Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sıçanlardan Türetilen Decellularized Spleen Matrix'in İmalatı

1.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66520

⸱

9 Şubat 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Local Joint Engineering Research Center for Precision Surgery and Regenerative Medicine, The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, 2Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, 3Center for Regenerative and Reconstructive Medicine, Med-X Institute, The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, 4Department of Graduate School, Xi'an Medical University

Bu makalede

Özet

Hücrelerden arındırılmış dalak matrisi (DSM), karaciğer doku mühendisliği alanında umut verici uygulamalara sahiptir. Bu protokol, sıçan dalaklarının hasat edilmesini, perfüzyon yoluyla hücrelerden arındırılmasını ve özelliklerini doğrulamak için elde edilen DSM'nin değerlendirilmesini içeren sıçan DSM'si hazırlama prosedürünü ana hatlarıyla belirtir.

Özet

Karaciğer nakli, son dönem karaciğer hastalığının birincil tedavisidir. Bununla birlikte, donör organların azlığı ve yetersiz kalitesi, alternatif tedavilerin geliştirilmesini zorunlu kılmaktadır. Deselüler karaciğer matriksi (DLM) kullanan biyoyapay karaciğerler (BAL'lar) umut verici çözümler olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, uygun DLM'leri tedarik etmek zor olmaya devam etmektedir. Hücreden arındırılmış dalak matrisinin (DSM) kullanımı, BAL'lar için bir temel olarak araştırılmıştır ve hazır bir alternatif sunar. Bu çalışmada, sıçan dalakları, donma-çözülme döngüleri ve hücre giderme reaktifleri ile perfüzyonun bir kombinasyonu kullanılarak hasat edildi ve hücrelerden arındırıldı. Protokol, DSM içindeki hücre dışı matrisin (ECM) mikro yapılarını ve bileşenlerini korudu. Tam hücre çözme işlemi yaklaşık 11 saat sürdü ve bu da DSM içinde sağlam bir ECM ile sonuçlandı. Histolojik analiz, ECM'nin yapısını ve bileşimini korurken hücresel bileşenlerin çıkarıldığını doğruladı. Sunulan protokol, karaciğer dokusu mühendisliği ve hücre tedavisinde potansiyel uygulamalar sunan DSM elde etmek için kapsamlı bir yöntem sağlar. Bu bulgular son dönem karaciğer hastalığının tedavisi için alternatif yaklaşımların geliştirilmesine katkıda bulunmaktadır.

Giriş

Karaciğer nakli, son dönem karaciğer hastalığı için tek kesin tedavi olmaya devam etmektedir 1,2,3. Bununla birlikte, donör organların kritik kıtlığı ve azalan kalitesi, alternatif tedavilere olan ihtiyacı artırmıştır4. Rejeneratif tıp alanında, hücreden arındırılmış karaciğer matrisi (DLM) kullanan biyoyapay karaciğerler (BAL'ler) umut verici çözümler olarak ortaya çıkmıştır 5,6,7. DLM, karmaşık mikrovasküler ağı ve ECM'nin bileşenleri de dahil olmak üzere orijinal karaciğer yapısını koruyarak, karaciğer hastalıklarını potansiyel olarak hafifletebilecek nakledilebilir BAL'lar oluşturmak için bir iskele sunar.

Verilen söze rağmen, bu teknolojinin benimsenmesi, özellikle uygun DLM'lerin tedarik edilmesinde zorluklarla karşı karşıyadır. İnsan kaynaklı DLM'ler yetersizdir, hayvan kaynaklı DLM'ler ise hastalık bulaşma ve bağışıklık reddi riskleri taşır. Yenilikçi bir yaklaşımla, araştırmamız BALs 8,9,10,11 için bir temel olarak hücreden arındırılmış bir dalak matrisinin (DSM) kullanımını araştırdı. Dalaklar, portal hipertansiyon, travmatik rüptür, idiyopatik trombositopenik purpura ve kardiyak ölüm sonrası bağış gibi çeşitli tıbbi durumlarda daha kolay bulunur. Bu nedenle dalaklar, araştırma amaçlı karaciğerlerden daha yaygın olarak bulunur. Splenektomi geçiren hastalar ciddi durumlardan muzdarip değildir, bu da dalağın dağıtılabilirliğini daha da doğrular. Dalağın mikro çevresi, özellikle hücre dışı matriks ve sinüzoidler, karaciğerinkine benzer. Bu, dalağı hepatosit nakli araştırmalarında hücre yapışması ve çoğalması için uygun bir organ haline getirir. Bu bulgulara dayanarak, önceki araştırmalarımız DSM'lerin DLM'lerle karşılaştırılabilir mikro yapıları ve bileşenleri paylaştığını ve albümin ve üre üretimi dahil olmak üzere hepatositlerin hayatta kalmasını ve işlevini destekleyebileceğini göstermiştir. Ayrıca, DSM'lerin kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin hepatik farklılaşmasını arttırdığı, bunun da gelişmiş ve tutarlı işlevsellik sağladığı gösterilmiştir.

Heparin ile tedavi edilen DSM'leri kullanarak, etkili kısa süreli antikoagülasyon ve kısmi karaciğer fonksiyon kompanzasyonu gösterebilen fonksiyonel BAL'lar tasarladık11. Sonuç olarak, bu üç boyutlu DSM, karaciğer dokusu mühendisliği ve hücre tedavisinin ilerlemesi için önemli bir umut vaat ediyor. Bu çalışmada, ECM'nin mikro yapılarını ve bileşenlerini koruyan sıçan dalaklarının toplanması ve DSM'nin hazırlanmasının ayrıntılı yöntemlerini sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Xi'an Jiaotong Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etiği Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür.

1. Dalak toplama

  1. 250-280 g ağırlığındaki erkek Sprague Dawley sıçanlarını kullanın. Fareleri kontrollü sıcaklık ve neme sahip odalarda barındırın ve ameliyattan önce oruç tutmak dışında onlara yiyecek ve su ad libitum sağlayın.
  2. Ameliyattan 1 saat önce deri altına buprenorfin (0.05 mL / kg) analjezik olarak enjekte edin. İzofluran inhalasyonu ile sıçanı uyuşturun. Bir pleksiglas kutuda indüksiyon anestezisi için 1.5 L / dak% 5 izofluran akış hızı kullanın ve anesteziyi bir maske aracılığıyla 0.6-0.8 L / dak% 2 izofluran akış hızı ile koruyun. Ayak parmaklarını sıkıştırarak anestezi derinliğini onaylayın.
  3. Tüm karın bölgesindeki cildi tıraş etmek için elektrikli tıraş makinesi kullanın. Fareyi ameliyat masasında sırtüstü pozisyonda sabitleyin. Sistemik antikoagülasyon elde etmek için penil dorsal ven yoluyla 2 mL heparinize salin (1.000 U heparin) enjekte edin. Tıraşlı cildi bir povidon-iyot solüsyonu ile dezenfekte edin ve steril bir örtü bezi ile örtün.
  4. Karında cerrahi makas kullanarak haç şeklinde bir kesi yapın, hemostatik forseps ile gererek karın boşluğunu ortaya çıkarın ve karaciğeri diyaframa doğru çevirin. Gastrointestinal sistemi karnın sağ tarafına dışlayın ve nemli gazlı bezle örtün.
  5. Dalak hilusunu ortaya çıkarmak için splenogastrik ligamenti dikkatlice ayırın ve kesin.
    NOT: Yaklaşık 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm boyutlarında, kırmızımsı uzun bir yapı olarak görünen dalak, sol karın bölgesinde tanımlanabilir.
  6. Ortak hepatik arteri, gastroduodenal arteri ve splenik arteri splenik hilum boyunca diseksiyon yaparak kademeli olarak ayırın ve ortaya çıkarın. Gastroduodenal arteri ve ortak hepatik arteri bağlayın ve kesin, aynı zamanda çevredeki dokuyu aşamalı olarak ayırın.
  7. Abdominal aortu ortaya çıkarmak için dalağı sağ tarafa doğru çevirin. Nazikçe künt diseksiyon yapın ve pamuklu çubuklar kullanarak abdominal aort ve çölyak gövdesini açığa çıkarın. Çölyak gövdesinin dallarının üstüne ve altına yaklaşık 3 cm uzunluğunda 3-0 ipek sütür yerleştirin ve çölyak gövdesinin dalına yaklaşık 10 cm uzunluğunda 6-0 ipek sütür yerleştirin.
  8. Çölyak gövdesinin dallarının altında ve üstünde abdominal aortu ligatür. Arteriyel dalda küçük bir kesi yapın. 6-0 ipek sütürü nazikçe kaldırın, çölyak gövdesi boyunca splenik artere 24 G'lik bir venöz kateter yerleştirin ve bağlayın ve sabitleyin.
  9. 4 mL / dak hızında bir şırınga pompası kullanarak, 50 mL'lik bir hacimde heparinize normal salin (25 U / mL) infüze edin. Aynı zamanda, infüze edilen sıvının dalaktan dışarı akmasına izin vermek için portal veni bir çıkış kanalı olarak kesin. Hayvan kan kaybı ile ötenazi yapılır.
  10. Dalağın çevresindeki dokuyu dikkatlice inceleyin, pankreasa zarar vermekten kaçının ve ana aksesuar damarları koruyun.
  11. Dalak çevresinde herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin, ardından dalağı ve pankreası çıkarın ve normal tuzlu suyla durulayın.
    NOT: Sıçanların dalağı ve pankreası, pankreasın splenik arterin etrafına sarılmasıyla yakından bağlantılıdır. Dalak ayrı ayrı çıkarılırsa, çok sayıda küçük kan damarını bağlamak zor olabilir. Bu işlemde dalak pankreas ile birlikte çıkarılır. Decellularizasyondan sonra, dalak ve pankreas şeffaf hale gelir ve mikro damar sistemi görünür hale gelir, bu da dalağın sağlam kan damarları ile korunmasını kolaylaştırır.
  12. Dalağı normal tuzlu su ile doldurulmuş 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
    NOT: Dalak arterine yerleştirilen dalak ve venöz kateter, perfüzyon deneyleri sırasında uygun bağlantı için birlikte dondurularak saklanacaktır.

2. Dalak hücre deselizasyonu

  1. Dalak hücrelerini parçalamak için steril bir kapta donma-çözülme döngüsünü 3 kez tekrarlayın.
    NOT: Donma-çözülme döngüsü, iskele hücreden arındırma için kullanılan fiziksel bir yöntemdir. Dalak dokusu dondurulması için gece boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirilir, daha sonra düşük sıcaklıktaki ortamdan çıkarılır ve çözülmesi için oda sıcaklığında veya 37 °C su banyosuna yerleştirilir. Bu dondurma ve çözme işlemi 3-6 kez tekrarlanır, bu da hücre zarlarını bozar ve hücre lizizine yol açar.
  2. Bir peristaltik pompa, 2 L'lik bir rezervuar, iç çapı 2.4 mm olan bir silikon tüp ve bir baloncuk tutucudan oluşan temiz bir tezgah içinde bir perfüzyon sistemi kurun (Şekil 1).
  3. Perfüzyon sistemini deiyonize su (ddH2O) ile doldurun ve 10 dakika boyunca çalışır durumda tutun.
  4. Hasat edilen dalağı dikkatlice ddH2O dolu kaba aktarın.
  5. Silikon tüpü splenik artere yerleştirilen venöz katetere bağlayın.
  6. 30 dakika boyunca 2 mL / dk oranında ddH2O ile perfüzyona başlayın.
  7. 30 dakika boyunca 4 mL / dk oranında ddH2O ile perfüzyona devam edin.
  8. 4 saat boyunca% 0.1 (a / h) SDS çözeltisi ile perfüz.
  9. 2 saat boyunca% 1 (h / h) Triton X-100 çözeltisi ile perfuse.
  10. DSM'yi yıkamak için 4 saat boyunca 4 mL / dak hızında PBS ile perfüz.
    NOT: Tüm sıvıların tek yönlü perfüzyonu için peristaltik pompanın kullanılması.
  11. Perfüzyon tamamlandıktan sonra, pankreas ve dalak arasındaki vasküler dalları bağlayın ve kesin ve ardından pankreası çıkarın. DSM'yi, gelecekteki deneyler için kullanıma hazır olana kadar -20 °C'de% 10 penisilin-streptomisin içeren PBS'ye batırılmış temiz ve sızdırmaz 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, sıçan dalağının hücreden arındırılması için tekrarlanan donma-çözülme döngüleri ve hücre giderme reaktifleri ile perfüzyonun bir kombinasyonunu kullandı. Dalağın tamamen hücreden arındırılması yaklaşık 11 saat içinde sağlandı (Şekil 2A). Hücreden arındırma işlemi boyunca, dalağın rengi yavaş yavaş koyu kırmızıdan benekli, açık kırmızıya ve nihayetinde beyaz yarı saydam bir görünüme geçiş yaptı (Şekil 2B). Genel morfoloji, görünür vasküler yapılarla ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

BAL'lar, özellikle karaciğer naklinin mevcut donör organ eksikliği nedeniyle engellendiği durumlarda, son dönem karaciğer hastalığının tedavisi için etkili bir yaklaşımı temsil etmektedir6. BAL'lar oluşturmak için umut verici bir seçenek, doğal karaciğerin doğal ECM'sini ve vasküler yapısını koruyan DLM'nin kullanılmasıdır. Bununla birlikte, insan DLM'sinin kıtlığı ve hayvan DLM'si ile ilişkili potansiyel enfeksiyon ve immünojenisite riskleri önemli sınırlamalar oluşturmaktadır. Bu zorluğun üstesi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemişlerdir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82000624), Shaanxi Doğa Bilimleri Temel Araştırma Programı (2022JQ-899 ve 2021JM-268), Shaanxi Eyaleti İnovasyon Yeteneği Destek Programı (2023KJXX-030), Shaanxi Eyaleti Anahtar Ar-Ge Planı Üniversitesi Ortak Proje-Anahtar Projesi (2021GXLH-Z-047), Xi'an Jiaotong Üniversitesi İlk Bağlı Hastanesinin Kurumsal Vakfı (2021HL-42 ve 2021HL-21) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anestezi MakinesiHarvard Aparatımasa üstühayvan anestezi
kabarcık tuzağıShandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.gözenek çapı: 5 μ mhava kabarcıklarını önlemek
BuprenorfinTIPR İlaç Sorumlu Co, Ltdbir analjezik
Hemostatik ForsepsŞangay Tıbbi Aletler   Co., LtdJ31020cerrahi alet
Heparinize SalinSPH No.1 Biyokimyasal & İlaç A.Ş., LTD tromboz oluşumunu önlemek 
İzofluranRWD yaşam Bilimleri A.Ş.anestezik: anestezi indüksiyonu ve bakımı için
Penisilin-Streptomisin & nbsp;Beyotime Biyoteknoloji Ltd. Şti.Mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için in vitroC0222
Peristaltik PompaBaoding Daha Uzun Hassas Pompa Co., Ltd.BT100-1L
Fosfat Tamponlu TuzluSabay Titan Scientific Co., Ltd.4481228fosforik asit tampon tuz çözeltisi
Silikon TüpBaoding Daha Uzun Hassas Pompa Co., Ltd.2.4 ve kez; 0.8mm
İpek SütürYangzhou Jinhuan Tıbbi Alet Fabrikası6-0 ve 3-0ligat kan damarları
Sodyum Dodesil SülfatShanghai Titan Scientific Co., Ltd.151-21-3iyonik deterjan, hem hücre hem de nükleer zarları çözer
Şırınga PompasıShenzhen Mindray Biyo-Medikal Elektronik Co, LtdBeneFusion SP5intravenöz infüzyon
Triton X-100Şangay Titan Scientific Co., Ltd.9002-93-1iyonik olmayan deterjan, lipid-lipid, lipid-protein ve DNA-protein etkileşimlerini bozar
Venöz KateterB. Braun Company24Gdalak arterinin yerleştirilmesi
antibiyotikler

Kaynaklar

  1. Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
  2. Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285(2023).
  3. Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
  4. Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972(2022).
  5. Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36(2022).
  6. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
  7. Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
  8. Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
  9. Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
  10. Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
  11. Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003(2019).
  12. Somuncu, Ö Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
  13. Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299(2022).
  14. Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786(2022).
  15. Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
  16. Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Dalak DeselülarizasyonuHücre Dışı MatriksBiyoartifisyal KaraciğerKaraciğer Doku MühendisliğiPerfüzyonla DeselülarizasyonDondurma Çözme DöngüleriSıçan Dalak İskelesiVasküler Ağ KorunumuHücre İmplantasyon İskelesi
Sıçanlardan Türetilen Decellularized Spleen Matrix'in İmalatı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.