına hayır gösteren bir biyopsi ve (B) orta ila yüksek folikül sayısını gösteren bir biyopsi. Foliküller yıldız işareti (*) ile işaretlenmiştir. Mavi kesikli çizgi yüzey epitelinden 1 mm uzakta olduğunu gösterirken, siyah çizgi yüzey epitelini işaretler. Ölçek çubukları 500 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Dışlanacak doku kesitlerinin temsili görüntüsü. (A) Korteks yerine medullanın alındığı bir yumurtalık parçası. Bu bölüm, yüzey epitelinin olmaması ve hücre yoğunluğunun düşük olması nedeniyle medulla olarak karakterize edilir. (B) Dokudaki sıyrıklarla tanımlanan düşük kaliteli bir doku kesiti. Ölçek çubukları 500 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Folikül Z-skoru hesaplayıcısı. Bu dosya, folikül Z-skorlarının hesaplanmasını kolaylaştırır. "Mm³ cinsinden foliküller" sayfasına veri (numune kimliği, yaş, slayt başına folikül sayısı, kesit kalınlığı, sayılan Ninci bölüm ve alan) girilmesi gerekir. Z-skoru daha sonra otomatik olarak hesaplanır ve "Z-Skoru (mm³ başına folikül)" sayfasında özetlenir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Kadınlar, yenilenemeyen sınırlı bir oosit havuzuyla doğarlar. Yumurtalık rezervi, bir kadının üreme potansiyelinin önemli bir belirleyicisidir. Bu makale, genç hastalarda ve 25 yaşına kadar olan kadınlarda yumurtalık kortikal folikül yoğunluklarının Z-skorlarını kullanarak folikül yoğunluğunun histolojik olarak ölçülmesi ve referans standartlarla karşılaştırılması için bir yöntemi özetlemektedir.

Bu protokolde doğurganlığın korunması için OTC uygulanan kısırlık riski yüksek veya çok yüksek olan kız ve kadınlardan veya cinsiyet değiştirme ameliyatı geçiren hastalardan yumurtalık dokusu elde edilir. Dondurularak saklanan materyali değerlendirmek için küçük bir yumurtalık dokusu parçası kullanılır. Yumurtalık rezervi yaşa göre değiştiğinden, folikül yoğunluklarını Z-skorlarına dönüştürmek, doğumdan cinsel olgunluğa kadar yaşa göre normalleştirilmiş referans değerlerle karşılaştırmaya izin verir (Hassan ve ark.33). Z-skorlarının kullanımı, bir yumurtalık rezerv örneğinin normalliğini tahmin etmek için yaşa standardize edilmiş, kohorttan bağımsız bir yöntem sağlar. Yaşa dayalı bir referans grubu ortalaması oluşturulur ve bu daha sonra bireysel bir numunenin Z-skoru hesaplaması için kullanılır. Bu yaklaşım, incelenen popülasyon içindeki yaş dağılımından bağımsız olarak normalliğin değerlendirilmesine izin verir. Yumurtalık rezervinin yaşa standardize edilmiş değerlendirmesi, farklı çalışma popülasyonlarında benzer genetik geçmişe sahip veya kemoterapi maruziyetine sahip hastalardan elde edilen verilerin birleştirilmesini sağlayarak büyük ölçekli meta-analizleri kolaylaştırır.

Bu yöntemin sınırlamaları vardır. Bilinen bir over patolojisi olmayan hastalardan alınan yumurtalık dokularındaki folikül sayıları sınırlıdır. Belirlenen referans standartlar, özellikle farklı yaş grupları göz önüne alındığında az sayıda örneğe dayanmaktadır ve yalnızca OTC uygulanan 25 yaşına kadar olan kadınlar için geçerlidir. Sonuç olarak, bu araç 25 yaşından büyük kadınlar için geçerli değildir. Ek olarak, küçük bir kortikal doku parçasının, foliküllerin korteks32 boyunca eşit olmayan dağılımı nedeniyle, üreme çağındaki kadınlarda bile hiç folikül içermemesi mümkündür. Ayrıca, gömme işlemi sırasında dokunun oryantasyonu, korteksin doğru tanımlanmasını engelleyebilir. Biyopsiler genellikle çok küçüktür ve biyopsi toplama yöntemi standartlaştırılmamıştır, bu da esas olarak medüller olan yumurtalık dokusunun alınması olasılığına yol açar ve bu da onu Z-skoru değerlendirmesi için uygun hale getirmez.

Ayrıca, çalışmalar kalan doğurganlığı teşhis etmek için yumurtalık biyopsisinin kullanımını henüz doğrulamamıştır40. Bu yöntemin foliküllerin sağlığını değil, sadece folikül yoğunluğunu dikkate aldığına dikkat etmek önemlidir. Doku artefaktlarına neden olduğu bilinen formaldehitle sabitlenmiş dokunun kullanımı ( Şekil 5B'de gösterildiği gibi), anormal morfolojinin foliküler atreziden mi yoksa fiksasyon prosedüründen mi kaynaklandığının belirlenmesini zorlaştırır. Bu sorun gelecekte kantitatif faz mikroskobu41 veya alternatif fiksatifler37 gibi etiketsiz yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleri kullanılarak ele alınabilir. Ek olarak, biyopsi alımından manuel folikül sayımına kadar tüm süreç invaziv, zaman alıcı ve emek yoğundur, bu da histoloji yoluyla folikül yoğunluğu değerlendirmesini bazı hasta grupları için pratik hale getirir.

Ayrıca, hangi foliküllerin olgunlaşmaya mahkum olduğu ve kemoterapinin yumurtalık rezervi boyutunu ve işlevselliğini nasıl etkilediği belirsizliğini korumaktadır. Yumurtalık dokusu transplantasyonunun başarısı ile herhangi bir korelasyon kurulabilmesi için bu yöntemi daha büyük ölçekte ve daha uzun bir süre boyunca kullanan daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Bununla birlikte, bu yöntem hem yumurtalık biyolojisi araştırmalarında hem de klinik doğurganlık danışmanlığında önemli bir değere sahiptir. Z-skorlarının kullanılması, bir bireyin yumurtalık rezervinin yorumlanmasını bir referans standardıyla karşılaştırarak geliştirir. Bu, farklı hasta grupları ve çalışma popülasyonları arasında yumurtalık rezervinin boyutunun ve normalliğinin kapsamlı bir şekilde incelenmesini kolaylaştırır. Örneğin, bu yöntem yumurtalık rezervi ile çevresel kimyasallar veya gonadotoksik tedaviler gibi çeşitli maruziyetler arasındaki ilişkileri değerlendirmek için kullanılabilir39. Bazı klinikler, kriyoprezervasyon için doku hazırlığı sırasında histolojik değerlendirme için rutin olarak küçük biyopsiler alır. Bu gibi durumlarda, bu yöntem kriyoprezervasyondan önce yumurtalık rezervinin normalliğini belirlemede yararlı olabilir. Özetle, folikül yoğunlukları, popülasyon düzeyinde39 yumurtalık rezerv boyutunu tahmin etmek için kullanılabilir, bu da bu yöntemi epidemiyolojik çalışmalar ve doğurganlık danışmanlığı için değerli bir araç haline getirir.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Katılımcı temini ve doku toplanması konusunda bize yardımcı olan sağlık çalışanlarına ve yumurtalık dokusunu bağışlayan tüm hastalara teşekkür ederiz. Ayrıca, finansmanı bu çalışmayı mümkün kılan Çocukluk Çağı Kanseri Fonu'na (PR2020-0096) ve Karolinska Institutet Doktora fonu KID'e de teşekkür ediyoruz. Histolojik slaytların hazırlanması için Morfolojik Fenotip Analizi tesisine de teşekkür ederiz. Bu el yazmasını dil düzenlemesi için Nicola Byers'a teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu TuzluTermo Fisher14190144
1x Fosfat Tamponlu Salin, CaCl2< / sub>, MgCl2,< / sub> 1 g / L D-glikoz, 36 mg / L piruvat ve nbsp;Thermo Fisher14287-080
%37 Hidroklorik asitSigma-Aldrich1.09057.1000
%70 etanolHistolabs01370.01L
%95 etanolFisher scientific10572143
Mutlak etanolHistolabs01399.01L
Bouin'in çözeltisiSigma-AldrichHT10132-1L
Eozin Y Serbest asitSigma-AldrichE4009-5G & nbsp;
DelafieldSigma-Aldrich03971-250ML
Microsoft Excel
formaldehitThermo Fisher28908
;
Perteks montaj çözümü Histolabs00840-05
PropofolBaxter Holding BVN01AX10Katalog numarası yerine sağlanan ATC kodu
QuPathhttps://qupath.github.io/
Roküronyum bromür B. Braun Melsungen AG M03AC09Katalog numarası yerine sağlanan ATC kodu
Scott'ın musluk suyu ikame konsantresiSigma-AldrichS5134-6x100ml
SevofluraneBaxter Medical AB N01AB08Katalog numarası yerine verilen ATC kodu
Slayt tarayıcı 
SufentanilHameln Pharma gmbhN01AH03katalog numarası yerine verilen ATC kodu
.V03AB35Katalog numarası yerine sağlanan ATC kodu
SuperFrost plus white Histolabs  06400 
SuperFrost Plus Beyaz mikroskop slaytlarıHistolabs  06400 
KsilenSaveen Werner131769.1611
ImageJ Microtome'a göre Hematoksilen çözeltisi Sugammadex Baxter Holding B.V.

Kaynaklar

  1. Richards, J. A. S. The ovarian cycle. Vitam Horm. 107, 1-25 (2018).
  2. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 1-9 (2010).
  3. Monniaux, D., et al. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: What is the link. Biol Reprod. 90 (4), 1-11 (2014).
  4. Gougeon, A. The early stages of follicular growth in biology and pathology of the oocyte. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Cambridge University Press. 50-61 (2013).
  5. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Ann Endocrinol. 71 (3), 132-143 (2010).
  6. Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and non-growing follicle counts according to the stages of reproductive aging workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
  7. Gold, E. B. The timing of the age at which natural menopause occurs. Obstet Gynecol Clin North Am. 38 (3), 425-440 (2011).
  8. Alberico, H., et al. Workflow optimization for identification of female germline or oogonial stem cells in human ovarian cortex using single-cell RNA sequence analysis. Stem Cells. 40, 523-536 (2022).
  9. White, Y. A. R., et al. Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women. Nat Med. 18 (3), 413-422 (2012).
  10. Wagner, M., et al. Single-cell analysis of human ovarian cortex identifies distinct cell populations but no oogonial stem cells. Nat Commun. 11, 1147(2020).
  11. Yoshihara, M., et al. In reply: Revisiting claims of the continued absence of functional germline stem cells in adult ovaries. Stem Cells. 41 (2), 205-206 (2023).
  12. Yoshihara, M., et al. The continued absence of functional germline stem cells in adult ovaries. Stem Cells. 41, 105-110 (2023).
  13. Van Kasteren, Y. M., Schoemaker, J. Premature ovarian failure: A systematic review on therapeutic interventions to restore ovarian function and achieve pregnancy. Hum Reprod Update. 5 (5), 483-492 (1999).
  14. McGlacken-Byrne, S. M., Conway, G. S. Premature ovarian insufficiency. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 81, 98-110 (2022).
  15. Viuff, M., Gravholt, C. H. Turner syndrome and fertility. Ann Endocrinol. 83 (4), 244-249 (2022).
  16. Poirot, C., et al. Ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in 418 girls and adolescents up to 15 years of age facing highly gonadotoxic treatment: Twenty years of experience at a single center. Acta Obstet Gynecol Scand. 98 (5), 630-637 (2019).
  17. Jensen, A. K., et al. Cryopreservation of ovarian tissue for fertility preservation in a large cohort of young girls: Focus on pubertal development. Hum Reprod. 32 (1), 154-164 (2017).
  18. The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Fertility preservation in patients undergoing gonadotoxic therapy or gonadectomy: A committee opinion. Fertil Steril. 112 (6), 1022-1033 (2019).
  19. ART Fact Sheet. , European Society of Human Reproduction and Embryology. https://www.eshre.eu/Press-Room/Resources (2020).
  20. Antonouli, S., et al. A comprehensive review and update on human fertility cryopreservation methods and tools. Front Vet Sci. 10, 1151254(2023).
  21. Nordic Society of Pediatric Hematology and Oncology (NOPHO). , http://www.nopho.net (2013).
  22. Bahroudi, Z., et al. Review of ovarian tissue cryopreservation techniques for fertility preservation. J Gynecol Obstet Hum Reprod. 51 (2), 102290(2022).
  23. Jensen, A. K., et al. 86 successful births and 9 ongoing pregnancies worldwide in women transplanted with frozen-thawed ovarian tissue: Focus on birth and perinatal outcome in 40 of these children. J Assist Reprod Genet. 34 (3), 325-336 (2017).
  24. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  25. Dolmans, M. M., Falcone, T., Patrizio, P. Importance of patient selection to analyze in vitro fertilization outcome with transplanted cryopreserved ovarian tissue. Fertil Steril. 114 (2), 279-280 (2020).
  26. Demeestere, I., et al. Live birth after autograft of ovarian tissue cryopreserved during childhood. Hum Reprod. 30 (9), 2107-2109 (2015).
  27. Ernst, E., Kjærsgaard, M., Birkebæk, N. H., Clausen, N., Andersen, C. Y. Case report: Stimulation of puberty in a girl with chemo- and radiation therapy-induced ovarian failure by transplantation of a small part of her frozen/thawed ovarian tissue. Eur J Cancer. 49 (4), 911-914 (2013).
  28. Rodriguez-Wallberg, K. A., et al. Successful pregnancies after transplantation of ovarian tissue retrieved and cryopreserved at time of childhood acute lymphoblastic leukemia - a case report. Haematologica. 106 (10), 2783-2787 (2021).
  29. Matthews, S. J., Picton, H., Ernst, E., Andersen, C. Y. Successful pregnancy in a woman previously suffering from β-thalassemia following transplantation of ovarian tissue cryopreserved before puberty. Minerva Ginecol. 70 (4), 432-435 (2018).
  30. Kristensen, S. G., et al. Use of cryopreserved ovarian tissue in the Danish fertility preservation cohort. Fertil Steril. 116 (4), 1098-1106 (2021).
  31. Donfack, N. J., et al. Expectations and limitations of ovarian tissue transplantation. Zygote. 25 (4), 391-403 (2017).
  32. Schmidt, K. L. T., Byskov, A. G., Andersen, A. N., Müller, J., Andersen, C. Y. Density and distribution of primordial follicles in single pieces of cortex from 21 patients and in individual pieces of cortex from three entire human ovaries. Hum Reprod. 18 (6), 1158-1164 (2003).
  33. Hassan, J., et al. Reference standards for follicular density in ovarian cortex from birth to sexual maturity. Reprod Biomed Online. 47, 103287(2023).
  34. Vilela, J. deM. V., Dolmans, M. M., Amorim, C. A. Ovarian tissue transportation: A systematic review. Reprod Biomed Online. 42 (2), 351-365 (2021).
  35. Gibson, E., Mahdy, H. Anatomy, abdomen and pelvis, ovary. , StatPearls Publishing. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK545187/ (2023).
  36. Nagaraj, A. S., et al. Establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing. J Vis Exp. (141), e58569(2018).
  37. Adeniran, B. V., Bjarkadottir, B. D., Appeltant, R., Lane, S., Williams, S. A. Improved preservation of ovarian tissue morphology that is compatible with antigen detection using a fixative mixture of formalin and acetic acid. Hum Reprod. 36 (7), 1871-1890 (2021).
  38. Bankhead, P., et al. QuPath: Open-source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 1-7 (2017).
  39. Björvang, R. D., et al. Persistent organic pollutants and the size of ovarian reserve in reproductive-aged women. Environ Int. 155, 106589(2021).
  40. Kwok, R., Johnson, N. P. Ovarian biopsy has no role as a routine diagnostic test of ovarian reserve: A systematic review. Reprod Biomed Online. 24, 492-495 (2012).
  41. Ahmad, A., et al. High-throughput spatial sensitive, quantitative phase microscopy using low spatial and high temporal coherent illumination. Sci Rep. 11 (1), 1-13 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Z-Skoru DeğerlendirmesiOver Dokusu KriyoprezervasyonuFolikül YoğunluğuHistolojik KantifikasyonPrimordial FoliküllerOosit KriyoprezervasyonuEmbriyo KriyoprezervasyonuYaşa Göre Normalize Edilmiş Referans
Doğurganlığın Korunması Uygulanan Genç Hastalarda Yumurtalık Rezervini Değerlendirmek için Z-Skorları
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.