Yöntem makalesi

HIV-1 ile Enfekte T Hücrelerinde Endoplazmik Retikulum Stresi ve Katlanmamış Protein Yanıtının Ölçülmesi ve HIV-1 Replikasyonundaki Rolünün İncelenmesi

3.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66522

⸱

14 Haziran 2024

 ,  , 
1National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

Bu makalede

Özet

Burada, özellikle HIV-1 enfeksiyonuna vurgu yaparak, endoplazmik retikulum (ER) stresini ve katlanmamış protein yanıtı (UPR) aktivasyonunu belirlemek için bazı yerleşik yöntemleri açıklıyoruz. Bu makalede ayrıca ER stresi/UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesi üzerindeki etkisini araştırmak için bir dizi protokol açıklanmaktadır.

Özet

Viral enfeksiyonlar, anormal protein birikimi nedeniyle Endoplazmik Retikulum (ER) stresine neden olarak Katlanmamış Protein Yanıtına (UPR) yol açabilir. Virüsler konak UPR'yi manipüle etmek için stratejiler geliştirmiştir, ancak literatürde UPR modülasyonu ve HIV-1 enfeksiyonu sırasındaki fonksiyonel önemi hakkında ayrıntılı bir anlayış eksikliği vardır. Bu bağlamda, bu makalede, T hücrelerinde HIV-1 enfeksiyonu sırasında ER stres düzeylerini ve UPR'yi ölçmek için laboratuvarımızda kullanılan protokoller ve UPR'nin viral replikasyon ve enfektivite üzerindeki etkisi anlatılmaktadır.

Thioflavin T (ThT) boyama, protein agregatlarını tespit ederek hücrelerdeki ER stresini tespit etmek için kullanılan nispeten yeni bir yöntemdir. Burada, ER stresini tespit etmek ve ölçmek için HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerde ThT boyama protokolünü gösterdik. Ayrıca, ER stresi, konvansiyonel immünoblotlama ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanılarak, HIV-1 ile enfekte hücrelerde BiP, fosforile IRE1, PERK ve eIF2α gibi UPR belirteçlerinin seviyeleri, XBP1'in eklenmesi, ATF6, ATF4, CHOP ve GADD34'ün bölünmesi ile dolaylı olarak da tespit edildi. ThT-floresansının UPR aktivasyonunun göstergeleri ile ilişkili olduğunu bulduk. Bu makale ayrıca, ER stresi ve UPR modülasyonunun HIV-1 replikasyonu üzerindeki etkisini, nakavt deneyleri ve farmakolojik moleküllerin kullanımı ile analiz etmek için protokolleri göstermektedir. UPR'nin HIV-1 gen ekspresyonu/replikasyonu ve virüs üretimi üzerindeki etkisi sırasıyla Luciferaz raportör testleri ve p24 antijen yakalama ELISA ile analiz edilirken, virion enfektivitesi üzerindeki etkisi enfekte raportör hücrelerin boyanması ile analiz edildi. Toplu olarak, bu yöntem seti, HIV-1 enfeksiyonu sırasında Katlanmamış Protein Yanıt yollarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar ve karmaşık dinamiklerini ortaya çıkarır.

Giriş

Edinilmiş immün yetmezlik sendromu (AIDS), CD4 + T lenfositlerinin sayısında kademeli bir azalma ile karakterizedir, bu da immün yanıtın ilerleyici başarısızlığına yol açar. İnsan immün yetmezlik virüsü-1 (HIV-1), AIDS'in etken maddesidir. Zarflı, pozitif anlamlı, virion başına iki RNA kopyası olan tek sarmallı bir RNA virüsüdür ve retroviridae ailesine aittir. Konak hücre içinde yüksek konsantrasyonlarda viral proteinlerin üretilmesi, hücrenin protein katlama mekanizmasına aşırı stres uygular1. ER, ökaryotik hücrelerin salgı yolundaki ilk bölmedir. Proteinlerin üretilmesinden, değiştirilmesinden ve salgı yoluna ve hücre dışı boşluk hedef bölgelerine iletilmesinden sorumludur. Proteinler çok sayıda translasyon sonrası değişikliğe uğrar ve asparagine bağlı glikosilasyon ve moleküller arası ve moleküller arası disülfür bağlarınınoluşturulması dahil olmak üzere ER'de doğal konformasyonlarına katlanırlar 2. Bu nedenle, ER lümeninde yüksek konsantrasyonlarda protein bulunur ve bunlar agregasyona ve yanlış katlanmaya çok eğilimlidir. Gelişmiş protein sentezi veya protein mutasyonu gerektiren ısı şoku, mikrobiyal veya viral enfeksiyonlar gibi çeşitli fizyolojik durumlar, ER'de artan protein birikimi nedeniyle ER stresine yol açar ve böylece ER lümen homeostazını bozar. ER stresi, yüksek oranda korunmuş adaptif sinyal iletim yollarından oluşan bir ağı, Katlanmamış Protein Tepkisi (UPR)3 aktive eder. UPR, katlanmamış protein yükünü ve katlanma kapasitesini hizalayarak normal ER fizyolojik durumunu geri getirmek için kullanılır. Bu, ER boyutunun ve ER'de yerleşik moleküler şaperonların ve foldazların arttırılmasıyla sağlanır ve bu da ER'nin katlanma kabiliyetinin artmasına neden olur. UPR ayrıca, translasyonel seviyede küresel protein sentezi zayıflaması yoluyla ER'nin protein yükünü azaltır ve ER ile ilişkili bozunmayı (ERAD) yukarı regüle ederek katlanmamış proteinlerin ER'den temizlenmesini artırır4,5.

ER stresi, ER'de yerleşik üç transmembran protein tarafından algılanır: Protein kinaz R (PKR) benzeri endoplazmik retikulum kinaz (PERK), Aktive edici transkripsiyon faktörü 6 (ATF6) ve İnositol gerektiren enzim tip 1 (IRE1). Tüm bu efektörler, bağlayıcı protein (BiP)/78-kDa glikoz regüle protein (GRP78) olarak da bilinen şaperon Isı şoku protein ailesi A (Hsp70) üyesi 5'e (HSPA5) bağlanarak inaktif tutulur. ER stresi ve katlanmamış/yanlış katlanmış proteinlerin birikmesi üzerine, HSPA5 ayrışır ve bu efektörlerin aktivasyonuna yol açar, bu daha sonra ER stresinin çözülmesine yardımcı olan ve aşırı koşullarda hücre ölümünü teşvik eden bir dizi aşağı akış hedefini aktive eder6. HSPA5'ten ayrışma üzerine, PERK otofosforilatlar ve kinaz aktivitesi aktive edilir7. Kinaz aktivitesi eIF2α'yı fosforile eder, bu da translasyonel zayıflamaya yol açarak ER8'in protein yükünü düşürür. Bununla birlikte, fosfo-ökaryotik başlatma faktörü 2α (eIF2α) varlığında, spesifik mRNA'lar üzerindeki çevrilmemiş açık okuma çerçeveleri, strese bağlı genleri düzenleyen ATF4 gibi tercihli olarak çevrilir. ATF4 ve C/EBP homolog proteini (CHOP), strese bağlı genleri düzenleyen ve apoptoz ve hücre ölüm yolaklarını düzenleyen transkripsiyon faktörleridir 9,10. ATF4 ve CHOP'un hedeflerinden biri, protein fosfataz 1 defosforilat peIF2α ile birlikte ve translasyonel zayıflama11 için bir geri besleme düzenleyicisi olarak işlev gören büyüme durdurma ve DNA hasarına neden olan proteindir (GADD34). ER stresi altında, ATF6, HSPA5'ten ayrışır ve Golgi lokalizasyon sinyali açığa çıkar, bu da Golgi aygıtına translokasyonuna yol açar. Golgi aygıtında ATF6, ATF6'nın (ATF6 P50) parçalanmış formunu serbest bırakmak için bölge-1 proteaz (S1P) ve site-2 proteaz (S2P) tarafından parçalanır. ATF6 p50 daha sonra çekirdeğe translokasyon yapar, burada protein katlanması, olgunlaşması ve salgılanmasının yanı sıra protein bozunması12,13 ile ilgili genlerin ekspresyonunu indükler. ER stresi sırasında, IRE1 HSPA5'ten ayrışır, multimerleşir ve14'ü oto-fosforile eder. IRE1'in fosforilasyonu, RNaz alanını aktive eder, spesifik olarak X-box bağlayıcı protein 1'in (XBP1) mRNA'sının merkezi kısmından 26 nükleotidin eklenmesine aracılık eder15,16. Bu, transaktivasyon fonksiyonu sağlayan yeni bir C-terminali oluşturur ve birkaç ER stresinin neden olduğu geni kontrol eden güçlü bir transkripsiyon faktörü olan fonksiyonel XBP1s proteini üretir17,18. Bu transkripsiyon faktörlerinin birleşik aktivitesi, ER homeostazını geri yüklemeyi amaçlayan genetik programları açar.

ER stresini ve UPR'yi tespit etmek için çeşitli yöntemler vardır. Bunlar, UPR belirteçlerini19,20 analiz etmek için geleneksel yöntemleri içerir. Çeşitli konvansiyonel olmayan yöntemler, UPR'nin redoks durumunun ve ER lümenindeki kalsiyum dağılımının ölçülmesinin yanı sıra ER yapısının değerlendirilmesini içerir. Elektron mikroskobu, hücrelerde ve dokularda ER stresine yanıt olarak ER lümeninin ne kadar büyüdüğünü görmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem zaman alıcıdır ve her araştırma grubu için mevcut olmayabilecek bir elektron mikroskobunun mevcudiyetine bağlıdır. Ayrıca, reaktiflerin mevcudiyeti nedeniyle kalsiyum akışının ve ER'nin redoks durumunun ölçülmesi zordur. Ayrıca, bu deneylerden elde edilen okuma çok hassastır ve hücresel metabolizmanın diğer faktörlerinden etkilenebilir.

UPR çıkışlarını izlemek için güçlü ve basit bir teknik, UPR'nin farklı sinyal yollarının aktivasyonunu ölçmektir ve onlarca yıldır çeşitli stres senaryolarında kullanılmaktadır. UPR aktivasyonunu ölçmek için kullanılan bu geleneksel yöntemler ekonomiktir, uygulanabilirdir ve bilinen diğer yöntemlere kıyasla bilgileri daha kısa sürede sağlar. Bunlar, IRE1, PERK ve eIF2α'nın fosforilasyonu gibi protein düzeyinde UPR belirteçlerinin ekspresyonunu ölçmek için immünoblotlamayı ve ATF6'nın bölünmesini ve HSPA5, eklenmiş XBP1, ATF4, CHOP ve GADD34 gibi diğer belirteçlerin protein ekspresyonunu ölçerek ve ayrıca mRNA seviyelerini ve XBP1 mRNA'nın eklenmesini belirlemek için RT-PCR'yi içerir.

Bu makale, HIV-1 ile enfekte hücrelerde ER stresini ve UPR aktivasyonunu izlemek ve UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve enfektivitesinde fonksiyonel önemini belirlemek için doğrulanmış ve güvenilir bir protokol setini açıklamaktadır. Protokoller, kolayca bulunabilen ve ekonomik reaktifleri kullanır ve UPR çıktıları hakkında ikna edici bilgiler sağlar. ER stresi, protein agregatları oluşturmaya eğilimli olan katlanmamış/yanlış katlanmış proteinlerin birikmesinin sonucudur21. Burada, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerde bu protein agregatlarını tespit etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Thioflavin T boyama, bu protein agregatlarını tespit etmek ve miktarını belirlemek için kullanılan nispeten yeni bir yöntemdir22. Beriault ve Werstuck, canlı hücrelerde protein agregatlarını ve dolayısıyla ER stres seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için bu tekniği tanımladılar. Küçük floresan molekülü tioflavin T'nin (ThT) seçici olarak protein agregatlarına, özellikle amiloid fibrillere bağlandığı gösterilmiştir.

Bu makalede, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerde ER stresini tespit etmek ve ölçmek için ThT'nin kullanımını açıklıyoruz ve bunu, UPR'nin farklı sinyal yollarının aktivasyonunu ölçerek geleneksel UPR izleme yöntemiyle ilişkilendiriyoruz.

HIV-1 enfeksiyonu sırasında UPR'nin rolü ile ilgili kapsamlı bilgi eksikliği olduğundan, UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesindeki rolünü anlamak için bir dizi protokol sunuyoruz. Bu protokoller, UPR belirteçlerinin lentivirüs aracılı yıkımının yanı sıra farmakolojik ER stres indükleyicileri ile tedaviyi içerir. Bu makale aynı zamanda HIV-1 gen ekspresyonu, viral üretim ve üretilen viryonların enfektivitesini ölçmek için kullanılabilecek okuma türlerini de göstermektedir, örneğin uzun terminal tekrar (LTR) bazlı lusiferaz testi, p24 enzimine bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve β-gal raportör boyama testi.

Bu protokollerin çoğunu kullanarak, yakın zamanda T hücreleri23'te HIV-1 enfeksiyonunun UPR üzerindeki fonksiyonel etkisini bildirdik ve bu makalenin sonuçları burada açıklanan yöntemlerin güvenilirliğini göstermektedir. Bu nedenle, bu makale, HIV-1'in ER stresi ve UPR aktivasyonu ile etkileşimi hakkında kapsamlı bilgi için bir dizi yöntem sunmaktadır.

Protokol

NOT: Burada kullanılan hücre hatları, Cell Repository, NCCS, Pune, Hindistan'dan elde edilen HEK-293T ve Jurkat J6'dır (bir CD4+T hücre hattı); HIV-1 uzun terminal tekrar (LTR) promotörü24 ve CEM-GFP (başka bir CD4 + T muhabir hücre hattı) altında β-galaktosidaz ve lusiferaz genlerinin kopyalarını entegre eden HeLa'dan türetilmiş bir hücre hattı olan TZM-BL, ABD, NIH AIDS Deposu'ndan elde edildi.

1. HIV-1 virüsü stok hazırlama ve depolama

  1. HIV-1 virüsü stok hazırlama
    NOT: HIV-1 içeren tüm deneylerde Dünya Sağlık Örgütü (WHO) veya Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) kılavuzunda bulunan biyogüvenlikle ilgili uluslararası kılavuzların uygulanması tavsiye edilir. Virüsün ele alınması ve canlı virüsle yapılan herhangi bir deney, yalnızca en az BSL2 düzeyinde bir muhafaza laboratuvarında bulunan uygun bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Bir Kalsiyum fosfat memeli transfeksiyon kiti kullanılarak bulaşıcı HIV-1 partiküllerinin üretimi, protokolün bu bölümünde açıklanmaktadır.
    1. HEK-293T hücrelerini, sınıf II tip A2 biyogüvenlik kabininde 10 mL tam (%10 Fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) ile 90 mm'lik tabaklarda tohumlayın ve hücrelerin birleşmesi %50-%60 arasında olacak şekilde 37 ° C'de bir doku kültürü inkübatöründe yaklaşık 12 saat saklayın.
    2. Ertesi gün, transfeksiyon karışımını yapın: Steril tamponda 25 μg pNL4.3 (HIV-1'in moleküler bir klonu) plazmit DNA, 86.8 μL 2 MCaCl2 ve kalan steril su içeren Çözelti A'yı hazırlayın ve nihai hacmi her plaka için 700 μL yapın. 1 plaka için 700 μL 2x HEPES tamponlu salin (HBS) içeren Çözelti B'yi hazırlayın. Ardından, toplam plaka sayısı için hesaplamayı ayarlayın.
    3. Şimdi, Çözüm A'yı sürekli olarak girdaplarken, Çözüm A'ya çözelti A'ya damla damla ekleyin. Transfeksiyon karışımının toplam hacmi şimdi bir plaka için 1.4 mL olur.
      NOT: Sürekli girdaplama sırasında Çözelti B'nin Çözelti A'ya hassas damla bazında eklenmesi, mükemmel transfeksiyon komplekslerinin oluşumuna yol açar.
    4. Bu karışımı oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, karışımı taze 9 mL tam DMEM içeren her bir plakaya yavaşça ekleyin ve plakaları CO2 inkübatöre aktarın. 8-10 saat sonra, mevcut ortamı yeni 10 mL tam DMEM ile değiştirin.
    5. Ortam değişiminden 24 saat sonra, konik tüplerdeki tüm plakalardan süpernatanı (virüs parçacıklarını içeren) toplayın. Hücre kalıntılarını gidermek için düşük hızlı bir masa üstü santrifüj (Malzeme Tablosu) kullanarak 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı poliallomer ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve bunları bir ultrasantrifüjün açılır rotoruna yerleştirin (Malzeme Tablosu). Tüp tutucuların ağırlıklarını denge açısından kontrol edin ve gerekirse steril bir ortamla ayarlayın.
    7. 1,41,000 ° C'de 2.5 saat boyunca 4 x g'da ultrasantrifüj. Bundan sonra, tüpleri dikkatlice çıkarın ve süpernatanı biyogüvenlik kabininin içinde yavaşça boşaltın.
    8. Her tüpteki pelete (şu anda konsantre virüs olan) 1 mL eksik RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 ortamı ekleyin ve peleti çıkarmak için kuvvetli pipetleme yapın.
      NOT: Ultrasantrifüj sonrası pelet çıplak gözle neredeyse görünmezdir. Bu nedenle, peletin düzgün bir şekilde yerinden çıkması için tüpün ortasına RPMI 1640 eklendiğinden emin olunmalıdır.
    9. Daha sonra, 1 mL virüs süspansiyonuna 25 μL 1 M HEPES pH 7.4 ekleyin. Süspansiyonun 50 μL'sini 1,5 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın ve uzun süreli saklama için hemen -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
  2. Virüs konsantrasyonu ve virion enfektivitesinin kantitasyonu
    NOT: Virüsün bulaşıcılığını hesaplamak için, öncelikle p24 Antijen Yakalama ELISA ile yapılan konsantrasyonunu ölçmek önemlidir (üreticinin talimatlarına göre ve bu nedenle burada açıklanmamıştır; Malzeme Tablosuna bakınız). Bu işlem, virüsün konsantrasyonunu stokun mikrolitresi (ng / μL) başına nanogram cinsinden verir ve daha sonra TZM-bl raportör hücrelerinde26 aşağıdaki deney yoluyla stoktaki enfektif virion sayısını tanımlamak için kullanılır.
    1. Her kuyucuk için 500 μL tam DMEM kullanarak 24 oyuklu bir plakada 0.1 x 106 TZM-bl hücreyi sayın ve tohumlayın ve 10-12 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe tutun.
    2. Virüs ölçümü için enfeksiyona başlamadan önce hücrelerin %50-60 oranında birleştiğinden emin olun. Mevcut ortamı her kuyucuğa 250 μL taze tam DMEM ile değiştirin.
      NOT: Herhangi bir deneysel hatayı ortadan kaldırmak için pozitif bir kontrol kuyusu tutun.
    3. Kopyalar halinde 1 ng, 0.1 ng ve 0.01 ng enfeksiyonları için gereken stok virüs miktarını hesaplayın. Kuyucuklara uygun miktarda virüs ekleyin ve plakayı inkübatörde 37 ° C'de 4 saat tutun.
    4. Hücreleri 500 μL eksik DMEM ile iki kez yıkayın ve ardından 500 μL tam DMEM ekleyin.
    5. Ortam değişiminden 36 saat sonra β gal boyama prosedürüne devam edin.
      1. Mevcut ortamı atın ve hücreleri 1 mL PBS ile iki kez yıkayın. Her bir kuyucuğa 500 μL sabitleme solüsyonu (PBS'de %0.25 Glutaraldehit) ekleyerek hücreleri sabitleyin ve biyogüvenlik kabini içinde RT'de 5-7 dakika inkübe edin.
      2. Boyama solüsyonunu Tablo 1'de verildiği gibi hazırlayın. X-gal ışığa duyarlı olduğu için ışıktan uzak tutun.
      3. Hücreleri bir kez 1 mL PBS ile yıkayın. Hücreleri 500 μL taze hazırlanmış boyama solüsyonu ile kaplayın ve karanlıkta 37 ° C'de 2-18 saat inkübe edin.
      4. Daha sonra reaksiyonu durdurmak için, hücreleri PBS'de 500 μL% 3 dimetil sülfoksit (DMSO) ile iki kez durulayın ve ardından hücreleri 500 μL taze PBS'de tutun.
      5. Mavi enfekte hücreleri ( Şekil 1A'da gösterildiği gibi) mikroskop altında 5 rastgele alan için 10x büyütmeyle sayın. 5 alanın ortalama sayısını alın ve bunu alan faktörü ve seyreltme faktörü ile çarpın. Bu, virüs stoğundaki enfektif virion partiküllerini ölçer.
        NOT: 24 oyuklu bir plaka için alan faktörü 75'tir.
BileşenHazırlıkGerekli hacim
PBS10x PBS'lik bir stoktan 1x PBS hazırlayın14 mL
Potasyum Ferri-ferro siyanür0.82 g Potasyum Ferrisiyanür ve 1.06 g Potasyum Ferrosiyanürü 25 mL 1x PBS'de çözün0,75 mL
Magnezyum klorür1x PBS'nin 1 mL'sinde 1 M15 μL
X-gal (İngilizce)30 mg'ı 0.6 mL N, N-dimetil formamid (karanlıkta) içinde çözün0,3 mL
Toplam = 15 mL

Tablo 1: TZM-bl hücrelerinde β-gal boyama için gerekli bileşenlerin listesi.

2. T hücre hatlarının HIV-1 enfeksiyonu

  1. Ölümsüzleştirilmiş bir T hücresi hattını çözün ve kültürleyin. Bu çalışmada, %10 Fetal sığır serumu, %1 penisilin-streptomisin ve 500 μg/mL G418 ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamında kültürlenmiş CEM-GFP hücre hattı kullanılmıştır.
  2. Her zaman noktası için 2 milyon hücre sayın ve alın (Enfekte olmayan, 24 saat, 48 saat, 72 saat ve 96 saat). Enfekte olmamış hücreleri 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyerek hemen hasat edin ve hücre lizis tamponu ekleyin (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.12 M NaCl, 5 mM EDTA,% 0.5 NP40, 0.5 mM NaF, 1 mM DTT), proteaz inhibitör kokteyli, 0.5 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve 1x fosfataz inhibitörü (1-3 milyon hücre için 50 μL) veya RNA izolasyonu için Trizol reaktifinde (1-3 milyon hücre için 1 mL) lizen (bkz . Malzemeler).
  3. Hücreleri bir kez 1 mL tam RPMI 1640 ortamı ile polibren (5 μg / mL) içeren polibren (5 μg / mL) ile RT'de 5 dakika boyunca yıkayın . Hücreleri 1 mL tam ortamda yeniden süspanse edin.
    NOT: Polibren, memeli hücrelerinde retroviral enfeksiyonu arttırmak için kullanılan katyonik bir polimerdir.
  4. Tam ortam içeren 1 mL polibrende 8 milyon hücreyi yeniden süspanse edin. Şimdi 4 milyon virion partikülü için gereken viral stok hacmini hesaplayın, virüs stoğunu ekleyin ve tam medya ekleyerek toplam hacmi 2 mL'ye çıkarın. Bu, onu 0,5'lik bir MOI yapar.
  5. Hücreleri CO2 inkübatörünün içinde 4 saat boyunca 37 ° C'de tutun ve her 30-45 dakikada bir aralıklı olarak vurun.
  6. 4 saat sonra, hücreleri döndürün ve süpernatanı uygun imha yöntemleriyle biyogüvenlik kabininin içine dikkatlice atın.
    NOT: Bu adımdan itibaren, hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
  7. Hücreleri 1 mL eksik ortamla iki kez yıkayın. Hücreleri 8 mL tam ortamda yeniden süspanse ederek 1 milyon hücre / mL yapar.
  8. 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında, gerekli sayıda oyukta eşit sayıda hücre tohumlayın ve plakayı 37 ° C'de tutulan bir CO2 inkübatöründe tutun.
  9. Önümüzdeki 4 gün boyunca, hücre lizis tamponu ekleyerek hücreleri her 24 saatte bir hasat edin. Ayrıca, süpernatanı toplayın ve hemen -80 °C dondurucuya aktarın.
  10. Enfeksiyonun olup olmadığını kontrol etmek için, tüm zaman noktaları için p24 antijen yakalama ELISA'ya devam edin. Zaman noktaları için uygun seyreltmeler yapın, yani ilk zaman noktaları için daha düşük bir seyreltme ve daha sonrakiler için 1:50 ila 1:500 arasında değişen daha yüksek bir seyreltme yapın. Okumaları, enfeksiyon ilerlemesini gösteren bir grafikte çizin (Şekil 1B).

3. ER stresini belirlemek için tioflavin T boyaması

  1. RT'de 20 dakika boyunca PBS'de 200 μL% 4 paraformaldehit ile 1 milyon enfekte olmamış ve 0.5 MOI ile enfekte olmuş CEM-GFP hücresini (72 saat enfekte hücre alınmış) düzeltin.
  2. Hücreleri 5 dakika boyunca 100 x g'da peletleyin ve 5 dakika boyunca 500 μL 0.1 M glisin ile muamele edin, ardından iki kez 500 μL PBS ile yıkayın. Hücreleri 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
  3. Cam slaytları, filtre kartlarını ve numune haznelerini birleştirin. 100 μL'lik yeniden süspanse edilmiş hücreleri numune odalarına ekleyin ve hücreleri bir sitosantrifüjdeki slaytlara yapıştırmak için hücreleri 4 dakika boyunca 1000 x g'da döndürün (Malzeme Tablosu).
    NOT: Hücre süspansiyonu çok seyreltilirse, sitosantrifüj santrifüjasyonunu takiben slayt üzerinde hareketsiz hale getirilmiş yeterli hücre olmayacaktır. Hücre süspansiyonu çok konsantre ise, sitosantrifüjden sonra hücrelerin topaklanması ve zayıf bir şekilde dağılması muhtemeldir.
  4. PBS'de% 0.1 Triton-X-100'lük damlalar kullanarak (hücrelerin yapıştığı alanı kaplayacak kadar) hücreleri 10 dakika boyunca geçirgen hale getirin ve damla damla PBS koyarak hücreleri iki kez yıkayın ve slaytı eğerek PBS'yi doku ile silin.
  5. Hücreleri 10 μL 5 μM Thioflavin T ile 30 dakika inkübe edin.
    NOT: ThT ile inkübe ettikten sonra yıkamayın.
  6. Slaytları 5 μL montaj ortamı (%80 gliserol v/v, %20 PBS v/v ve 8 mg/mL 1,4-diazabisiklo[2.2.2]oktan [DABCO]) kullanarak monte edin, lamel koyun ve lameli oje kullanarak kapatın. Slaytları kurumaya bırakın.
    NOT: Tüm bu adımlarda hücrelerin kurumadığından emin olun.
  7. Konfokal mikroskopta 63x gliserol daldırma lensi ile sabit hücrelerin konfokal görüntülerini alın (Malzeme Tablosuna bakınız). Aşağıdaki uyarma ve emisyon ayarlarını yapın: GFP (Örn. 494 nm, Em. 519 nm) ve ThT (Örn. 458 nm, Em. 480-520 nm).
    NOT: Kanal çakışmasını önlemek için her floresan kanalı, aynı anda değil, sırayla görüntülenmelidir. CEM-GFP hücreleri, HIV-1 enfeksiyonu25 üzerine ateşlenen LTR promotörü düzenlemesi altında GFP'ye sahip olduğundan, HIV-1 enfeksiyonunun göstergesi olarak alınmıştır.
  8. Eşik analizi ile nicelemeden önce floresan görüntüleri 8 bit'e dönüştürün. Image J (~ 50 hücre)27 gibi bir yazılım kullanarak her hücrenin yoğunluğunu manuel olarak ölçün. Grafiği, enfekte olmamış ve enfekte olmuş kriterlere karşı Y ekseni üzerinde noktalar olarak her hücrenin yoğunluğu ile çizin.
  9. Bu protokolün etkinliğini göstermek için, örneğin bu durumda Thapsigargin tedavisi (bilinen ER stres indükleyicisi) gibi pozitif bir kontrol uygulayın28. Her biri 1 μL DMSO (araç kontrolü) ve 100 nM Thapsigargin içeren 1 milyon CEM-GFP hücresini 12 saat boyunca tedavi edin.
  10. Hücreleri hasat edin ve enfekte numuneler için belirtildiği gibi ThT boyama işlemini gerçekleştirin (adım 3.1-3.8).
    NOT: Bu numuneler için GFP floresansı gerekli değildir. Bu nedenle, konfokal mikroskopide sadece ThT floresan yakalanır.

4. Çeşitli UPR belirteçlerinin aktivasyonunu ve ekspresyonunu belirleme

NOT: UPR belirteçlerinin ekspresyonunu belirlemek için iki yöntem kullanılır: İmmünoblotlama ve RT-PCR. İmmünoblotlama için, 0.5 MOI HIV-1 ile enfekte olmuş CEM-GFP hücrelerini enfeksiyondan sonra çeşitli zaman noktalarında (enfeksiyondan 24 saat, 48 saat, 72 saat ve 96 saat sonra) hasat edin ve hücre peletini lizis tamponunda yeniden süspanse edin (adım 2.2'de belirtildiği gibi). Alternatif olarak, RT-PCR için, hücre peletleri Trizol reaktifi (1-3 milyon hücre için 1 mL) içinde parçalanır ( Bkz. Malzeme Tablosu). Lizis tamponu ve Trizol reaktifi içinde yeniden süspanse edilen hücreler, daha fazla kullanıma kadar -80 ° C'de saklanabilir.

  1. UPR belirteçlerinin analizi için immünoblotlama.
    1. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri, bir girdap kullanarak aralıklı karıştırma ile 45 dakika boyunca buz üzerindeki lizis tamponunda tutun.
    2. Tezgah üstü yüksek hızlı santrifüj kullanarak hücreleri 15 dakika boyunca 18000 x g'da peletleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Süpernatanı yeni bir tüpte toplayın.
    3. Bradford veya benzer bir reaktif kullanarak her numunedeki protein konsantrasyonunu ölçün.
    4. Her numune için eşit konsantrasyonda protein alın ve protein numunelerini Laemmli tamponunda hazırlayın (6x tampon: 250 mM Tris-Cl pH 6.8, %10 SDS, %30 Gliserol ve %0.02 Bromofenol mavisi; %5 β-Merkaptoetanol).
      NOT: Her bir UPR markörü için immünoblotlama için minimum 60-80 μg protein kullanılmıştır.
    5. Protein örneklerini 96 °C'de 5 dakika kaynatın ve kısa bir dönüş yapın.
    6. Protein örneklerini %10-12'lik bir SDS-PAGE jel üzerinde çözün ve proteinleri bir poliviniliden diflorür (PVDF) membranına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu).
    7. 1-2 saat boyunca% 5 yağsız kuru süt veya sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin, TBST (20 mM Tris pH7.4 ve 0.137 M NaCl;% 0.1 Tween 20) ile iki kez yıkayın ve UPR belirteçlerine karşı proteine özgü primer antikorlarla problayın (bkz . Malzeme Tablosu) bir külbütörde, gece boyunca 4 ° C'de. Ertesi gün, lekeleri TBST ile iki kez yıkadıktan sonra, 1.5 saat boyunca ilgili ikincil antikorlarla araştırın.
    8. Lekeleri TBST ile tekrar yıkayın ve bir batı lekesi görüntüleme cihazında kemilüminesans tespit eden bir substrat (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak protein bantlarını görselleştirin.
  2. RT PCR
    1. Trizol reaktifi kullanarak hücrelerden toplam RNA'yı izole edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
    2. Moloney Murine Lösemi Virüsü ters transkriptaz (MMLV-RT) kullanarak eşit konsantrasyonda RNA'dan cDNA'yı hazırlayın (bkz.
    3. Gene özgü primerlerle qRT-PCR kullanarak HSPA5, eklenmiş XBP1, ATF4, CHOP ve GADD34'ün mRNA ekspresyonunun modülasyonunu analiz edin (Tablo 2). Kısaca, cDNA şablonu (100 ng), 5 μL SYBR Yeşil boya ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve her bir gene özgü oligonükleotid primer çiftinden 10 pmol içeren 10 μL reaksiyon karışımları hazırlayın. Steril H2O kullanarak ses seviyesini ayarlayın.
    4. Karışımları aşağıdaki programı kullanarak gerçek zamanlı bir PCR makinesinde çalıştırın: 3 dakika boyunca 95 °C'de ilk denatürasyon ve 30 saniye boyunca 95 °C'lik 40 döngü, 30 saniye boyunca 55 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C'de ve ardından eriyik eğrisi analizi. Temizlik genine (örneğin β-Actin) göre hedef gen ekspresyonundaki kıvrım değişikliğini şu şekilde hesaplayın:
      Katlama değişimi = 2-Δ(ΔCT)
      Burada ΔCT = CT (hedef) - CT (temizlik geni)
      ve Δ(ΔCT) = ΔCT (tedavi edilmiş) -ΔCT (kontrol)
    5. XBP1'in eklenmesini daha fazla doğrulamak için, enfekte olmamış ve 72 saat enfekte olmuş numunelerle yarı kantitatif bir RT-PCR gerçekleştirin.
      NOT: XBP-1 mRNA'nın eklenmesi, ekleme bölgesi boyunca RT-PCR kullanılarak incelenir.
    6. Aşağıdaki koşullar altında yüksek kaliteli bir PCR ana karışımı (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak cDNA'yı XBP1 primerleri (Tablo 2) ile amplifiye edin: 30 saniye boyunca 98 °C'lik 1 döngü, ardından 15 saniye boyunca 98 °C'lik 5 döngü, 30 saniye boyunca 65*Δ-5 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C, ardından 15 saniye boyunca 98 °C'lik 30 döngü, 30 saniye boyunca 55 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C, ardından 10 dakika boyunca 72 °C'lik son bir uzatma ve 4 °C'de tutun.
    7. Amplikonları 50 ng etidyum bromür / mL içeren% 2.5'lik bir agaroz jel üzerinde ayırın ve bir jel doc cihazında görselleştirin. Eklenmiş XBP1 bandı 26 nükleotid ile daha küçüktür.

5. UPR belirteçlerinin yıkılması ve HIV-1 LTR güdümlü gen ekspresyonu ve virüs üretiminin analizi

  1. UPR belirteçlerinin sökülmesi için shRNA yapılarının hazırlanması
    1. pLKO.1-TRC vektör omurgasını (lentiviral klonlama vektörü) kullanarak shRNA yapıları oluşturun29.
    2. Her gen için iki shRNA yapısı oluşturun (IRE1, PERK, ATF6 ve HSPA5). İlgili genin mRNA'sını hedefleyen anlamlı ve anti-anlamlı oligonükleotidler, RNAi Konsorsiyumu (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) tarafından tasarlanmıştır (Tablo 3).
      NOT: Benzer şekilde, diğer UPR belirteçleri için shRNA yapıları yapılabilir.
    3. Primerleri (ileri ve geri her biri 100 nM) 95 °C'de tavlayın ve ardından RT'ye kademeli olarak soğutun.
    4. Ardından, bir T4 DNA ligaz kullanarak pLKO.1 vektörünün Age1 ve EcoRI bölgelerine bağlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Diziyi DNA dizilimi ile onaylayın.
      NOT: LacZ genini hedefleyen bir shRNA yapısı, hedeflemeyen bir kontrol olarak kullanılır.
  2. HEK-293T hücrelerinde PERK, ATF6, IRE1 ve HSPA5'in yıkılması, Lusiferaz testi ve p24 ELISA
    1. ShRNA yapısı (0.9 μg) ve polietilenimin (PEI) gibi bir transfeksiyon reaktifi (1 μg DNA için 3 μL PEI) (malzeme Tablosuna bakınız) karışımını 50 μL serumsuz ortamda girdaplama yoluyla hazırlayın ve 20 dakika inkübe edin.
    2. Şişe, tripsinize ve tohum ~ 0.25 x 106 hücre içeren birleşik bir HEK-293T hücresinden, 24 oyuklu bir plakada transfeksiyon karışımı ile birlikte, toplam hacmi 125 μL yapar ve bir CO2 inkübatörde 37 ° C'de 6 saat inkübe edilir. Bu yöntem, hücrelerin transfeksiyon karışımı ile birlikte tohumlandığı ters transfeksiyon olarak adlandırılır.
    3. 6 saat sonra, kuyucuklara 125 μL tam ortam ekleyin ve eşit tohumlama için hücreleri yeniden süspanse edin.
      NOT: Knockdown deneyleri için, ters transfeksiyon (adım 5.2.1-5.2.3) hem shRNA'lar hem de siRNA'lar ile daha iyi verimlilik sağlar.
    4. 24 saat sonra ikinci bir transfeksiyon gerçekleştirin. pNL4-3 (100 ng), pLTR-Luc (100 ng) ve pEGFP-N1 (50 ng) (pNL4-3: pLTR-Luc: pEGFPN1-1: 1: 0.5) ile PEI (1 μg DNA için 3 μL PEI) ile girdaplama yoluyla 50 μL eksik ortamda. Karışımı RT'de 20 dakika inkübe edin. Mevcut ortamı 250 μL taze eksik ortamla değiştirin ve karışımı hücrelere ekleyin.
      NOT: HIV-1 LTR için bir raportör vektör, LTR'nin daha önce laboratuvarda pU3RIII30,31'den pGL3basic'e32 alt klonlanmasıyla geliştirilmiştir. Transfeksiyon verimliliğini normalleştirmek için pEGFP-N1 kullanılarak GFP ekspresyonukullanıldı 32.
    5. Transfeksiyondan 6 saat sonra 500 μL tam DMEM ile ortamı değiştirin. İmmünoblotlama ve lusiferaz tahlili için hücreleri 36 saat sonra hasat edin.
    6. Lusiferaz tahlili için, hücreleri peletleyin ve ticari olarak tedarik edilen bir lusiferaz substratında (50 μL) yeniden süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu). Yeniden süspanse hücre lizatını opak 96 oyuklu bir plakaya ekleyin ve 10-15 dakika inkübe edin. Bir luminometrede lusiferaz okumasını elde edin. Ayrıca, bir mikroplaka mikromod plaka okuyucusunda (Örn: 494 nm, Em: 519 nm) lusiferaz okumasını normalleştirmek için aynı numunelerde GFP floresansını ölçün.
    7. Grafiği Y ekseninde Luciferaz birimi/GFP olarak çizin.
      NOT: İlgili UPR belirteçlerinin yıkılması kontrol edilmelidir ve sırasıyla gen spesifik antikorlar veya primerler kullanılarak immünoblotlama veya qRT-PCR ile yapılabilir.
    8. Yukarıda belirtildiği gibi p24 ELISA için işlenecek süpernatantları toplayın.
  3. UPR belirteçlerinin ve HIV-1 enfeksiyonunun yıkılması ile stabil hücrelerin oluşturulması.
    1. Lentivirus parçacıklarını, pMD2.G (VSV-G zarf vektörü) (0.75 μg) ve psPAX2 (Lentiviral ambalaj plazmidi) (0.25 μg) ile birlikte ilgili shRNA (1 μg) yapıları ile birlikte 6 oyuklu bir plakaya ekilen HEK-293T hücrelerini transfekte ederek hazırlayın (1 μg DNA: 3 μL PEI oranında PEI kullanarak). Karışımı 100 μL eksik DMEM'de hazırlayın ve RT'de 20 dakika inkübe edin. Karışımı, tohumlanmış HEK-293T hücrelerinde 1.8 mL tam ortama ekleyin.
      NOT: HEK-293T hücrelerini, transfeksiyondan en az 12 saat önce, morfoloji kazanana ve yaklaşık% 60-70 birleşim olana kadar 6 oyuklu bir plakada tohumlayın.
    2. 24 saatlik transfeksiyondan sonra, her kuyucuğa 1 mL tam DMEM ekleyin.
    3. Süpernatanları 48 saat sonra toplayın, -80 °C dondurucuda saklayın ve bu süpernatanlarda virüsün varlığını doğrulamak için p24 ELISA uygulayın. J6 hücrelerini dönüştürmek için bu ham lentiviral süpernatanı kullanın.
    4. Her kontrol ve gene özgü knockdown lentivirus için eşit hacimde lentiviral süpernatant (500 μL) ile 6 oyuklu bir plakada 2 milyon hücreyi inkübe edin ve hacmi 2 mL'ye çıkarmak için polibren (5 μg / mL) varlığında taze tam RPMI 1640 ortamı ekleyin.
    5. 24 saat sonra, stabil hücreleri seçmek için her bir oyuğa Puromycin (1 μg / mL) ekleyin. Puromisin ekledikten sonra, hücreleri her 24 saatte bir pelet haline getirin ve Puromisin ile 2 mL taze ortam ekleyin.
    6. Hücre ölümü olmayana kadar (~ 1 hafta) bunu yapın. Hayatta kalan hücreler, istenen gen yıkımına sahip kararlı hücrelerdir.
      NOT: İlgili genlerin yıkılması düzenli aralıklarla kontrol edilebilir ve son olarak, immünoblotlama veya qRT-PCR kullanılarak Puromisin içeren ortamda sadece hayatta kalan hücreler göründüğünde kontrol edilebilir.
    7. LacZ ve gene özgü knockdown hücrelerini, bölüm 2'de açıklandığı gibi 0.5 MOI HIV-1 ile enfekte edin ve hücreleri enfeksiyondan 48 saat sonra hasat edin.
    8. Her numuneden süpernatanı toplayın ve daha önce tarif edildiği gibi p24-ELISA için işlem yapın ve immünoblotlama ile yıkım seviyesini kontrol etmek için hücreleri işleyin.

6. ER stres indükleyicisi ile tedavi ve HIV-1 replikasyonu üzerindeki etkisinin analizi

NOT: HIV-1 replikasyonu sırasında UPR'nin aşırı uyarılmasının etkisini belirlemek için, farmakolojik indükleyici molekül olan Thapsigargin kullanılabilir.

  1. Thapsigargin tedavisi üzerine hücre canlılığı yüzdesinin belirlenmesi.
    NOT: Thapsigargin'in sitotoksisitesi MTT reaktifi tarafından belirlenir (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. 100 μL tam RPMI 1640 içeren 96 oyuklu plakada kuyu başına 25.000-30.000 CEM-GFP hücresi tohumlayın. Ortama 100 nM Thapsigargin ekleyin ve bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: 1 μL DMSO ile tedavi edilen hücreler araç kontrolü olarak alınmıştır.
    2. 48 saat sonra, her bir oyuğa 10 μL MTT (5 mg / mL) ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO2 ile formazan kristallerinin oluşumu için karanlıkta 4 saat inkübe edin.
    3. 4 saat sonra, mor bir renk oluşturmak için 100 μL izopropanol kullanarak kristalleri çözün ve bir spektrofotometre kullanarak 570 nm'de absorbansı ölçün.
    4. Aşağıda verilen denkleme göre hücre canlılığı yüzdesini hesaplayın
      % hücre canlılığı = (KontrolOD570 - TedaviOD570)/ KontrolOD570 x 100
  2. Thapsigargin'in ön tedavisi ve p24 ELISA ile HIV-1 enfeksiyonu ilerlemesinin analizi.
    1. 1 mL tam RPMI 1640 içeren 12 oyuklu bir plakada 1 milyon CEM-GFP hücresi tohumlayın ve hücreleri 37 ° C'de tutulan bir CO2 inkübatörde 12 saat boyunca 100 nM Thapsigargin veya 1 μL DMSO (araç kontrolü) ile tedavi edin. 12 saat sonra, hücreleri tam RPMI 1640 ile yıkayın ve daha önce tarif edildiği gibi 0.5 MOI HIV-1 ile enfekte edin.
    2. İmmünoblotlama için hücreleri enfeksiyondan 24 saat, 48 saat ve 72 saat sonra gibi farklı zaman noktalarında hasat edin.
    3. Her numuneden süpernatanları toplayın ve daha önce açıklandığı gibi p24 ELISA gerçekleştirin.
    4. Numunedeki p24 konsantrasyonu Y ekseni ve ilgili zaman noktaları X ekseni olarak grafiği çizin.
    5. İmmünoblotlama kullanarak, herhangi bir UPR markörünün seviyesini ölçerek Thapsigargin tedavisine bağlı ER stres indüksiyonunu analiz edin. Bu çalışmada belirteç olarak HSPA5 kullanılmıştır.

7. UPR'nin virion enfektivitesi üzerindeki etkisini belirlemek için TZM-bl β-gal enfektivite testi

NOT: Virion enfektivitesinde UPR'nin rolünü anlamak için, knockdown'dan elde edilen süpernatant ve Thapsigargin ile tedavi, p24 ELISA tarafından belirlenen p24 konsantrasyonuna dayalı olarak bölüm 1.2'de tarif edildiği gibi TZM-bl β-gal enfektivite testi için kullanılabilir.

  1. TZM-bl hücrelerini her numuneden eşit konsantrasyonda p24 ile enfekte edin ve β gal boyama yapın. Mavi enfekte hücreleri mikroskop altında 5 rastgele alan için 10x büyütme ile sayın.
  2. Yukarıdaki adımlardan her örnek için 5 alanın sayısının ortalamasını alın.
  3. Katlama değişikliğini aşağıda belirtildiği gibi hesaplayın:
    Katlama değişikliği = Test numunelerindeki ortalama mavi hücre sayısı/Kontrol numunesindeki ortalama mavi hücre sayısı.

Sonuçlar

Bu çalışmada, T hücrelerinde HIV-1 enfeksiyonu üzerine in vitro ER stresi ve UPR aktivasyonunu incelemek için ayrıntılı bir protokol tanımladık (Şekil 2). Bu çalışma aynı zamanda UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesinde fonksiyonel önemini analiz etmek için yöntemleri de açıklamaktadır (Şekil 3).

Bu amaçla, HIV-1 enfeksiyonunun neden olduğu ER stresini, Thioflavin T ile boyanarak hücre içindeki protein agregatlarını gözlemleyerek analiz ettik. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, ThT'nin yoğunluğu, enfekte olmamış ve enfekte olmuş hücrelerdeki protein agregatlarını temsil eder. Benzer şekilde, pozitif bir kontrol olarak, Şekil 4B , Thapsigargin ile tedavi edilen hücrelerde ThT boyamasını temsil eder. Geliştirilmiş ThT yoğunluğu, artmış ER stresi ile ilişkili olan daha fazla protein agregatının varlığını gösterir.

Ayrıca, bu gözlemi doğrulamak için, UPR belirteçlerinin analizini içeren daha geleneksel bir yöntem kullanıldı. UPR aktivasyonu başlangıçta primer efektörler -IRE1, ATF6 ve PERK'in aktivasyonu ile analiz edildi. IRE1'in aktivasyonu, Şekil 5A'da gösterildiği gibi, enfeksiyon sonrası farklı zaman noktalarında hasat edilen enfekte olmamış ve enfekte olmuş hücrelerin lizatlarının immünoblotlanması yoluyla fosfo-IRE1 seviyelerinin analiz edilmesiyle ölçüldü. pIRE1 / Total IRE1 seviyelerindeki artış, IRE1'in aktivasyonunu düşündürmektedir. Benzer şekilde, PERK aktivasyonu, enfekte olmamış ve enfekte olmuş hücrelerdeki fosfo-PERK seviyeleri ile ölçülmüştür (Şekil 5B). ATF6'nın aktivasyonu, immünoblotlama ile ATF6 P50 formunun ekspresyon seviyesi ile ölçüldü (Şekil 5C). UPR'nin bir diğer önemli belirteci, ana regülatör ve bir ER refakatçisi olan HSPA5'tir. HSPA5 seviyesi, Şekil 5D'de gösterildiği gibi immünoblotlama ile de analiz edildi. Spesifik antikorları kullanılarak sXBP1, peIF2α, ATF4, CHOP ve GADD34 gibi diğer UPR belirteçleri için de benzer bir protokol izlendi (Ek Şekil 1). XBP1 mRNA'nın eklenmesi hem kantitatif RT-PCR (Şekil 5E) hem de yarı kantitatif RT-PCR ile analiz edilebilir. Kantitatif RT-PCR, eklemeyi spesifik olarak tanımlayamadığından, yarı kantitatif RT-PCR'nin kullanıldığı uçbirleştirme testi ile eşleştirildi (Şekil 5F). Yukarıda belirtilen protokol ile qRT-PCR verilerinin yarı qRT-PCR verileri ile eşleştiğini gözlemledik. sXBP1 için gerçekleştirilen qRT-PCR'ye benzer şekilde, protokol, mRNA seviyesinde HSPA5, ATF4, CHOP ve GADD34 gibi diğer UPR belirteçlerinin analizi için kullanıldı (Ek Şekil 2)

Daha sonra, UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesindeki rolünü araştırmak için, belirli UPR belirteçlerinin bir nakavtını gerçekleştirdik: PERK ve HSPA5. Bahsedilen protokolleri kullanarak, bu belirteçlerin hem HEK-293T hücrelerinde (Şekil 6A) hem de J6 hücrelerinde (Şekil 6B) önemli bir seviyeye indirilmesini sağladık. Bu knockdown hücrelerini kullanarak, ilgili numunelerde Luc / GFP ekspresyon oranı olarak temsil edilen HIV-1 LTR güdümlü gen aktivitesinin (Şekil 6A) knockdown etkisini araştırdık. Virüs üretimi, Şekil 6B'de gösterildiği gibi süpernatantın p24 ELISA'sı ile ölçüldü. Üretilen virionların enfektivitesi, Şekil 1A'da gösterildiği gibi β-gal boyama protokolü kullanılarak da analiz edilebilir.

Ayrıca, ER stresinin kimyasal bir indükleyicisi olan Thapsigargin kullanılarak, UPR'nin aşırı uyarılmasının HIV-1 replikasyonu, virüs üretimi ve virion enfektivitesi üzerindeki etkisi incelenebilir. Verilen konsantrasyonda Thapsigargin'in sitotoksisitesi, istenen konsantrasyondaki sitotoksisitenin anlamlı olmadığını gösteren bir MTT testi (Şekil 7A) kullanılarak analiz edildi. HSPA5 için immünoblotlama, ilacın ER stresi üzerindeki etkisini analiz etmek için yapıldı (Şekil 7B). Sonuçlar, 100 nM Thapsigargin'in 12 saatlik ön tedavisinin, tüm zamanların noktalarında HSPA5 ekspresyonunu indüklediğini göstermektedir. P24 ELISA, daha önce tarif edildiği gibi analiz edilebilen, virüs üretimi ve üretilen virionların bulaşıcılığı üzerindeki etkiyi gösterir.

figure-results-1
Şekil 1: Virion enfektivitesinin ölçülmesi ve enfeksiyon ilerlemesinin analizi. (A) TZM-bl bazlı β-gal testi ile virion enfektivitesinin kantitasyonu. Virüsün enfektivitesi, TZM-bl hücrelerine 1 ng, 0.1 ng ve 0.01 ng virüs eklenerek belirlendi, ardından β gal boyama ve mavi hücre sayısı sayıldı. Büyütme: 10x. (B) Kültür süpernatantlarının p24 antijen yakalama ELISA'sına dayalı olarak 0.5 MOI HIV-1 ile enfekte CEM-GFP hücrelerinde enfeksiyon ilerlemesinin analizi. CEM-GFP hücreleri 0.5 MOI HIV-1 ile enfekte edildi ve süpernatanlar p24 ELISA için işlendi. Hata çubukları ortalama ± S.E değerleri olarak görüntülenir. Yıldız işaretleri, Student t-testi ile analiz edildiği gibi ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 ve ****=≤p 0.0001 olarak şekillerde gösterilen anlamlılık düzeyini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: HIV-1 enfeksiyonunun ER stresi ve UPR üzerindeki etkisini analiz etmek için izlenecek adımların şematik sunumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: UPR'nin HIV-1 replikasyonu, virüs üretimi ve virion enfektivitesi üzerindeki etkisini analiz etmek için izlenecek adımların akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: ThT boyama kullanılarak HIV-1 enfeksiyonuna bağlı T hücrelerinde ER stres seviyesinin analiz edilmesi. (A) CEM-GFP hücreleri 0.5 MOI HIV-1 ile enfekte edildi ve enfeksiyondan 72 saat sonra hasat edildi. Hücreler fikse edildi ve Thioflavin T ile boyandı. GFP ekspresyonu enfekte CEM-GFP hücrelerini gösterir. Grafik, enfekte olmamış ve HIV-1 ile enfekte olmuş hücreler durumunda Thioflavin T'nin yoğunluğunu göstermektedir. n = 3 biyolojik kopyadan ~ 50 hücreden elde edilen veriler grafikte sunulmaktadır. (B) CEM-GFP hücreleri 12 saat boyunca DMSO ve TG ile muamele edildi. Hücreler tespit edildi ve Thioflavin T ile boyandı. Grafik, DMSO ve TG ile tedavi edilen hücrelerde Thioflavin T'nin yoğunluğunu göstermektedir. n = 3 biyolojik kopyadan ~ 50 hücreden elde edilen veriler grafikte sunulmaktadır. Hata çubukları ortalama ± S.E değerleri olarak görüntülenir. Yıldız işaretleri, Student t-testi ile analiz edildiği gibi ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 ve **** = p ≤ 0.0001 olarak gösterilen anlamlılık düzeyini göstermektedir. BM: Enfekte olmayan; İÇİNDE: Enfekte; TG: Thapsigargin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: HIV-1 ile enfekte T hücrelerinde farklı UPR belirteçlerinin ekspresyonunun analizi. (AE) HIV-1 (0.5 MOI) ile enfekte CEM-GFP hücreleri, her 24 saatte bir 4. güne kadar hasat edildi ve aşağıda açıklandığı gibi çeşitli analizler için işlendi. (A) IRE1'in aktivasyonu, pIRE1'in immünoblotlanması ile analiz edildi. (B) PERK'in aktivasyonu, pPERK'in immünoblotlanması ile analiz edildi. (C) ATF6'nın aktivasyonu, ATF6 P50 formunun immünoblotlanması ile analiz edildi. (D) ER şaperon HSPA5'in ekspresyonu, HSPA5'in immünoblotlanması ile analiz edildi. (E) XBP1'in eklenmesi, spesifik gerçek zamanlı primerler kullanılarak sXBP1'in qRT-PCR'si ile analiz edildi. (F) XBP1'in yarı qRT-PCR ile birleştirilmesini analiz etmek için, XBP-1 mRNA, ekleme bölgesi boyunca RT-PCR kullanılarak amplifiye edildi ve bantlar görselleştirildi. Hata çubukları ortalama ± S.E değerleri olarak görüntülenir. UN: Enfekte olmamış. İÇİNDE: Enfekte. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virüs üretimi üzerindeki rolünün analizi. (A) HEK-293T hücrelerinde PERK (Sol panel) ve HSPA5 (Sağ panel) yere serildi ve HIV-1 LTR güdümlü gen aktivitesini analiz etmek için bir lusiferaz testi yapıldı. İmmünoblotlar, ilgili proteinlerin yıkım seviyelerini gösterir. (B) J6 hücrelerinde PERK (Sol panel) ve HSPA5 (Sağ panel) parçalandı ve virüs üretimini analiz etmek için toplanan süpernatan ile p24 ELISA yapıldı. İmmünoblotlar, ilgili proteinlerin yıkım seviyelerini gösterir. Hata çubukları ortalama ± S.E değerleri olarak görüntülenir. Yıldız işaretleri, Student t-testi ile analiz edildiği gibi ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 ve ****=≤p 0.0001 olarak şekillerde gösterilen anlamlılık düzeyini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Kimyasal ER stres indükleyicisi Thapsigargin'in HIV-1 enfeksiyonunun ilerlemesi üzerindeki etkisinin analizi. (A) 100 nM Thapsigargin ile tedavi üzerine CEM-GFP hücrelerinin hücre canlılığı. Hücre canlılığı MTT testi ile analiz edilir. (B) 12 saat boyunca 100 nM TG ile ön işleme tabi tutulan CEM-GFP hücreleri, 0.5 MOI HIV-1 ile enfekte edildi ve enfeksiyondan 24 saat, 48 saat ve 72 saat sonra hasat edildi. İmmünoblot, TG'nin HSPA5 ekspresyonu üzerindeki etkisini gösterirken, grafik, p24 ELISA tarafından analiz edilen virüs üretimini göstermektedir. Hata çubukları ortalama ± S.E değerleri olarak görüntülenir. Yıldız işaretleri, Student t-testi ile analiz edildiği gibi ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 ve ****= p ≤ 0.0001 olarak gösterilen anlamlılık düzeyini göstermektedir. TG: Thapsigargin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: UPR'nin çeşitli aşağı akış belirteçlerinin ekspresyonunun analizi. İmmünoblotlama ile analiz edildiği gibi (A) sXBP1, (B) eIF2α, (C) ATF4, (D) CHOP ve (E) GADD34'ün fosforilasyonu. (A-E) 0.5 MOI HIV-1 ile enfekte olmuş CEM-GFP hücreleri, enfeksiyondan 24 saat, 48 saat, 72 saat ve 96 saat sonra toplandı ve immünoblotlama için kullanıldı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: qRT-PCR ile mRNA düzeyinde farklı UPR belirteçlerinin analizi. (M.S.) 0.5 MOI HIV-1 ile enfekte olmuş CEM-GFP hücreleri, 4. güne kadar her 24 saatte bir hasat edildi ve (A) HSPA5, (B) ATF4, (C) CHOP ve (D) GADD34'ün qRT-PCR'si için kullanıldı. Hata çubukları ortalama ± S.E değerleri olarak görüntülenir. Yıldız işaretleri, Student t-testi ile analiz edildiği gibi ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 ve **** = p ≤ 0.0001 olarak gösterilen anlamlılık düzeyini göstermektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

YapmakAstar dizisi 5' ila 3'
XBP1 EKLEME DENEYİ FTTACGAGAGAAAACTCATGGCC
XBP1 EKLEME DENEYI RGGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC
EKLENMIŞ XBP1 FCTGAGTCCGAATCAGGTGCAG
EKLENMIŞ XBP1 RATCCATGGGGAGATGTTCTGG
HSPA5 FCACAGTGGTGCCTACCAAGA
HSPA5 RTGATTGTCTTTTGTCAGGGGT
ATF4 FAGTCCCTCCAACAACAGCAA
ATF4 RGAAGGTCATCTGGCATGGTT
DOĞRAYIN FCAGTGTCCCGAAGGAGAAAG
DOĞRAYIN RCAGAGCTGGAACCTGAGGAG
GADD34 FATGGACAGTGACCTTCTCGG
GADD34 RCTGGGCTCCTCCTAGGCT
AKTİN FAGAAAATCTGGCACCACACC
AKTİN RGGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

Tablo 2: RT-PCR analizi için kullanılan primerlerin listesi. F: İleri; R: Ters

shRNA YapısıAstar dizisi 5' ila 3'
PERK SH1 FCCGGCGGCAGGTCATTAGTAATTATCGAGATAATTACTAATGACCTGCCGTTTTTG
PERK SH1 RAATTCAAAAACGGCAGGTCATTAGTAATTATCGAGATAATTACTAATGACCTGCCG
PERK SH2 FCCGGGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGCTTTTTG
PERK SH2 RAATTCAAAAAGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGC
ATF6 SH1 FCCGGCCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGGTTTTTG
ATF6 SH1 RAATTCAAAAACCCAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGG
ATF6 SH2 FCCGGCCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGGTTTTTG
ATF6 SH2 RAATTCAAAAACCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGG
IRE1 SH1 FCCGGCCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGGTTTTTG
IRE1 SH1 RAATTCAAAAACCTGCTTAATGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGG
IRE1 SH2 FCCGGCCCATCAACCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTATTGGGTTTG
IRE1 SH2 RAATTCAAAAACCCATCAACCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGG
HSPA5 SH1 FCCGGGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTCTTTTTG
HSPA5 SH1 RAATTCAAAAAGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTC
HSPA5 SH2 FCCGGGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCACTTTTTG
HSPA5 SH2 RAATTCAAAAAGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCAC
LacZ FCCGGTCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGATTTTTG
LacZ RAATTCAAAAATCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGA

Tablo 3: shRNA yapılarını oluşturmak için kullanılan primerlerin listesi. F: İleri; R: Ters

Tartışma

Bu protokolün kapsamı şunları içerir: (i) HIV-1 virüs stoklarının işlenmesi ve virüs konsantrasyonunun ve virion enfektivitesinin ölçülmesi, (ii) T-hücrelerinin HIV-1 ile enfeksiyonu ve bunun ER stresi ve farklı UPR belirteçleri üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi, (iii) UPR belirteçlerinin yıkılmasının etkisi ve bunların HIV-1 LTR güdümlü gen aktivitesi üzerindeki etkisi, virüs üretimi ve virion enfektivitesi ve (iv) Farmakolojik molekül kullanarak UPR'nin aşırı uyarılması ve HIV-1 replikasyonu üzerindeki etkisinin analiz edilmesi. Mevcut protokol setini kullanarak, HIV-1 ve UPR'nin etkileşimi hakkında kapsamlı bilgi elde edilebilir. Bu çalışmada listelenen protokollerin gerçekleştirilmesi kolay, uygun maliyetli ve son derece güvenilirdir.

UPR strese duyarlı bir sinyal yolu olduğundan, bunun üzerinde çalışmak oldukça hassas adımlar içerir. Tüm deneyler için, sonuçlarda tutarlılık elde etmek için uzun geçişli hücrelerden kaçınmanızı öneririz. Bakteri ve maya kontaminasyonlarını önlemek için tüm hücre kültürü tekniklerinde steril koşulların korunması da önemlidir, çünkü bunlar deneyleri ve ilgili sonuçları engelleyebilir. Ayrıca, sonraki yetiştiricilikleri de dahil olmak üzere deneyler sırasında hücreleri tutarken, sert veya uzun süreli sıcaklık değişikliklerini önleyin ve hücrelerin başlangıçta sağlıklı ve stressiz olduğundan emin olun. Aksi takdirde, değişiklikler hücrelerde ek strese neden olabilir ve bu da sonuçları değiştirebilir. UPR hassas bir sinyalleşme yolu olduğundan ve zaman noktalarındaki küçük bir değişiklik sonuçları değiştirebileceğinden, zaman noktalarını mümkün olduğunca sabit tutmaya çalışın.

Protein agregatlarını tespit eden ve ER stresini belirlemek için kullanılan ThT boyama yöntemi22, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerdeki ER stres seviyelerini çok net bir şekilde göstermektedir. ThT boyama, ER stresi ile ilişkili olan protein agregatlarının tespitine dayanır. Bununla birlikte, bireysel UPR sinyal yolları, protein agregatlarının katılımı olmadan doğrudan aktive edilebildiğinden, UPR aktivasyonunun her zaman protein agregatları ile ilişkilendirilemeyeceğine dikkat edilmelidir. Bu nedenle, bu ThT boyama yöntemi, ER stres seviyeleri hakkında bir fikir verse de, UPR aktivasyonunun derinlemesine analizi için, her zaman UPR belirteçlerinin daha fazla analizi ile doğrulanmalıdır. Ayrıca, ThT boyamanın hücre altı lokalizasyonunu daha fazla tanımlamak için, ER'nin işaretlenmesi durumunda KDEL gibi belirteçler kullanılabilir. Ayrıca, birçok durumda, ER stresi hücre boyutunda ve şeklinde bir değişikliğe neden olur, bu nedenle ThT yoğunluğunu ölçerken hücre alanı da dikkate alınabilir. Son derece hassas, güvenilir ve uygun maliyetli ticari gene özgü antikorların mevcudiyeti, hücrelerdeki protein seviyelerinin daha kolay analiz edilmesini sağlayarak yaşam bilimleri alanının birçok alanında devrim yaratmıştır. Ayrıca, günümüzde, lekeler üzerindeki protein bantlarını görselleştirmek ve miktar tayinini hızlı ve daha kolay hale getirmek için son derece hassas ekipman türleri mevcuttur. Böylece, UPR belirteçlerinin aktivasyonu, immünoblotlama ile kolayca analiz edilebilir. Bununla birlikte, UPR işaretleyici proteinlerinin ekspresyonu nispeten düşük olduğundan, ekspresyonlarını analiz etmek için önemli bir protein konsantrasyonu kullanılması gerekir. Ayrıca, birincil antikorların seyreltilmesi, spesifik olmayan bağlanmayı ve lekelerdeki arka plan gürültüsünü önlemek için kullanılan hücrelerdeki protein ekspresyonuna dayalı olarak uygun şekilde optimize edilmelidir. Ayrıca, gösterildiği gibi Şekil 4C, ATF6 antikoru poliklonaldir ve bir dizi spesifik olmayan bant verir. Bu spesifik olmayan bantları bir dereceye kadar azaltmak için yıkama ve antikor konsantrasyonunun uygun optimizasyonu gereklidir. Lekeler, arka planı ve spesifik olmayan bantları azaltmak için bloke edici solüsyon, birincil antikor ve ikincil antikor içinde inkübattan sonra uygun şekilde yıkanmalıdır. Lekeler geliştirilirken, elde edilen sonuçlarda desenin uygun şekilde görselleştirilmesini sağlamak için bantların aşırı doygunluğundan kaçınılmalıdır. Bu yöntem makalesinin genel odağına baktığımızda, genel immünoblotlama teknikleri için ayrıntılı yöntemlere ve sorun gidermeye odaklanmadık; bununla birlikte, Mahmood ve Yang'ın yöntem makalelerine başvurulabilir33 yanı sıra Ghosh ve ark.34 aynı şekilde. Günümüzde RT-PCR çok yaygın olarak kullanılan bir yöntem olduğundan, kolayca bulunabilen primerler ve RT-PCR makineleri, belirli UPR belirteçlerini analiz etmek için veri sağlar. Bununla birlikte, RNA ve cDNA'yı RT-PCR için hazırlarken önlemler alınmalıdır, çünkü bu çok hassas bir yöntemdir ve numunelerin ve pipetlemenin kalitesindeki küçük farklılıklar okumada büyük farklılıklara yol açabilir. Herhangi bir DNA veya protein kontaminasyonu RNA örneklerinden uzaklaştırılmalıdır. Ayrıca, pipetleme hatasının azaltılabilmesi için numuneleri qRT-PCR için her zaman üç nüsha halinde alın. qRT-PCR için kullanılan DNA'nın konsantrasyonu, 30'un üzerindeki herhangi bir şeyin ideal olmadığı kabul edildiğinden, her numune için CT değeri 30'un altında olacak şekilde optimize edilmelidir. Herhangi bir yanlış pozitif okumayı önlemek için qRT-PCR için her zaman negatif bir kontrol tutulmalıdır. XBP1'in eklenmesi hem qRT-PCR hem de yarı qRT-PCR ile analiz edilebilir. qRT-PCR, birleştirmeyi doğru bir şekilde göstermeyeceğinden, verileri doğrulamak ve nispi eklenmiş XBP1 ila eklenmemiş XBP1 oranını belirlemek için her zaman qRT-PCR'den ayrı olarak yarı qRT-PCR yapılmalıdır. Eklenmiş ve eklenmemiş XBP1'in boyutu arasındaki fark sadece 26 nt olduğundan, jeli çözmek için daha yüksek bir agaroz jel yüzdesi kullanılmalıdır. Ayrıca, daha iyi ayrılma için bantlar düşük voltajda ve daha uzun süre çözülmelidir. XBP1'in eklenmesini gözlemlemek için günümüzde daha popüler olan bir başka yöntem, Pst1 cDNA'nın enzim sindirimini kısıtlama ve XBP1 eklemesinin daha iyi görselleştirilmesini sağlar35. Bu yöntem, HIV-1 ile enfekte olmuş örneklerde XBP1'in eklenmesini görselleştirmek için de kullanılabilir. İmmünoblotlama ve RT-PCR'den elde edilen sonuçlar, ThT boyama sonuçlarını doğrulamak için kullanılabilir.

Şekil 5'te gösterilen temsili sonuçlar, HIV-1 enfeksiyonu üzerine UPR aktivasyonunun, Şekil 4'te gösterilen gelişmiş ThT boyaması ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, UPR'yi analiz etmek için immünoblotlama ve RT-PCR kullanımının sınırlamaları, titiz olmaları ve bireysel UPR genlerinin ER olmayan stres faktörleri tarafından bağımsız olarak değiştirilebilmesinden birden fazla gen ürününün izlenmesi gerektiğidir. Ayrıca, bu yöntemler, farklı UPR belirteçlerine bakarak dolaylı olarak ER stresini ölçer. Bu nedenle, ThT boyaması ve immünoblotlama ve RT-PCR ile UPR belirteçlerinin analizi, HIV-1 enfeksiyonunun T hücrelerinde ER stresi ve UPR aktivasyonu üzerindeki etkisini analiz etmek için birlikte kullanılabilir.

Bu makalenin ikinci kısmı, UPR'nin HIV-1 replikasyonu üzerindeki etkisinin anlaşılmasında yer alan protokollerle ilgilidir. Bu makalede açıklanan UPR belirteçlerinin knockdown için kullanılan ters transfeksiyon yönteminin, UPR belirteçlerinin ekspresyonunda önemli bir azalma sağladığı bulunmuştur. Protokolde belirtildiği gibi, lusiferaz testi için lusiferaz okumasını normalleştirmek için GFP floresansı kullanıldı. Bununla birlikte, birçok durumda, spesifik gen transfeksiyonu nedeniyle GFP okuması da etkilenebilir36, bu durumda, lusiferaz okumasını normalleştirmek için RFP, YFP veya toplam protein konsantrasyonu gibi diğer floresan belirteçler kullanılabilir. Ayrıca, TZM-bl hücreleri gibi hücrelerin parçalanmasının zor olduğu bazı durumlarda, lusiferaz substratı eklenmeden önce ek lizis reaktifi eklenebilir. Sonuçlarda gösterildiği gibi, lusiferaz sonuçları (Şekil 6A Sol panel), PERK durumunda p24 ELISA sonuçlarıyla eşleşir (Şekil 6B Sol panel), burada PERK knockdown, HIV-1 gen aktivitesini ve virüs üretimini önemli ölçüde azaltır. HSPA5 söz konusu olduğunda, HSPA5'in yıkılması LTR güdümlü gen aktivitesini etkilemez (Şekil 6A Sağ panel) lusiferaz tahlil sonuçlarına göre, p24 ELISA'ya göre virüs üretimini etkilerken (Şekil 6B Sağ panel). Bu şekilde, bu sonuçlar, farklı UPR belirteçlerinin HIV-1 LTR güdümlü gen aktivitesi ve virüs üretimi üzerinde farklı etkilere sahip olabileceğini düşündürmektedir. ELISA tarafından süpernatantta ölçülen p24 antijeni, esas olarak kültür süpernatanında salınan virüs partiküllerinin konsantrasyonunun göstergesidir. Bu nedenle, rutin olarak, araştırmacılar p24 antijen yakalama ELISA sonuçlarını, hücre süpernatanında virüs üretiminin dolaylı bir göstergesi olarak kullandılar37. Bu nedenle, hücrelerdeki lusiferaz testi ve süpernatantın p24 ELISA'sı, HIV-1 LTR güdümlü gen aktivitesi ve virüs üretimi üzerindeki etkiyi belirlemek için birlikte kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol, gene özgü shRNA'ları kullanarak diğer UPR belirteçlerinin HIV-1 LTR güdümlü gen aktivitesi ve virüs üretimi üzerindeki etkisini analiz etmek için kullanılabilir. P24 ELISA ve lusiferaz testinin okunmasını içeren tüm bu deneyler için, uygun seyreltmelerin ve inkübasyon süresinin korunduğundan emin olmak önemlidir ve aykırı değer kategorisine giren değerler dikkate alınmamalıdır. Örneğin, p24 ELISA yaparken, bir OD450 0.1-2 arasındaki değer ideal olarak kabul edilir. UPR'nin HIV-1 replikasyonundaki rolünü araştırmak için ikinci yaklaşım, bir ER stres indükleyicisi olan Thapsigargin veya bir ER stres inhibitörü olan TUDCA gibi farmakolojik moleküllerin kullanılmasıdır. Bu ilaçlar, çeşitli bağlamlarda UPR'yi incelemek için çok yaygın olarak kullanılmaktadır38,39,40,41. Bu yazıda, Thapsigargin tedavisi için protokolü gösterdik ve T hücrelerinde HIV-1 enfeksiyonunun ilerlemesi üzerindeki etkisini analiz ettik. İlacı herhangi bir deney için kullanmadan önce, kullanılacak hücre hattındaki ilaç için bir dizi doz için hücre canlılığının test edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Verilen hücre hattında ~% 80'den daha az hücre canlılığı veren konsantrasyondan kaçınılmalıdır. Ayrıca, hücre canlılığı deneyleri için, zaten stresli olan hücreler uygun okumayı göstermeyeceğinden ve hücre kalıntıları bulanıklık yaratabileceğinden ve yanlış okumalar verebileceğinden, sağlıklı hücreler her zaman alınmalıdır. Bu çalışmada bahsedilen protokol, Thapsigargin'in enfeksiyondan sonraki 72 saat boyunca viral replikasyon üzerindeki etkisini göstermektedir, bu da ilacın bir zaman boyunca viral replikasyon üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasını sağlar. İlacın viral replikasyon üzerindeki etkisini göstermeye başladığı en erken zaman noktasını daha fazla analiz etmek için enfeksiyondan sonra 12 saat, 24 saat, 36 saat, 48 saat, 60 saat ve 72 saat gibi daha kısa zaman aralıkları da alınabilir.

UPR aynı zamanda protein yıkımı ve membran dinamiği42,43 ile de ilgili olduğundan, UPR'nin virionların enfektivitesinde rol oynaması mümkündür. Hücreler tarafından üretilen virionların enfektivitesi de verilen protokol kullanılarak analiz edilebilir. Yukarıda belirtilen protokoller, HIV-1 enfeksiyonunun ER stresi ve UPR üzerindeki etkisini ve biyolojik olarak daha ilgili çalışmalar için insan PBMC'lerindeki işlevsel önemini belirlemek için de kullanılabilir. ER-UPR'nin HIV-1 enfeksiyonundaki işlevini anlamak, çok sayıda ciddi hastalığın gelişiminde rol oynadığına dair artan farkındalık nedeniyle çok önemlidir. Bu yöntemler kullanılarak elde edilen bilgiler, HIV-1 ve UPR arasındaki etkileşimin önemli bir anlayışını sunarak bu keşfedilmemiş alana katkıda bulunacaktır.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Hindistan Hükümeti Ulusal Hücre Bilimi Merkezi, Biyoteknoloji Bölümü'ne okul içi desteği için teşekkür ederiz. AT ve AD, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü, Ulusal Hücre Bilimi Merkezi'nden alınan doktora araştırma desteği için minnettardır. DM, Hindistan Hükümeti SERB'den JC Bose Ulusal Bursu için müteşekkirdir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AkrilamamidBiorad, ABD1610107
AgaroseG-Biosciences, ABDRC1013
Amonyum persülfatSigma-Aldrich, ABDA3678
anti-ATF4 antikoruHücre Sinyal Teknolojisi, ABD11815Western blot tespiti Seyreltme-1:1000
anti-ATF6 antikoruAbcam, İngiltereab122897Western blot tespiti Seyreltme-1:1000
anti-CHOP antikoruHücre Sinyalleme Teknolojisi, ABD2897Western blot tespiti Seyreltme-1:1000
anti-eIF2&alfa; antikorSanta Cruz Biyoteknoloji, ABDsc-11386Western leke tespiti Seyreltme-1:2000 
anti-GADD34 antikoruAbcam, İngiltereab236516Western blot tespiti Seyreltme-1:1000
anti-GAPDH antikoruSanta Cruz Biotechnology, ABDsc-32233Western blot tespiti Seyreltme-1:3000 
anti-HSPA5 antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi, ABD3177Western blot tespiti Seyreltme-1:1000
anti-IRE1 antikorHücre Sinyal Teknolojisi, ABD3294Western blot algılama Seyreltme-1:2000
Anti-fare HRP konjuge antikoru Biorad, ABD1706516Western blot tespiti Seyreltme- 1:4000
anti-peIF2 & alfa; antikorInvitrogen, ABD44-728GWestern blot tespiti Seyreltme-1:1000
anti-PERK antikoruHücre Sinyal Teknolojisi, ABD5683Western blot tespiti Seyreltme-1:2000
anti-pIRE1 antikoruAbcam, İngiltereab243665Western blot tespiti Seyreltme-1:1000
anti-pPERK antikoruInvitrogen, ABDPA5-40294Western blot tespiti Seyreltme-1:2000
Anti-tavşan HRP konjuge antikoruBiorad, ABD1706515Western blot tespiti Seyreltme - 1:4000
anti-XBP1 antikoruAbcam, İngiltereab37152Western blot tespiti Seyreltme-1:1000
Tezgah üstü yüksek hızlı santrifüjEppendorf, ABD5804RRotor- F-45-30-11
Tezgah üstü düşük hızlı santrifüjEppendorf, ABD5702RRotor- A-4-38
Bis-AkrilamidBiorad, ABD1610201
Sığır Serum Albümini (BSA)MP biyomedikal, ABD160069
Bradford reaktifiBiorad, ABD5000006
CalPhos memeli Transfeksiyon kitiClontech, Takara Bio, ABD631312Virüs stoğu hazırlık
CEM-GFPNIH, AIDS Deposu, ABD3655
Clarity ECL substratBiorad, ABD1705061kemilüminesans tespit substratı
Clarity max ECL substratBiorad, ABD1705062kemilüminesans tespit substratı
Konfokal lazer tarama mikroskobuOlympus, JaponyaModel: FV3000
Cytospin santrifüjThermo Fisher Scientific, ABDASHA78300003
DMEMInvitrogen, ABD11995073
DMSOSigma-Aldrich, ABDD2650
dNTP'lerPromega, ABDU1515
DTTInvitrogen, ABDR0861
EDTAInvitrogen, ABD12635
EtBrInvitrogen,ABD'15585011
Fetal Sığır SerumuInvitrogen, ABD16000044
G418Invitrogen, ABD11811023
Glutaraldehit %25Sigma-Aldrich, ABDG6257Enfektivite testi
GlisinThermo Fisher Scientific, ABDQ24755
HEK-293TNCCS, Hindistan
HIV-1 bulaşıcı Moleküler Klon pNL4-3NIH, AIDS Deposu, ABD114
Ters mikroskopNikon, JaponyaModel: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, ABD1715124
Jurkat J6NCCS, Hindistan
Magnezyum klorürSigma-Aldrich, ABDM8266Enfektivite deney
MMLV-RT Invitrogen, ABD28025013
MTT reaktifiSigma-Aldrich, ABDM5655Hücre canlılığı deneyi
N, N-dimetil formamidFluka Chemika40255Enfektivite testi
NaClThermo Fisher Scientific, ABDQ27605
NaFSigma-Aldrich, ABD201154
NP40Invitrogen, ABD85124
P24 antijen yakalama ELISA kitiABL, ABD5421
PageRuler önceden boyanmış protein merdiveniBilimkurgu Biyolojik, HindistanPGPMT078
ParaformaldehitSigma-Aldrich, ABDP6148
pEGFP-N1Clontech, ABD632515
Penisilin / StreptomisinInvitrogen, ABD151140122
Fosfataz İnhibitörüSigma-Aldrich, ABD4906837001
Phusion GC tamponlu yüksek kaliteli PCR mastermixNEB, ABDM05532
pLKO.1-TRCAddgene, ABD10878Lentiviral klonlama vektörü
pMD2.GAddgene, ABD12259VSV-G zarf vektörü
PMSFSigma-Aldrich, ABDP7626
Polietilenimin (PEI) Polysciences, Inc., ABD23966
Potasyum ferrisiyanürSigma-Aldrich, ABD244023Enfektivite deneyi
Potasyum ferrosiyanürSigma-Aldrich, ABDP3289Enfektivite deneyi
Proteaz İnhibitörüSigma-Aldrich, ABD 
psPAX2Addgene, ABD12260Lentiviral ambalaj plazmid
PuromycinSigma-Aldrich, ABDP8833Kararlı hücrelerin seçimi
PVDF membranBiorad, ABD1620177
Rastgele primerlerInvitrogen, ABD48190011
RPMI 1640Invitrogen, ABD22400105
SDSSigma-Aldrich, ABDL3771
Steady-Glo substratPromega, ABDE2510Lusiferaz testi
T4 DNA ligazInvitrogen, ABD15224017
TEMEDInvitrogen, ABD17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, ABDT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, ABD596200
TrisThermo Fisher Scientific, ABDQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, ABDT8787
TrizolInvitrogen, ABD15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, ABDP1379
TZM-blNIH, AIDS Deposu, ABD8129
UltrasantrifüjBeckman Optima L90K, ABD330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, ABD15520-018Enfektivite testi
, 5056489001

Kaynaklar

  1. Levy, J. A. HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , ASM Press. (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307(2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855(1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374(2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4(2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536(2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156(2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

T H cre EnfeksiyonuThioflavin T BoyamaUPR MarkerlarmmunoblottingRT PCRLusiferaz Raporlay c DeneyiP24 ELISA
HIV-1 ile Enfekte T Hücrelerinde Endoplazmik Retikulum Stresi ve Katlanmamış Protein Yanıtının Ölçülmesi ve HIV-1 Replikasyonundaki Rolünün İncelenmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.