Bu makale, bir 6X-histidin etiketi ile etiketlenmiş bir insan rekombinant proteini olan flep endonükleaz 1'in (FEN1) afinite saflaştırılması için bir prosedür sağlar. Protokol, etiketli proteinin saflaştırılması için iki farklı hareketsizleştirilmiş metal iyon kolonunun kullanılmasını içerir.
Yöntem makalesi
Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması
Bu makalede
Özet
Özet
Proteinlerin fonksiyonel karakterizasyonu, biyokimyasal analizler yapmak için bunların yüksek saflıkta önemli miktarlarda ifade edilmesini ve saflaştırılmasını gerektirir. Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC) sistemi, karmaşık protein karışımlarının yüksek çözünürlükte ayrılmasını sağlar. FPLC'de uygun saflaştırma matrisinin seçilmesi, protein numunesinin sıcaklığının düzenlenmesi ve numunenin matris üzerindeki akış hızının ve elüsyon hızının yönetilmesi gibi çeşitli parametreleri ayarlayarak, proteinin stabilitesini ve işlevselliğini sağlamak mümkündür. Bu protokolde, bakteri kültürlerinde üretilen 6X-His etiketli flep endonükleaz 1 (FEN1) proteinini saflaştırmak için FPLC sisteminin çok yönlülüğünü göstereceğiz. Protein saflaştırma verimliliğini artırmak için, uygun kolon paketleme ve hazırlama, bir numune döngüsü kullanarak numune enjeksiyonu, numune uygulamasının kolona akış hızı ve numune elüsyon parametreleri dahil olmak üzere birçok hususa odaklanacağız. Son olarak, kromatogram, yüksek protein verimi içeren fraksiyonları ve uygun rekombinant proteinin uzun süreli depolanması için hususları belirlemek için analiz edilecektir. Protein saflaştırma yöntemlerinin optimize edilmesi, protein analizinin hassasiyetini ve güvenilirliğini artırmak için çok önemlidir.
Giriş
Hücresel biyolojiyi anlamak için çok sayıda strateji mevcuttur. Bir yaklaşım, genetik mutasyonların bir gene sokulduğu ve ardından bir model organizmada ortaya çıkan fenotipik değişikliklerin değerlendirilmesinin izlediği yukarıdan aşağıya bir stratejiyi içerir. Tersine, indirgemeci bir yaklaşım, belirli bir proteinin moleküler mekanizmalarının ve enzimatik fonksiyonlarının, diğer hücresel bileşenlerle etkileşimlerinin karakterizasyonu ile birlikte ilk açıklanmasını gerektirir. Daha sonra, bu proteinin biyolojik bir yol üzerindeki etkisi değerlendirilir. Her araştırma yaklaşımının kendine özgü avantajları ve sınırlamaları olmasına rağmen, biyolojik bir yolun kapsamlı bir şekilde anlaşılması, disiplinler arası araştırmaları gerektirir.
DNA'nın yaşamın genetik planı olmasıyla, DNA kopyalanması ve genom bakımı mekanizmalarını anlamak, yetmiş yılı aşkın bir süredir aktif bir ilgi alanı olmuştur. DNA replikasyonu alanındaki çalışmalar, çok sayıda replikasyon proteininin bireysel yapıları ve işlevleri hakkında bol miktarda veri sağlamıştır. Mekanik yönleri ve biyokimyasal aktivite testlerini kapsayan bu araştırmalar, bu proteinlerin saflaştırılması yoluyla mümkün hale getirilmiş ve in vitro ortamda titiz bir şekilde incelenmelerini sağlamıştır. Sonuç olarak, protein saflaştırması, DNA replikasyonuna ilişkin mekanik içgörüleri çözmeye yönelik araştırma çabalarının çoğunda vazgeçilmez ve her yerde bulunan bir teknik olarak ortaya çıkmaktadır.
Bu makale, bakteri hücrelerinde aşırı eksprese edilmiş 6X-histidin ile etiketlenmiş bir DNA replikasyon proteinini izole etmek için bir metodoloji sunmaktadır. İlgilenilen protein, gecikmeli iplik replikasyonunda çok önemli bir rol oynayan ve aynı zamanda baz eksizyon onarımı (BER) gibi DNA onarım yollarında kritik bir katılımcı olan yapıya özgü bir nükleaz olan insan flep endonükleaz 1'dir (FEN1)1,2,3. FEN1'in birincil işlevi, DNA replikasyonu veya BER sırasında ortaya çıkan bir ara ürün olan 5' yer değiştirmiş bir flep yapısının tabanında parçalanmaktır. Başlangıçta, FEN1'in enzimatik aktivitesini değerlendiren biyokimyasal araştırmalar, nükleazın bir flep yapısının serbest 5'-fosfat ucunu tanıyacağı ve daha sonra onu parçalamadan önce flebitabanına kadar takip edeceği bir "izleme" mekanizması önerdi 4. Daha sonraki araştırmalar, FEN1'in bir "diş açma" mekanizması ile çalıştığını, burada önce kanadın tabanına bağlandığını ve daha sonra serbest 5' ucunu bölünmeden önce aktif bölgesinden geçirdiğini ortaya koydu (Şekil 1)5. Rekombinant FEN1'i aşırı eksprese etme ve izole etme yeteneği, bu atılımları kolaylaştırmış ve araştırmacıların onu biyokimyasal ve yapısal araştırmalarda kullanmalarını sağlamıştır.
Afinite kromatografisi, DNA'yı saflaştırmak için yaygın olarak kullanılan bir ayırma yöntemidir. Bu teknik, ilgilenilen proteini spesifik olarak yakalamak için hedef proteinlerin bir reçine üzerinde hareketsiz hale getirilmiş ligandlara doğru tersinir bağlanma afinitesini kullanır. En yaygın olarak kullanılan biyo-afinitelerden biri, amino asit, histidin ve nikel ve kobalt gibi metal iyonları arasındaki sağlam etkileşimdir ve bu nedenle Ni2+ veya Co2+ ile yüklü bir reçine üzerine yakalanabilir.
6-9 histidin kalıntısından (His) oluşan bir diziyi kodlayan DNA dizisi, sıklıkla ilgilenilen proteini (N-terminalinde veya C-terminalinde) kodlayan plazmit yapısına dahil edilir ve proteini bir 6X-His-etiketi veya bir poli-His etiketi ile etiketler. His etiketli protein daha sonra, reçine üzerindeki metal iyonlarının daha sonra uygun elüsyon ajanları kullanılarak ayrıştırılabilen bir afinite etiketi ile proteinleri yakaladığı bir afinite kromatografisinin bir alt türü olan hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisi (IMAC) ile kolayca saflaştırılabilir. Ni2+ ve Co2+ gibi geçiş metali iyonları, N, N, N'-tris- (karboksimetil) -etilendiamin veya nitrilotriasetik asit (NTA) gruplarından6' türetilen agaroz veya silika jel matrisleri üzerine immobilize edilebilir.
Metal ligandların fiziksel, kimyasal ve biyolojik faktörlerle bozulmaya karşı dayanıklı oldukları bilinmektedir ve bu avantajı diğer ligand türlerine göre 6,7 tutarlar. Ek olarak, His-tag nispeten küçük bir etikettir ve protein yapısını veya işlevini önemli ölçüde etkilemez7. Bununla birlikte, bir bakteri ekspresyon sisteminde, kromozomal olarak eksprese edilen birçok protein, metal iyonlarına karşı bir afiniteye sahiptir ve hedef protein ile birlikte saflaştırılabilir. Nikel ve kobalt, IMAC matrislerinde kullanılan tipik metal iyonlarıdır. Ni-NTA reçinesi ve TALON kobalt bazlı reçine, His etiketli proteinlerin saflaştırılması için yaygın olarak kullanılır.
Ni-NTA, TALON'a karşı
Hem Ni-NTA hem de TALON'un ilgili metal iyonları, NTA ligandları aracılığıyla reçine üzerinde hareketsiz hale getirilir. Ni-NTA'nın 100 mg / mL'ye kadar protein bağlayan daha yüksek bir bağlanma kapasitesine sahip olduğu düşünülmektedir. Bu, kirletici proteinlerin birlikte saflaştırılabileceği uyarısı ile daha yüksek bir protein verimi ile sonuçlanabilir. Buna karşılık, reçine, His etiketli proteinlere karşı daha yüksek bir bağlanma özgüllüğüne sahiptir ve daha yüksek saflıkta fraksiyonlar üretebilir. Bu çalışmada, referans alınan otomatik hızlı protein sıvı kromatografi sistemi olan NGC sistemini kullanarak her iki reçinenin saflaştırma verimliliğini karşılaştırmayı amaçlıyoruz (Malzeme Tablosuna bakınız).
Tamponlar ve uyumluluk
Hücre parçalanması, numune hazırlama, reçine dengesi ve yakalanan proteinin reçineden elüsyonu için protein saflaştırması sırasında tamponlar gereklidir. 100 mM konsantrasyona kadar Tris, MOPS ve HEPES tamponları, Ni-NTA reçinesi için bilinen uyumlu tamponlardır. Tamponlar genellikle proteinin oksidasyonunu ve protein agregasyonunu önlemek için indirgeyici maddeler içerir. Bununla birlikte, bir eşik sınırının üzerinde, indirgeyici maddeler reçineyi metal iyonlarından sıyırabilir. Yukarıda belirtilen nikel ve kobalt bazlı reçineler için beta-merkaptoetanol (BME) veya ditiyotreitol (DTT) gibi indirgeyici ajanların önerilen konsantrasyonu 1 mM'nin altındadır.
hFEN1'in saflaştırılması için tamponlar, NaCl, BME, fenilmetilsülfonil florür (PMSF), EDTA ve gliserol içeren Tris tamponlarıdır. NaCl, proteini çözünür formda tutar ve DNA bağlanması gibi moleküler etkileşimleri bozar. BME, oksitlenmiş proteinleri azaltır ve böylece protein agregasyonunu önler. PMSF), hedef proteinin proteaz aracılı bozunmasını önleyen bir proteaz inhibitörüdür. EDTA, numunedeki iki değerlikli katyonları ortadan kaldırarak nükleazlara ve proteazlara erişimlerini engeller. Gliserol, proteinin sulu formdaki stabilitesini arttırır. Ek olarak, lizis tamponu, hücre lizizi sırasında hedef proteinin bozulan proteazlardan maksimum korumasını sağlamak için tam proteaz inhibitör tabletleri içerir. Dengeleme ve elüsyon tamponları imidazol içerir, elüsyon tamponu, imidazolün elüsyon sırasında bağlı proteini reçineden uzaklaştırması için daha yüksek miktarlar içerir.
Yeni Nesil Kromatografi (NGC) sistemi
Hızlı akışlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) için tasarlanan bu otomatik, orta basınçlı kromatografi sistemi, iki farklı tamponu aynı anda pompalamak için iki pompa kullanır ve 250 μL'den 100 mL'ye kadar çok çeşitli numune hacimlerini enjekte edebilir. Numune döngüsü (bu sistemde Dynaloop olarak bilinir), daha büyük numune hacimlerinin enjekte edilmesini mümkün kılar. Sistem, özelleştirilmiş yöntem oluşturmayı, saflaştırma çalışmalarının manipülasyonunu ve UV tepe noktalarının ve protein fraksiyonlarının analizini kolaylaştıran Chromlab yazılımı kullanılarak çalıştırılabilir.
Protokol
1. Numune hazırlama
- Rekombinant FEN1'i saflaştırmak için, daha önce Ononye ve ark.8 tarafından tarif edildiği gibi BL21 (DE3) hücrelerindeki yapıyı (pET-FCH-FEN1) eksprese edin.
- LB ortamını (Tablo 1) gece boyunca% 1 kültür ile aşılayın ve hücreleri OD 0.6'ya ulaşana kadar 37 ° C'de büyütün.
- 0.4 M izopropil-beta-D-tiyogalaktozit (IPTG) ile indükleyin ve kültürü 3 saat daha büyütün.
- Kültürü 5.000 × g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyerek hücreleri hasat edin. Peleti -80°C'lik bir dondurucuda saklayın.
- Saflaştırma gününde, hücre peletini -80 °C dondurucudan çıkarın, buz üzerinde çözülmesine izin verin ve peleti 100 mL lizis tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 1).
NOT: Proteolizi önlemek için hücre lizatı, kullanım sırasında her zaman buzun üzerine yerleştirilmelidir. Çözüldükten sonra, tüm saflaştırma işlemi aynı gün içinde tamamlanmalıdır. Hücre lizatı gece boyunca buzdolabında saklanmamalıdır.
- Süspansiyonu 250 mL'lik bir behere aktarın ve 15 dakika boyunca% 35 genlikte 30 s AÇIK ve 30 s KAPALI ile buz üzerinde sonikat yapın.
NOT: Genliği belirlemek için üreticinin ayarlarına bakın. - Sonikasyonlu numuneyi bir santrifüj tüpüne aktarın ve net bir lizat elde etmek için 4 ° C'de 30 dakika boyunca 27.000 × g'da döndürün. Hücre lizatını, numune enjeksiyonuna kadar 4 ° C'lik buzdolabında buz üzerine yerleştirin.
2. Yakınlık sütunlarının hazırlanması
- Sütunları (biri Ni-NTA reçinesi ve diğeri kobalt bazlı reçine için), sütunların herhangi bir eğilmesini önleyerek, sütunların mümkün olduğunca düz tutulacağı şekilde bir kelepçe standına yerleştirin. Kolonların alt kısmının bir tıpa ile tıkandığından emin olun ve kolon paketleme sırasında hava kabarcıklarını önlemek için her kolonun altına 1-2 mL başlangıç tamponu ekleyin.
- Reçine şişelerini reçine tamamen yeniden süspanse olana kadar hafifçe çalkalayın. Sütunların üstünü açın ve hava kabarcıklarının dahil olmasını önlemek için her bir bulamacın 10 mL'sini sürekli olarak dökün. Kolonda hava kabarcıklarını önlemek için reçineyi kolonun kenarında tutulan metal bir spatula veya cam çubuğa dökün.
3. Bir akış adaptörü kullanarak kolon paketleme
- Durdurucuyu kolondan çıkarın ve alt kısmı borunun bir ucuna bağlayın. Borunun diğer ucunu FPLC sisteminin UV bağlantı noktasına bağlayın.
- Yatak destek muhafazasının akış adaptörü gövdesine çekildiğinden emin olun ve akış adaptörü gövdesini kolonun üstüne kaydırın (Şekil 2A). Kam mandalı 1 konumundayken, arabelleğe sokmamaya dikkat ederek akış adaptörünü indirin (Şekil 2B). Kam mandalını 2 konumuna getirin (Şekil 2B). Boruyu sisteme bağlayın ve borudaki havayı boşaltmak ve paketleme sırasında hava kabarcıklarını önlemek için 1-2 dakika boyunca başlangıç tamponunun akışını başlatın.
- Mandalı tekrar 1 konumuna getirin ve hava kabarcıklarının dahil olmasını önleyerek akış adaptörünü tek bir yumuşak hareketle tampona indirin ve mandalı tekrar 2 konumuna getirin. Bu, bir miktar tamponun akış adaptörüne girmesine izin verir ve kalan kabarcıkları giderir.
- Mandalı 3 konumuna getirin ve kam tabanını ve kilitleme halkasını sıkın (Şekil 2B).
- Sütunu paketlemek için tampon akışını 10 mL / dk'da başlatın. Bu adıma 3 dakika boyunca veya reçine iyice paketlenene kadar devam edin.
4. FPLC sisteminin örnek döngüsünün hazırlanması
- S'nin üst kısmından gelen boruyu s'ye bağlayın.ampl döngüsü FPLC sistemindeki Döngü E'ye (Şekil 3).
- S'nin altındaki boruyu s'ye bağlayınample FPLC sistemindeki Atık 2'ye döngü.
- Borunun bir ucunu FPLC sisteminin sütun portuna yerleştirin ve diğer ucunu atık şişesine yerleştirin.
- Hortumu A pompasından filtrelenmiş çift damıtılmış suya (ddH2O) yerleştirin.
- Yazılımı kullanarak pompa ayarlarına çift tıklayın (Şekil 4A, etiketli 2) ve sistem pompası enjeksiyon döngüsünü seçin (Şekil 4C).
- Akış hızı ayarlarına tıklayın (Şekil 4A, etiketli 1) ve akış hızını 10 mL/dk olarak değiştirin. %B kutusuna %0 girin (Şekil 4B).
- Numune halkasını suyla yıkamak için akışı başlatın, bu da kayar contayı aşağı doğru itecektir.
- Kayar conta numune döngüsünün altına ulaştığında akışı durdurun. Pompa A'yı ddH2O'dan başlangıç tamponuna geçirin. S'nin üst kısmından gelen boruyu s'ye bağlayın.ampDöngü 2'ye ve alttan Döngü E'ye. Boruyu sütun portundan atığın içinde bırakın.
- Akışı 10 mL/dk'da başlatın. Gelen başlangıç tamponu tarafından yukarı doğru itilen kayar conta, numune döngüsünün tepesine ulaştığında, akışı durdurun. Numune döngüsü artık numune enjeksiyonu için hazırdır.
5. Numune enjeksiyonu
- Pompa ayarlarına çift tıklayın ve Manuel yük döngüsünü seçin (Şekil 4C).
- Boruyu Loop E'den sökün ve atık kabına yerleştirin.
- Boruyu sütun bağlantı noktasından akış adaptörünün üstündeki boruya bağlayın.
- Numuneyi 30 mL'lik bir şırınga kullanarak hazırlayın; Ardından, şırıngayı enjeksiyon portu adaptörüne takın.
- Şırıngayı enjeksiyon portuna vidalayın ve numuneyi enjekte edin, numune döngüsüne görünür bir şekilde enjekte edildiğinden emin olun. SDS-PAGE analizi için 100 μL numuneyi (etiket giriş lizatı) -20 °C'de bir mikrosantrifüj tüpünde saklayın
NOT: Toplam numune hacmine bağlı olarak 2-3 enjeksiyon gerekebilir. - Enjeksiyon portunu sütun kapağıyla takın.
- S'nin altındaki boruyu bağlayınample döngü tekrar Döngü E bağlantı noktasına geri dönün.
- B pompasından gelen boruyu elüsyon tamponuna yerleştirin.
6. FPLC sistemine bağlı yazılımı kullanarak yöntem oluşturma ve analiz etme
- Giriş sekmesine gidin ve Yeni yöntem'i seçin.
- Sol sütundaki Yöntem ayarları sekmesini seçin, Sütun türü açılır menüsüne gidin ve Özel'i seçin (Şekil 5).
- Sütun hacmini (5 mL) girin.
- Çalışma için gerekli akış hızını girin (1 mL/dk).
- Birim seçimi'ne gidin ve yöntem temel birimi olarak CV'yi (sütun hacimleri) seçin.
- Giriş A'nın Tampon A olarak ayarlandığından ve Giriş B'nin Tampon B (varsayılan ayar) olarak ayarlandığından emin olun.
- Sol taraftaki menüden Yöntem Anahattı sekmesini seçin. Saflaştırma adımlarını aşağıdaki sırayla ekleyin: dengeleme, numune uygulaması, kolon yıkama ve elüsyon.
- Dengeleme altında, dengeleme hacmini 10 CV olarak ayarlayın. Tampon ayarının %0 B'de tutulduğundan emin olun.
- Örnek uygulama sekmesi altında, örnek döngüsünü gözlemleyerek örnek hacmini ayarlayın. Kayar contanın konumu numune hacmini gösterir.
- Sütun yıkama altında, yıkama hacmini 5 CV'ye ayarlayın. Bu adım için kesir toplamayı devre dışı bırakın; Yıkama işlemini, fraksiyonlar halinde toplamak yerine, çalışma sırasında bir beherde bir bütün olarak toplayın.
- Elüsyon için, gradyan hacmini %0 Tampon B'den %100 Tampon B'ye başlayarak 14 CV'ye ayarlayın.
- Yöntemi kaydedin ve çalıştırmayı başlatın.
- Kesir toplayıcının ilk kesirin konumundan başladığından emin olun.
- Çalıştırma adını girin ve Başlat'a tıklayın.
- Dengeleme aşamasında, gerçek zamanlı UV eğrisini izleyin. Tüm bağlantıların sızıntı olmadan sağlam olduğundan emin olun; Atık kabına akan arabelleği arayarak tam bir devreyi onaylayın. Dengelemenin son dakikalarında UV eğrisi stabilize olmadıysa, stabilizasyon sağlanana kadar dengeleme adımını uzatın (Şekil 6).
- Numune uygulaması sırasında, atık kabına giren tüpleri temiz bir behere geçirin. Bu adım sırasında, atık tüplerden akan bağlanmamış proteinleri akış olarak toplayın ( FT olarak etiketleyin).
- UV eğrisinde, muhtemelen mümkün olan maksimum 3.000 maU değerine ulaşan keskin bir artış arayın (Şekil 6).
NOT: Örnek uygulama adımının çoğu boyunca 3.000 maU'da tipik bir eğri platosu. - Kolon yıkama sırasında, artık bağlanmamış proteinler, reçine üzerinde sadece bağlı proteinler kalacak şekilde yıkanırken, UV eğrisinde keskin bir düşüş olup olmadığına bakın (Şekil 6). Yıkama adımının sonunda UV eğrisi düşmediyse, UV yeterince düşene kadar tutma adımına tıklayarak adımı uzatın. Bu adımın başında, atık tüpleri FT beherinden Wash etiketli başka bir temiz behere aktarın.
- Elüsyon adımı başladığında, fraksiyon toplayıcının yerine hareket ettiğinden emin olun ve fraksiyonları toplamaya başlayın. UV eğrisindeki tepe noktalarını arayarak proteinin elüsyonunu görselleştirin (Şekil 6).
- Çalıştırma tamamlandıktan sonra Giriş sekmesine gidin ve Çalıştırmayı Aç'ı seçin. Kromatogramı görüntülemek için koşuyu açın ve koşu sırasında elde edilen tepe noktalarını işaretlemek için üst menüden tepe entegrasyonunu seçin.
- Ayrıştırılmış protein içeren kesirleri görselleştirmek için Kesirler sekmesini seçin.
7. SDS SAYFA analizi
- Protein içeren her fraksiyonun 15 μL'sini 5 μL SDS numune yükleme tamponu ile karıştırın (Tablo 1). Numuneleri 95 °C'de 5 dakika ısıtın.
- Numuneleri prekast jellere yükleyin ve önceden boyanmış protein işaretleyici ile birlikte 45 dakika boyunca 160 V'ta çalıştırın.
- Jelleri Coomassie parlak mavi boyama solüsyonunda 30 dakika boyayın (Tablo 1).
- Jeli ddH2O'da yıkayın (3x tekrarlayın).
- Jeli leke giderme solüsyonunda 1 saat boyunca lekeden arındırın (Tablo 1).
- Protein bantlarını gözlemleyin; FEN1'i 42 kDa işaretinde tespit edin.
- FEN1 içeren havuz fraksiyonları ve 10 kDa'lık bir santrifüj filtre kullanarak havuzu konsantre edin. Aliquot ve -80 ° C dondurucuda saklayın.
Sonuçlar
hFEN1'i eksprese eden BL21 (DE3) hücre lizatları, dengelenmiş Ni-NTA ve TALON reçinelerinden geçirildi. Ni-NTA reçinesi Ni2+ iyonları ile yüklüdür ve yüksek bağlama kapasitesine sahiptir. Sonuçlar, Ni-NTA reçinesinin, TALON reçinesine kıyasla daha yüksek miktarda FEN1 verdiğini göstermektedir (Şekil 7). Ni-NTA reçinesinin, kromozomal olarak eksprese edilen diğer proteinlere spesifik olmayan bir şekilde bağlandığı da bilinmektedir. Kobalt bazlı reçineden geçen hücre lizatı, Ni-NTA'ya kıyasla yüksek saflıkta ancak daha düşük bir verimle saflaştırıldı. Diğer birçok DNA bağlayıcı protein gibi, FEN1 de safsızlıkları gidermek için boyut dışlama reçinesinden geçirildi. hFEN1, 43 kDa işaretinde tanımlanabilir.
Şekil 1: hFEN1 ile flep bölünme mekanizması: izlemeye karşı diş açma. FEN1'in (sarı renkle gösterilen) başlangıçta kanat yapısının 5' ucuna bağlandığı ve içinden kanat tabanına (solda) kadar ilerlediği düşünülüyordu. Daha sonraki çalışmalar, FEN1'in ilk olarak flep tabanına bağlandığını ve 5' flebi aktif bölgesinden (sağda) geçirdiğini ortaya koydu. Kısaltma: hFEN1 = insan flebi endonükleaz 1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akış adaptörü. (A) Kolon paketleme ve saflaştırma işlemi için kullanılan akış adaptörünün bileşenleri; (B) O-ringi sıkmak/gevşetmek ve adaptörü yerine sabitlemek için kullanılan kam mandalının üç konumu. Yakınlaştırılmış görüntü, yukarıdan aşağıya 1,2 ve 3 konumlarında O-ringin (gevşek/sıkı) durumunu gösterir. Görüntüler 9'un izniyle çekilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hızlı protein sıvı kromatografi sisteminin enjeksiyon modülü. Enjeksiyon modülünün çeşitli portları, hızlı protein sıvı kromatografi sistemini kolona, numune döngüsüne ve atığa bağlar. Görüntü 10'un izniyle çekilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sistem kontrolü. (A) Akış ayarlarının manipüle edilebildiği ve akış yolunun görülebildiği sistem kontrol sekmesi; (B) akış hızı ayarları penceresi; (C) pompa ayarları penceresi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yöntem ayarları penceresi. Sütun tipi, sütun hacmi, yöntem temel birimi ve çalışma için akış hızı gibi saflaştırma ayrıntılarını girmek için bir pencere. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: FPLC sırasında UV eğrisinin şeması: UV eğrisi, saflaştırma aşamasına göre yükselir ve düşer. Dengelemenin başlangıcında, borudaki hava kabarcıkları veya kirleticilerin varlığı nedeniyle UV eğrisi bozulabilir. Dengeleme devam ettikçe, eğri düz bir çizgi olarak stabilize olmalıdır; Numune enjeksiyonu sırasında, reçineye bağlanmamış proteinler dışarı akarken, UV eğrisi maksimum eşiğe ulaşılana kadar yükselir. Artık bağlanmamış proteinleri temizleyen yıkama adımı, UV ölçümlerinde kademeli bir azalma gösterir. Son olarak, elüsyon fazı sırasında, hedef protein ayrıştırıldığında, UV eğrisinde bir tepe görülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: SDS PAGE jel görüntüsü. Şerit 1-Moleküler ağırlık işaretleyicisi; Şerit% 2-1 Ni-NTA Girişi (hücre lizatı); Ni-NTA reçinesinden şerit %3-1 akış; Ni-NTA reçinesinden saflaştırılmış şerit 4-hFEN1; Şerit% 5-1 Giriş (hücre lizatı); Şerit: Kobalt bazlı reçineden %6-1 akış; Lane 7-hFEN1, kobalt bazlı reçineden saflaştırılmış; siyah ok, 42,5 kDa'da FEN1'i temsil eder. Kısaltmalar: SDS-PAGE = sodyum dodesil sülfat; MW = moleküler ağırlık; hFEN1 = insan flep endonükleazı 1; NTA = nitrilotriasetik asit. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tamponlar ve çözeltiler | Bileşen |
| Lizis tamponu | 50 mM Tris–HCl [pH 8.0] |
| 500 mM NaCl | |
| 1 mM beta merkaptoetanol (BME) | |
| 1 mM fenil-metilsülfonil florür (PMSF) | |
| 1 mM EDTA | |
| 1 tablet tam proteaz inhibitörü | |
| 10 mM imidazol | |
| % 10 gliserol | |
| Dengeleme/Yıkama tamponu | 50 mM Tris–HCl [pH 8.0] |
| 500 mM NaCl | |
| 1 mM BME | |
| 1 mM PMSF | |
| 10 mM imidazol | |
| % 10 gliserol | |
| Elüsyon tamponu | 50 mM Tris–HCl [pH 8.0] |
| 500 mM NaCl | |
| 1 mM BME | |
| 1 mM PMSF | |
| 1 M imidazol | |
| % 10 gliserol | |
| SDS numune yükleme tamponu | 900 μL 4x Laemmli numune tamponu |
| 100 μL BME | |
| Coomassie parlak mavi boyama çözümü | % 50 ddH2O |
| % 40 Metanol | |
| % 10 Asetik asit | |
| % 0.1 Coomassie parlak mavi R-250 | |
| Leke çıkarma çözümü | % 50 ddH2O |
| % 40 Metanol | |
| % 10 Asetik asit |
Tablo 1: Tampon bileşimi.
Tartışma
Afinite kromatografisi, DNA bağlayıcı proteinleri saflaştırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. İmmobilize metal afinite kromatografisi (IMAC), bir peptit dizisinin histidin kalıntılarını yakalamak için metal iyonlarını kullanan spesifik bir afinite kromatografisi türüdür. Bu nedenle "6X-His etiketi" veya "poli-His etiketi", saflaştırılacak proteinlerin N-terminaline veya C-terminaline eklenir. Nikel ve kobalt en yaygın kullanılan metal iyonlarıdır ve normalde saflaştırmada kullanılan BME ve DTT gibi reaktiflerle uyumluluklarına göre değişir. Saflaştırmalar 1 mM BME veya DTT konsantrasyonlarında gerçekleştirilmiş olsa da, bu reaktiflerin kullanımı hala güvenilmez olabilir. Dengeleme sırasında uyumsuzluk gözlenebilir. Reçineden akan tampon kahverengi renkte görünüyorsa, metal iyonlarının oksidasyonunu gösterir ve metal iyonlarını reçineden sıyırabilir. Bu, reçinenin bağlanma kapasitesini büyük ölçüde azaltabilir.
Yüksek saflık ve protein verimi sağlamak için, metal iyonları ve His-tag arasındaki afinite etkileşimleri, diğer olası yüke dayalı etkileşimlere göre tercih edilmelidir. Bu, elüsyonun farklı fazları boyunca elüsyon yapmak yerine tüm proteinin bir kerede ayrıştırılmasını sağlayacaktır. Bunu başarmak için, proteinin saflaştırma sırasında çok düşük bir yük taşıması gerekir. Tamponların pH değerleri hedef proteinin izoelektrik noktasına daha yakınsa, proteinin yükü düşük tutulabilir. FEN1'in izoelektrik noktası yaklaşık 8.8 olduğundan, tamponlarımız pH 8'de tutulur.
Ni iyonları ile yüklü Ni-NTA reçinesinin daha büyük bir protein bağlama kapasitesine sahip olduğu düşünülmektedir ve kobalt bazlı reçine TALON'a kıyasla daha yüksek miktarda protein vermesi beklenmektedir. Bu aynı zamanda spesifik olmayan proteinlerin bağlanması için daha büyük bir potansiyel olduğu ve dolayısıyla daha düşük saflık olduğu anlamına gelir. TALON'un daha düşük bağlanma kapasitesi, daha yüksek spesifik bağlanma ve yüksek saflıkta protein verimi ile tamamlanmaktadır. Bu, TALON'a kıyasla Ni-NTA'dan saflaştırılmış daha yüksek bir protein verimi gösteren sonuçlarımızla tutarlıdır.
Reçineden bağımsız olarak, saflık ve verim kolon salmastrasından önemli ölçüde etkilenir. NGC otomatik kromatografi sistemine9 bağlı akış adaptörü kullanılarak verimli paketleme elde edilebilir. Yeterince yüksek akış hızlarında, akış adaptörü reçineyi etkili bir şekilde paketleyebilir ve kolonda tampon birikmesini önleyebilir. NGC ile birlikte akış adaptörü, akış hızı, basınç ve elüsyon gradyanının düzenlenmesinin yanı sıra protein fraksiyonlarının verimli bir şekilde toplanması nedeniyle her iki reçinenin doğru bir şekilde karşılaştırılmasına izin verir.
Chromlab yazılımı sayesinde, çalışma koşulları gerçek zamanlı olarak izlenebilir10. Akış hızı, çalışma boyunca herhangi bir zamanda değiştirilebilir. Numune uygulaması sırasında sistem basıncı eşiği (600 psi) aşabilir. Bu durumda, numune uygulama adımı sırasında akış hızının düşürülmesi basıncı azaltabilir. Yazılım ayrıca, herhangi bir adımın gerektiği gibi genişletilebildiği bir Tutma adımı işlevine sahiptir. Bu fonksiyon özellikle kolon yıkama ve elüsyon adımları sırasında faydalıdır. Kolon yıkama sırasında, UV grafiğinin aşağı inmesi ve neredeyse 0'a ulaşması beklenir - bu, bağlanmamış proteinlerin çoğunun reçineden yıkandığını gösterir. UV çizgisinin yükselmeye devam etmesi veya aşağı inmemesi durumunda, yıkama adımı beklenen grafik görülene kadar uzatılabilir. Benzer şekilde, elüsyon sırasında, hedef proteinin elüsyonu UV grafiğindeki tepe noktaları aracılığıyla görselleştirilebilir. Beklenmedik bir şekilde, hiçbir tepe noktası görünmüyorsa, elüsyon adımı, beklenen zirveler gözlenene kadar uzatılabilir.
İpuçları ve püf noktaları
Dengeleme adımı sırasında, tampon kolona enjekte edilmeli ve atık tampon sürekli olarak atık şişesine bırakılmalıdır; Bu, tüm bağlantıların sıkı ve sızdırmaz olmasını sağlar. NGC'nin herhangi bir bölgesinden herhangi bir sızıntı olması durumunda, sızıntının kaynağı sızıntının fark edildiği yerden farklı olabileceğinden, alanı çevreleyen tüm portlar kontrol edilmelidir. Akış başlatıldıysa ancak kolona herhangi bir tampon girmiyorsa, borunun içinde hava sıkışmış olabilir. Devam etmeden önce sistemi temizleyin.
Numune enjeksiyonu sırasında, sistemden gelen geri basınç enjeksiyona direniyorsa, boru Döngü E'den sökülmeli ve enjeksiyon süresi boyunca atık şişeye yerleştirilmelidir. Programı başlatmadan önce tekrar Loop E'ye vidalamak önemlidir. Çalışma sırasında kolonda dengeleme tamponu veya numunenin birikmesi durumunda, çalışma duraklatılmalı ve akış adaptörü çıkarılmalıdır. Boru, kolonun altından sökülmeli ve tampon veya numunenin akmasına izin verilmelidir. Örnek akıyorsa, onu akış olarak topladığınızdan emin olun.
SDS PAGE jeli üzerinde çalıştırılan fraksiyonlar yüksek seviyelerde kirletici proteinler gösteriyorsa, fraksiyonlar kromatogramda görülen piklerin her iki tarafında da çalıştırılabilir. Genellikle, düşük ekspresyonlu proteinler için, saf fraksiyonlar UV'de önemli zirveler göstermez.
Nikel bazlı reçinenin ve kobalt bazlı reçinenin özellikleri arasındaki farkların anlaşılması, saflaştırılmış proteinin gelecekteki uygulamaları için en uygun reçinenin seçilmesine izin verir. Örneğin, in vitro biyokimyasal tahlillerde kullanılan proteinlerin, kobalt bazlı reçinenin uygun olduğu bir durum olan mümkün olan en yüksek saflıkta olması beklenir. Bununla birlikte, protein antikorların üretimi için kullanılıyorsa, işlem için önemli miktarda saflaştırılmış protein verimi gereklidir. Ni-NTA reçinesi bu durumda daha iyi bir seçenek olarak hizmet edebilir. Bu makale, FEN1'in saflaştırılması yoluyla bu reçineler arasındaki farklılıkları ortaya çıkarmayı amaçlamıştır.
Açıklamalar
Yazarların rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (1929346) ve Amerikan Kanser Derneği'nden (RSG-21-028-01) alınan hibelerle finanse edilmiştir. Yararlı tartışmalar için Balakrishnan laboratuvarı üyelerine de teşekkür ederiz.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 4x Laemmli numune tamponu | BioRad | 1610747 | |
| Asetik asit | Merck | UN2789 | |
| Beta-merkaptoetanol (BME) | Sigma | M-6250 | |
| Chromlab yazılım sürümü 6.1.27.0 | BioRad | , NGC sistemini çalıştırır | |
| Komple MINI proteaz inhibitör tablet | Roche | 11836153001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma | B0149 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Dot Scientific | DSD11000 | |
| Econo-Column cam | BioRad | 7371512 | |
| Etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) | Dot Scientific | DSE57020 | |
| Akış adaptörü | BioRad | 7380014 | |
| Gliserol | Nokta Bilimsel | ||
| İmidazol | Nokta Bilimsel | DSI52000 | |
| Metanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mini PROTEAN TGX jeller | BioRad | 4561084 | |
| NGC Kromatografi Sistemi | BioRad | otomatik sıvı kromatografi sistemi | |
| Ni-NTA Agaroz | Qiagen | 1018244 | |
| Fenil-metil-sülfonil florür | Dot Scientific | DSP20270 | |
| PreScission Plus Protein Çift Renk Standartları | BioRad | 1610374 | |
| Sodyum klorür | Dot Scientific | DSS23020 | |
| TALON metal afinite reçinesi | Takara | 635502 | |
| Tris Base | DST60040 |
Kaynaklar
- Balakrishnan, L., Bambara, R. A. Flap endonuclease 1. Annu Rev Biochem. 82, 119-138 (2013).
- Asagoshi, K. FEN1 functions in long patch base excision repair under conditions of oxidative stress in vertebrate cells. Mol Cancer Res. 8 (2), 204-215 (2010).
- Lyamichev, V., Brow, M. A., Dahlberg, J. E. Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases. Science. 260 (5109), 778-783 (1993).
- Bornarth, C. J., Ranalli, T. A., Henricksen, L. A., Wahl, A. F., Bambara, R. A. Effect of flap modifications on human FEN1 cleavage. Biochemistry. 38 (40), 13347-13354 (1999).
- Xu, Y., Potapova, O., Leschziner, A. E., Grindley, N. D., Joyce, C. M. Contacts between the 5' nuclease of DNA polymerase I and its DNA substrate. J Biol Chem. 276 (32), 30167-30177 (2001).
- Wen-Hui, K., Kuo, K., Chase, H. A. Exploiting the interactions between poly-histidine fusion tagsand immobilized metal ions. Biotechnol Lett. 33 (6), 1075-1084 (2011).
- Charlton, A., Zachariou, M. Immobilized metal ion affinity chromatography of native proteins. Methods Mol Biol. 421, 25-35 (2008).
- Ononye, O. E., Njeri, C. W., Balakrishnan, L. Analysis of DNA processing enzyme FEN1 and its regulation by protein lysine acetylation. Methods Mol Biol. 1983, 207-224 (2019).
- Econo-column flow adaptor instruction manual. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M7380014.pdf (2015).
- NGC Chromatography systems and ChromLab software instrument guide version 3.3. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10026252.pdf (2015).
Yeniden basım ve izinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste