Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İmmünoelektron Mikroskobunun Önceden Gömülmesi ile Retina Devrelerinin ve Moleküler Lokalizasyonun İncelenmesi

1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66543

⸱

12 Temmuz 2024

 ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, retinadaki sinaptik devreleri ve protein lokalizasyonunu keşfetmeye odaklanarak, önceden gömülü immünoelektron mikroskobunun ayrıntılı adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

Özet

Retina, görme yolunun ilk aşamasını oluşturan çeşitli nöronal devreler oluşturan çok sayıda hücreden oluşur. Her devre, rolünü ve işlevsel önemini belirleyen benzersiz özellikler ve farklı nörotransmiterler ile karakterize edilir. Yapısındaki karmaşık hücre tipleri göz önüne alındığında, retinadaki nöronal devrelerin karmaşıklığı keşif için zorluklar doğurur. Koni ve çubuk yolları arasındaki bağlantı gibi retina devrelerini ve çapraz konuşmayı ve fare retinasında P benzeri immünoreaktivite maddesinin varlığı gibi kesin moleküler lokalizasyonu (nörotransmiterler veya nöropeptitler) daha iyi araştırmak için, sinaptik bağlantıları ve organizasyonu keşfetmek için önceden gömülü bir immünoelektron mikroskobu (immüno-EM) yöntemi kullandık. Bu yaklaşım, spesifik hücreler arası sinaptik bağlantıları ve kesin moleküler lokalizasyonu belirlememizi sağlar ve işlevini keşfetmede yol gösterici bir rol oynayabilir. Bu makale, (1) retina fiksasyon hazırlığı, (2) ön gömme immün boyama ve (3) sabitleme sonrası ve gömme dahil olmak üzere protokolü, kullanılan reaktifleri ve ayrıntılı adımları açıklamaktadır.

Giriş

Retinadaki nöronal devrelerin karmaşıklığı, yapısındaki çeşitli hücre tipleri göz önüne alındığında, keşif için zorluklar ortaya çıkarmaktadır 1,2. İlk adım, farklı hücreler arasındaki sinaptik bağlantıların tanımlanmasını ve spesifik nörotransmiterlerin veya nöropeptitlerin hücresel lokalizasyonunun belirlenmesini içerir. Moleküler biyolojideki ilerlemeler yeni proteinleri tanıttıkça, retinadaki hassas lokalizasyon, işlevlerini anlamak ve retina devrelerini ve sinaptik bağlantıları analiz etmek için çok önemli hale gelir 3,4,5.

Işık mikroskobunun sınırlı çözünürlüğü nedeniyle, elektron mikroskobu (EM), sinir hücrelerinin hücre altı yapılarını tespit etmek için yaygın olarak kullanılır. EM, hücre ultrayapılarınıgözlemlemek için kullanılan geleneksel transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile çeşitli sınıflandırmalara sahiptir 6,7,8,9. EM'nin uzamsal çözünürlüğünü, spesifik olarak proteinlere10 bağlanan antikorların kimyasal tanımlama yeteneği ile birleştiren immünoelektron mikroskobu (immüno-EM), retinadaki sinaptik bağlantıları ve hücre altı protein lokalizasyonunu araştırmak için en uygun ve özel yöntem olarak öne çıkmaktadır11,12.

İmmüno-EM teknikleri, gömme ve antikor inkübasyon sırasına bağlı olarak gömme öncesi ve sonrası gömme yöntemlerine ayrılabilir. Gömme sonrası yöntemle karşılaştırıldığında, ön gömme yaklaşımı, aksonlar ve dendritler gibi hücre süreçlerini incelemek için en uygun yaklaşımı sunan büyük ölçekli ve uzun mesafeli tanımlama 13,14,15 yeteneğine sahiptir. Ek olarak, bu teknik, güçlü bir sinyal ve geniş bir görüş alanı sağlayarak, sitoplazmada protein ekspresyonu ve moleküler lokalizasyonun kapsamlı araştırmaları için avantajlı hale getirir. Bu yöntem, tüm sitoplazma, hücreler veya retina boyunca görülebilen kimyasal olarak tanımlanmış yapıların sağlanmasında özellikle değerli olduğunu kanıtlamaktadır.

Bununla birlikte, gömme sonrası yöntem, gömme öncesi yönteme kıyasla daha düşük penetrasyon veya difüzyona sahip olsa da, o kadar hassas değildir16,17. Basit bir ifadeyle, amaç sitoplazma veya sinaptik terminallerdeki spesifik nörotransmiterlerin lokalizasyonunu araştırmaksa, önceden gömülü immüno-EM tercih edilen yöntemdir. Tersine, membran reseptörlerinin lokalizasyonunu tanımlamak için, gömme sonrası immünogold EM'nin kullanılması daha fazla tavsiye edilir.

Bu hususlar göz önüne alındığında, koni ve çubuk yolları arasındaki etkileşim ve fare retinasındaki P benzeri immünoreaktivitenin (SP-IR) dağılımı ve sinaptik organizasyonu gibi moleküler lokalizasyon dahil olmak üzere retina devrelerini araştırmak için önceden gömme immüno-EM yöntemini tercih ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanların bakımı ve idaresi, ARVO yönergelerine uygun olarak Wenzhou Tıp Üniversitesi Etik Kurul Yönetmeliği tarafından onaylanmıştır. Bu araştırmada yetişkin fareler (C57BL / 6J, erkek ve dişi, 8 ila 12 haftalık) kullanılmıştır. Çalışma için gerekli ekipman ve reaktifler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Retina fiksasyonu için hazırlık

  1. Aşağıdaki malzemeleri ve aletleri birleştirin: bir diseksiyon mikroskobu, çok ince uçlu iki forseps, makas, 1 mL şırınga iğnesi (iğne boyutu: G26) ve filtre kağıdı.
  2. 0.25 mg / g vücut ağırlığında 2,2,2-tribromoetanolün intraperitoneal enjeksiyonu ile fareleri derinlemesine uyuşturun. Daha sonra, farelerin kafasını kesin ve kafalarınıkesin 16.
  3. Gözlerini dirsek makasıyla enüklee edin ve 0,1 M fosfat tamponunda (PB; pH 7,4) %4 paraformaldehit-%0,2 pikrik asit içeren bir cam kaba koyun.
  4. Diseksiyon mikroskobu altında, 1 mL'lik bir şırınga iğnesi kullanarak kornea limpusuna bir delik açın ve deliği takip ederek ön segmenti makasla kesin. Daha sonra lensi forseps ile retina iç yüzeyinden çıkarın.
  5. Retina göz kabından tamamen izole edilene kadar sklerayı dikkatlice soymak için iki forseps kullanın (cuppy retina dokusu koroidden tamamen ayrılır). Daha sonra, retinayı dört parçaya bölün.
  6. Bu bölümleri oda sıcaklığında (RT) 2 saat boyunca 0.1 M PB'de (pH 7.4) %4 paraformaldehit-%0.2 pikrik asit içinde sabitleyin ve ardından dokuyu gece boyunca 4 °C'de 0.1 M PB'de (pH 10.4) %4 paraformaldehite aktarın.

2. Ön gömme immün boyama

  1. 0.01 M PBS'de (pH 7.4) her biri 10 dakika boyunca altı kez yıkadıktan sonra, retina dokularını 30 dakika boyunca 0.01 M PBS'de (pH 7.4) %1 sodyum borohidrür (NaBH4) içinde inkübe edin.
  2. Retina bölümlerini 0.01 M PBS'de (pH 7.4) en az altı kez yıkayın. Bu arada, vitreusu filtre kağıdı ile çıkarın ve ardından retinayı çift kenarlı bir tıraş bıçağı kullanarak 100-300 μm arasında küçük dilimler halinde kesin.
  3. RT'de 1 saat boyunca 0.1 M PB'de (pH 7.4) %5 normal keçi serumu (NGS) ile bloke ettikten sonra, retina dilimlerini birincil antikorlarla inkübe edin (Anti-tavşan PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100), bir çalkalayıcı üzerinde RT'de 2 saat boyunca 0.01 M PBS'de (pH 7.4) %2 NGS ile birlikte. Daha sonra, bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de 96 saat (5 gün) inkübe edin.
  4. 0.01 M PBS'de (pH 7.4) her biri 10 dakika boyunca altı kez yıkadıktan sonra, retina dilimlerini keçi anti-tavşan IgG gibi 1: 200'de ikincil antikor ile birlikte 0.01 M PBS'de% 2 NGS ile birlikte inkübe edin (pH 7.4) bir çalkalayıcı üzerinde RT'de 2 saat boyunca. Daha sonra, bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de 48 saat (2 gün) inkübe edin.
    NOT: İkincil antikorlar kontrol deneylerinde tek başına uygulanmıştır.
  5. Retina şeritlerini 0.01 M PBS'de (pH 7.4) 0.01M PBS'de (pH 7.4) 1: 100'de 0.01M PBS'de (pH 7.4) 4 ° C'de 2 gün boyunca ABC kitinden reaktif A ve reaktif B ile inkübe etmeden önce altı kez 10 dakika boyunca yıkayın. (Hem reaktif A hem de reaktif B, 0.01 M PBS ile seyreltildi. Örneğin: Bir çözelti: 6 μl; B çözeltisi: 6 μl; 0,01 M PBS: 588 μl, toplam 600 μl).
  6. Retina şeritlerini 0.05 M Tris tamponunda (pH 7.2) her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Ardından, retina şeritlerini DAB kitinden %5 reaktif 1 ve %5 reaktif 3 ile damıtılmış suda oda sıcaklığında 1 saat önceden inkübe edin. (Örneğin oran: reaktif 1: 50 μl; reaktif 3: 50 μl; damıtılmış su: 900 μl, toplam 1000 μl).
  7. Retina çizgilerini DAB ile boyayın. DAB kitindeki üç tüpten sırayla aynı hacimde çözelti ekleyin (reaktif 1-reaktif 2-reaktif 3). Diseksiyon mikroskobunu kullanarak lekelenme durumunu gözlemleyin. Hücreler kahverengileştiğinde lekelenmeyi durdurun; Bu işlem 10-20 dk sürer.
  8. Retina şeritlerini 0.05 M Tris tamponu (pH 7.2) ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın ve ardından her biri 10 dakika boyunca altı kez 0.01 M PBS'de yıkayın.

3. Sabitleme sonrası ve gömme

  1. Retina şeritlerini oda sıcaklığında (RT) 1-2 saat boyunca% 2 glutaraldehit içinde sabitleyin ve ardından her biri 10 dakika boyunca altı kez 0.01 M PBS'de (pH 7.4) yıkayın.
  2. Retina şeritlerini RT'de 1 saat boyunca 0.1 M PB'de% 1 osmiyum tetroksit (OsO4) ile inkübe edin ve karanlık bir yerde tutun.
  3. Damıtılmış suda (ddH2O) her biri 10 dakika boyunca altı kez yıkadıktan sonra, retina dokularını RT'de 1 saat uranil asetat ile inkübe edin ve bu dokuları lekelemek için karanlık bir yerde tutun.
  4. Retina dokularını her biri 10 dakika boyunca aseton solüsyonlarına (%50, %70, %80 ve %90), ardından her biri 10 dakika boyunca iki kez %100 koyun.
  5. Retina dokularını aynı hacimde uranil asetat ve epoksi reçine içeren bir karışıma 37 °C kurutma fırınında 1 saat daldırın, ardından uranil asetat ve reçine (1:4) içeren bir karışım gece boyunca 37 °C kurutma fırınında bekletin.
  6. Retina dokularını bir kürdan kullanarak bir kurutma fırınında 45 °C'de 1 saat boyunca yeni reçineye nazikçe aktarın ve ardından yönlendirilmiş retina şeridi reçine ile gömme plakasına gömülür.
  7. Numuneyi 45 °C'lik bir kurutma fırınına 3 saat ve 65 °C'lik bir kurutma fırınına 48 saat koyun.
  8. Gömme bloklarını yamuk şeklinde şekillendirin ve bloğu bir ultramikrotom ile 1 μm kalınlığında bölümler halinde kesin, bu bölümleri toluidin mavisi ile boyayın ve ilgilenilen bölgeleri ışık mikroskobu altında önceden eleyin.
  9. Bakır ızgaralarda ultra ince kesitler (70-90 nm) toplayın ve bunları elektron mikroskobu altında görüntüleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 , protein kinaz C alfa (PKCα) veya SP'ye karşı primer antikorların inkübasyonu olmadan, immünoreaktivite (IR) bulunmayan kontrol deneylerinin örneklerini göstermektedir.

Şekil 2 , fare retinasındaki PKCα-IR'yi göstermektedir. PKCα, retina18'deki tüm çubuk bipolar hücreler (RBC) için bir belirteç görevi görür. Elektron mikroskobu (EM) seviyesinde, RBC, yüksek elektron yoğunluğuna sahip diaminobenzidin (D...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makale, sinaptik devrelerin ve protein lokalizasyonunun başarılı bir şekilde gözlemlenmesi için üç kritik adımı tanımlamıştır: (1) hızlı ve zayıf fiksasyon, (2) ön gömme immün boyama ve (3) fiksasyon sonrası ve gömme.

Fiksasyonun, başarılı bir pre-embedding immüno-EM yaklaşımı için anahtar adım olduğunu öneriyoruz. Bu nedenle, burada taze fiksatif ve hızlı fiksasyonun önemi vurgulanmakta ve bu ilkeye doku hazırlığında çok önemli olan "4F prensibi" adı veril...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2022YFA1105503), Devlet Nörobilim Anahtar Laboratuvarı (SKLN-202103), Çin Zhejiang Doğa Bilimleri Vakfı (Y21H120019) Hibeleri ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL şırınga iğnesikangdelai
%1 OsO4Elektron Mikroskobu Bilimi19100
2,2,2-TribromoetanolSigma-AldrichT48402
%8 Gluteraldehit ElektronMikroskobu Bilimi16020
%8 ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimi157-8
Aseton ElektronMikroskobu Bilimi10000
Anti-tavşan PKCSigma-AldrichP4334
Anti-Tavşan SPAbcamab67006
DAB Yüzey kitiMXB BiyoteknolojiKIT-9701/9702/9703
Dirsek makasıSuzhou66 vizyon şirketi54010
Elektron mikroskobuPhillipsCM120
Epon reçine ElektronMikroskobu Bilimi14910
forsepSuzhou66 vizyon şirketiS101A
Millipore filtre kağıdıMerck Millipore 
PR05538 Na2< / sub>HPO4< / sub>· 12H2OSigma71650fosfat tamponunun bir bileşeni
NaH2PO4· H2OSigma71507Fosfat tamponunun bir bileşeni
Pikrik asitElektron Mikroskobu Bilimi19550
Sodyum borhidrür (NaBH4) Sigma215511
TrisSolarbio917R071
UltramikrotomLeica
Uranil asetatElektron Mikroskobu Bilim22400
VACTASTAIN ABC kiti, Peroksidaz (Tavşan IgG)Vektör LaboratuvarlarıPK-4001

Kaynaklar

  1. Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
  2. Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , JN-RM-0910-23 (2023).
  3. Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
  4. Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022(2023).
  5. Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
  6. Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
  7. Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599(2024).
  8. Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189(2023).
  9. Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
  10. Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371(2022).
  11. Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
  12. Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526(2019).
  13. Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525(2023).
  14. Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
  15. Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873(2023).
  16. Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547(2016).
  17. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
  18. Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
  19. Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
  20. van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687(2022).
  21. Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381(2023).
  22. Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
  23. Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
  24. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  25. Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  26. Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
  27. Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
  28. Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
  29. Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
  30. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).
  31. Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
  32. Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Sinaptik BağlantılarGömme Öncesi İmmunboyamaRetinal Nöronal DevrelerSubstans P İmmunoreaktivitesiÇubuk Bipolar HücrelerDış Pleksiform TabakaDAB Boyama
İmmünoelektron Mikroskobunun Önceden Gömülmesi ile Retina Devrelerinin ve Moleküler Lokalizasyonun İncelenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.