Method Article

Isı Şoku Proteininin Şaperon Fonksiyonunu İncelemek için Escherichia coli Bazlı Tamamlama Testi 70

DOI:

10.3791/66515

⸱

March 8th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Microbiology, University of Venda

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, ısı şoku proteini 70'in (Hsp70) şaperon aktivitesini gösterir. E. coli dnaK756 hücreleri, doğal, işlevsel olarak bozulmuş bir Hsp70 barındırdıkları için test için bir model görevi görür ve bu da onları ısı stresine duyarlı hale getirir. Fonksiyonel Hsp70'in heterolog girişi, hücrelerin büyüme eksikliğini kurtarır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isı şoku proteini 70 (Hsp70), hücre içindeki diğer proteinlerin katlanmasını kolaylaştıran ve onu moleküler bir şaperon yapan korunmuş bir proteindir. Hsp70, normal koşullar altında büyüyen E. coli hücreleri için gerekli olmasa da, bu şaperon yüksek sıcaklıklarda büyüme için vazgeçilmez hale gelir. Hsp70 yüksek oranda korunduğundan, çeşitli türlerden Hsp70 genlerinin şaperon fonksiyonunu incelemenin bir yolu, onları Hsp70'te eksik olan veya işlevsel olarak tehlikeye atılmış doğal bir Hsp70'i eksprese eden E. coli suşlarında heterolog olarak ifade etmektir. E. coli dnaK756 hücreleri, λ bakteriyofaj DNA'sını destekleyemez. Ayrıca, doğal Hsp70 (DnaK), GrpE (Hsp70 nükleotid değişim faktörü) için azalmış afinite gösterirken yüksek ATPaz aktivitesi sergiler. Sonuç olarak, E. coli dnaK756 hücreleri, 30 °C ila 37 °C arasında değişen sıcaklıklarda yeterince büyür, ancak yüksek sıcaklıklarda (>40 °C) ölürler. Bu nedenle, bu hücreler Hsp70'in şaperon aktivitesini incelemek için bir model görevi görür. Burada, Hsp70'in selülo şaperon fonksiyonunun incelenmesini sağlayan bir tamamlama testi yapmak için bu hücrelerin uygulanması için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isı şoku proteinleri, protein katlanmasını kolaylaştırarak, protein agregasyonunu önleyerek ve protein yanlış katlanmasını tersine çevirerek moleküler şaperonlar olarak önemli bir rol oynar 1,2. Isı şoku proteini 70 (Hsp70), protein homeostazında merkezi bir rol oynayan en önemli moleküler şaperonlardan biridir 3,4. DnaK, E. coli Hsp70 homologu5'tir.

Hsp70'in şaperon aktivitesini araştırmak ve bu şaperon 6,7,8'i hedefleyen inhibitörleri taramak için çeşitli biyofiziksel, biyokimyasal ve hücre bazlı testler geliştirilmiştir. Hsp70 yüksek oranda korunmuş bir proteindir. Bu nedenle, Plasmodium falciparum (sıtmanın ana ajanı) gibi ökaryotik organizmaların birkaç Hsp70'inin, E. coli 6,9'da DnaK fonksiyonunun yerini aldığı bildirilmiştir. Bu şekilde, sitoprotektif fonksiyonlarını araştırmak için E. coli'de Hsp70'lerin heterolog ekspresyonunu içeren bir E. coli bazlı kompleman testi geliştirilmiştir. Tipik olarak, bu tahlil, DnaK için eksik olan veya işlevsel olarak tehlikeye atılmış doğal bir DnaK'yi eksprese eden E. coli hücrelerinin kullanımını içerir. DnaK, normal koşullar altında E. coli büyümesi için gerekli olmasa da, hücreler yüksek sıcaklıklar veya diğer stres biçimleri gibi stresli koşullar altında büyütüldüğünde gerekli hale gelir10,11.

Bir tamamlama testi kullanarak Hsp70 fonksiyonunu incelemek için geliştirilen E. coli suşları arasında E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103 () thr::Tn10]) ve E. coli dnaK756 bulunur. E. coli dnaK103 hücreleri, işlevsel olmayan kesilmiş bir DnaK üretir ve bu nedenle, hücreler 30 °C'de yeterince büyürken, suş soğuğa ve sıcak stresineduyarlıdır 12,13. Benzer şekilde, E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) suşu 40 °C'nin üzerinde büyümez14,15. E. coli dnaK756 suşu, 32, 455 ve 468 pozisyonlarında üç glisin-aspartat ikamesi ile karakterize edilen ve tehlikeye atılmış proteostatik sonuçlara yol açan mutant bir doğal DnaK'yi (DnaK756) eksprese eder. Sonuç olarak, bu suş bakteriyofaj λ DNA14'e dirençlidir. Ek olarak, E. coli dnaK756, yüksek ATPaz aktivitesi sergilerken, nükleotid değişim faktörü GrpE'ye olan afinitesi azalır16. E. coli DnaK mutant suşları, bir tamamlama yaklaşımı ile Hsp70'in şaperon aktivitesini araştırmak için ideal modeller olarak hizmet eder. DnaK sadece stresli koşullar altında gerekli olduğundan, tamamlama testi tipik olarak yüksek sıcaklıklarda gerçekleştirilir (Şekil 1). Bu çalışma için E. coli kullanmanın bazı avantajları arasında iyi karakterize edilmiş genomu, hızlı büyümesi ve düşük kültür ve bakım maliyetiyer alır 17.

Bu yazıda, Hsp70'in işlevini incelemek için E. coli dnaK756 hücrelerinin kullanımını içeren bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Testte kullandığımız Hsp70'ler, vahşi tip DnaK ve onun kimerik türevi KPf'dir (Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18'in C-terminal substrat bağlama alanına kaynaşmış DnaK'nin ATPaz alanından oluşur). KPf-V436F, heterolog olarak negatif bir kontrol olarak ifade edildi, çünkü mutasyon esasen onu substratların bağlanmasını bloke eder, böylece şaperon aktivitesini iptal eder9.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dönüşüm

NOT: Kültür, pipet uçları ve yeni hazırlanmış ve otoklavlanmış ortamlar için steril cam eşyalar kullanın. 2x maya triptonunda (YT) [% 1.6 tripton (a / v),% 1.6 maya özütü (a/v),% 0.5 NaCl (a / v),% 1.5 agar (a / v)] agarda E. coli hücrelerinin kültürlerini hazırlayın. Protokolde kullanılan genel reaktifler ve kaynakları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

  1. 2.0 mL mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve hücreleri buz üzerinde tutarak 50 μL yetkin E. coli dnaK756hücrelerini ayırın.
  2. Yetkin hücrelere sahip 2.0 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine, 10-50 ng pQE60 / DnaK, pQE60 / KPf ve pQE60 / KPf-V436F plazmit DNA9'u ayrı tüplere ayırın.
  3. Yetkili hücreleri ve plazmit DNA'yı içeren 2.0 mL'lik mikrosantrifüj tüplerini 30 dakika buz üzerinde tutun.
  4. Yetkili hücreler-DNA karışımını 42 ° C'de 60 saniye boyunca ısı şoku yapın ve mikrosantrifüj tüplerini 10 dakika boyunca tekrar buza geri döndürün.
  5. 950 μL taze 2x YT et suyu (37 °C'de önceden inkübe edilmiş) ekleyin ve 1 saat boyunca 150 devir/dk'da çalkalarken 37 °C'de inkübe edin. Gerekirse iyileşmelerini teşvik etmek için hücreleri çok daha uzun süre büyümeye bırakın.
    NOT: Hücreleri kuvvetlice sallamaktan kaçının.
  6. Hücrelerin 100 μL'sini pipetleyin ve bunları ilgili suş için 50 μg/mL kanamisin, 10 μg/mL tetrasiklin ve plazmit seçimi için 100 μg/mL ampisilin içeren 2x YT agar plakalarına yayın (bkz.
  7. Hücrelerin geri kalanını (hacmi şu anda yaklaşık 900 μL olan) bir tezgah üstü mikrosantrifüj kullanarak 5000 x g'de (4 ° C'de) 1 dakika santrifüjleyin.
  8. Et suyunun yaklaşık 800 μL'sini boşaltın ve kalan ortamı peletlenmiş hücreleri yeniden süspanse etmek için kullanın.
  9. Geri kazanılan hücreleri 2x YT agar plakasına yerleştirin.
  10. Her iki agar plakasını gece boyunca (veya yaklaşık 17 saat) 37 °C'de inkübe edin.
    NOT: Bu hücreler çok yavaş büyür ve çok daha uzun süre inkübe edilmeleri gerekebilir. Çok küçük başlayabilecek kolonileri tespit etmeye dikkat edin. Santrifüjlemeden sonra yeniden süspanse edilen hücreleri içeren plaka (adım 1.7), hücrelerin dönüşüm verimliliğinin zayıf olması durumunda bir yedek görevi görür, bu durumda peletlenmiş hücreler herhangi bir dönüştürülmüş hücrenin geri kazanımını iyileştirebilir. Bununla birlikte, dönüşüm verimliliği mükemmelse, konsantre hücrelerin kaplandığı agar plakası, inkübasyon sırasında aşırı büyümüş bir kültür ile karakterize edilebilir ve bu da tek kolonilerin tanımlanmasını zorlaştırır. Bu durumda, diğer agar plakası, üzerinde iyi aralıklı kolonilerin büyüdüğü plaka olabilir.

2. Hücre kaplama

  1. Dönüştürücülerden tek bir koloni alın ve 50 μg/mL kanamisin, E. coli dnaK756 hücrelerinin seçimi için 10 μg/mL tetrasiklin ve plazmit seçimi için 100 μg/mL ampisilin ile takviye edilmiş 10 mL 2x YT suyuna aşılayın.
    NOT: Kültürü çalkalarken havalandırmayı sağlamak için şişeler (≥50 mL) kullanın. Aşılamayı gece boyunca (17 saat) 37 °C'de 150 devir/dk'da çalkalayın.
  2. Ertesi sabah OD600'de bir absorbans okuması yapın.
  3. Hücre lekelenmesine hazırlık olarak yüzeyi temizlemek için tezgah yüzeyini %75 etanol kullanarak temizleyin.
  4. 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü kullanarak, kültürü 2x YT et suyu kullanarak 2.0'lık bir OD600 okumasına standardize edin.
    NOT: Bu adım, çeşitli numunelerde hücre yoğunluğunu standartlaştırmak için önemli olduğundan, OD okumalarının doğru yapıldığından emin olun.
  5. 2 mL mikrosantrifüj tüpleri kullanarak, hücrelerin 100 ila 10-5 arasında seri dilüsyonlarını hazırlayın.
  6. Hücreleri tespit etmek için kullanılacak agar plakalarını, su buharının dışarı çıkmasını sağlamak için kapaklar kısmen açıkken plakaların kurumasını sağlamak için 40 °C'ye ayarlanmış bir fırında inkübe edin.
    NOT: Hücrelerin eşit olarak ayrılmış mesafelerde tespit edildiğinden emin olmak için, üzerine bir tespit yerleri şablonunun yazdırıldığı bir kağıda çizgiler çizin.
  7. 50 μg/mL kanamisin, 10 μg/mL tetrasiklin, 100 μg/mL ampisilin ve 0.5 mM IPTG (rekombinant proteinlerin ekspresyonunun indüksiyonu için) ile takviye edilmiş agar plakalarına seri olarak seyreltilmiş hücrelerin 2 μL'sini yerleştirin (bkz.
  8. Her numuneyi iki ayrı plakaya yerleştirin (biri 37 °C'de ve diğeri 43.5 °C'de inkübe edilecek).
    NOT: Agar plakasını delmekten kaçının.
  9. Çevresel etkileri en aza indirmek için kontrol numunelerini deney numuneleriyle aynı plakaya yerleştirin.
  10. Hücreler büyümeye başlamadan önce sürecin tamamlandığından emin olmak için lekelenmeyi hızlı bir şekilde gerçekleştirin, çünkü bu çarpık büyüme modelleri oluşturabilir.
    NOT: Plakaları kirleteceğinden, lekelenme sırasında aerosollerden kaçınmak önemlidir. Kontaminasyonu önlemek için plakaları lekelenme arasında kapalı tutmak da önemlidir.
  11. Bir plakayı 37 °C'de (izin verilen büyüme sıcaklığı) ve diğerini 43.5 °C'lik izin verilmeyen büyüme sıcaklığında inkübe edin.
    NOT: Yoğuşmuş su benekli kolonileri konumlarından yıkayacağından, kapağın üzerinde buhar birikmesini önlemek için plakaları baş aşağı bakacak şekilde inkübe edin.
  12. Tüm plakaları aynı anda inkübatörlere yerleştirin ve ertesi sabaha kadar inkübatörü açmaktan kaçının.
    NOT: Plakaların inkübasyonu sırasında inkübatör kapağının birkaç kez açılması önerilmez. Bunun nedeni, havanın inkübatöre erişiminin hücre büyümesini olumsuz yönde etkileyen sıcaklık dalgalanmalarına neden olabilmesidir.

3. Rekombinant proteinlerin ekspresyonunun doğrulanması

  1. Steril bir döngü kullanarak, kalan hücrelerin bir kısmını aynı dönüştürülmüş E. coli dnaK756 hücresi kolonisinden alın.
  2. Hücreleri, 50 μg/mL kanamisin, 10 μg/mL tetrasiklin ve 100 μg/mL ampisilin ile takviye edilmiş 10 mL YT suyuna aşılayın. Gece boyunca (17 saat) 37 °C'de 150 devir/dk'da çalkalayın.
  3. Kültürü, adım 3.2'de belirtildiği gibi gerekli antibiyotikleri içeren 90 mL steril 2x YT suyuna aktarın. Hücrelerin orta log fazına kadar büyümesine izin verin (OD600 = 0.4-0.6).
  4. İndüksiyondan önce 2 mL numune kültürü alın (0 saat indüksiyon numunesi).
  5. Protein üretimini indüklemek ve hücreleri 37 °C'de yeniden inkübe etmek için IPTG'yi 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
  6. İndüksiyondan 6 saat sonra ikinci bir 2 mL numune alın.
  7. Hücreleri 10 dakika boyunca 5000 x g'da santrifüjleyerek hasat edin. Santrifüj sıcaklığını 4 °C'de tutun.
  8. Süpernatanı atın.
  9. Peleti PBS tamponunda (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4) tekrar süspanse edin ve -20 °C'de saklayın.

4. SDS-PAGE ve western blot analizleri

  1. Daha önce tarif edildiği gibi 2x %10 SDS jeli hazırlayın19.
  2. Protein bantlarını görüntülemek için Coomassie boyasını kullanarak sonraki boyama için SDS-PAGE jellerinden birini saklayın. Western blot analizi yapmak için ikinci SDS-PAGE jelini kullanın.
  3. Yeniden süspanse edilmiş numunelerin 80 μL'sini ayırın ve 20 μL 4x Laemmli SDS yükleme tamponu ile karıştırın.
  4. Süspansiyonu 100 °C'de 10 dakika kaynatın. Daha sonra her bir numuneden 10 μL prekast SDS jeli üzerine yükleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
  5. 1x SDS çalışma tamponu çözeltisinde (120 mm Tris, 1 mm glisin, 250% (a/h) SDS) 0.1 V'luk bir voltaj kullanarak oda sıcaklığında 1 saat boyunca elektroforez gerçekleştirin.
  6. Jeli 1 saat boyunca Coomassie boyası ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakın), ardından 2 saat boyunca leke giderici tampon (%50 (h/h) metanol, %10 (h/h) asetik asit) kullanarak lekeyi çıkarın.
  7. Bir jel görüntüleme sistemi kullanarak jelde bulunan protein bantlarını görselleştirin (bkz. Başka bir SDS-PAGE jelini tekrar çalıştırınampyukarıda belirtilen protokolü izleyerek aynı sample.
  8. Elektroforetik çalışma sona erdiğinde, daha önce tarif edildiği gibi western blot analizi yapmak için SDS-PAGE jellerini alın19.
  9. Proteinlerin üzerine aktarıldığı nitroselüloz membranı yıkama tamponunda üç kez yıkayın (TBS-Tween, pH 7.4 [50 mM Tris, 150 mM NaCl, %1 (h/h) Ara]).
  10. Sırasıyla DnaK'yi tespit etmek için α-DnaK ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve KPf ve mutantı KPf-V436F'yi tespit etmek için α-PfHsp70-17'yi kullanın.
  11. Antikorları% 5 yağsız sütte 1:2000 seyreltmede kullanın. 4 °C'de 60 devir/dk'da çalkalanarak 1 saat inkübe edin.
  12. Nitroselüloz membranı TBS-Tween'de 15 dakikada 3 kez yıkayarak spesifik olarak bağlanmamış antikoru çıkarın.
  13. Membranı ikincil antikorda (α-tavşan, Malzeme Tablosuna bakınız) önceki adımla aynı koşullar altında inkübe edin. Bunu, birincil antikor ile aynı koşullar altında müteakip yıkama takip eder.
  14. Gelişmiş kemilüminesans (ECL) algılama reaktifi kullanarak bantları çözün.
  15. Bir jel görüntüleyici kullanarak bantları görselleştirin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2, sırasıyla 37 °C ve 43.5 °C'lik izin verilen büyüme sıcaklığında tespit edilen ve kültürlenen hücreleri içeren taranmış agar görüntüsünü, göstermektedir. Şekil 2'nin sağ tarafında, eksize edilen western blot bileşenleri, E. coli dnaK756 hücrelerinde DnaK, KPf ve KPf-V436F'nin ekspresyonunu temsil eder. Beklendiği gibi, 37 ° C'lik izin verilen büyüme sıcaklığında kültürlenen tüm E. coli dnaK756 hücreleri büyümeyi başardı. Bununla birlikte, 43.5 °C'lik izin verilmeyen büyüme koşulları altında, daha öncebildirildiği gibi, yalnızca DnaK ve KPf'yi heterolog olarak eksprese eden hücreler büyümeyi başardı 6,9,20 (Şekil 2). Öte yandan, KPf-V436F eksprese eden hücreler sadece 37 °C'de büyüdü, ancak 43.5 °C'de büyüyemedi. Bu, DnaK ve KPf'nin ısı stresi koşulları altında E. coli dnaK756 hücrelerinin büyüme kusurunu geri yükleyebildiğini göstermektedir. KPf-V436F'yi heterolog olarak eksprese eden hücrelerin 43.5 °C'de hücrelerin büyümesini desteklemedeki başarısızlığı, bu proteinin şaperon fonksiyonunun eksikliğini gösterir. Bu bağlamda, KPf-V436F ideal bir negatif kontrol proteini olarak hizmet eder.

figure-results-1
Şekil 1: Heterolog olarak eksprese edilen proteinlerin şaperon fonksiyonunu incelemek için E. coli dnaK756 hücrelerini kullanan tamamlama testinin prensibi. E. coli dnaK756, hücreleri ısı stresine karşı koruyamayan doğal bir DnaK756 proteinini ifade eder. Fonksiyonel heterolog Hsp70'in eklenmesi, hücreleri ısı stresine maruz kaldığında ölümden kurtarır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: DnaK ve KPf'nin E. coli dnaK756 hücrelerini ısı stresine karşı koruma yeteneklerini gösteren tamamlayıcı plaka testi. Transforme edilen hücreler 37 ° C'de (izin verilen büyüme sıcaklığı) ve 43.5 ° C'de (izin verilmeyen büyüme sıcaklığı) kültürlendi. Hücreler standardize edildi ve seri dilüsyonlar olarak kaplandı. 'N', seyreltilmemiş hücrelerden oluşan ilk noktayı temsil eden 'Düzgün'ü sembolize eder. En sağ tarafta, üç proteinin ekspresyonunu temsil eden batı lekesi eksizyonları vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, heterolog olarak eksprese edilen Hsp70'in şaperon fonksiyonunu araştırmada E. coli dnaK756hücrelerinin faydasını göstermektedir. Bu test, selülde Hsp70 fonksiyonunu hedefleyen inhibitörleri taramak için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntemin bir sınırlaması, E. coli'de DnaK'nin yerini alamayan Hsp70'lerin bu testle uyumlu olmamasıdır. Bazı doğal olmayan Hsp70'lerin translasyon sonrası modifikasyon21 eksikliği, E. coli sistemi içindeki işlev eksikliğini açıklayabilir. Maya bazlı bir tamamlama testi22, E. coli bazlı testin bazı eksikliklerini giderebilir.

Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için birkaç önemli adım çok önemlidir. Bunlar, kaplama sırasında yalnızca ilgili plazmit yapısı tarafından dönüştürülen hücrelerin kullanılmasını sağlamayı içerir. Ek olarak, adımlar boyunca kültürün kirlenmesini önlemek önemlidir. Ayrıca, stresli E. coli DnaK hücreleri aşırı filamentasyona10 duyarlı olduğundan, bu fiziksel zorlanma geniş filamentasyonu teşvik ettiğinden, kültür sırasında kuvvetli çalkalamadan kaçınmak önemlidir. Aşırı filamentli hücreler, OD600'de daha yüksek yanlış görünür büyüme okumaları verir, bu da kültür büyümesinin fazla tahmin edilmesine yol açar ve kaplamadan önce hücre standardizasyonunu olumsuz etkiler. Hsp70, normal koşullar altında E. coli büyümesi için gerekli olmasa da, bu proteinden yoksun hücreler strese duyarlıdır10. Bu nedenle, E. coli dnaK756 hücreleri, dönüştürüldükten sonra veya gliserol stoklarından geri kazanımları sırasında çok daha yavaş büyür. Ek olarak, sıcaklık dalgalanmalarına karşı son derece hassastırlar. Bu nedenle, kaplanmış agar plakaları içeriye yerleştirildikten sonra, plakaları görme zamanı gelene kadar inkübatör kapısını açmaktan kaçınmak önemlidir.

Western blot verileri, E. coli dnaK756 hücrelerinde ilgili rekombinant Hsp70 proteinlerinin ekspresyonunu doğrulamak için önemlidir. İlgili proteinin eksprese edilmemesi, izin verilmeyen büyüme sıcaklığı altında büyüyen hücreler için yanlış negatif bir sonuca yol açar.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların birbiriyle çelişen finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, Uluslararası Genetik Mühendisliği ve Biyoteknoloji Merkezi (ICGEB) hibe numarası, HDI/CRP/012, Venda Üniversitesi Araştırma Direktörlüğü, hibe I595, Bilim ve Yenilik Bölümü (DSI) ve Güney Afrika Ulusal Araştırma Vakfı'ndan (NRF) (hibe numaraları, 75464 ve 92598) elde edilen hibe fonu ile desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-β-MerkaptoetanolSigma-Aldrich8,05,740Numune yükleme boyası için bileşen
Asetik asitLabchem101005125Leke çıkarıcı
AkrilamidSigma-Aldrich8008300100bileşeni SDS
MerckHG000BX1.500bileşeni Orta ve sıvı büyüme testinin bileşeniAgaroz
Akıllı Bilimsel14131031Sertifikalı moleküler biyoloji agaroz
Amonyum persülfatSigma-Aldrich101875295SDS-PAGE jel
AmpisilinVWR International0339 & mdash ; EU — 25GSeçici antibiyotik
BisSigma-aldrich1015460100SDS Bromofenol
0449-25GNumune yükleme boyası için
bileşen CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4Yetkili hücrelerin hazırlanması için
Coomassie parlak maviVWR International443293XSDS-PAGE boya
Dibazik sodyum fosfatSigma-AldrichRB10368PBS tamponu
ECLThermofischer Scientific32109Western blot tespit reaktifi
Etidyum BromürThermofischer Scientific17898DNA interkalasyon boyası
GliserolMerckSAAR2676520LNumune yükleme boyası Glisin için bileşen
VWR International10119CUSDS
IPTGGlentham yaşam bilimlerinin162ILindükleyici
KanamisinMelfordK0126Seçici antibiyotik
Magnezyum KlorürMerckSAAR4123000EMOrta ve sıvı büyüme testinin bileşeni
MetanolLabchem113140129Leke çıkarıcı bileşeni
Monobazik potasyum fosfatMerck1,04,87,30,250PBS tamponunun
PeptonMerckHG000BX4.250Orta ve sıvı büyüme testinin bileşeni
Potasyum klorürMerckSAAR5042020EMPBS tamponunun
PVDF membranıThermofischer scientificPB7320Western blot membranı
Sodyum KlorürMerckSAAR5822320EMOrta ve sıvı büyüme testinin bileşeni
Sodyum dodesil sülfatVWR International108073İfade edilen proteinleri çözmek için
Spectramax iD3Ayırma373705019Otomatik plaka okuyucu
TEMEDVWR uluslararasıACRO420580500SDS jelinin bileşeni
TetrasiklinDuchefa BiyokimyalarıT0150.0025Seçici antibiyotik
TrisVWR International19A094101SDS jel
bileşeni Tween20MerckSAAR3164500XFWestern yıkama tamponu için bileşen
Batı transfer odasıThermofisher ScientificPB0112Proteinin nitroselüloz membrana transferi
Maya özüMerckHG000BX6.500Orta ve sıvı büyüme testinin bileşeni
& alfa; -DnaK antikoruInqabaBK CAC09317Birincil antikor
&alfa; -tavşan antikoruThermofischer scientific31460İkincil antikor
Agar Sigma-Aldrich'in Bileşeni bileşeni bileşeni bileşeni

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
  2. Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
  3. Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
  4. Edkins, A. L., Boshoff, A. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. , Springer. (2021).
  5. Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
  6. Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
  7. Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
  8. Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
  9. Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626(2016).
  10. Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
  11. Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243(2015).
  12. Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
  13. Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
  14. Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
  15. Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
  16. Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
  17. Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
  18. Sato, S., Wilson, R. I. Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites. Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).
  19. Shonhai, A. Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University. , Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007).
  20. Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226(2021).
  21. Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
  22. Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389(2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Heat Shock Protein 70Chaperone FunctionEscherichia Coli AssayProtein FoldingDnaK756 CellsComplementation AssayHeterologous ExpressionSDS PAGEWestern BlotSmall Molecule Screening

Related Articles