Yöntem makalesi

Proteazla Aktive Edilen Reseptörlerin Modülatörlerinin Plaka Okuyucu Kullanılarak Kalsiyum Mobilizasyon Testi ile Karakterize Edilmesi

DOI:

10.3791/66507

⸱

24 Mayıs 2024

 , 
1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry, Marquette University, 3School of Medicine, Washington University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteaz ile aktive edilmiş reseptörlerin (PAR'lar) ligandlarını tanımlamak için kullanılan endotel hücreleri ile bir kalsiyum mobilizasyon testi için geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiştir. Yeni protokol, toplam test süresini 90-120 dakika azaltır ve tekrarlanabilir konsantrasyon-yanıt eğrileri verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerdeki kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler, hücre içi, floresan, kalsiyum bağlayıcı boyalar ve aynı anda 1.536 kuyudan floresan emisyonlarını ölçebilen görüntüleme cihazlarının kullanılmasıyla yüksek verimli bir şekilde hızla izlenir. Bununla birlikte, bu cihazlar çok daha pahalıdır ve kuyuları ayrı ayrı tarayan yaygın olarak bulunan plaka okuyuculara göre bakımı zor olabilir. Burada tarif edilen, Gαq sinyalinin proteaz ile aktive edilen reseptör (PAR) güdümlü aktivasyonunu ve ardından kalsiyum bağlayıcı boya Fluo-4 kullanılarak kalsiyum mobilizasyonunu ölçmek için bir endotel hücre hattı (EA.hy926) ile kullanım için optimize edilmiş bir plaka okuyucu testidir. Bu test, Dockendorff laboratuvarında tanımlanan allosterik PAR1 hedefli anti-enflamatuar "parmodulin" ligandları dahil olmak üzere bir dizi PAR ligandını karakterize etmek için kullanılmıştır. Bu protokol, otomatik bir sıvı işleyiciye olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve 96 oyuklu plakalarda PAR ligandlarının orta verimli taramasına izin verir ve kalsiyum mobilizasyonunu başlatan diğer reseptörlerin çalışmasına uygulanabilir olmalıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteaz ile aktive olan reseptörler (PAR'lar)1,2,3, trombositler ve endotel hücreleri 4,5,6,7 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde eksprese edilen A sınıfı G proteinine bağlı reseptörlerin (GPCR'ler) bir alt ailesidir. GPCR'lerin çoğundan farklı olarak, PAR'lar benzersiz bir molekül içi aktivasyon moduna sahiptir. Çoğu GPCR, farklı bir bağlanma cebi ile etkileşime giren çözünür ligandlar tarafından aktive edilir, ancak PAR'lar, N-terminalinin proteolitik bölünmesi ile aktive edilir, bu da bir hücre 6,8,9'un yüzeyindeki hücre dışı döngü 2 alanı ile etkileşime girebilen yeni bir bağlı ligand ile sonuçlanır. Bu etkileşim reseptörü aktive eder ve iltihaplanma ve trombosit aktivasyonugibi etkileri teşvik eden çeşitli sinyal yollarını başlatabilir 4,10,11,12. Farklı proteazlar, N-terminali üzerindeki benzersiz bölgelerde bölünme yoluyla PAR'ları aktive edebilir ve farklı sinyal yollarını başlatan reseptör konformasyonlarını stabilize eden farklı bağlı ligandları (TL) ortaya çıkarır 9,13,14,15. Örneğin, alt ailenin en iyi çalışılmış üyesi olan PAR1'de, trombin tarafından bölünme, trombosit aktivasyonu ve endotelyuma lökosit alımı dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik süreci desteklemek için kullanılır, ancak reseptör aşırı eksprese edildiğinde veya aşırı aktive edildiğinde zararlı etkilere yol açabilir 4,16,17,18,19,20,21 . Tersine, aktive protein C (aPC) ile bölünme, anti-enflamatuar etkileri ve endotel bariyerlerinin korunmasını teşvik edebilir 15,22,23,24,25,26,27,28,29. PAR'lar ayrıca moleküller arası bir şekilde TL'lerin peptit analogları tarafından da aktive edilebilir 13,30,31. Bu peptitler, PAR hedefli proteazlar yerine PAR inhibisyonunu (modülasyon) ölçmek için rutin olarak kullanılır ve bu protokolde kullanılırlar.

Sepsis22,32, kardiyovasküler hastalık 33,34,35,36,37,38, böbrek hastalığı 39,40,41,42, orak hücre hastalığı43, fibroz44, osteoporoz ve osteoartrit45 dahil olmak üzere çok sayıda bozukluk patolojik PAR1 sinyali ile ilişkilidir,46, nörodejenerasyon 47,48,49,50,51 ve kanser 52,53,54,55,56,57,58,59. PAR1 antagonistleri, 1990'lardan beri kardiyovasküler hastalık için antiplatelet ajanlar olarak incelenmiştir ve reseptörle ilişkili hastalıkların artan listesi, biyolojik problar (alet bileşikleri) veya potansiyel terapötikler olarak kullanılmak üzere yeni ligandların tanımlanmasını gerektirmektedir. Şu anda, yüksek riskli hastalarda koroner arter hastalığını tedavi etmek için kullanılan FDA onaylı tek bir PAR1 antagonisti olan vorapaxar bulunmaktadır 34,36,37,60. Alternatif bir PAR1 antagonisti olan pepducin PZ-128, kalp kateterizasyonu hastalarında trombozu önlemek için başarılı bir faz II çalışmasını tamamladı38. Dockendorff grubu, parmodulinler 61,62 olarak bilinen ayrı bir küçük molekül sınıfı olan PAR1 ligandlarının tıbbi kimyası ve farmakolojisine odaklanmıştır. Vorapaxar gibi bildirilen PAR1 antagonistlerinin aksine, parmodulinler, aPC'ye benzer sitoprotektif etkileri teşvik ederken Gαq yolunu seçici olarak bloke eden PAR1'in allosterik, önyargılı modülatörleridir. Vorapaxar gibi güçlü ortosterik PAR1 antagonistlerinin aksine, yayınlanan parmodulinler de geri dönüşümlüdür 63,64,65.

Başlangıçta, parmodulinler Flaumenhaft ve meslektaşları tarafından trombositlerde P-selektin ekspresyonunu veya granül sekresyonunu inhibe etme yetenekleri nedeniyle tanımlandı61,66. Bununla birlikte, parmodulinlerin endotel hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek için alternatif bir yöntem gerekliydi. GPCR ile ilgili sinyalleri izlemenin yaygın bir yöntemi, uygun bir hücre içi kalsiyum bağlayıcı boya67,68 kullanılarak ölçülebilen önemli bir ikincil haberci olan hücre içi Ca2+ mobilizasyonunu ölçmektir. PAR1 tarafından indüklenen kalsiyum mobilizasyonunun Gαq 69,70'in aktivasyonu yoluyla olduğunu gösteren önemli kanıtlar sağlanmıştır. Bağlı ligandı (veya uygun bir eksojen ligand) tarafından aktive edildikten sonra, PAR1, Gαq alt birimine bağlı guanozin difosfatın (GDP) guanozin trifosfat (GTP) ile değiştirilmesine neden olan konformasyonel bir değişikliğe uğrar.68. Gαq alt birimi daha sonra fosfatidilinositol 4,5 bifosfatın (PIP2) hidrolizini katalize eden ve 1,4,5-inositol trifosfat (IP3) ve diasilgliserol (DAG) oluşturan fosfolipaz Cβ'yı (PLC-β) aktive eder. Son olarak, IP3, endoplazmik retikulumun zarındaki IP3'e duyarlı Ca2+ kanallarına bağlanır ve Ca2+'nın sitoplazmaya salınmasına izin verir, burada hücrelere eklenen Fluo-4 gibi Ca2+ bağımlı floresan boyalara bağlanabilir71. Bu işlem saniyeler içinde gerçekleşir ve Ca2+ konsantrasyonunu 100 kat artırabilir, bu da kalsiyuma bağlı boya miktarında ciddi bir değişikliğe ve sağlam bir floresan sinyaline yol açar.

2018'de Dockendorff grubu,PAR1 72'nin Gαq yolunun antagonistlerini tanımlamak için kullanılabilecek orta verimli bir Ca 2+ mobilizasyon testini açıkladı. Test, PAR926 ekspresyonunda gözle görülür bir değişiklik olmadan çoklu geçişler için kullanılabilen ve sitoprotektif etkilerin in vitro ölçümleri için kurulan hibrit bir insan endotel hücre hattı olan EA.hy731'ü kullandı.

Orijinal protokol, 96 oyuklu plakalarda EA.hy926 hücrelerini kullandı ve 488 nm'de yoğun floresansı ve yüksek hücre geçirgenliği nedeniyle seçilen Fluo-4 / boyası ile yüklendi. Boya hücrelere yüklendikten sonra, otomatik 8 kanallı bir sıvı işleyici ile uzun yıkama adımları gerçekleştirildi (96 kanallı yıkayıcı gibi daha hızlı sıvı işleme yöntemlerine erişilemiyordu). Bu testin tekrarlanabilirliği, dikkatli, otomatik robotik ortam değişiklikleri olmadan olandan daha üstündü. Antagonistler daha sonra hücrelerle inkübe edildi, PAR1, seçici bir agonistin (bir seferde 16 kuyucuk) sıralı ilavesi yoluyla aktive edildi ve aktiviteyi belirlemek için kalsiyum mobilizasyonu ve boya bağlanmasından kaynaklanan floresan değişiklikleri ölçüldü.

Bu protokol, PAR1 aracılı kalsiyum mobilizasyonunun ölçülmesine izin verirken, her 96 oyuklu plakayı test etmek için gereken süre ile sınırlıdır. Uzun deney süreleri, yalnızca her gün taranabilecek bileşiklerin sayısının sınırlı olması nedeniyle değil, aynı zamanda zamanla boya akışının meydana gelmesi ve bazal floresansı artırarak tahlil penceresini daraltması nedeniyle de sorunludur. Uzun deney süresine katkıda bulunanlardan biri, plaka yıkama için 8 kanallı bir sıvı işleyicinin kullanılmasıdır ve bu da her deneye 30 dakikadan fazla ekler. Tedarik zinciri sorunları nedeniyle gerekli ipuçlarının elde edilmesi de zorlaştı. Burada, sıvı bir işleyici gerektirmeyen ve bu nedenle daha yüksek verimde çalıştırılabilen PAR aracılı kalsiyum mobilizasyon testi için güncellenmiş bir protokol rapor edilmiştir. Bu protokol aynı zamanda hücre içi kalsiyum mobilizasyonuna yol açan diğer GPCR'lerle sinyalizasyonu ölçmek için de uygun olmalıdır. Bu güncellenmiş plaka okuyucu protokolü, pahalı hücre görüntüleme cihazları için kaynaklara sahip olmayan ancak çok sayıda bileşiği hızlı bir şekilde taraması gereken akademik ve küçük endüstriyel laboratuvarlar için idealdir. Bir plaka görüntüleyici kullanılarak yapılan bir kalsiyum mobilizasyon testi örneği için, Caers ve ark.74'e bakınız.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki protokolün 1. ve 2. adımlarında yapılan tüm medya değişimleri/eklemeleri steril bir başlıkta gerçekleştirilir. Aksi belirtilmedikçe, steril davlumbazda kullanılan tüm plastik malzemeler sterilize edilmiş ve mühürlenmiş olarak satın alınmalı veya otoklav yoluyla uygun şekilde sterilize edilmelidir.

1. EA.hy926 hücre hattının başlatılması

  1. EA.hy926 hücrelerini edinin.
  2. Hücre şişelerini bir sıvı nitrojen tankının buhar fazında saklayın.
  3. Önce DMEM, FBS ve kalem / strep'i (belirli ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın) 37 ° C'lik bir su banyosunda 15-30 dakika ısıtarak DMEM tam ortamını hazırlayın. 500 mL DMEM'e 50 mL FBS ve 1 mL kalem / strep ekleyin. Çözeltiyi ters çevirerek yavaşça karıştırın.
    NOT: Çok kuvvetli karıştırmak aşırı miktarda kabarcıklara neden olur.
  4. Bir şişe hücreyi sıvı nitrojenden çıkarın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika ısıtın.
  5. Hücre şişesini ve DMEM tam ortam şişesini alkol püskürterek sterilize edin, ardından steril davlumbaza geçin.
  6. Hücreleri dikkatlice 15 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarmak için 1.000 μL'lik bir pipet kullanın. Durulamak için şişeye 1 mL DMEM ekleyin ve santrifüj tüpüne ekleyin.
  7. Bir santrifüj kullanarak bir hücre peleti yapın (150 × g, 5 dk, 22 °C). Ortamı aspirasyon ile santrifüj tüpünden çıkarın; Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin.
  8. Santrifüj tüpüne 3 mL DMEM tam ortam ekleyin ve 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak hücre süspansiyonunu karıştırarak peleti nazikçe parçalayın.
    NOT: Hücreleri aktive edebileceği veya zarar verebileceği için çok kuvvetli karıştırarak kabarcıklara neden olmaktan kaçınılmalıdır.
  9. 20 μL veya 200 μL uçlu bir pipet kullanarak bir mikrosantrifüj tüpünde 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi ile karıştırın. Bir hemositometreye 10 μL hücre süspansiyonu / tripan mavisi karışımı ekleyin ve hücreleri sayın.
    NOT: 0,1-10 μL pipet uçlarının kullanılması hücreleri kesebilir. Hücre süspansiyonu kullanılırken bu boyuttaki uçlar kullanılmamalıdır.
  10. 10 veya 25 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 66.000 hücre / mL'lik bir yoğunluk elde etmek için hücre süspansiyonuna DMEM tam ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunun 15 mL'sini T-75 kültür şişesine / şişelerine pipetleyin. Şişeyi kuzeyden güneye ve doğudan batıya hareket ettirerek hücre süspansiyonunun eşit dağılmasını sağlayın.
  11. Hücreleri, mikroskop altında incelenerek tahmin edildiği gibi, birleşme noktasına ulaşana kadar (tipik olarak 4-6 gün sonra) inkübe edin. Bu noktada, deneydeki hücreleri kullanın (bölüm 2'den başlayarak) veya donmuş stokları hazırlamak için genişleme için yeni şişelere tohumlayın (T-75 şişesi başına 15 mL tam ortamda 1.000.000 hücrelik önerilen tohumlama yoğunluğunda).
    NOT: Hücreler, tahlilde şekil, sağlık veya performansta gözle görülür bir fark olmaksızın kültür şişelerinde 3 haftaya kadar büyütülebilir. Tam ortam her 3-4 günde bir değiştirilmelidir.

2. EA.hy926 hücrelerinin 96 oyuklu plakalara eklenmesi

NOT: Bir birleşik T-75 kültür şişesinden alınan hücreler, iki veya üç tahlil plakası hazırlamak için kullanılabilir veya isteğe bağlı olarak 15 adede kadar taze T-75 şişesine genişletilebilir. Normal bir iş gününde bölüm 4 ve 5'teki protokol kullanılarak en az beş tahlil plakası taranabilir. Aşağıdaki talimatlar, bir tahlil plakasının hazırlanmasını ve test edilmesini açıklar, ancak istenen sayıda tahlil plakası hazırlamak için 2.2, 2.7, 2.12 ve 3.2 adımları tekrarlanarak ek plakalar hazırlanabilir. En yaygın olarak, 16 bileşiğe kadar konsantrasyon tepkilerini ölçmek için günde dört tahlil plakası hazırlanır, bu da birleşen hücrelere sahip iki T-75 şişesi gerektirir.

  1. DMEM komple besiyerini 37 °C su banyosunda 15-30 dakika ısıtın. DMEM tam ortam şişesini alkol püskürterek sterilize edin, ardından steril davlumbaza taşıyın.
  2. Siyah duvarlı, 96 oyuklu, kapaklı şeffaf tabanlı bir plakanın tüm kuyucuklarına 100 μL sterilize edilmiş% 0.4 jelatin çözeltisi ekleyin. Plakayı jelatin çözeltisi ile bir inkübatörde (37 °C,% 5 CO2) 30 dakika inkübe edin.
  3. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak bir T-75 kültür şişesindeki hücrelerin %80-100 birleşim olduğunu doğrulayın. DMEM tam besiyerini aspirasyon yoluyla T-75 şişesinden çıkarın.
  4. Şişedeki hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın ve şişeyi nazikçe Kuzey'den Güney'e ve Doğu'dan Batı'ya hareket ettirin. PBS'yi aspirasyon yoluyla şişeden çıkarın.
  5. Şişeye 5 mL hücre ayrışma çözeltisi ekleyin ve şişeyi bir inkübatörde (37 °C,% 5 CO2) ~ 12 dakika inkübe edin. Ayrışmayı kolaylaştırmaya yardımcı olmak için 6 dakika sonra şişeye dokunun.
    NOT: Referans alınan hücre ayrışma ajanı ile hücrelerin 15 dakikadan daha uzun süre inkübe edilmesi, hücrelerin bir araya toplanmaya başlamasına neden olur, bu da doğru bir hücre sayımı elde etmeyi zorlaştırır ve tahlile müdahale edebilir.
  6. Şişeye 5 mL önceden ısıtılmış DMEM tam ortamı ekleyin ve hücre ayrışma çözeltisine / hücre süspansiyonuna yavaşça karıştırın. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu steril bir 50 mL'lik santrifüj tüpüne ekleyin. Bir santrifüj (150 × g, 5 dk, 22 °C) kullanarak bir hücre peleti yapın.
  7. Pelet oluşturulurken, jelatin çözeltisini bir vakuma bağlı bir Pasteur pipeti kullanarak aspirasyon yoluyla 96 oyuklu plakadan çıkarın. Jelatinin çıkarılması sırasından, çözelti kaplanmaya hazır olana kadar plaka kapağını çıkarın.
    NOT: İsteğe bağlı olarak vakuma bağlı çok kanallı bir pipet veya steril manifold kullanılabilir.
  8. Bir vakuma veya serolojik bir pipete bağlı bir Pasteur pipeti kullanarak aspirasyon yoluyla ortamı santrifüj tüpünden çıkarın; Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin.
  9. 5 veya 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak santrifüj tüpüne taze DMEM tam ortamı ekleyin. DMEM tam ortamını 1.000 μL'lik bir pipet veya 5 mL'lik bir serolojik pipet ile karıştırarak hücre peletini nazikçe parçalayın.
    NOT: Tipik olarak sekiz mililitre DMEM kullanılır, ancak hücre sayımını kolaylaştırmak için daha yüksek hacimler eklenebilir.
  10. 20 μL veya 200 μL uçlu bir pipet kullanarak bir mikrosantrifüj tüpünde 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi ile karıştırın. Bir hemositometreye 10 μL hücre süspansiyonu / tripan mavisi karışımı ekleyin ve hücreleri sayın.
  11. 10 veya 25 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 600.000 hücre / mL'lik bir yoğunluk elde etmek için hücre süspansiyonuna DMEM tam ortamı ekleyin. Bu, 96 oyuklu bir plakada (deneyle optimal yoğunluk olarak belirlenen) 60.000 hücre / kuyuluk bir nihai yoğunluk verecektir.
    NOT: Normal bir başarılı hücre kültürü, 12.000.000 ila 15.000.000 hücre verecektir, bu da iki ila üç 96 oyuklu plakayı tohumlayabilir.
  12. Santrifüj tüpünü hafifçe ters çevirerek hücre süspansiyonunu karıştırın ve 50 mL'lik çok kanallı bir pipet haznesine ekleyin. Rezervuarı her 30 saniyede bir hafifçe yan yana sallayarak rezervuardaki süspansiyonu karıştırarak, çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Şeffaf plaka kapağını değiştirin ve eşit hücre dağılımını sağlamak için steril davlumbazın yüzeyinde Kuzey'den Güney'e ve Doğu'dan Batı'ya kaydırarak plakayı hafifçe sallayın. Plakayı inkübatörde (37 °C,% 5 CO2) 16-24 saat inkübe edin.
    NOT: Ek plakalar hazırlamak için ek hücre süspansiyonu kullanılabilir veya hücre hattına devam etmek için 1.10-1.11 adımları tekrarlanabilir.

3. Kalsiyum mobilizasyon testi hazırlığı

  1. Tahlil reaktiflerini hazırlayın.
    1. Bir mikrosantrifüj tüpüne 36 mg probenesid ekleyerek ve 0.6 M NaOH (500 μL) içinde çözerek probenesid çözeltisi (250 mM, sulu) hazırlayın. Çözümü girdap.
      NOT: Probenesid, organik iyon taşıyıcıları75,76,77 inhibe ederek hücrede boya tutulmasını iyileştirir.
    2. HBSS-HEPES test tamponu yapmak için, 500 mL'lik bir şişe Ca / Mg / fenol kırmızı içermeyen HBSS'ye (10 mM'lik bir HEPES çözeltisi yaparak) HEPES (1.19 g) ekleyin. Tamponu MgCl2 (1 M sulu çözelti, 500 μL) ve CaCl2 (1 M sulu çözelti, 500 μL) ile destekleyin. Solüsyonu karıştırın ve kullanılmadığı zaman buzdolabında 5 °C'de saklayın.
      1. Her 96 oyuklu plaka için, 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 50 mL HBSS-HEPES tahlil tamponu ekleyin, 500 μL probenesid çözeltisi ile destekleyin ve iyice karıştırın. Kullanmadan önce tamponu oda sıcaklığına ısıtın.
    3. Bir mikrosantrifüj tüpüne veya HPLC şişesine Pluronic F-127 (20 mg) ekleyerek ve 200 μL DMSO ile çözerek DMSO'da% 10'luk bir Pluronic F-127 çözeltisi yapın.
      NOT: Bu çözelti oda sıcaklığında saklanabilir ve yaklaşık 30 tabak için yeterlidir. Pluronic F-127, oda sıcaklığında çok yavaş çözünür ve çözünmeyi kolaylaştırmak için hafifçe ısıtılmalıdır.
    4. Boyayı çözmek için önce bir Fluo-4 / (50 μg) şişesine 24 μL DMSO ekleyerek boya yükleme tamponunu hazırlayın. Folyo sarılı 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 6 mL HBSS-HEPES test tamponu ekleyin ve 6 μL% 10 Pluronic F-127 ve 6 μL Fluo-4 / çözeltisi ile destekleyin. Çözeltiyi kısaca girdaplayın ve oda sıcaklığında, ışıktan 10 dakika bekletin.
      NOT: Fluo-4'ün foto-ağartılmasını önlemek için, boya solüsyonunu içeren santrifüj tüpünün ve tahlil plakasının kapağının etrafına alüminyum folyo sararak boyayı ışıktan uzak tutun.
  2. Tahlil plakalarını hazırlayın.
    1. Tahlil plakasını inkübatörden çıkarın ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak birleşmeyi onaylayın. DMEM komple ortamını bir lavaboya iterek ve plakanın üstünü bir kağıt havluyla lekeleyerek manuel olarak çıkarın.
      NOT: Plakayı yatay olarak tutarak ve hafifçe vurarak, ardından plakayı 180° döndürerek ve tekrar ederek ortam yeterince çıkarılır.
    2. HBSS-HEPES tahlil tamponu artı probenesid çözeltisini 50 mL çok kanallı pipet çözücü haznesine ekleyin.
      NOT: Bu solüsyon daha sonraki yıkama adımları için kullanılacaktır ve bir kenara bırakılmalı ve ihtiyaç duyulana kadar alüminyum folyo ile kapatılmalıdır.
    3. Çok kanallı bir pipet ile her bir oyuğa 100 μL HBSS-HEPES tahlil tamponu artı probenesid çözeltisi ekleyin ve hücrelerin 5 dakika boyunca probenesid varlığında oturmasına izin verin. HBSS-HEPES test tamponunu, adım 3.2.1'deki gibi lavaboya hafifçe vurarak çıkarın.
    4. Ayrı bir 50 mL çok kanallı pipet çözücü haznesine boya yükleme tamponu ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak tahlil plakasının her bir oyuğuna 50 μL boya yükleme tamponu ekleyin. Plakayı 45 dakika (37 °C,% 5 CO2) inkübe edin.
    5. Plaka inkübatördeyken, agonist / antagonist çözeltilerini hazırlayın.
      1. Antagonist çözeltiler DMSO'da 31.6 mM çözeltiler olarak depolanır. Bir PCR tüpünde, 1,58 mM'lik bir çözelti elde etmek için 2 μL stok çözeltisini 38 μL %0,1 BSA/su ile seyreltin. Bu çözeltinin 2 μL'si, tahlil plakasında 31.6 μM'lik bir nihai konsantrasyon verecektir. 1.58 mM antagonist çözeltisinin 4 μL'sini 36 μL% 5 DMSO / su (BSA ilavesi yok) ile seyreltin ve kalan konsantrasyonları seri seyreltmeler yoluyla hazırlayın.
      2. Tahlil plakasının her bir oyuğuna 6 μL eklendiğinde 6,5 μM'lik bir nihai konsantrasyon verecek olan HBSS-HEPES tahlil tamponunda 108.3 μM (16.7x) bir TFLLRN-NH2 çözeltisi hazırlayın. Örneğin, 0.5 mM'lik bir stok çözeltisi vermek için 2 mg'lık bir TFLLRN-NH2 alikotunu 5.244 mL HBSS-HEPES test tamponu ile çözün. 108.3 μM'lik bir çözelti elde etmek için bu çözeltinin 1.083 mL'sini 3.917 mL HBSS-HEPES test tamponu ile karıştırın.
        NOT: TFLLRN-NH2 çözeltileri kullanılmadığı zaman -20 °C'lik bir dondurucuda saklanmalıdır.
    6. Plakayı inkübatörden çıkarın ve uygun bir ayarda bir floresan mikroskobu kullanarak boya alımını sağlayın (tipik olarak yeşil floresan proteini için, hücrelere başarıyla yüklenen Fluo-4 örneği için Şekil 1'e bakınız). Plakayı adım 3.2.1 ile aynı şekilde hafifçe vurarak boya yükleme tamponunu çıkarın.
    7. Hücreleri 2x 50 μL HBSS-HEPES test tamponu artı probenesid çözeltisi (adım 3.2.3'ten itibaren) ile her bir kuyucukta yıkayın (ortamı lavaboya hafifçe vurarak çıkarın).
    8. Her bir oyuğa 92 μL HBSS-HEPES tahlil tamponu ekleyin ve fazla boyanın tamamen çıkarıldığından ve hücrelerin yapışkan kaldığından emin olmak için hücreleri bir floresan mikroskobu ile tekrar görüntüleyin.
    9. Uygun kuyucuklara 2 μL antagonist çözelti ve araç eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın (temsili bir plaka haritası için Tablo 1'e bakınız).

4. Kalsiyum mobilizasyon testinin yapılması

  1. Plaka okuyucuyu aşağıdaki gibi ayarlayın: sıcaklık: 37 °C; uyarma dalga boyu: 485 nm; emisyon dalga boyu: 525 nm; ölçüm yüksekliği: 7,8 mm (optimize edilmiş); yanıp sönme sayısı: 100; Tekrar sayısı: 20.
  2. Plakayı plaka okuyucuda 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Sütun 1 ve 2'deki arka plan floresansını ölçün (kuyu başına beş tarama).
  3. Plakayı plaka okuyucudan çıkarın ve çok kanallı bir pipet kullanarak 8 tüplü bir PCR şeridinden 1 ve 2 numaralı sütunlardaki her bir oyuğa hızlı bir şekilde 6 μL agonist solüsyonu ekleyin.
    NOT: Bu adım için, 0,1-10 μL pipet uçlarına sahip 8 kanallı elektronik bir pipet kullanıyoruz.
  4. Hücrelerde kalsiyum mobilizasyonu meydana geldikçe floresanstaki değişikliği ölçün. Yukarıdaki ayarlara göre her kuyucuk için 20 tarama gerçekleştirin.
    NOT: Her bir kuyucuğun her biri 20x olmak üzere iki sütunda taranması yaklaşık 5 dakika sürer (yani, her bir oyuğun taramaları arasında ~15 saniye).
  5. 3-12 arasındaki sütunlar için 4.2-4.4 arasındaki adımları iki sütunlu artışlarla yineleyin.

5. Veri analizi

  1. Tahlildeki verileri, her iki sütunlu grup için ayrı elektronik tablolar olarak dışa aktarın.
  2. AVG (ilk tarama: son tarama) işlevini kullanarak bazal floresan okumalarının ortalamasını bulun. Bunu her iki sütundaki her kuyu için yapın.
  3. MAX (ilk tarama: son tarama) fonksiyonunu kullanarak agonist eklendikten sonra maksimum floresanı bulun.
  4. Bazal floresansı maksimum floresanstan çıkararak floresanstaki değişimi hesaplayın.
  5. Negatif kontrol (agonistsiz araç ilavesi) için hesaplanan floresan değişimini aynı sütundaki her bir kuyucuktan çıkarın.
  6. Her bir kuyucuktaki floresan değişikliğini araçtaki floresan değişimine (%0,1 DMSO/su) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 kuyusuna bölerek floresanstaki nispi (normalleştirilmiş) değişikliği bulun.
  7. Kontrol dışı değerleri, yüzde olarak, bir istatistik ve grafik yazılım programına kopyalayın. Başvurulan yazılımı kullanıyorsanız, X ekseni olarak seçilen Sayılar ve Y ekseni olarak yan yana alt sütunlardaki değerleri çoğaltarak XY tablosu seçeneğini belirleyin.
  8. Verilerden konsantrasyon-tepki eğrilerini (CRC'ler) çizmek için programı kullanın. Başvurulan yazılımı kullanıyorsanız, log(inhibitör) ve yanıt - Değişken eğim (dört parametre) seçeneğini seçin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu testin amacı genellikle üç ila dört yeni parmodulin için konsantrasyon-tepki eğrileri (CRC'ler) üretmektir. Her tahlil plakasında, NRD-21 gibi bilinen bir bileşik için genellikle ek bir CRC üretilir ve bu, bilinen IC50'si nedeniyle deney için bir kalite kontrolü görevi görür. CRC'leri oluşturmak için, Tablo 1'de gösterilen gibi bir plaka haritası planlanmalıdır. Bunun yerine tek noktalı konsantrasyon tepkileri isteniyorsa, 10 μM nihai konsantrasyonlardaki (veya diğer tercih edilen konsantrasyonlardaki) bileşikler en az üç oyuğa eklenmelidir.

Testi gerçekleştirirken, plaka okuyucu tarafından görüntülenen floresansta hızlı bir artış olmalıdır (artış ilk 3-4 tarama içinde başlamalıdır) (Şekil 2B'deki başarısız çıktıya kıyasla örnek bir çıktı için Şekil 2A'ya bakın). Plaka okuyucunun floresanstaki artışı doğru bir şekilde yakalayabilmesi için agonistin hızlı bir şekilde (15 s içinde) eklenmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Çalışan bir deneyde, araç kuyusu için floresan sinyali düz kalmalı, pozitif kontrol kuyularındaki (araç + 6.5 μM TFLLRN-NH2) floresan sinyali üç veya dört taramadan sonra artmaya başlamalıdır. Maksimum değere ulaşıldığında (~10 taramadan sonra), floresan sinyali yavaş yavaş azalmaya başlamalıdır. Yüksek etkili antagonistlerle yapılan deneylerde, en yüksek antagonist konsantrasyonlarına sahip kuyucuklar, negatif kontrole benzer şekilde nispeten düz kalan bir sinyale sahip olmalıdır. Pozitif kontrol kuyularının sinyali ile düşük antagonist konsantrasyonlarına sahip olanlar arasında da çok az fark olmalıdır (Şekil 2C). En düşük antagonist konsantrasyonları hala kalsiyum mobilizasyonunu inhibe ediyorsa, taranan konsantrasyonlar daha düşük konsantrasyonları içerecek şekilde ayarlanmalıdır. Oluşturulan CRC'ler, eğrinin sigmoidal yapısını tam olarak göstermek için en az bir ~0 veri noktasına sahip olmalıdır.

Bir deneyin işe yaramadığının en yaygın işareti, pozitif kontrol kuyusunun (araç + 6.5 μM TFLLRN-NH2) floresanda büyük bir artış göstermemesidir (Şekil 2B). Bu, çeşitli nedenlerle olabilir: hücre sayısı düşük olabilir (birleşme doğrulanmadıysa), agonist çözelti tehlikeye girebilir veya hücreler tarafından yetersiz miktarda boya alınmış olabilir. Bazı kuyucuklara yanlışlıkla agonist eklememek de mümkündür.

Programlanmış bir yöntemle, veriler, her biri iki sütun için veri içeren altı ayrı elektronik tablo olarak çıkarılır. Bazal floresanın beş taraması kendi sıralarındadır ve hemen aşağıdaki satırda agonist eklendikten sonra alınan 20 tarama (temsili çıktı için Şekil 3'e bakınız). Örnek bir hesaplama için, NRD-21 kullanan bir deneyden bir sütun kullanılacaktır. Dışa aktarılan dosyada (Şekil 3), her bir oyuktan gelen bazal floresan C'den G'ye kadar olan sütunlara verilir ve agonist eklemesinden sonraki veriler (aşağıdaki 20 tarama) sonraki satırdaki C'den V'ye kadar olan sütunlara verilir. Dosyadaki 14-17 arası satırlar, iki ayrı sütunun pozitif denetimini içerir. Pozitif kontrol kuyularından biri için bazal sıranın ortalaması, 1.039.8 değerini veren "=AVERAGE(C16:G16)" komutu kullanılarak hesaplandı. Bu komut, her bir kuyucuktaki ek bazal ölçümler için tekrarlandı. Deneysel taramaların maksimumu, 2,629 değerini veren "=MAX(C16:V16)" komutu kullanılarak hesaplandı. Yine, komut tüm kuyular için tekrarlandı. Her kuyucuk için bazal floresan daha sonra maksimum değerden çıkarıldı. Bu deneyde, negatif kontroldeki floresan değişimini her bir kuyucuktan (örnek sütunda 142.6 idi) çıkararak veriler normalleştirildi. Bu değerler daha sonra pozitif kontrolün benzer şekilde hesaplanan değerine bölündü. Bu sütunda maksimum değer 2.629, ortalama bazal ölçüm 1.039.8 ve boşluk için çıkarılan değer 142.6 idi. Düzeltilmiş pozitif kontrol değeri bu nedenle 1.446,6'dır (denklemden hesaplanmıştır). Bu denklem, sütundaki her bir kuyucuk için tekrarlanır ve hesaplanan değerler, floresandaki nispi değişimlerini vermek için 1.446,6'ya bölünür. Oranlar daha sonra yüzdelere dönüştürüldü ve analitik yazılıma kopyalandı. Bu işlem diğer 11 sütun için tekrarlandı.

Referans verilen yazılımı kullanarak verileri işlemek için, yan yana sütunlarda tekrarlanan üç ölçüme sahip olma seçeneğiyle bir XY tablosu seçilmelidir. Her konsantrasyonun -log değerleri x değerlerine girilmeli ve hesaplanan yüzdeler y değerlerine eklenmelidir. Veriler üzerinde doğrusal olmayan bir regresyon analizi yapılmalıdır, bu da dört konsantrasyon-tepki eğrisinin üretilmesine neden olur. Program ayrıca IC50 değerlerini, niceliksel hata istatistiklerini ve uyum istatistiklerinin iyiliğini de verir.

figure-results-1
Resim 1: Fluo-4/, EA.hy926 hücrelerine yüklenmiştir. Fluo-4, boya inkübasyonu ve yıkama aşamalarından sonra seçici olarak EA.hy926 hücrelerine yüklenir. Tüm floresans, boya sızıntısı olmadan hücrelerin içindedir. Görüntü, bir EVOS hücre görüntüleyicide GTP ayarı ve 20x büyütme kullanılarak elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Testin potansiyel çıktısı. (A) Çalışan bir tahlilin temsili plaka okuyucu çıktısı. Satır A negatif kontroldür ve floresansta herhangi bir değişiklik yoktur. Satır B pozitif kontroldür ve floresansta hızlı bir artış gösterir. CH sıraları, plakada daha düşük parmodulin konsantrasyonları ile deneysel kuyulardır. (B) Başarısız bir deneyin örnek çıktısı. Pozitif kontrol olan B satırında floresansta herhangi bir artış görülmez. (C) PAR1 agonisti TFLLRN-NH2 tarafından indüklenen zamanla floresanstaki değişiklik. Sağlanan ayarları kullanarak 96 oyuklu bir plakanın iki sütununu taramak, PerkinElmer EnSpire plaka okuyucusunda ~ 5 dakika sürer (yani, her bir oyuğun taramaları arasında ~ 15 saniye). Farklı NRD-21 çözeltileri belirtildiği gibidir, "Agonist" 6.5 μM TFLLRN-NH2, n = 1'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Çalışan bir tahlil için örnek Excel çıktısı. Bazal floresan, 10. satırdan başlayarak çift sayılı satırlara verilir ve agonist eklenmesinden sonraki ilk 10 taramanın sonucu, sonraki tek sayılı satırlarda gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Robotik sıvı işleme ve "fiske". Tahlil plakalarının jelatin ile önceden kaplanması ve plakayı fiske vurarak ve kurulayarak manuel olarak medya değişimlerini gerçekleştirmek, daha düşük değişkenliğe sahip konsantrasyon-tepki eğrileri üretir. (A) Parmodulinler ML161 ve NRD-21 ve 5 μM TFLLRN-NH2'nin konsantrasyon-tepki eğrileri, n = 3 (otomatik sıvı işleme). (B) Parmodulinler ML161 ve NRD-21 ve 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3'ün konsantrasyon-tepki eğrileri (jelatin kaplı, fistekli plakalar). Veriler SEM ± anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Sıcaklık etütleri. Testin 37 °C'de gerçekleştirilmesi, oda sıcaklığına göre daha fazla tekrarlanabilir veri üretir. (A) ML161 ve 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (oda sıcaklığı) konsantrasyon-tepki eğrileri. (B) ML161 ve 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (37 °C) konsantrasyon-tepki eğrileri. Veriler SEM ± anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Hücre yoğunluğu çalışmaları. Optimal hücre yoğunluğu, bir teste başlamadan 16-24 saat önce tohumlama sırasında 60.000 hücre / kuyudur. (A) Farklı hücre yoğunluklarında TFLLRN-NH2'nin konsantrasyon-tepki eğrileri, n = 3. (B) 60.000 hücre / kuyu optimal hücre yoğunluğunda TFLLRN-NH2'nin konsantrasyon-tepki eğrisi. Veriler SEM ± anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Tahlil hacmi. 100 μL'lik bir tahlil hacminin kullanılması, 200 μL'lik bir nihai hacim kullanan tahlillerden daha fazla tekrarlanabilir konsantrasyon-yanıt eğrisi üretir. (A) ML161 ve 5 μM TFLLRN-NH2'nin konsantrasyon-tepki eğrileri, n = 3 (200 μL nihai hacim). (B) ML161 ve 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (100 μL nihai hacim) konsantrasyon-tepki eğrileri. Veriler SEM ± anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Testin bir isabet bileşiğini tespit etme yeteneğini belirlemek için Z' faktörlerinin oluşturulması. 6.5 μM TFLLRN-NH2 (sütun B) artı isteğe bağlı PAR1 antagonistleri 10 μM NRD-21 (sütun C) veya 0.316 μM vorapaxar (sütun D) ile kalsiyum mobilizasyon yanıtları. (A) Tahlil, hücre tohumlamasından 16 saat sonra tamamlandı. (B) Tahlil, hücre tohumlamasından 24 saat sonra tamamlandı. (C) Aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanan Z' faktörleri tablosu: figure-results-9burada σp pozitif kontrolün standart sapmasıdır, σn negatif kontrol veya numune için standart sapmadır, μp pozitif kontrolün ortalamasıdır ve μn negatif kontrolün veya numunenin ortalamasıdır. Her değer, araç + 6.5 μM TFLLRN-NH2'nin pozitif kontrol olarak atanması ve belirtilen durumla negatif kontrol (araç) veya numune (NRD-21 ve vorapaxar) olarak karşılaştırılmasıyla hesaplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10
Şekil 9: Bir PAR2 agonistinden kalsiyum mobilizasyonu. 10 μM SLIGKV-NH2'nin neden olduğu zaman içinde floresan değişimi, n = 4. Veriler SEM ± araçlardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Bileşik tarama için örnek 96 kuyulu plaka haritası. Her konsantrasyon üç kopya halinde ölçülür. Satır A negatif kontroller içerir (antagonist yok; agonist yok) ve Satır B pozitif kontroller içerir (antagonist yok; agonist). 1'den 3'e kadar olan sütunlar, isteğe bağlı olarak kalite kontrol için kullanılabilen parmodulin NRD-21'in altı yarım log konsantrasyonunu içerir. PM-A, PM-B, PM-C isimsiz parmodulinlerdir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Daha önce yayınlanmış protokol ile yeni, optimize edilmiş protokolün karşılaştırılması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce bildirilen protokol72 genellikle güvenilir ve yeni bir kurşun parmodulin tanımlamamıza izin verirken, NRD-21,62 daha verimli bir protokol istendi. Tahlil, COVID-19 salgınının neden olduğu tedarik sıkıntısı sırasında daha da tehlikeye girdi. Otomatik sıvı işleyici için uç almak zorlaştı ve uçları yıkamaya, sterilize etmeye ve yeniden kullanmaya çalışmak, önemli farklılıklarla CRC'ler üretti. Bu, geliştirilmiş bir PAR güdümlü kalsiyum mobilizasyon testini düzene sokmak için tasarlanmış acil bir dizi deneyi kolaylaştırdı.

Yıkama adımları için otomatik sıvı işleyicinin kullanımına geçerli bir alternatif belirlemek bu çalışmada ana öncelikti. Önceki tahlil geliştirme sırasında, robotik sıvı işleyicinin kullanılması, manuel medya değişimlerinin neden olduğu hataları azalttı. Bununla birlikte, 8 kanallı sıvı işleyici ile ortam alışverişleri her bir test plakasının toplam süresini 30-45 dakika artırdığından, bu teste önemli bir zaman ekledi. Daha önce bir "fiske" medya değişimi yöntemi denenmiş olmasına rağmen, bu deneyler hücre tohumlamadan önce tahlil plakalarını jelatin ile kaplamadan yapıldı. Plakaları jelatin ile ön işleme tabi tutarak, ortamı manuel olarak çıkarmak için kullanılan kuvvetten bağımsız olarak hücrelerin yerinde kalması sağlandı. Jelatin kaplı, hafifçe vurulmuş plakalar kullanılarak yapılan bir tahlilde üretilen CRC'ler, otomatik sıvı işleyicinin kullanıldığı eğrilere göre birden fazla veri noktasında daha iyi uyum kalitesi puanlarına ve daha küçük hata çubuklarına sahipti (Şekil 4). Otomatik sıvı işleyici kullanan plaka için kök-ortalama-kare hata (RMSE) değerleri ML161 eğrisi için 9.687 ve NRD-21 eğrisi için 10.690 iken, jelatin ve manuel medya değişimi kullanan plaka için RMSE değerleri ML161 eğrisi için 7.658 ve NRD-21 eğrisi için 6.408 idi. Daha düşük RMSE değerleri, verilen verilere daha iyi uyan bir eğriyi gösterir. Bu değişiklik aynı zamanda toplam test süresini de büyük ölçüde azaltır. Alternatif olarak, çok kanallı bir otomatik plaka yıkayıcı kullanılabilir.

Agonist ekleme yöntemi, incelenen ek bir faktördü. Bu, agonistin tüm plaka kuyucuklarına aynı anda eklenip eklenemeyeceğini belirlemek için yapıldı ve ardından tüm plakanın bir kerede taranması yapıldı; Bu, araştırmacıların, verimi önemli ölçüde artırabilecek çok sayıda ayrı agonist ilavesi için zamana duyarlı test süresince plaka okuyucunun yakınında kalma ihtiyacını ortadan kaldıracaktır. Ne yazık ki, tüm kuyucuklara agonist eklemek ve tüm plakayı taramak sorunluydu, çünkü yanıt, her oyuktaki geçici maksimum kalsiyum konsantrasyonunu güvenilir bir şekilde ölçmek için çok hızlıydı ve oldukça değişken CRC'ler veriyordu. Taranan sütun sayısının 12'den 6'ya düşürülmesi sonuçları biraz iyileştirdi, ancak en iyi sonuçlar bir seferde yalnızca iki sütunun (16 kuyucuk) taranmasından elde edildi. Tahlil sıcaklığının 37 ° C'den oda sıcaklığına düşürülmesinin, kalsiyum konsantrasyonundaki değişimi güvenilir ölçümlere izin verecek kadar yavaşlatabileceği varsayılabilir. Farklı boyalar veya hücre hatları ile çoklu kalsiyum mobilizasyon protokollerioda sıcaklığında 78,79 doğrulanmış olmasına rağmen, bu spesifik testte 37 °C'de daha iyi sonuçlar gözlenmiştir. Oda sıcaklığında (~ 23 ° C) ölçülen antagonist konsantrasyon-yanıt eğrileri, 37 ° C'deki kadar tekdüze değildi (Şekil 5A ve Şekil 5B). Bu sonuçlar nedeniyle, 37 °C'de aynı anda iki sütunun taranmasının optimal olduğu belirlendi.

Test süresini azaltmak için incelenen bir diğer değişken ise antagonist inkübasyon süresiydi. Önceki protokolde, antagonistler agonist ilavesinden önce 40 dakika boyunca inkübe edildi, ancak burada parmodulinlerin PAR1 ile etkileşime girmesi için 15 dakikanın yeterli olduğu belirlendi. Bu, aynı anda birden fazla sütuna parmodulin çözeltileri eklenerek ve ardından farklı zaman noktalarında agonist eklenerek test edildi (agonist t = 15 dakika, 30 dakika ve 45 dakikada eklendi). Parmodulinlerin aktivitesi, antagonistlerin daha uzun süre inkübe edilmesiyle korundu, ancak iyileştirilmedi. Bu bulgu sonucunda yeni protokolde antagonist solüsyonlar tek seferde tüm plakaya eklenmekte ve agonist solüsyonlar 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra ilk kolonlara eklenmektedir. Bu değişiklik, toplam deneme süresini 30 dakika daha azaltır. Vorapaxar gibi yavaş bağlanma kinetiğine sahip antagonistlerin daha uzun inkübasyon süreleri gerektirebileceğiunutulmamalıdır 80,81.

Tahlil süresinin kısaltılması ve sıvı işleyiciye olan bağımlılığın ortadan kaldırılması, tahlil protokolünün güncellenmesini gerektiren ana faktörler iken, alternatif bir hücre kültürü yöntemi de test edildi. Daha önce, plakalar doğrudan donmuş stoklardan alınan hücrelerle tohumlanır ve tohumlamadan sonra 40-48 saat boyunca plakalarda büyümesine izin verilirdi. Bununla birlikte, tohumlama plakaları ile tahlillerin gerçekleştirilmesi arasındaki uzun süre, her hafta gerçekleştirilebilecek deney sayısını sınırladı. Kültür şişelerinde yetiştirilen hücrelerin kullanılması bu süreyi büyük ölçüde azaltır. Hücreler, doku kültürü ile muamele edilmiş T-75 şişelerinde büyütüldü ve enzimatik olmayan bir hücre ayrışma ajanı kullanılarak şişe yüzeyinden çıkarıldı. Bu, belirli hücre yüzeyi reseptörlerine, özellikle PAR2'ye tripsin ile zarar vermekten kaçınmak için önemli olabilir. Tahlil plakasına eklendikten sonra, hücrelerin yerleşmesi ve jelatine yapışması için yeterli zamana ihtiyacı vardır. Ortamın uzaklaştırılmasının fiske atma yöntemi de hücrelerin yerini alabildiğinden, hücrelerin jelatin içine gömülmesine izin vermek için yeterli zamana ihtiyaç vardır. Hücrelerin iki saat boyunca yerleşmesine izin veren bir deney, önemli bir hücre kaybına neden oldu ve bu da kullanılamaz bir tahlil ile sonuçlandı (veriler gösterilmemiştir). 2 saat ile 12 saat arasındaki çökeltme süreleri, tek bir günde analiz edilebilecek plaka sayısını sınırlar, bu nedenle daha uzun gece inkübasyonu tercih edilir. Yeni kültürlenmiş hücrelerin 16 saat ile 24 saat arasında herhangi bir yerde inkübe edilmesinin, hücrelerin jelatine tamamen yapışmasına izin verdiği ve tekrarlanabilir verilerin elde edilebileceği bulundu.

Donmuş hücrelerden kültür şişesi ile yetiştirilen hücrelere geçiş, optimal hücre tohumlama yoğunluğunu da değiştirdi. Tahmin edilebileceği gibi, önceki protokolde standart olan 25.000 hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlama kuyuları, hücrelerin daha kısa bir inkübasyon süresi ile birleşmesine izin vermedi. Optimal koşulları belirlemek için sekiz ayrı hücre yoğunluğu ile agonist CRC'ler oluşturuldu (Şekil 6). Daha önce, TFLLRN-NH2, 5 μM'de PAR1 agonisti olarak kullanılıyordu, çünkü bu, daha düşük çözünürlüklü parmodulinlerle makul antagonizmaya izin veriyordu. 45.000-65.000 hücre/kuyu ile tohumlama yapılırken arka plan veya maksimal sinyalde önemli bir fark yoktur, ancak 60.000 hücre/kuyu eklendiğinde 5 μM TFLLRN-NH2 ile değişkenlikte azalma olur. İlginç bir şekilde, daha fazla sayıda hücre ile maksimum floresansta önemli bir artış yoktur, bu nedenle azalan değişkenlik nedeniyle optimal yoğunluk olarak 60.000 hücre / kuyu seçilmiştir. Agonist CRC'ler ayrıca TFLLRN-NH2 için 6.5 μM'lik bir EC50 üretti, bu nedenle bu yeni standart agonist konsantrasyonu olarak seçildi.

Analiz edilen bir diğer faktör, tahlilde kullanılan hacimlerdi. Önceki protokolde, 200 μL'lik bir nihai test hacmi vermek için her oyuğa 2 μL agonist eklenmiştir. Daha yüksek hacimlerde agonist çözeltisi eklemenin, ancak nihai konsantrasyonun sabit tutulmasının, karıştırmaya yardımcı olarak daha hızlı ve daha güvenilir bir sinyale neden olabileceği varsayılmıştır. Bu hipotezi test etmek için, farklı konsantrasyonlarda NRD-21 içeren bir test plakasında 100 μL veya 200 μL HEPES-HBSS'ye 2 μL, 6 μL ve 10 μL TFLLRN-NH2 eklenmesi karşılaştırıldı. Hangi agonist hacmi ve son tahlil hacmi kombinasyonunun en tutarlı veriyi verdiğini belirlemek için her koşuldan NRD-21'in CRC'leri oluşturuldu. Hem 2 μL hem de 6 μL ilaveleri, çok az değişkenliğe sahip üretilen CRC'lerle sonuçlanırken, 10 μL TFLLRN-NH2'nin eklenmesinden üretilen eğriler için aynı şey söylenemez (veriler gösterilmemiştir); floresandaki artışlar, bu kuyularda ne büyüklük ne de zamanlama açısından tutarlı değildi, bu da aynı olması gereken ancak bunun yerine büyük ölçüde farklı olan CRC'ler üretiyordu. 2 μL ve 6 μL ilaveleri benzer sonuçlar vermesine rağmen, floresanstaki değişiklik 6 μL TFLLRN-NH2 ilavesiyle çok daha hızlı gerçekleşti, bu da her bir oyuktaki toplam tarama sayısının yarıya indirilmesine izin verdi, 40 taramadan 20 taramaya. Ayrıca, 100 μL'lik bir nihai hacim kullanılmasının, 200 μL'lik bir nihai hacimle üretilenlere kıyasla daha düzgün CRC'ler ürettiği tespit edilmiştir (Şekil 7).

Yeni protokolün daha yüksek verimli tahliller için uygun olup olmadığını belirlemek için, tahlil için Z' faktörleri hesaplanmıştır (Şekil 8). Z' faktörü, bir tarama testinin kalitesini ölçen istatistiksel bir yöntemdir ve bir testin aktif ve aktif olmayan bileşikleri güvenilir bir şekilde ayırt edip etmeyeceğini belirler82. Z' faktörleri, tohumlama plakalarından 16 ila 24 saat sonra ve farklı hücre pasajlarında gerçekleştirilen tahliller için hesaplandı. Tüm durumlarda - hem sadece agonist hem de agonist artı antagonist modlar için - hesaplanan Z' faktörleri 0.5'ten büyüktü, bu da mükemmel bir tahlilingöstergesiydi 82. Hesaplanan Z' faktörleri de önceki tahlil için hesaplananlara benzerdi, bu da daha hızlı bir tahlil üretmek için protokolde yapılan değişikliklerin kaliteyi olumsuz etkilemediğini gösteriyordu.

PAR güdümlü kalsiyum mobilizasyonu protokolü, CRC'lerden IC50 değerleri üreten deneyler yoluyla güncellendi, ancak tahlil, tek konsantrasyonlarda PAR1 antagonistlerinin etkinliğini ölçmek için de kullanılabilir. Test ayrıca PAR2 ligandlarının aktivitesini ölçmek için de kullanılabilir; örneğin, PAR2 agonisti SLIGKV-NH2 , güncellenmiş protokolde TFLLRN-NH2'nin yerini alabilir (Şekil 9); önceki protokol ayrıca PAR2 agonistleri ve antagonistleri83 ile de kullanılmıştır. Burada açıkça test edilmemiş olsa da, bu protokol, önceki protokolle kullanılan İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücreleri (HUVEC) ve potansiyel olarak diğer yapışık hücre hatları için de geçerli olmalıdır. Bunun gibi protokollere sahip bir tarama plakası okuyucusunun kullanımına ilişkin bir sınırlama, en azından bir plaka görüntüleyici ile mümkün olduğu gibi paralel olarak hızlı (saniyenin altında) yanıtları incelemek için uygun olmamalarıdır.

Sonuç olarak, burada bir plaka okuyucu kullanılarak endotelyal PAR güdümlü kalsiyum mobilizasyon testi için daha hızlı ve daha basit bir protokol bildirilmiştir. Otomatik bir sıvı işleyiciye olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, antagonist inkübasyon süresini azaltarak ve her bir kuyucuk için tarama sayısını azaltarak, toplam test süresi en az 90-120 dakika düşürüldü ve test maliyetleri düşürüldü (daha önce rapor edilen ve mevcut protokoller arasında bir karşılaştırma için, bakınız Tablo 2). Bu, yalnızca her gün daha fazla bileşiğin taranmasına izin vermekle kalmaz, aynı zamanda boya akışından kaynaklanan azalmış bir tahlil penceresi riskini de ortadan kaldırır, bu da güvenilmez sonuçlara yol açabilir. Yeni optimize edilmiş test, plaka okuyucuların kullanımıyla sınırlı laboratuvarlarda PAR1 veya PAR2 ligandlarının veya hücre içi kalsiyum mobilizasyonunu aktive eden potansiyel olarak diğer GPCR ligandlarının endotel hücrelerinde daha hızlı taranmasına izin verir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.D. parmodulinleri içeren patentlerin mucididir ve klinik kullanım için parmodulinler geliştiren Function Therapeutics, Inc.'in kurucusu ve hissedarıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Irene Hernandez, Trudy Holyst, Dr. Hartmut Weiler (Versiti Kan Araştırma Enstitüsü) ve Dr. Leggy Arnold'a (Wisconsin-Milwaukee Üniversitesi) bu projeye yer sağladıkları ve dolaylı destek sağladıkları için ve Dr. John McCorvy'ye (Wisconsin Tıp Fakültesi) ilgili tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü'ne (R15HL127636), ABD Savunma Bakanlığı'na (W81XWH22101) ve Ulusal Bilim Vakfı'na (2223225) hibe desteği için teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre Kültürü Reaktifleri
Uyumlu EA.hy926 hücreleriATCCCRL-2922
CellStripper hücre ayrışma reaktifiCorning25-056-CITripsin isteğe bağlı olarak kullanılabilir, ancak PAR2 tahlillerinden kesinlikle kaçınılmalıdır.
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), fenol kırmızısıCorning10-013-CV
ile Fetal Sığır Serumu (FBS)Avantor97068-091
Domuz derisinden elde edilen jelatinMilliporeSigmaG2500Deiyonize su ile sulu% 0.4 (a / h) bir çözelti yapmak için kullanın. Sterilize etmek için kullanmadan önce otoklavlayın.
Kalem / Strep (100X)Corning30-002-CI
Fosfat tamponlu salin (PBS)Corning21-040-CV
Tripan Mavisi (% 0.4 w / h)Corning25-900-CI
güçlü > Kalsiyum Mobilizasyon Reaktifleri< / güçlü >
4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)Termo172571000
Sığır serum albümini (BSA)Avantor97061-420
Kalsiyum klorür dihidratThermo42352-0250
Dimetil sülfoksitThermoJ66650-AD
Fluo-4/InvitrogenF14201
Hank'in dengeli tuz çözeltisi (Ca/Mg/fenol-kırmızı içermez)Corning21-022-CV
Magnezyum klorür hekzahidratMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spektrum KimyasalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Sodyum hidroksitVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA tuzu)Versiti Blood'da Trudy Holyst tarafından hazırlanmıştır. Araştırma Enstitüsü
Malzemeler< / güçlü>
96 iyi kültürle işlenmiş, siyah duvarlı, şeffaf tabanlı tahlil plakasıkapaklıCorning3603
Santrifüj tüpü, 15 mLAvantor89039-664
Santrifüj tüpü, 50 mLAvantor89039-656
Kültür şişesi, T-75Corning353136doku kültürü ile tedavi edildi
Tek kullanımlık reaktif rezervuarı, 50 mLCorningRES-V-50-S
Enspire plaka okuyucuPerkin ElmerÜretimi Durdurulan
Mikrosantrifüj tüpü, 1,5 mLAvantor20170-038
Pasteur pipeti, 9"Fisher13-678-6Bsterilize edilmelidir
PCR tüp şeridi ayrı düz başlık şeritleriAvantor76318-802
Pipet uçları, 20 & LBiotix63300042steril, filtreli uçlar
Pipet uçları, 200 & mikro; LBiotix63300044steril, filtrelenmiş uçlar
Pipet uçları, 1250 & mikro; LBiotix63300047steril, filtrelenmiş uçlar
PrismGraphPadhacim 6 kullanılmış
Serolojik pipet, 5 mLTradewinds Direct  07-5005
Serolojik pipet, 10 mLTradewinds Direct  07-5010
Serolojik pipet, 25 mLTradewinds Direct  07-5025
< Şeffaf

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4(2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582(2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, Pt 1 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597(2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062(2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124(2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100(2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23(2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516(2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Plaka Okuyucu DeneyiEndotelyal H crelerPAR1 Mod lat rleriFluo 4 BoyasY ksek Kapasiteli TaramaGq Sinyal iletimi96 Kuyucuklu PlakaFloresans l m

İlgili makaleler