Larvalardan Gençlik Dönemlerine Kadar Mikropsuz Zebra Balığı Modellerinin Üretimi, Bakımı ve Tanımlanması

Mikrobiyota (yani Arkeler, Bakteriler, Ökarya ve virüsler), bireylerde bağırsak bariyeri, epitel yüzeyi ve müsin fonksiyonları içindeki simbiyotik etkileşimler yoluyla fizyolojik ve patolojik süreçleri etkileyerek konak sağlığının korunmasında ve çeşitli hastalıkların gelişimine katkıda bulunmada çok önemli roller oynar ^1,2,3. Mikrobiyotanın bebeklikten gençliğe, yetişkinliğe ve yaşlanmaya kadar farklı yaşam evrelerindeki bileşimi ve ayrıca burun, ağız, cilt ve bağırsak bölgeleri gibi çeşitli yerlerdeki varlığı, çeşitli habitatlar ve ortamlar tarafından dinamik olarak şekillendirilir⁴. Organizmalardaki bağırsak mikrobiyotası, besin emilimi, bağışıklık tepkisi, patojen istilası, metabolik düzenleme vb.^{ile ilgilidir 5,6}. Hastalar üzerinde yapılan çalışmalar, bağırsak mikrobiyotasındaki bozulmaların insan obezitesi, uyku bozuklukları, depresyon, inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD), nörodejeneratif hastalıklar (Parkinson, Alzheimer), yaşlanma ve çeşitli kanserlerle ilişkili olduğunu göstermiştir ^7,8,9. Ayrıca, bağırsak mikrobiyotası ve konakçılar arasındaki etkileşimli yollar, fareler ve balık modelleri kullanılarak yapılan önceki araştırmalarda gözlemlendiği gibi, inflamatuar faktörleri, nörotransmiterleri, metabolitleri, bağırsak bariyerini ve oksidatif stresi içerir^10,11.

Son zamanlarda, potansiyel probiyotikler ve fekal mikrobiyota transplantasyonu (FMT) dahil olmak üzere çoklu bakteri ile ilgili yaklaşımlar veya tedaviler, klinik ve hayvan modellerinde bu bozukluklar için araştırılmıştır. Bu keşifler, mikrobiyota-bağırsak-beyin/karaciğer/böbrek ekseni, mikrobiyota türevi ürünler ve değiştirilmiş reseptör aktivitesi^12,13 ile ilgili keşiflere dayanmaktadır. Bununla birlikte, mikrobiyota konak sisteminin gelişimi, çeşitli işlevleri ve mekanizmaları, mikrobiyal topluluğun karmaşıklığı ve güçlü insan benzeri hastalık modelleri üretmenin zorluğu nedeniyle hala tam olarak anlaşılmamış ve tanımlanmamıştır.

Bu sorunları ele almak için, mikropsuz (GF) hayvan modelleri 19^{. yüzyılın} ortalarında acilen önerildi ve öncelikle 20^{. yüzyılda geliştirildi}. Mikrobiyal tespit ve gözlem teknolojilerindeki gelişmelerin yanı sıra antibiyotikle tedavi edilmiş ve gnotobiyotik modeller de dahil olmak üzere müteakip iyileştirmeler, bu modelleri daha da mükemmelleştirdi 14,15,16. Kendi geçmişlerini silerek ve çevresel mikroplardan kaçınarak yaratılan GF hayvanları, mikroorganizmalar ve konakçıları arasındaki etkileşimleri keşfetmek için mükemmel bir strateji sunar¹⁷. Hayvan modellerinin ve rafine protokollerin uygulanmasıyla, araştırmacılar GF farelerinde ve balıklarda hastalarda bulunan benzer mikrobiyal bileşimleri başarıyla kopyaladılar. Ek olarak, köpekler, tavuklar ve domuzlar gibi diğer GF hayvan modelleri, araştırma konuları olarak çeşitli seçenekler sunar 18,19,20,21. Bu yaklaşım, kommensal mikrobiyomların insanlarda kanser immünoterapisi de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar üzerindeki potansiyel terapötik etkilerinin araştırılmasını sağlamıştır ^16,18. GF modelleri, konakçılar içindeki spesifik bakteri kolonizasyonu, göçü, çoğalması ve etkileşiminin özellikleri ve mekanizmaları hakkında daha doğru bilgiler sunar. Bu, mikrobiyota ile ilgili hastalıkların ortaya çıkışı ve gelişimi hakkında çok önemli yeni bilgiler sağlar^22,23. Mikrobiyal araştırmalarda GF zebra balığının kurulması ve uygulanmasının tarihi, 2004'te Rawls ve ark. ve 2006'da Bates ve ark.'nın raporlarından 2017'de^Melancon ve ark.'nın protokolüne kadar gelişmiştir ^16,24,25. Bununla birlikte, yetişkin veya üreyen GF modellerinin fizibilitesi, değişken uzun ömür, başarı oranları ve sağlık sorunlarının eşlik ettiği uzun bir süreçtir.

Çeşitli hayvan modelleri arasında zebra balığı (Danio rerio), insan organlarına ve genomiklere avantajlı benzerliği, kısa gelişim döngüsü, yüksek doğurganlığı ve şeffaf embriyoları nedeniyle hem temel hem de biyomedikal araştırmalar için kritik bir araç olarak öne çıkmaktadır^19,26. Güvenilir insan hastalığı modelleri olarak hizmet veren zebra balığı, in vivo fizyolojik ve patolojik süreçlerin görsel bir temsilini sunarak, konakçı-mikrop etkileşimlerinin çekici özellikleri hakkında fikir verir. Özellikle, zebra balığı, bağırsak fizyolojisi, mikrobiyal dinamikler, gonadlar ve üreme gelişimi, konakçı bağışıklık sisteminin olgunlaşması, davranış ve metabolizmanın görüntülenmesine izin veren farklı hücre soyları sergiler²⁷. Zebra balığı embriyoları, yumurtadan çıkana kadar koruyucu koryonlar içinde gelişir ve döllenmeden 3 gün sonra (dpf) larva haline gelir. Aktif olarak 5 dpf'de yiyecek avlarlar ve döllenmeden yaklaşık 3 ay sonra (mpf) cinsel olgunluğa ^{ulaşırlar28}. Rawls ve ^ark.24 tarafından bildirilen ilk başarılı mikropsuz (GF) zebra balığı, yumurta sarısı emiliminden sonra otoklavlanmış yemle beslenen larvaların 8 dpf'den doku nekrozu ve 20 dpf'de toplam ölüm sergilediğini gösterdi. Bu, diyetin etkilerini veya uzun süreli (>7 dpf) GF balıklarını içeren deneylerde dışsal besin tedarikini dikkate almanın önemini gösterdi²⁹. Daha sonraki çalışmalar, steril gıda ve farklı balık modellerinde mükemmelleştirilen yöntemler kullanarak GF balıklarının üretim protokolünü geliştirdi¹⁶.

Bununla birlikte, GF zebra balığı modelleri üzerine yapılan araştırmaların çoğu, deneylerin sonunda 24 ila 48 saat boyunca 5 dpf'de bakteriyel enfeksiyonu içeren erken yaşam evrelerine odaklanmıştır^{ve deneylerin} sonunda 7 dpf'den önce toplanan örnekler ^25,30,31. İnsanlar ve zebra balıkları da dahil olmak üzere organizmalardaki mikrobiyotanın yaşamın başlangıcında kolonize olduğu ve büyüme ve gelişme sırasında şekillendiği yaygın olarak kabul edilmektedir. Bileşim yetişkin aşamalarında stabil kalır, konakçıdaki mikrobiyotanın rolleri, özellikle yaşlanma, nörodejeneratif, metabolik ilişkili obezite ve bağırsak hastalığı yönlerinde yaşam boyunca çok önemlidir³. Bu nedenle, daha uzun sağkalıma sahip GF hayvanlarından elde edilen bakış açıları, balık larvalarının erken yaşamdaki olgunlaşmamış bağışıklık ve üreme sistemlerini göz önünde bulundurarak, konakçı organ gelişimi ve işlevlerindeki mikrobiyal rollerin mekanizmaları hakkında fikir verebilir. Zebra balığı bağırsaklarındaki bakteri suşları önceki çalışmalarda izole edilmiş ve tanımlanmış olsa da, GF hayvan modellerini probiyotikleri seçmek veya konakçıdaki bakteri fonksiyonlarını araştırmak için enfekte etme potansiyeli sunarken^19,25, GF balık modellerinin üretimi ve uygulanması öncelikle erken yaşam evreleriyle sınırlandırılmıştır. Karmaşık üretim sürecine, yüksek bakım maliyetlerine ve gıda ve bağışıklıkla ilgili sorunlara atfedilen bu sınırlama, konakçıdaki mikrobiyotanın gelişimsel ve kronik etkilerini araştırmayı amaçlayan araştırma çabalarını engellemektedir.

Balıkların hayatta kalma oranı, davranışı, büyümesi, olgunlaşması ve genel sağlığı, özellikle mikropsuz (GF) modellerde, erken larvalardan yavrulara kadar ağız açık döneminde besin alımını ve emilimini kapsayan beslenme uygulamalarından önemli ölçüde etkilenir^32,33. Bununla birlikte, GF balık yetiştiriciliğindeki zorluklardan biri, larvaların büyümesini ve hayatta kalmasını sürdürmek için beslenme desteğinin etkinliğini sınırlayan uygun steril diyetlerin kıtlığıdır. Bu sorunu çözmek, gelişimsel savunma mekanizmaları ve bağırsak mikrobiyomunun olmaması nedeniyle zayıf sindirim yetenekleri göz önüne alındığında, GF balıklarının yaşamını eski haline getirmek için çok önemlidir. Gıda açısından canlı salamura karides (Artemia sp.) ağzı açık larvalar ve yavru balıklar için en uygun diyet olarak karşımıza çıkmaktadır. Canlı salamura karides ile beslenen balıkların, pişmiş yumurta sarısı veya diğer doğal ve sentetik yemlerle beslenenlere göre daha yüksek büyüme ve hayatta kalma oranları sergilediği görülmüştür³⁴. GF balıklarının erken yaşam modelleri yumurta sarısı desteği ile hayatta kalabilirken ve GF larva modelleri steril besleme ile korunabilirken, larvalardan yavrulara kadar uzun vadeli modeller oluşturmak ve cinsel olgunluğa ulaşmak zor olmaya devam etmektedir. Ek olarak, pul veya toz gıdalar eşit olmayan besin bileşimi ile sınırlıdır ve su kalitesini etkileyebilir. Buna karşılık, canlı Artemia'nın hem tuzlu hem de tatlı suda hayatta kalması, larvalar için yetişkinlere uygun küçük boyut, harmanlama kolaylığı ve daha yüksek kuluçka kalitesi gibi avantajları vardır³⁵. Önceki yöntemlere (^16,24,30) dayanarak, karmaşık tedavi sürecini basitleştirdik ve erken yaştaki GF balıklarından daha uzun süre steril bir yem olarak kolayca kuluçkaya yatırılan GF live Artemia sp. oluşturarak diyet zorluğunu ele aldık.

Bu çalışma, mikropsuz (GF) zebra balıklarının embriyolardan larvalara ve gençlik aşamalarına kadar büyümesini sağlamak için (1) nesil, (2) bakım, (3) steril oranın belirlenmesi ve (4) bakım ve beslemeyi kapsayan optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır. Sonuçlar, GF zebra balığının yumurtadan çıkması, hayatta kalması, büyümesi ve kısırlığı hakkında ön kanıtların yanı sıra GF Artemia sp. steril gıda olarak. Model oluşturma ve steril canlı mamaların hazırlanmasındaki ayrıntılı adımlar, mikrobiyota-konak etkileşimi araştırmalarında GF Artemia sp.'nin yanı sıra uzun vadeli GF balık modellerinin oluşturulması ve uygulanması için çok önemli teknik destek sağlar. Protokol, GF balık modellerinde bakteriyel izolasyon, tanımlama ve enfeksiyonu ele alarak, bakteriyel floresan etiketleme yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir ve mikroskop altında balık bağırsaklarında kolonizasyonlarını gözlemler. GF balıkları, bakteriyel enfeksiyonu olan gnotobiyotik balıklar veya transfer edilen insan mikrobiyota modelleri, işlevlerini ve konakçı bağışıklığı, sindirim, davranış, transkriptomik düzenleme ve metabolik yönler üzerindeki etkilerini aydınlatmak için çeşitli tespitlere tabi tutulacaktır. Uzun vadede, bu protokol deniz medaka gibi farklı vahşi tip balık türlerine ve potansiyel olarak belirli dokular veya hastalıklarla ilişkili diğer seçilmiş transgenik zebra balığı hatlarına genişletilebilir.

Balık deneyleri, Chongqing Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Çin'deki Chongqing Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerinin yanı sıra Devlet Kalite ve Teknik Denetim Bürosu tarafından yayınlanan deney hayvanları standartlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Onay Kimliği: GB14922-2001 - GBT14927-2001). Zebra balığı (Danio rerio, yabani tip, AB suşu) Çin Bilimler Akademisi Hidrobiyoloji Enstitüsü'nden temin edildi ve daha önce bildirilen prosedürlere göre laboratuvarda tutuldu³⁶.

1. Yetişkin zebra balığı bakımı ve embriyo toplama

NOT: Önceki çalışmalardan ve ^16,37,38,39 raporlarından elde edilen değişikliklere dayanarak, laboratuvarımızda yetişkin zebra balıklarının bakımı, larva yetiştiriciliği ve mikropsuz (GF) modellere yönelik uygulamalar aşağıda belirtilen adımlar izlenerek gerçekleştirilmiştir. Balık kültürü için ultra saf akış sistemi ticari olarak elde edilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu). Dengeli bir pH, tuz ve alkali ile korunan su, temiz koşulları sağlamak için döngü sırasında filtrasyona tabi tutulur.

1. Yetişkin balıkları, karanlığın fotoperiyodu ile otomatik döngü sisteminde (Malzeme Tablosuna bakınız) aşağıdaki standart prosedürle koruyun: ışık = 10 saat: 28 °C'de 14 saat ± 0,5 °C'de ve taze kuluçkaya yatırılmış Artemia sp. ile beslenir. günde iki kez.
2. Cinsel olarak olgun yetişkin zebra balığını (erkek: dişi = 2:1) bir gece önceden taze ve temiz su ile tanklara koyun.
3. Balıkların ertesi sabah (yaklaşık 8:30) laboratuvarda düzenli ışık stimülasyonu altında yumurtlamasına izin verin. 1-2 saat sonra balığı başka bir tanka aktarın.
4. Embriyoları, tek kullanımlık bir Pasteur pipeti kullanarak bir kültür kabında yetiştirme ortamı olarak otomatik döngü sisteminden suya toplayın.

2. Embriyolardan larvalara kadar GF zebra balığı üretimi

NOT: Mikropsuz (GF) balık üretme prosedürü Şekil 1'de özetlenirken, geleneksel (CR) ve GF modellerinin temel gelişim indeksleri Ek Şekil 1'de sunulmuştur. Lütfen temiz bir odada steril aseptik teknik kullanan bir tezgah üstü biyolojik güvenlik kabininde veya laminer akış başlığında aşağıda belirtilen adımları izleyin.

1. Embriyoları balık kültürü suyunu kullanarak yıkayın ve dışkı, safsızlıkları ve ölü veya döllenmemiş yumurtaları çıkarın.
2. Embriyoları 2 hpf'de antibiyotik mikropsuz zebra balığı besiyeri (AB-GZM, Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi ile doldurulmuş sterilize plakalara (10 cm çapında steril tabak başına 480 embriyoya kadar) aktarın ve 28.5 ° C'de 6-8 saat kültürleyin.
   NOT: AB-GZM, yüzey mikroorganizmalarını ortadan kaldırmak için embriyoları birkaç saat boyunca tedavi etmek için kullanılır ve antibiyotiksiz GZM, GF balıklarını alt sırayla kültürlemek için kullanılır. Genellikle, mükemmelleştirilmiş kültür süresi 6 saattir).
3. Beyaz lekeli veya beyazımsı bir görünüme sahip yumurtaları hariç tutun ve normal olarak geliştirilenleri seçin, daha sonraki işlemler için şeffaf ve sağlam zarflar görüntüleyin.
4. Embriyoları AB-GZM kullanarak 10 dakika içinde üç kez durulayın.
5. Embriyoları 0.2 g / L povidon-iyot çözeltisinde (PVP-I) 1 dakika bekletin (Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Daha yüksek konsantrasyon ve 2 dakikadan uzun süre embriyoların ölüm ve kuluçka oranını etkileyecektir.
6. Embriyoları 10 dakika içinde üç kez mikropsuz zebra balığı ortamı (GZM) kullanarak yıkayın.
7. Embriyoları sodyum hipoklorit (NaClO) çalışma çözeltisine ekleyin, 50 mL mikrosantrifüj tüplerini sıkıca kapatın ve 15 dakika ağartın. Bu süre zarfında embriyoları hafifçe çalkalayarak çamaşır suyu solüsyonunda bekletin.
8. Embriyoları GZM kullanarak 10 dakika içinde üç kez yıkayın.
9. Embriyoları, oyuk başına 5 embriyo ve 10 mL GZM içeren steril 6 oyuklu plakalara aktarın. Onları koyu bir fotoperiyoda sahip ultra temiz bir platformda veya inkübatörde kültürleyin: ışık = 10 saat: 28 ° C'de 14 saat ± 0,5 ° C. Kültür yoğunluğu steril oranı etkileyecektir.
10. Harcanan GZM'yi çıkararak, steril durum tespiti için numuneler halinde toplayarak ve her bir kuyucuğu aynı hacimde steril GZM ile doldurarak kültür ortamını günlük olarak yenileyin.
11. Hayatta kalma oranı, kuluçka oranı, kalp atışları, vücut uzunluğu ve ağırlığı vb. dahil olmak üzere GF embriyolarının/larvalarının temel gelişim indekslerini kaydedin¹⁹.
12. GF balıklarını genişletilmiş hacimli uygun kaplara (tabaklar, hücre kültürü şişeleri veya kapaklı cam şişeler) aktarın ve büyüme süreci boyunca steril gıda sağlayın.

3. GF zebra balığının larvalardan yavrulara kadar bakımı

1. 7 dpf'den önce beslemeden GZM'yi yenileyin ve steril durumları günlük olarak tespit edin (bkz. adım 5).
2. GZM'yi değiştirmeden önce zebra balığı larvalarını 8 dpf'den gençlik aşamalarına kadar günde bir kez steril yumurta sarısı (oyuk başına 10 μL hazırlanmış stok çözeltisi) ile besleyin.
3. GF yavrularını 14 dpf'den GF Artemia sp. ile karıştırılmış sterilize yumurta sarısı ile günde bir kez (1-3 Artemia/larva, bkz. adım 4), GF balıklarının büyümesi ve gelişmesiyle birlikte besin kütlesini kademeli olarak artırın.
4. Tüm balıklar Artemia nauplii'yi tüketene kadar yumurta sarısı sağlayın.
   NOT: GF Artemia kullanımdan önce sterilite testinden geçmelidir. Kalan Artemia nauplii sayısını değerlendirin, takip ve yakalama ilerlemesini gözlemleyin ve beslenme başarısını belirtmek için tüketilen yiyeceklerle balık gövdesini inceleyin.
5. 28 dpf'den erken yetişkinlik aşamalarına kadar, GF Artemia'yı günde bir kez (3-5 Artemia/larva) besleyin ve kullanılmayan veya ölü Artemia'yı ve ölü balıkları günlük örnekler olarak atık GZM'ye temizleyin.
6. GF balık büyümesi sırasında, 7 dpf'den sonra 6 oyuklu plakaları 8 ila 21 dpf arasında steril plakalara veya hücre kültürü şişelerine ve ardından 21 dpf'den sonra steril şişelere değiştirin. Her kaptaki GF balığının sayısına ve ağırlığına göre kültür ortamını ve besin kütlesini artırın.
7. GF modellerinin başarısını sağlamak için GZM'yi günlük olarak yenileyin ve numuneleri kontrol edin.
   NOT: Mikropsuz (GF) balık modellerini erken yetişkinliğe ve cinsel olgunluğa kadar sürdürmek zordur, ortalama hayatta kalma oranı 30 dpf'de, tipik olarak %10'dan azdır. Bu öncelikle zayıf bağışıklığa, gecikmiş gelişime ve bozulmuş bağırsak fonksiyonuna atfedilir.

4. Kronik GF balık modelleri için steril yem olarak GF Artemia nauplii'nin hazırlanması

NOT: Mikropsuz (GF) Artemia'nın yetiştirilme ve hazırlama yöntemi Şekil 2'de özetlenmiştir. Aşağıdaki tüm adımların steril bir aseptik teknik kullanılarak bir tezgah üstü biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirildiğini unutmayın.

1. 0.25 g Artemia kistini 2.4 g / L sodyum hipoklorit (NaClO, Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak 5 dakika durulayın.
2. Durulanmış Artemia kistlerini sterilize edilmiş ultra yoğun bir filtreyle (açıklıkta yaklaşık 170 gözenek) süzün ve her seferinde 1-2 dakika boyunca üç kez sterilize edilmiş ultra saf su ile yıkayın.
3. Yıkanmış Artemia kistlerini 100 mL %2,5 sterilize tuzlu suya aktarın, karıştırın ve aşağıda belirtilen adımlara göre aseptik kuluçka için paketleyin.
4. 50 mL ile muamele edilmiş Artemia kist karışımı solüsyonunu 100 mL hacimli steril bir şişeye paketleyin, filmle kapatın ve 150 rpm'de, 30 °C'de 18 saat ila 24 saat boyunca çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin.
5. Tek kullanımlık bir Pasteur pipeti kullanarak orta ve alt katmanlardan yaklaşık 30 mL kuluçka Artemia nauplii çıkarın.
   NOT: Yüzen yumurtaların ve boş kabukların üst tabakaya ulaşmasını önleyin. 24 saat inkübe edilen mikropsuz (GF) Artemia kistleri ve naupliusların indeksleri Şekil 3'te sunulmuştur.
6. Artemia'yı bir sterilizasyon filtresi ile süzün ve her seferinde yaklaşık 30 s ila 1 dakika olmak üzere üç kez sterilize edici ultra saf su ile sterilizasyon kabında yıkayın. Son olarak, Artemia karışık solüsyonunu hazırlamak için 4 mL sterilize ultra saf su ekleyin.
7. Tek kullanımlık bir Pasteur pipeti kullanarak, üst katmandan aktif olarak yüzen Artemia'yı alın, yıkayın ve nauplii solüsyonunu besleme ve aseptik tanımlama için hazırlayın.

5. GF balık modellerinin tüm yaşam evrelerinde tanımlanması

NOT: Mikropsuz (GF) balıkların tüm yaşam aşamaları boyunca, modellerin başarısını sağlamak için temel indeksler ve günlük numune tespitleri çok önemlidir. Bu adım, numunelerin ortak sınıflandırmasını ve tanımlama için olağan yöntemleri özetlemektedir (Şekil 4).

1. GF zebra balığı larvalarının hayatta kalma durumunu ve oranını günlük olarak gözlemleyin ve sayın. İlgili oranları hesaplayan deneylerde, GF balıkları, kuyu başına bir balık olacak şekilde 24 veya 48 oyuklu plakalarda kültürlenir.
   1. Hayatta kalma oranı = (gözlem sırasındaki canlı balık sayısı / toplam yumurta sayısı) × %100.
   2. Sterilite oranı = (steril balık sayısı/hayatta kalan balık sayısı) × %100.
      NOT: Bu protokol, canlı balıkların steril oranına odaklanmaktadır. Steril balık sayısı, canlı balıklar arasında birden fazla kontrolden sonra başarılı GF balıklarının sayılmasıyla belirlenir. Bakteri varlığı nedeniyle başarısız olan ölü balık veya canlı balık GF modelleri, sonraki GF prosedürleri sırasında elimine edilir.
2. Aşağıdaki GF zebra balığı larva örneklerini toplayın.
   1. Her bir kuyudan veya şişe kabından GF zebra balığı kültür ortamı.
   2. Steril yumurta sarısı ve GF Artemia gibi balık yemi.
   3. Yumurtadan çıktıktan sonra yumurta zarı parçaları ve larvalardan yavru balıklara kadar beslenme dönemlerinde yiyecek artıkları veya dışkı dahil olmak üzere atık ortam.
   4. Bakterilerin varlığını tanımlamak için ölü balık örnekleri.
   5. Balık besiyeri ve embriyo tedavisinde steril kontrol olarak kullanılan ajanlardır.
   6. Malzemelerden, işletim platformundan ve kuluçka makinesinden vb. numuneler.
3. Birden fazla yöntem kullanarak günlük olarak toplanan örnekleri tespit edin.
   1. İlk olarak, yayılmış plaka yöntemini ve kültür plakalarını 30 °C'de bir inkübatörde kullanın.
      1. Aerobik koşullar altında Triptikaz Soya Agar (TSA) plakası üzerine 20-50 μL atık ortam numunesi ile kaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
      2. Anaerobik koşullar altında TSA plakası üzerine 20-50 μL atık ortam numunesi ile kaplayın.
      3. Aerobik koşullar altında kan TSA plakaları üzerine 20-50 μL atık ortam numunesi ile kaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
      4. Anaerobik koşullar altında kan TSA plakaları üzerine 20-50 μL atık ortam numunesi ile kaplayın.
   2. İkinci olarak, sıvı kültür yöntemini kullanın.
      1. 200 μL numuneyi Beyin Kalp İnfüzyon Suyu (BHI) ortamı ile aerobik tüplere alın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 30 ° C, 150-180 rpm'de çalkalama inkübatöründe kültürleyin.
      2. BHI besiyeri ile anaerobik tüplere 200 μL numune ekleyin ve inkübatörde 30 ° C'de kültür edin.
      3. Triptikaz Soya Suyu (TSB) ortamı ile aerobik tüplere 200 μL numune ekleyin, ardından 30 ° C, 150-180 rpm'de çalkalama inkübatörde kültürleyin.
      4. TSB besiyeri ile anaerobik tüplere 200 μL numune ekleyin ve inkübatörde 30 ° C'de kültür edin.
   3. Üçüncüsü, moleküler teknikler-16s polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tahlili kullanın.
      1. Atık su numunesini iki çift 27F ve 1492R'nin yanı sıra 63F ve 1387R ile analiz edin (Tablo 1).
         NOT: PCR ana karışımı, ticari olarak temin edilebilen bir DNA polimeraz kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak Tablo 2'ye göre hazırlandı ve PCR makinesi, Tablo 3'te belirtilen programla kuruldu.
      2. PCR programı tamamlandıktan sonra, numunelerin sterilitesini anlamak için ürünleri 1465 bp (27F ve 1492R primerleri kullanılarak) veya 1324 bp (63F ve 1387R primerleri kullanılarak) hedef bantlarında %1 agaroz jel elektroforezi⁴⁰ ile inceleyin.
4. 24 saatten 3 güne ve 7 güne kadar plaka ve orta kültür dahil olmak üzere, plakalar üzerinde koloni ve sıvıda bulanıklık olmamasının GF modellerinin başarılı bir şekilde yapıldığını gösterdiği sterilite testlerini kaydedin ve gözlemleyin. Plakayı ve ortamı 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat, 120 saat, 144 saat ve 168 saat'te gözlemleyin ve kaydedin.

6. GF balıklarıyla beslenmeden önce GF Artemia örneklerinin tanımlanması

NOT: GF balıkları ile beslenmeden önce canlı yem olarak vazgeçilmez olan GF Artemia örneklerini tespit etmek için (Şekil 4) aşağıdaki adımları izleyin.

1. GF Artemia modellerinin örneklerini toplayın.
   1. Tedavi edilmemiş Artemia kistleri.
   2. Tedavi edilen GF Artemia kistleri.
   3. Yumurtadan çıkmış GF Artemia nauplii.
   4. Kontrol olarak sterilize edilmiş ultra saf su.
2. GF Artemia'yı aşağıdaki yöntemlerle tespit edin.
   1. Numuneleri aerobik ve anaerobik koşullar altında TSA plakaları ve kan TSA plakaları üzerine kaplayarak tespit etmek için yayılmış plaka yöntemini kullanın. Onları 30 ° C'de inkübe edin.
   2. Aerobik ve anaerobik TSB ve BHI tüplerindeki numuneleri tespit etmek için sıvı bir ortam kullanın. 150-180 rpm, 30 °C'de bir çalkalayıcıda kültür.
   3. 16s ribozomal RNA hedef genleri 27F ve 1492R, 63F ve 1387R kullanılarak toplanan örneklerde bakteri varlığını tespit etmek için PCR testini kullanın (Tablo 1). Cilt ve program Tablo 2 ve Tablo 3'te gösterilmiştir.
3. Sonuçları kaydedin: PCR ürününü, 1465 bp (27F ve 1492R primerleri kullanılarak) veya 1324 bp (63F ve 1387R primerleri kullanılarak) ölçen hedef bantlar için %1 agaroz jel elektroforezi⁴⁰ ile tespit edin. Plakaların ve sıvı ortamın sonuçları, GF Artemia'nın GF balık yemi olarak kullanılmadan önce steril durumunu sağlayabilir.

7. Zebra balıklarından bağırsak bakteri suşlarının izolasyonu ve tanımlanması

NOT: Bağırsak fonksiyonlarını in vitro ve in vivo olarak keşfetmek için, zebra balıklarından bakteri suşlarını izole etmek gerekir, bu da GF hayvanları kullanılarak enfeksiyonla taranan potansiyel probiyotikler için tür kaynağı sağlar (Şekil 5). Bu protokolde, bağırsak içeriğini elde etmek için geleneksel diseksiyon yöntemi tanımlanırken, örnekler doğrudan canlı anestezi uygulanmış balıklardan da toplanabilir (veriler gösterilmemiştir).

1. Sağlıklı yetişkin zebra balığı seçin ve steril suyla yıkayın. Temiz tezgahta aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
2. Balıkları 100 mg / L MS-222 ile 5-10 dakika uyuşturun.
3. Balığın vücut yüzeyini tedavi etmek için% 75 alkol kullanın.
4. Balık bağırsaklarını inceleyin ve bağırsak içeriğini TSB veya BHI ortamı ile ekstrüde edin.
5. Aerobik ve anaerobik koşullarda TSA, kan plakası, TSB ve BHI ortamı uygulayarak bağırsak süpernatanı inkübe edin.
6. Sinyal suşunu elde etmek için bakterileri çevirin ve farklı kolonilerin özelliklerini kaydedin.
7. Bakterileri -80 °C'de% 30 gliserol içinde saklayın.
8. Ardından, genomik DNA ekstraksiyonu ve PCR dizilimi ile bağırsak bakterilerini tanımlayın.
   NOT: Bakteriyel genomik DNA ekstraksiyonunun ana adımları, sıvı santrifüjleme, RNase A ve Proteaz K ayrışması, etil alkol ekstraksiyonu, durulama ve üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak çözündürmeyi içerir (bkz. Malzeme Tablosu).
9. Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) ve Temel Yerel Hizalama Arama Aracını (BLAST) kullanarak 16S dizilerini Bakteri ve Arke veritabanı^40,41 ile analiz edin (bkz.
10. Cins düzeyinde izole edilmiş bağırsak suşlarını tanımlamak için en iyi eşleşen bakteri ve karakterleri seçin.
11. Piyasada bulunan kitleri kullanarak bakteri suşlarının metabolik fonksiyonlarını tespit edin (bkz. Malzeme Tablosu).

8. GF zebra balığı bağırsaklarında grip etiketi, enfeksiyon ve bakteri kolonizasyonu

NOT: GF zebra balığını enfekte etmeden önce, izole edilen bakteriler boyalarla modifiye edildi ve sayıldı, bu da mikrobiyal kolonizasyonu ve göçü sürekli ve in vivo olarak görünür hale getirdi (Şekil 6).

1. GF balık modellerini enfekte etmek için konakçıda bol miktarda bulunan potansiyel faydalı bakterileri veya baskın suşları seçin.
   NOT: Bu çalışmada kullanılan bakteriler Aeromonas sp. ve Vibrio sp. (bkz . Malzeme Tablosu), laboratuvarda yetişkin vahşi tip zebra balıklarından izole edilen ve tanımlanan 8 cinsten seçilmiştir⁴².
2. Taze bakterileri CM-Dil boyaları ile etiketleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları 10 6-10⁸ Koloni Oluşturan Birimler (CFU'lar)/mL konsantrasyonda 5 dpf'de GF zebra balığına maruz bırakın.
3. GF zebra balığı larvalarının bağırsaklarındaki bakterilerin kolonizasyonunu ve dağılımını 6 dpf ve 14 dpf'den göstermek için floresan mikroskobu altında 3× büyütmeli floresanı gözlemleyin.
4. GF balığındaki bakteri sayısını her zaman noktasında plaka kültürüne göre manuel olarak sayın.
5. Enfeksiyonun hedef bakteri suşları ile başarılı olduğundan emin olmak için kolonileri ve dizileri tespit edin.
6. Nöro-davranış, gelişimsel indeksler, histopatolojik analiz ve hormon ölçümleri vb. dahil olmak üzere sonraki tahliller için bakteriyel enfeksiyonu olan GF balığı örneklerini toplayın 43,44,45.
   NOT: Enfeksiyon deneyinde kullanılan bakteriler yeni elde edilmeli ve sıvı ortam tarafından taze olarak kültürlenmelidir.

GF zebra balığı modelleri, zebra balığı çiftlerinin yumurtladığı bol yumurtalar kullanılarak verimli bir şekilde üretilebilir ve protokol önceki GF balık modellerine göre optimize edilmiştir35. Tek bir 6 oyuklu plaka, yaklaşık 30-48 embriyo / larvayı kültürleyebilir ve bu da bol miktarda veri toplama ve istatistiksel analize izin verir. Steril tedaviden sonra, GF embriyoları 48-72 saatte larvalara yumurtadan çıkana kadar temiz bir inkübatörde kültürlenir ve toplanan örneklerin tespiti ile GZM'yi günlük olarak değiştirir, bu da mikropsuz durumun korunması için çok önemlidir (Şekil 1). 7 dpf'den sonra, larvaların gençlik dönemlerine kadar yumurta sarısı ve canlı Artemia yiyecekleri hazırlanmalıdır. Balığın büyümesi ve gelişmesi sırasında, GZM'nin hacmi, kabı ve yoğunluğu, steril durumun ölümünü ve başarısızlığını önlemek için zaman içinde düzenlenmeli veya değiştirilmelidir. Tespit bakteriyel kirlilik göstermezse, başarılı GF modelleri çocukluktan erken yetişkinliğe kadar kronik modeller olarak korunabilir, ancak hayatta kalma oranı pratikte çok daha düşüktür. Son olarak, mikrobiyota ve ilaç tarama alanlarının etkisini keşfetmek için GF ve CR balık modellerinin steril oranı, sağkalım oranı, gelişim indeksi, davranışı, histopatolojik analizi ve transkripsiyon profili ölçülebilir. Bu çalışmada, temel gelişimsel indeksler karşılaştırıldı (Ek Şekil 1

GF Artemia'nın protokolü, Çin Ulusal Fikri Mülkiyet İdaresi tarafından patent olarak verildi ve bu, yazarların iznini aldıktan sonra yöntemin kısıtlı kullanımını ortadan kaldıracak. Yazarlar, başka hiçbir rakip veya finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.