Yöntem makalesi

Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü

DOI:

10.3791/66545

⸱

22 Mart 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Tulane University, 2Native American Center for Health Professions, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison, 4Department of Biochemistry, University of Wisconsin-Madison, 5School of Science and Engineering, Tulane University, 6Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Boston Children’s Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, monokrom multipleks kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (MMqPCR) testi kullanılarak bağıl telomer uzunluğunun (TL) ölçümü için bir protokol sunuyoruz. MMqPCR testi, popülasyon temelli çalışmalarda insan DNA'sından TL ölçümü için tekrarlanabilir, verimli ve uygun maliyetli bir yöntemdir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomerler, DNA'yı hasardan koruyan ve kromozom stabilitesini koruyan tüm ökaryotik kromozomların sonunda bulunan ribonükleoprotein yapılarıdır. Telomer uzunluğu (TL) çeşitli maruziyetler, biyolojik süreçler ve sağlık sonuçları ile ilişkilendirilmiştir. Bu makale, insan DNA'sından bağıl ortalama TL ölçümü için laboratuvarımızda rutin olarak yürütülen monokrom multipleks kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (MMqPCR) test protokolünü açıklamaktadır. Birkaç farklı PCR tabanlı TL ölçüm yöntemi vardır, ancak bu yayında sunulan MMqPCR yöntemi için spesifik protokol tekrarlanabilir, verimli, uygun maliyetlidir ve popülasyon temelli çalışmalar için uygundur. Bu ayrıntılı protokol, araştırmacıların laboratuvarlarında bu testi oluşturmaları için gerekli tüm bilgileri özetlemektedir. Ek olarak, bu protokol, aynı numunenin tekrarlanan ölçümleri boyunca sınıf içi korelasyon katsayısı (ICC) ile tanımlanan bu tahlil ile TL ölçümünün tekrarlanabilirliğini artırmak için özel adımlar sağlar. ICC, belirli bir çalışma popülasyonu için beklenen gücün değerlendirilmesinde kritik bir faktördür; bu nedenle, herhangi bir TL tahlili için kohorta özgü ICC'lerin raporlanması, TL'nin popülasyona dayalı çalışmalarının genel titizliğini artırmak için gerekli bir adımdır. Periferik kan mononükleer hücrelerinden ekstrakte edilen DNA örneklerini kullanan örnek sonuçlar, bu MMqPCR protokolünü kullanarak yüksek oranda tekrarlanabilir TL verileri üretmenin fizibilitesini göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomerler, tüm ökaryotik kromozomların sonunda bulunan, yüksek oranda korunmuş, tekrarlayan DNA dizileri ve ilişkili proteinlerden oluşan koruyucu komplekslerdir. Telomer, kromozom stabilitesini koruyarak DNA'nın bütünlüğünü korur. Telomerlerin ilerleyici kısalması, eksik gecikmeli iplikçik DNA sentezi, DNA hasarı ve diğer faktörlerin bir sonucu olarak bölünen hücrelerde meydana gelir 1,2. Telomer uzunluğunun (TL) insan ömrü boyunca yaşlanma ve yaşa bağlı hastalıkların bir biyobelirteç olduğunu destekleyen artan kanıtlara, insan maruziyeti, hastalık ve sağlık çalışmalarında TL'nin rolünü değerlendirmek için kullanılan TL ölçüm testlerinin türlerinde bir artış eşlik etmiştir 3,4,5. Meta-analizler, TL'nin genel mortalite, çevresel maruziyetler ve kanser, kardiyovasküler hastalık ve diyabet dahil olmak üzere sağlık sonuçları ile ilişkilerini bildirmiştir 6,7,8,9,10,11,12,13 . Bu meta-ilişkilendirmeler, ilişkilendirmelerin güçlü yönlerinin farklı metodolojiler arasında farklılık gösterme eğiliminde olduğu iki düzineden fazla farklı TL ölçüm metodolojisinden birini kullanan çalışmalardan kaynaklanmaktadır 14,15,16. Bir araştırma çalışması için en uygun TL ölçüm yönteminin seçilmesi, her yöntemin kendine özgü avantajları ve dezavantajları olduğundan, doğru sonuçlar elde etmek için çok önemli bir adımdır 5,17.

Reaktiflerin nispeten düşük maliyeti, hızlı tahlil geri dönüşü, ölçeklenebilirlik ve daha düşük başlangıç DNA gereksinimi nedeniyle, PCR tabanlı TL ölçüm teknikleri, büyük örneklem popülasyonlarıyla yapılan çalışmalar, yüksek DNA konsantrasyonlarına sahip örneklere sınırlı erişimi olan çalışmalar veya yüksek verime öncelik veren çalışmalar yürütülürken genellikle tercihen kullanılır. Orijinal olarak Richard Cawthon tarafından geliştirilen tek katlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) olan ilk PCR tabanlı TL ölçüm yöntemi, ayrı PCR plakaları18 üzerinde çalıştırılan telomer (T) ve tek kopya gen (S) amplifikasyonunun floresan sinyallerinin oranını kullanır. Bu yaklaşımda, numunedeki toplam telomer DNA içeriğini amplifiye etmek için tekrarlanan telomer DNA dizilerini (T) tamamlayan primerler kullanılır ve floresan raportör SYBR green'in tespiti ile nicelik belirlenir. Benzer şekilde, korunmuş tek kopya (S) geninin intergenik bir bölgesini tamamlayan primerler, genom kopya sayısını ölçmek için kullanılır. Bu iki tahmin, plakadan plakaya varyasyonu kontrol etmek için bir projedeki tüm tahlillerde kullanılan bir genomik DNA standart eğrisine göre ölçülür. Toplam telomerik DNA'nın (T) tek genom kopya sayısına (S) bölünmesi, tek bir DNA örneği18,19 için hücre başına ortalama telomerik içeriği temsil eden birimsiz, göreceli bir ölçüm olan T/S oranını üretir. Bu nedenle, T/S oranı, fonksiyonel uzunluğun belirli bir ölçüsü değildir; ancak literatür normlarına uygun olarak bu protokol boyunca örneklem başına ortalama TL terimini kullanmaktayız.

Bu yöntem, 2009 yılında Richard Cawthon'un monokrom multipleks qPCR (MMqPCR) testini, orijinal singleplex qPCR yöntemine göre T/S oranındaki değişkenliği potansiyel olarak azaltmak için bir yaklaşım olarak tanımladığı19 zaman geliştirilmiştir. MMqPCR testi, qPCR testinin faydalarına sahiptir ve aynı reaksiyon kuyusu içinde T ve S sinyallerini tek bir raporlama floroforu kullanarak ölçme avantajına sahiptir, böylece singleplex qPCR'ye göre hatayı azaltır ve daha yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile sonuçlanır19. Ayrıca, bu multipleks yöntemi potansiyel olarak maliyetleri düşürür ve singleplex testine kıyasla yarısı kadar reaksiyon gerektiğindenverimi artırır 19.

MMqPCR TL ölçümünün avantajları göz önüne alındığında, bu yöntem, maruziyetler, sağlık sonuçları ve biyolojik süreçlerle TL ilişkilerinin popülasyon temelli çalışmaları için çok uygundur. Ancak, yöntemi başlatmak zor olabilir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, laboratuvarımızda kullanılan MMqPCR TL ölçüm protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyor ve test hassasiyetini artırmak, kontaminasyon riskini azaltmak ve tekrarlanabilirliği geliştirmek için uygulanan temel adımları vurguluyoruz.

Ayrıca, bu protokol, verilerin temizlenmesi ve TL ölçümlerinin tekrarlanabilirliğinin önemli bir istatistiksel ölçüsü olan sınıf içi korelasyon katsayısının (ICC) hesaplanması için adımları ana hatlarıyla belirtir2. Temsili sonuçlarımızla, bu protokolü kullanarak yüksek ICC'ler üretme kabiliyetini gösteriyoruz. Ek olarak, TL ölçümlerindeki değişimi azaltması ve ortaya çıkan ICC'yi artırması beklenen kalite kontrol (QC) ve sorun giderme adımlarını belirliyoruz. Bu yöntemin yüksek tekrarlanabilirliği, verimliliği ve maliyet etkinliği nedeniyle, MMqPCR TL ölçümü epidemiyolojik TL araştırmaları için idealdir. Şekil 1, bu protokolde açıklandığı gibi MMqPCR yöntemine görsel bir genel bakış sağlar.

figure-introduction-1
Şekil 1: Yönteme genel bakış. Telomer uzunluğunu ölçmek için monokrom multipleks kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu yöntemine geniş bir genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokol, çift üçlülerden oluşan bir ölçüm derinliğinde gerçekleştirilen MMqPCR testini, yani verimi artırmak için aynı anda iki termosikler kullanılarak uygulanan, çift plakalar boyunca tekrarlanan her bir numunenin üçlü ölçümlerini açıklar. Çift plakaların kullanılması, yüksek ICC'ler tarafından belirtildiği gibi yüksek tekrarlanabilirlik elde etmek için bu protokolün uygulanmasında en önemli husustur. Daha az kopya kullanmak mümkün olsa da, ICC üzerindeki etkinin ve ardından güç ve ihtiyaç duyulan numune boyutunun her laboratuvar tarafından her bir kohortta dikkatlice düşünülmesi ve ölçülmesi gerekir20,21. Yalnızca bir termodöngüleyici mevcutsa, ölçüm derinliğini korumanızı (yani yinelenen üçlüler) ve 2 plakayı sırayla çalıştırmanızı öneririz.

1. Stok hazırlama ve saklama koşulları

  1. Bu protokol için kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlar için Malzeme Tablosuna bakınız. Ek olarak, MMqPCR testi için kullanılan spesifik ana karışım reaktifleri ve miktarları için Tablo 1'e bakınız. İki plakayı sırayla çalıştırıyorsanız, konsantrasyonu korurken ana karışım hacminin yarısı kadar, aynı tahlilin sıralı plakaları boyunca aynı reaktif alikotlarının kullanılmasını sağlayın.
    NOT: Tüm stok reaktifleri önceden hazırlanmalı ve alıntılanan reaktifler kullanımdan önce tamamen çözülmelidir.
  2. 1x Tris-EDTA, pH 7.6 (TE) 5 mL'lik tüplerde 3 mL'lik hacimlerde oda sıcaklığında 2 yıla kadar alikotlayın ve saklayın.
  3. 5 M Betain'i 5 mL'lik tüplerde 1.280 μL'lik hacimlerde -20 °C'de 1 yıla kadar ayırın ve saklayın.
  4. SYBR Green'i 3 μL'lik hacimlerde, -20 °C'de 2 yıla kadar, folyo ile kaplanmış ve minimum düzeyde ışığa maruz kalmış olarak saklayın ve saklayın.
  5. DNA polimerazı orijinal tüplerde -20 °C'de 1 yıla kadar saklayın.
  6. 10x polimeraz tamponunu 1.5 mL'lik tüplerde 660 μL'lik hacimlerde -20 °C'de 1 yıla kadar alikotlayın ve saklayın.
    1. 10x polimeraz tamponunun 1x tampon dilüsyonları için, 0.5 mL tüplerde 89.1 μL PCR derecesi H2O'ya 9.9 μL 10x tampon ekleyin; -20 °C'de 1 yıla kadar saklayın.
  7. 1 M MgCl2'yi 0,5 mL'lik tüplerde 70 μL'lik hacimlerde 4 °C'de ışıktan 1 yıla kadar uzakta saklayın ve saklayın.
  8. İleri ve geri telomer (T) ve tek (S) kopya gen oligonükleotid liyofilize primerleri oda sıcaklığında ışıktan uzakta saklayın. Dört spesifik oligonükleotid primer dizisi Tablo 2'de sunulmuştur.
    NOT: Bu protokoldeki tek kopya gen albümindir; farklı bir tek kopya gen seçiliyorsa, kabul edilebilir PCR verimliliğini sağlamak için primer konsantrasyonlarının ayarlanması gerekebilir.
    1. Astar sulandırma: Her liyofilize primer tüpünü 10 saniye boyunca vorteksleyin ve ardından 1x TE tamponu eklemeden önce liyofilize peletin tüpün dibinde olduğundan emin olmak için tüpleri 5 saniye boyunca bir mini santrifüje yerleştirin.
    2. Her bir primer tüpünü nM konsantrasyonu ([nM] = alfa) açısından kontrol edin ve μL cinsinden alfa değerinin 10x'ine eşit 1x TE ekleyerek her bir primer tüpünü rehidre edin (örneğin, tüp üzerindeki nM konsantrasyonu 24.6 nM ise, daha sonra primer tüpüne 246 μL 1x TE ekleyin) her bir astarın 100 μM'lik bir çözeltisini oluşturmak için.
    3. Aliquot ileri ve geri telomer primerleri 16 μL hacimlerde ayrı ayrı ve ileri ve geri albümin primerlerini 11 μL hacimlerde ayrı ayrı. Dört tip astar alikotunu da -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.
  9. dNTP karışımı: Dört dNTPS tipi 25 mM stok çözeltisinin her birinden (yani toplam 16-32 tüp) 4-8 tüpü 10 saniye boyunca vorteksleyin ve ardından bir mini santrifüj kullanarak oda sıcaklığında hızlı bir şekilde döndürün. Tüpleri mini santrifüjdeki tüp konumlarına eşit bir dağılım gösterecek şekilde yerleştirin ve ardından makinenin yaklaşık 5 saniye dönerek tam hıza ulaşmasını sağlamak için kapağı kapatın.
    1. 5 mL'lik bir tüpte, her tüpten 200-250 μL ekleyin, dört dNTP tipinin her birinin eşit parçalarının eklendiğinden emin olun ve dNTP karışımını girdaplayın.
    2. 210 μL karışımı 0,5 mL'lik tüplerde toplayın ve -20 °C'de 1 yıla kadar saklayın.
  10. Stok DTT'yi -20 °C'de saklayın ve oda sıcaklığında 3 M sodyum asetat stoklayın.
    1. DTT çözümü: Paslanmaz çelik bir spatula kullanarak darası alınmış bir tartı teknesinde 0.1545 g DTT'yi ölçün.
      DİKKAT: Ditiyotreitol (DTT) tehlikeli bir reaktiftir. DTT yutulduğunda zararlıdır, cilt tahrişine neden olur ve ciddi göz hasarına neden olabilir. Bireyler DTT'yi kullanırken koruyucu eldiven, göz koruması ve yüz koruması giymelidir. Ek olarak, bireyler DTT buharlarını solumaktan kaçınmalı, DTT ile çalışırken PCR başlığında çalışmalı ve uzun süreli veya tekrarlanan maruziyetten kaçınmalıdır.
    2. 15 mL'lik bir tüpe 33.33 μL sodyum asetat ve 9.967 μL PCR derece H2O ekleyerek 10 mL 0.01 M sodyum asetat yapın ve iyice girdap yapın. Ölçülen DTT'yi 15 mL'lik 0.01 M sodyum asetat tüpüne ekleyin. Kalan DTT'yi toplamak için yaklaşık 100 μL 0.01 M sodyum asetat çözeltisini tartım teknesine aktarın. 100 μL'yi tekrar 15 mL'lik tüpe pipetleyin. Tüm DTT çözeltiye girdikten sonra, tüpü tamamen eriyene kadar girdaplayın.
    3. 15 mL'lik tüpün içeriğini bir yükleme oluğuna dökün, tüm çözeltiyi yükleme oluğunun bir ucundan 10 mL'lik plastik bir şırıngaya aspire edin. Doldurulmuş şırınganın ucuna 25 mm steril bir 0,2 μm selüloz asetat şırınga filtresi takın, 1 dakika boyunca tamamen doymasına izin verin ve şırınga pistonunu hafifçe aşağı iterek çözeltiyi yeni bir 15 mL'lik tüpe yavaşça damlatın, tüm çözeltinin filtreden yeni 15 mL'lik tüpe damlamasını sağlayın.
    4. Aliquot DTT çözeltisini 200 μL'lik hacimlerde 0,5 mL'lik tüplere indirin ve -20 ° C'de 6 haftaya kadar saklayın.

Tablo 1: Reaktiflerin nihai hacimleri ve konsantrasyonları. Bireysel alikotlarda, ana karışımda ve PCR kuyularında reaktiflerin hacimleri ve konsantrasyonları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Telomer ve tek kopya gen oligonükleotid primer dizileri. Metodolojide kullanılan telomer ve albümin tek kopya gen primer dizilerinin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Genomik DNA ekstraksiyonu ve numune hazırlama

  1. Analitik numunelerin ekstraksiyonu: Laboratuvarda kitleri veya yerleşik yöntemleri kullanarak üreticinin yönergelerine uygun olarak numuneler için bir genomik DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
    1. DNA numunesinin kalitesini bir spektrofotometre ve bir florometre kullanarak çift sarmallı DNA (dsDNA) ile kontrol edin. Kabul edilemez ortalama 260/280 ve 260/230 oranlarına veya tespitin altında dsDNA konsantrasyonuna (<0.20 ng/μL) sahip numuneler22,23 TL için analiz edilmemelidir. Ek olarak, dsDNA konsantrasyonu florometre (>1000 ng/μL) kullanılarak bir okuma oluşturmak için çok yüksekse, numuneyi seyreltin ve testi tekrarlayın.
      NOT: Burada sunulan sonuçlar için, nükleik asitlerin saflığı için kabul edilebilir değerler, 1.6 ila 2.0 arasında 260/280 oranı ve 2.0 ile 2.2 arasında 260/230 oranıydı.
  2. Kontrol numunelerinin ekstraksiyonu: Belirli bir proje için test edilen denek numuneleri ile aynı biyolojik materyalden türetilen bir kontrol numunesi üzerinde bir genomik DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin. Tüm kohort için çalıştırılması beklenen tüm plakalar için yeterli kontrol DNA'sının çıkarıldığından emin olun, böylece tüm tahliller için tek bir DNA standardı kullanılır.
    1. Kontrol DNA numune kalitesini spektrofotometre ve florometre ile kontrol edin. Kontrol numunesi, kabul edilebilir ortalama 260/280 ve 260/230 oranlarına ve saptanabilir dsDNA22,23 konsantrasyonlarına sahip olmalıdır.
    2. Aliquot, numune tipi ve tarihi ile etiketlenmiş 0.5 mL'lik tüplerde 150 μL miktarlarında 2 ng/μL konsantrasyonda DNA'yı kontrol eder. Kontrol DNA alikotlarını -20 °C'de 5 yıla kadar saklayın. Aynı kohort veya araştırma projesinden alınan tüm örneklerin tüm plakaları için bir kontrol DNA örneği kullanın. Bu stok alikotlarını önceden hazırlayın.
  3. Analitik numunelerin hazırlanması: Başlangıç konsantrasyonu >5 ng/μL olan numuneler için, konsantrasyonu 2,5 - 5,0 ng/μL arasında olacak şekilde seyreltmek için uygun miktarda ekstrakte edilmiş DNA numunesi (Ek Dosya 1 MMqPCR Kurulum Sayfası, Sütun F) ve PCR derecesi H2O (Ek Dosya 1 MMqPCR Kurulum Sayfası, Sütun G) ekleyerek bir tam sayı seyreltme faktörü kullanarak seyreltme alikotları oluşturun MMqPCR Kurulum Sayfası, Sütun K). Numuneleri <5 ng/μL konsantrasyonla seyreltmeyin, ancak bu protokolü kullanarak numuneyi 3x test etmek için yeterli hacmi elde edin.
    NOT: Her numunenin karşılık gelen PCR şerit tüpüne 15 ng DNA eklenebilmesi için numune hazırlama sırasında seyreltme alikotları yapılmalıdır. Numune alikotları, numunenin kalite kriterlerini geçememesi ve yeniden çalıştırılması gerekmesi durumunda, teknisyenlerin gereksiz donma-çözülme döngülerinin stok numune DNA bütünlüğünü etkilemesini önlemesine olanak tanır. Ek Dosya 1'de bulunan örnek MMqPCR Şablonu, seyreltme alikotlarını hazırlamak için doğru seyreltme faktörünün ve hacimlerinin belirlenmesine yardımcı olabilir (Ek Dosya 1, MMqPCR Kurulum Sayfası, Sütun E-I).
    1. PCR şeritlerini, Ek Dosya 1 MMqPCR Kurulum Sayfasında ayrıntılı olarak açıklandığı ve Tablo 3'te listelendiği gibi, PCR şeridi A'daki A1-8 numuneleri, PCR şeridi B'deki numuneler ve PRC şeridi C'deki C1-8 numuneleri ile doldurun ve uygun şekilde seyreltilmiş numune miktarları (Ek Dosya 1 MMqPCR Kurulum Sayfası, Sütun L) ve PCR derecesi H2O miktarları (Ek Dosya 1 MMqPCR Kurulum Sayfası, Sütun M) PCR tüpü başına toplam 15 ng DNA miktarı ve toplam 75 μL hacim için. Bir kenara koyun.
      NOT: PCR şeritlerindeki numuneler, ertesi gün kaplanmak üzere gece boyunca 4 °C'de saklanabilir.
  4. Standart eğrinin hazırlanması: Bir kontrol DNA alikotunu çözün, 30 saniye girdap, 5 saniye santrifüjleyin ve tam hacmi (150 μL) standart eğri (SC) PCR tüp şeridindeki ilk tüpe aspire edin.
    1. SC PCR şeridinin ikinci ila sekizinci tüplerine 70 μL PCR sınıfı H2O pipetleyin. 70 μL'yi aspire etmeden ve ikinci PCR tüpüne dağıtmadan önce birinci tüpte kontrol DNA'sını iyice yeniden süspanse edin. 30 saniye bekleyin, ardından 70 μL'yi aspire etmeden ve üçüncü PCR tüpüne dağıtmadan önce ikinci PCR tüpündeki çözeltiyi iyice yeniden süspanse edin. Yedi standartta 2 kat seri seyreltme oluşturmak için bunu üç ila yedi arasındaki tüpler için tekrarlayın. Son tüp, şablon olmayan bir kontrol (NTC) olarak işlev görmesi için yalnızca PCR sınıfı H2O içermelidir. SC PCR şeridini bir kenara koyun.

Tablo 3: Numunelerin organizasyonu ve plakadaki kontrol standardı. Tüm numunelerin ve standartların 96 oyuklu bir PCR plakası üzerindeki yeri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

3. MMqPCR ana karışım hazırlama

  1. DNA polimeraz hariç Tablo 1'de listelenen ana karışım reaktif alikotlarını toplayın ve PCR başlığının içinde oda sıcaklığına gelmelerine izin verin. 1x tampon alikotuna 1 μL SYBR Green alikot ekleyin.
    NOT: Bu kesin miktar, tahlil sırasında pipet doğruluğunun sınırlamaları nedeniyle doğru SYBR konsantrasyonunu oluşturmak için gereklidir, bu nedenle bir seferde yalnızca bir plaka çalıştırılsa bile bu miktar değişmeden kalmalıdır.
  2. Tüm alikotları 10 saniye vorteksleyin, 5 saniye santrifüjleyin, ardından 5 M betaini (şimdi ana karışım tüpü) tutan 5 mL'lik tüpe aşağıdaki miktarlarda reaktif ekleyin: 1.235.2 μL PCR derecesi H2O, 640 μL 10x tampon, 204.8 μL dNTP, 192 μL DTT, 64 μL MgCl2, 48 μL SYBR Green / 1x tampon (adım 3.1'den itibaren), her iki telomer primerinin 14.4 μL'si ve her iki albümin primerinin 9.6 μL'si Tablo 1'de listelenmiştir.
  3. DNA polimerazı -20 °C depodan çıkarın, 10 saniye girdap, 5 saniye santrifüjleyin, ardından ana karışıma yavaşça 128 μL ekleyin; DNA polimerazı hemen -20 °C depolamaya geri taşıyın.
  4. 5 mL'lik ana karışım tüpünü 30 saniye boyunca vorteksleyin.

4. 96 oyuklu plakanın hazırlanması

  1. PCR başlığının içine iki adet 96 oyuklu plaka, yükleme teknesi ve çok kanallı pipet ucu yerleştirin. Her plakayı plaka numarası (1 veya 2) ile etiketleyin. Birinci plakayı (P1 plakası) sütunların numaraları ters olacak şekilde 180° çevirin. İkinci plakayı (P2) teknisyene bakacak şekilde bırakın.
  2. 5 mL'lik ana karışım tüpünün içeriğini yükleme oluğuna dökün. Tüpte kalan çözeltiyi toplamak ve dağıtmak için bir pipet ucu kullanın.
  3. Sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için uçları çok kanallı pipetin üzerine yükleyin ve her pipet ucunun tabanını itin. Uçların, ana karışımın aspire edileceği çıkış bölgesinde herhangi bir filtreye sahip olmadığını kontrol edin; Bir filtre parçası varsa, ucu değiştirin.
  4. Plakaları viskoz ana karışımla doldurmak için ters pipetleme kullanın, yükleme teknesini döndürün ve ardından pipet uçlarına 15 μL'den daha fazla aspire ederek ilk duraktan sonra pipet pistonuna bastırın ve uçların aynı anda aynı hacimle dolduğundan emin olun. Ana karışımı bir sütuna boşaltırken, pistonu ilk sonuna kadar bastırın ve ekstra ana karışımı pipet uçlarında bırakın. Pistonu basılı bırakarak, uçları tekrar yükleme oluğuna daldırın ve uçları 15 μL daha doldurmak için pistonu serbest bırakın. Her iki plakayı da doldurmak için aynı uçları kullanın.
    1. Ana karışımı, plakalar arasında geçiş yaparak önce tüm çift veya tüm tek sütunlara atarak plakaları doldurun (yani, teknisyen tek sütun numaralarıyla başlamayı seçerse, önce P2'deki sütun 1, ardından P1'deki sütun 1, ardından P1'deki sütun 1, ardından P3'deki sütun 2, vb.). Teknisyen soldan sağa çalışarak serinin tüm kuyularını (tek veya çift) doldurduktan sonra, diğer sütun serilerini (çift veya tek) aynı şekilde yapın. Bu işlemin bir tablosu için Şekil 2'ye bakın.
      NOT: Bu şekilde plaka doldurma, plakalar boyunca konum etkilerini kontrol etme işlevi görür.
  5. Numuneleri ve standart eğriyi içeren dört kapalı PCR şeridini girdaplayın, ardından her birini 5 saniye boyunca bir mini santrifüjde döndürün.
    1. PCR tüp rafındaki PCR şeritlerini, plakaya nasıl yerleştirileceklerine göre sıralayın. P1 için ilk 3 sütun numunelerdir (PCR şeridi A), sütun 4-6 standarttır (PCR şeridi S), sütun 7-9 numunelerdir (PCR şeridi B) ve sütun 10-12 numunelerdir (PCR şeridi C; bkz. Şekil 3 ve Tablo 3). Teknisyene göre 180° döndürüldüğünde P2 doldurulduğundan, sütunlar tam tersi olacaktır.
  6. Her iki plakayı da 180° çevirin, böylece sütunların numaraları her plaka için teknisyene göre ters çevrilir (yani, teknisyen daha önce P2 etiketine baktıysa, şimdi plaka kenarındaki P1 etiketine bakacaktır).
  7. Çok kanallı pipeti 10 μL'ye ayarlayın ve pipet uçlarını adım 4.3'te açıklandığı gibi çok kanallı pipete yükleyin.
    1. Solüsyonları yeniden süspanse etmek için çok kanallı pipeti kullanın, ardından PCR şeridi A'dan başlayarak 10 μL numuneleri ve standart solüsyonları aspire etmek ve dağıtmak için adım 4.4'te açıklandığı gibi ters pipetleme gerçekleştirin.
    2. Her bir plakanın ilk 3 sütununu, ana karışımın plakaya yerleştirildiği gibi (yani çift veya tek) sütunları değiştirerek PCR şeridi A'yı kullanarak doldurun.
    3. Standart eğri PCR şeridini kullanarak sonraki üç sütunu doldurun. Bu şerit için, çok kanallı pipeti kullanarak tüm şeridi yeniden askıya almadan önce, ~ 90 μL'ye ayarlanmış 200 μL'lik bir pipet kullanarak 7. standart seyreltme tüpünü (sondan ikinci) yeniden süspanse edin.
      NOT: Bu tüpteki daha büyük hacim ve daha küçük DNA konsantrasyonu, zayıf karıştırma nedeniyle sıklıkla PCR plaka kuyuları boyunca çeşitli ölçümlere neden olur. Bu tüpü karıştırmak için daha büyük bir hacim kullanmak, DNA çözeltisini daha iyi homojenize eder.
    4. Sonraki üç sütunu PCR şeridi B ile ve son üçünü PCR şeridi C ile doldurun. Her bir PCR şeridi arasındaki pipet uçlarını değiştirin, her iki plakadaki 96 oyuğun tamamını Şekil 3'te belirtildiği gibi karşılık gelen numuneler ve kontrol standardı ile doldurun.
  8. Plakalar doldurulduktan sonra, kuyucukların kenarlarındaki sıvının dibe akmasını sağlamak için plakayı tezgah üstüne hafifçe vurun ve ardından plaka üstlerini sızdırmazlık filmleri kullanarak kapatın. Sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için filmin tüm kenarlarına bastırmak için parmak uçlarınızı kullanın.
    1. Plakaları, davlumbazın üst kısmında 30 saniye döndürerek karıştırın, ardından sızdırmaz plakaları, kuyu açıklıkları merkeze bakacak şekilde 2 dakika boyunca plaka döndürücüye yerleştirin.
    2. Plakaları, plakaların sütunlarının numaraları okunaklı bir sırayla olacak şekilde bir termocycler'a yerleştirin. Termocycler üstünü kapatmadan önce her plakanın üstünü temizlemek için temiz bir mendil kullanın.

figure-protocol-1
Şekil 2: Plakaları doldurma işlemi. (A) Önce tek sütunları doldurmayı seçerseniz, bu, kuyuların doldurulma sırasıdır. (B) Önce çift sütunları doldurmayı seçerseniz, bu, kuyuların doldurulma sırasıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-2
Şekil 3: Plaka düzeni. PCR şeridi A, şerit B, şerit C ve standart eğri (SC) şeridinin tümü, her numunenin ve standart seyreltmenin çift üçlüsünü üretmek için her plakadaki üç sütunu doldurmak için kullanılmalıdır. Bu diyagram, her şeritle hangi sütunların doldurulması gerektiğini gösterir. İkinci plaka yüklemeden önce 180° döndürülür (sütun ve satır başlıklarının baş aşağı olduğuna dikkat edin), ancak plaka birinci plaka ile aynı şekilde doldurulur, bu da olası pipetleme hatalarını ortadan kaldırırken plakalar arasındaki konum etkilerini kontrol etmeye devam eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. MMqPCR termosilleme

  1. Adım 4.8.1'de plakalar dönerken, bilgisayarı ve termodöngüleyicileri AÇIN. Thermocycler yazılımını açın. Bu protokol, CFX Maestro yazılımının kullanımını açıklar.
  2. MMqPCR termosikling protokolü19'a uygun olarak TL termosikling protokolünü oluşturun (Şekil 4).
    1. DNA polimerazı 95 °C'de 15 dakika aktive etmek için bir inkübasyon adımı ekleyin.
    2. Astar-dimer bağlanmasını önlemek için, 15 saniye boyunca 94 °C'de, 1 dakika boyunca 49 °C'de iki döngü, ardından 15 saniye boyunca 94 °C'de 3 döngü, 15 saniye boyunca 59 °C'de 3 döngü çalıştırın.
    3. Telomer amplifikasyonu için, 15 sn boyunca 85 °C'lik 27 döngü, 30 sn için 74 °C, ardından sinyal alımı ekleyin.
    4. Albümin amplifikasyonu için, 15 saniye boyunca 94 °C'lik 31 döngü, 30 saniye boyunca 84 °C, ardından sinyal alımı ekleyin.
    5. Termal döngü protokolünde her artan derece için 5 sn aralıklarla 59 °C ila 95 °C arasında bir erime eğrisi ekleyin.
  3. Her iki termodöngüleyici için Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın. İstendiğinde, analiz dosyaları için bir başlık sağlayın.

figure-protocol-3
Şekil 4: MMqPCR testinin termosiklasyon profili. Yazılımda orijinal termosikling protokolüne uygun olarak oluşturulan MMqPCR protokolü19. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. MMqPCR veri analizi

  1. Isıl döngü tamamlandığında, işlenmiş numuneler için TL değerleri üretmek için verileri aşağıdaki şekilde analiz edin.
  2. Yazılımda, Plaka Kurulumu özelliğini seçin. Açılır menüde, Plakayı Görüntüle/Düzenle'ye tıklayın.
    1. Tüm kuyucukları vurgulayın ve Florofor Seç'e tıklayın, ardından SYBR etiketli kutuyu işaretleyin ve diğer tüm kutuların işaretini kaldırın. Tamam'a tıklayın.
    2. Tüm kuyular hala vurgulanmış durumdayken, Yük kelimesinin yanında, SYBR'nin yanındaki kutuyu işaretleyin. Şimdi tüm kuyuların üzerinde SYBR yazılı olmalıdır.
    3. Ardından, standart kontrol seri seyreltmesinin üstündeki veya altındaki üç NTC kuyusunu vurgulayın ve sağdaki numune türü menüsünden NTC'yi seçin. Üç kuyu şimdi sarı olmalı ve NTC olarak adlandırılmalıdır. Şekil 5A , P1 için hangi kuyuların seçilmesi gerektiğini ve Şekil 5B , P2 için hangi kuyuların seçilmesi gerektiğini göstermektedir.
      NOT: P2, P1'den ters çevrilecektir, bu nedenle NTC, P1 için 4-6 sütunlarının altında ve P2 için 7-9 sütunlarının üstünde olacaktır.
    4. Standart kontrol seri seyreltmesinin 21 kuyusunu vurgulayın ve numune tipi menüsünden Standart'ı seçin. Bu kuyular yeşil olmalıdır. Bu kuyular hala vurgulanırken, Teknik Çoğalt'ı tıklayın. Çoğaltma Boyutu menüsünden 3'ü seçin, ardından Yatay > Uygula'yı seçin. Bu kuyucuklar, Std-1'den Std-7'ye kadar üçlü setler halinde etiketlenmelidir.
    5. Standart hala vurgulanmış durumdayken aşağı kaydırın ve Seyreltme Serisi'ni seçin. Seyreltme Faktörü alanına 2 girin ve ardından aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi plaka numarasına göre seyreltme başlangıç konsantrasyonunu ve yönünü yazın.
    6. P1 plakası için, başlangıç konsantrasyonu alanına 2.00E-03 girin ve Azaltma kutusunu işaretleyin ve ardından Uygula'yı seçin. 21 kuyucuğundaki değerler, yukarıdan aşağıya 2.00E-03 ile 3.13E-05 arasında değişen her bir kuyuda yazılı konsantrasyon değerlerine sahip olmalıdır.
    7. P2 plakası için, başlangıç konsantrasyonu alanına 3.13E-5 girin ve Artırma kutusunu işaretleyin ve ardından Uygula'yı seçin. 21 kuyudaki değerler, yukarıdan aşağıya 3.13E-05 ile 2.00E-03 arasında değişen her bir kuyuda yazılı konsantrasyon değerlerine sahip olmalıdır.
  3. Örnekler için PCR şeridi A sütunlarını vurgulayın (P1 ve P2 için 1-3), örnek türü menüsünden Bilinmiyor'u seçin ve ardından Teknik Çoğaltma'yı seçin. Çoğaltma Boyutu menüsünden 3'ü seçin, ardından Yatay > Uygula'yı seçin. Bu sütunlar için kuyucuklar mavi olmalı ve Unk-1'den Unk-8'e kadar 3'lü setler halinde sıra sıra etiketlenmelidir.
    1. PCR şeridi B için sütunlar için adım 6.3'ü tekrarlayın (P1 için sütun 7-9 ve P2 için 4-6 sütunları). Unk-9 ile Unk-16 arasında etiketlenmelidirler.
    2. PCR şeridi C için sütunlar için adım 6.3'ü tekrarlayın (P1 ve P2 için sütun 10-12). Unk-17 ile Unk-24 arasında etiketlenmelidirler. 6.2-6.3.2 adımları tamamlandığında, plaka kurulum pencereleri Şekil 5A,B'ye benzemelidir.
  4. Plaka düzenleyici penceresinin sağ alt kısmındaki Tamam'ı seçin. İstendiğinde değişiklikleri uygulamak için Evet'i tıklatın.
  5. Test düzeyinde kalite kontrol için, sırasıyla telomer ve albümin amplikonlarına karşılık gelen termosiklasyon profilinin hem Adım 9 hem de Adım 12 için nicelik belirleme sekmesindeki eğrilerin uygun olduğundan emin olun (örneğin, ters amplifikasyon eğrileri yok). Eğrilere, yazılım penceresinin sağ orta tarafındaki açılır menüden erişilir. Şekil 6A,B uygun eğrileri gösterir.


    1. figure-protocol-4


    1. figure-protocol-5







  9. figure-protocol-6

figure-protocol-7

figure-protocol-8

figure-protocol-9

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tablo 4 ve Tablo 5'te sunulan sonuçlar, protokol izlenerek elde edilen yüksek oranda tekrarlanabilir TL ölçümlerine bir örnek sunmaktadır. Bu sonuçlar için, üreticilerin yönergelerine göre ticari bir kit kullanılarak 24 periferik kan mononükleer hücre (PBMC) örneğinden DNA ekstrakte edildi. Bu 24 numune, iki adet 96 oyuklu plaka boyunca çalıştırıldı. Tüm DNA örnekleri, tahlil uygunluğunu ve numune seyreltme faktörünü belirlemek için ortalama 260/280 oranı, ortalama 260/230 oranı ve dsDNA konsantrasyonu kullanılarak spektrofotometre ve florometre ile kalite açısından kontrol edildi (Tablo 6). Tablo 6 ayrıca, bir spektrofotometre kullanılarak ölçülen DNA konsantrasyonundan farklı olabilen dsDNA konsantrasyonunun ölçülmesinin önemini vurgulamaktadır. Bu değişkenlik, nicelemeye yönelik farklı yaklaşımların bir sonucudur. Spesifik olarak, spektrofotometre, 280 nm'de absorpsiyona dayalı olarak DNA konsantrasyonunu türetir ve absorbans okumalarını etkileyen kirleticilerden (örn. protein, tuz vb.) kaynaklanan dalgalanmalara karşı hassastır. Buna karşılık, bir florometre kullanılarak ölçülen dsDNA konsantrasyonları, dsDNA'ya spesifik olarak bağlanan bir boyanın floresansı ile belirlenir ve bu nedenle, DNA içeriğinin daha doğru bir yansıması olduğu varsayılır. DNA örnekleri, MMqPCR TL analizinden önce üç adede kadar donma-çözülme döngüsüne maruz kaldı. Kontrol DNA'sı, 2 ng/μL'den 0.0313 ng/μL DNA'ya yedi noktalı bir seri seyreltme oluşturmak için kullanılan bir bireyden PBMC'lerin havuzlanmış DNA ekstraksiyonlarından oluşturuldu. PCR Step 9 (telomer amplicon) ve Step 12 (bu protokolde tek kopya gen amplicon, albumin) için oluşturulan bağımsız standart eğriler Şekil 6A,B'de sunulmuştur. Tahliller, Şekil 8'de görüldüğü gibi, bireysel amplikon ürünlerinin farklı sıcaklıklarda üretildiğini gösteren bir eriyik eğrisi oluşturan ticari bir Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi üzerinde çalıştırıldı.

Tablo 4: Optimum temsili sonuçlar için MMqPCR ölçümünden elde edilen çıktı verileri. 24 örnek için ortalama T/S oranları, SD'ler, CV'ler ve Z-skorlu TL. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 5: Telomer uzunluğu veri çıkışı. MMqPCR testinden elde edilen ham veriler yazılımda analiz edilir, ardından daha fazla analiz ve kalite kontrol için Ek Dosya 1 olarak eklenen elektronik tablo şablonuna eklenir. Bu TL şablonu çıktı sayfası, her iki plakadaki her numune için numune kimliklerini, ortalama TL'leri, SD'leri ve CV'leri görüntüleyen verilerin bir özetini sunar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 6: Numune sonuçları için Spektrofotometre ve Florometre DNA kalite ölçümleri. Numune başına dsDNA ve herhangi bir kontamine için çift spektrofotometre analizinden ve tekil florometre ölçümünden elde edilen kalite kontrol verileri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-1
Şekil 8: Örnek erime eğrisi. Yazılımda oluşturulan örnek veriler için erime eğrisi. Önceki tepe ~ 80 ° C, telomer amplikonunu temsil eder ve ~ 89 ° C'deki ikincil tepe albümin amplikonunu temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2002'den önce daha büyük popülasyon temelli çalışmalarda en yaygın olarak kullanılan TL ölçümü yöntemi, terminal kısıtlama fragmanı uzunluklarının (TRF) Southern blot analiziydi24,25. TRF, özel laboratuvarlarda mükemmel hassasiyet ve tekrarlanabilirlik sağlamasına rağmen, gerekli DNA'nın miktarı ve kalitesi ve sınırlı verim nedeniyle uygulanabilirlik açısından sınırlıdır, böylece qPCR bazlı TL testlerinin ve ardından MMqPCR testinin artan kullanımı için zemin sağlar. MMqPCR TL yöntemi, her bir QC kriterine dikkat edilerek kurulduğunda, optimize edildiğinde ve sürdürüldüğünde tekrarlanabilir TL ölçümü sağlar. Analiz edilen her kohort için spesifik ICC'nin hesaplanması ve raporlanması, test güvenilirliğini sağlamak için gereklidir. DNA kalitesine ve teknik uzmanlığa tabi olmakla birlikte, MMqPCR yöntemi, küçük miktarlarda DNA gerektirdiği, singleplex PCR'den daha güvenilir olduğu ve reaktif maliyetleri ve teknisyen süresi açısından diğer yöntemlere göre daha verimli olduğu için TL'yi araştıran büyük popülasyon tabanlı çalışmalar için çok uygundur. Yüksek ICC'ler üretme yeteneği, büyük popülasyon tabanlı TL çalışmaları için MMqPCR kullanımını desteklemek için ek veriler sağlar. MMqPCR TL ölçümü, TL'nin tüm nedenlere bağlı mortalite, yaşlanma, yaşam boyu stres, çevresel maruziyetler ve kardiyovasküler hastalık ve kanser gibi fiziksel sağlık sonuçlarının bir biyobelirteç olarak rolünü tanımlamayı amaçlayan çok çeşitli çalışmalara uygulanabilir 4,7,8,10,11,12,13,26,27,28, 29,30,31.

MMqPCR yönteminin bir sınırlaması, TL'yi tek kopya gen, ana karışım bileşimi ve PCR döngü parametrelerinin32 seçimine bağlı olarak değişen göreceli bir uzunluk tahmini olan bir T/S oranı olarak rapor etmesidir. T / S oranı birimsizdir. Bu nedenle, diğer TL ölçüm metodolojileri ile birleştirilmeden, bu yöntem 18,33,34 baz çifti değerlerinde tahminleri raporlama yeteneğine sahip değildir. Sonuç olarak, T/S oranı, çalışmalar arasında alaka düzeyine sahip olmak için bir Z-skoruna dönüştürülmelidir35. Bunu laboratuvarlarda, yöntemlerde ve tahlillerde yaparken çok dikkatli olunmalıdır. Ayrıca, bu yöntem, jel bazlı hibridizasyon deneylerinde olduğu gibi, interstisyel telomerlerin miktar tayinini içerebilir. Bununla birlikte, bu diziler genom başına toplam telomer DNA içeriğinin çok küçük bir bölümünü oluşturur. Ek olarak, interstisyel telomerik dizilerin, kanonik telomer tekrarlarından sapan uyumsuz baz çifti dizileri içerme olasılığı daha yüksektir, bu da primer bağlanması ve amplifikasyon olasılığını azaltır. Ek olarak, MMqPCR testi için gereken minimum DNA miktarı avantajlı olsa da, TL'nin qPCR tabanlı ölçümlerinin, numune saklama koşulları, DNA ekstraksiyon metodolojisi ve biyolojik doku dahil olmak üzere DNA kalitesini ve bütünlüğünü etkileyen pre-analitik faktörlerden etkilendiğine dikkat etmek önemlidir36,37. Bu faktörler için analitik kontrolün, qPCR38 kullanılarak oluşturulan TL ölçümlerinin dış geçerliliğini artırabileceği gösterilmiştir. Buna rağmen, DNA kalitesindeki farklılıkların MMqPCR testi ile üretilen TL üzerindeki etkisinin özellikle sistematik olarak değerlendirilmesi gerekir, çünkü bu yaklaşımı kullanarak bir numunenin doğru bir TL tahmini oluşturmak için yeterli kalitede olup olmadığını belirlemek için veriye dayalı güncel bir kılavuz mevcut değildir. Bu sınırlamalara rağmen, bu testin popülasyon düzeyinde sağlık sonuçları üzerine yapılan çalışmalar için uygulamaları dikkate değerdir.

MMqPCR testini kullanırken, hassasiyet ve verimin sürekli olarak değerlendirilmesi gerekir. Şu anda tasarlandığı gibi, teknisyenler iki termodöngüleyici kullanarak çift plakalar üzerinde aynı anda üç kopya numune çalıştırır. Birden fazla termodöngüleyicinin yokluğunda, azalan verim pahasına bile daha fazla hassasiyet için çift üçlü ölçümleri ve çalışma plakalarını sırayla tutmanızı öneririz. Hassasiyet yerine verime öncelik verme kararına, örneğin tek üçlü ölçümler kullanarak, analitik numunelerin analizine devam etmeden önce elde edilen ICC'lerin kapsamlı bir şekilde test edilmesi ve değerlendirilmesi eşlik etmelidir. Verim ve hassasiyet ile ilgili kararlar verirken, numune boyutu ve numune DNA'sının kalitesi dikkate alınmalıdır. Daha küçük bir örnek boyutu veya düşük kaliteli DNA örnekleri, daha yüksek hassasiyete öncelik verilmesini gerektirir23. Bu, ilgili gruplardan örneklerle çalışırken daha da önemlidir (örneğin, aile üyeleri, birden fazla zaman noktasına sahip denekler). Bu gibi durumlarda, dikkatli bir planlama, örneğin deneye başlamadan önce ilgili numuneleri aynı plakaya atamak, yanlışlıkla plaka karıştırmaya göre gruplandırma yoluyla istatistiksel güç kaybını önlemenin bir yoludur.

Bu test için, DNA numune kalitesini değerlendirmek için bir spektrofotometre kullanıldı: 260/280 oranları için 1.6-2.0 ve 260/230 oranları için 2.0-2.2 aralığındaki numuneler kabul edilebilir olarak kabul edildi. Bu kalite değerlendirmesi ve çift sarmallı DNA'nın florometre ile doğru bir şekilde değerlendirilmesi, tekrarlanabilir TL verilerinin elde edilmesi için bu protokoldeki kritik adımlardır. Numune kalitesinin belirlenmesinde, parça boyutu ve/veya agaroz jel ile belirlenen DNA kalitesinin özet ölçümleri (örneğin, DNA bütünlük numarası) gibi DNA bütünlüğünün diğer, daha tanımlayıcı ölçümleri de kullanılabilir38. Ayrıca, numunelerin seyreltilmesinin yalnızca MMqPCR testinin çalıştırılması için numune hazırlama sırasında gerçekleşmesini öneririz. Bu, DNA alikotlarının ekstraksiyondan sonra mümkün olduğunca az miktarda manipülasyona maruz kalmasını sağlar ve test öncesi işlemedeki değişkenliği azaltır. DNA numunelerinin taşınması gerekiyorsa, daha düşük konsantrasyonlarda DNA numunelerinde meydana gelen bozulmayı azaltmak için mümkün olan en yüksek konsantrasyonda kuru buz üzerinde sevk edilmelidir39,40. Donma-çözülme döngüleri ile meydana gelen DNA bozunması nedeniyle, stok DNA'ya donma-çözülme sayısı en aza indirilmelidir41. Kohort çalıştırılmadan önce havuzlanmış kontrol DNA'sının alikotları oluşturulmalı ve tahlil çalıştırılmadan önce bireysel analitik DNA örneklerinin alikotları oluşturulmalıdır.

Tahlil performansı ve kalite kontrolünün temel metrikleri arasında NTC sinyali, plakalar arası ve plaka içi CV'ler ve standart eğriR2 bulunur. Kalite kontrol kriterlerinin karşılanamaması çeşitli yollarla azaltılabilir. PCR derece H2O stoklarının düzenli olarak değiştirilmesi ve her bir plaka çifti için PCR derece H2O alt stoklarının kesilmesi, NTC amplifikasyonunun yanı sıra kontaminasyon kaynaklarını da en aza indirecektir. Kontaminasyonu azaltmak için ek adımlar şunları içerir: yalnızca MMqPCR testine adanmış özel bir PCR başlığının belirlenmesi; PCR başlığını ve ekipmanını bir DNA dekontamine edici solüsyon ile silmek; odayı ultraviyole ışıkla ışınlamak; ve PCR başlığındayken steril teknik uygulamak. Test tekrarlanabilirliğini artırmak ve CV'leri azaltmak için, DNA örneklerini pipetlerken numuneleri, seyreltmeleri ve PCR şeritlerini ilgili girdap adımlarında kuvvetlice girdaplamak ve iyice yeniden süspanse etmek önerilir. Eşik değerin altındaki bir standart R2 eğrisi (<0,995), büyük olasılıkla plaka yükleme sırasındaki pipetleme hatalarına bağlanabilir. Bunu önlemek için, hassas pipetlemeye ve pipetleri yıllık olarak kalibre etmeye dikkat edin, yüklemeden önce standart PCR şeritlerini kuvvetlice karıştırın ve verimli bir iş akışını teşvik etmek için sarf malzemelerini dikkatli bir şekilde düzenleyin. İki makine ve bir plakanın kullanılmasının sürekli olarak daha yüksek CV'ler çıkardığı gözlemlenirse, sorunu iyileştirmenin potansiyel bir yolu olarak makineye servis yapılmalıdır. Termocycler'ın performansını değerlendirmek için üreticinin QC plakaları plakalar üzerinde düzenli olarak çalıştırılmalıdır.

Yukarıda önerilen adımların uygulanmasından sonra bile sorunlar devam ederse, protokoldeki sorunları gidermek için aşağıdaki adımlar kullanılabilir. Tüm reaktiflerin ne zaman alikote edildiğinin ve ilgili son kullanma tarihlerinin kaydını tutmak, zorluklar kaçınılmaz olarak ortaya çıktığında sorun giderme sürecini kolaylaştırmaya yardımcı olabilir. Herhangi bir sorun giderme sürecinin önemli bir parçası, söz konusu en ucuz reaktiften başlayarak, QC kriterlerini geçmeyen plakaların spesifik nedenini belirlemek için bir seferde yalnızca bir reaktifi ayarlamaktır. Örneğin, hem telomer hem de tek kopya gen düşük verimliliğe sahipse, DTT, dNTP'ler veya SYBR alikot gibi paylaşılan reaktifler, amplikon spesifik primerlerden daha olasıdır. Listelenen fiyatta, yeni alikotlar DTT sırasına göre test edilmeli, ardından dNTP'ler ve son olarak, sorun devam ederse, yeni SYBR alikotları test edilmelidir. Tersine, amplikonlardan sadece biri (telomer veya tek kopya gen) düşük bir verime sahipse, zorluğun nedeni daha çok primerlerden biridir. Şekil 8'de sunulan erime eğrisi tepe noktalarının yorumlanması, sorun giderme için bir temel bilgi kaynağı olarak hizmet edebilir. İki erime eğrisi tepe noktasının görselleştirilmesi, belirli bir numuneyle ilgili potansiyel sorunları belirlemek için kullanılabilir, çünkü bireysel bir problem numunesi, standartlar veya kalan analitik numuneler tarafından sergilenen zirvelerin genel eğiliminden öne çıkacaktır. Eriyik eğrisi, belirli bir amplikon için tepe noktaları sistematik olarak diğerinden daha az keskinse, belirli bir primer ile ilgili sorunları teşhis etmek için de kullanılabilir.

Bu makale, halk sağlığı araştırmalarına geniş uygulanabilirlik ile TL ölçümü için MMqPCR testinin nasıl başarılı bir şekilde kurulacağını detaylandırmakta ve bu verimli ve uygun maliyetli yöntemin erişilebilirliğini ve güvenilirliğini artırmak amacıyla kalite kontrol ve sorun giderme için temel önerileri sunmaktadır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmayı mümkün kılan Telomer Araştırma Ağı Danışma Komitesi'ne ve Ulusal Yaşlanma Enstitüsü / Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü finansmanına (U24 AG066528 ve U24 AG066528-S1) teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5 mL TüplerUSA Scientific1605-0099Seal-Rite 0.5 mL Mikrosantrifüj Tüpleri, Steril < br / > Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
1.5 mL TüplerUSA Scientific1615-5599Seal-Rite 1.5 mL Mikrosantrifüj Tüpleri, Steril < br / > Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
100mM DTTEvde UygulanamazStok DTT, seyreltilmiş sodyum asetat ve PCR Sınıf H2O
ile üretilmiştir Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 derece; C 
15 mL TüplerThermo Fisher14-959-53ACorning 352196 Falcon 15mL Konik Santrifüj Tüpleri
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
1M MgCl < alt > 2 < / alt >Thermo Fisher50152107Biotang Inc 1M MgCl < alt > 2 < / alt > 18.2 Megohm Suda Hazırlanmış ve 0.22 Mikron Filtre
ile Filtrelenmiş Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: 4 & derece; C 
1x Evde Altın TamponuUygulanamazPCR Grade H2O
ile seyreltilmiş 10X Altın Tamponu Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 °C; C 
25mM dNTP'lerNew England BioLabsN0446SDeoksinükleotid Çözelti Seti
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 °C; C 
5 mL TüplerThermo Fisher3391276Argos Technologies Mikrosantrifüj Tüpleri ve 5 mL
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
96 Kuyulu PlakaBio-RadHSP9601Sert Kabuklu 96 Kuyulu PCR Plakaları, Düşük Profilli, İnce Duvarlı, Etekli, Beyaz / Şeffaf
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Alüminyum FolyoOfis Depo3489072Reynolds Wrap Stanard Alüminyum Folyo Rulo, 12" x 75', Gümüş
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
AmpliTaq Gold Kit – Polimeraz ve TamponThermo Fisher4311806Altın Tamponlu AmpliTaq Altın DNA Polimeraz ve MgCl2 (bu kitte MgCl<>sub2 kullanılmaz), 10X Altın Tamponu, 2.5U AmpliTaq Altın Polimeraz
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 &°; C 
BetainThermo FisherAAJ77507ABBetain, 5M Çözelti, Moleküler Biyoloji Sınıfı, Ultrasaf, 10mL
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 °C; C 
Büyük Tüp RafıThermo Fisher344817Fisherbrand 4 Tüp Raf
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
CFX Maestro Yazılımızamanlı PCR plakası kurulumu, veri toplama, istatistikler ve sonuçların grafiklendirilmesi için Bio-Rad 12004110 Yazılımı
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
CFX96 Başlangıç Paketli Gerçek Zamanlı PCR Sistemleri için Optik Reaksiyon ModülüGerçek zamanlıPCR
için Bio-Rad 1845096 96 kuyulu optik modül Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
DTTFisher ScientificAAJ1539706Dithiothreitol, >99.5+ Moleküler Biyoloji Sınıfı, 5 g
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 °C; C 
ELIMINaseFisher Scientific04-355-32ELIMINase Laboratuvar Dekontaminant
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
HEPA FiltreABD BilimselYedek FiltrelerAirClean İş İstasyonları için Yüksek Verimli Partikül Hava Filtresi
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
KimwipesThermo Fisher06666AKimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Hassas Görev Silecekleri, 1 Katlı
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Yükleme TeknesiThermo Fisher14387069Thermo Scientific Matrix Reaktif Rezervuarları
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
Microsoft ExcelMicrosoftUygulanamazMicrosoft 365 paketi, Excel yazılım uygulaması
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Mini SantrifüjGenesee Scientific31-500BPoseidon 31-500B Mini Santrifüj, Mavi Kapak
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
PCR Sınıf H2OThermo FisherAM9937Nükleaz İçermeyen Su (DEPC ile Muamele Edilmemiş)
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
PCR HoodUSA Scientific4263-2588HEPA Filtrasyonlu Nükleik Asit İş İstasyonu, AirClean Sistemleri Kombinasyonu PCR İş İstasyonu
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
PCR ŞeritleriThermo FisherAB0776Düşük Profilli Tüpler ve Düz Kapaklar, 8
Şeritler Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
PCR Tüp RafıThermo Fisher344820Fisherbrand 96 Kuyulu PCR Tüp Rafı
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Pipet Uçları (Çok Kanallı)Ranin17005860Pipet Uçları SR LTS 20µ L F 960A / 5, 20 ve mikro; L Maksimum
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Pipet Uçları (Tek Kanallı)USA Scientific1181-385010µ L Dereceli TipOne RPT Filtre Uçları < br / > Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
Pipet Uçları (Tek Kanallı)USA Scientific1180-185020 & L Eğimli TipOne RPT Filtre Uçları < br / > Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Pipet Uçları (Tek Kanallı)USA Scientific1111-0880200 & micro; L Raflarda Doğal TipOne Pipet Uçları < br / > Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Pipet Uçları (Tek Kanallı)USA Scientific1111-28901000 & L Raflarda Doğal Dereceli TipOne Pipet Uçları < / > Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Pipetleyiciler (Çok Kanallı)Ranin17013802Pipet-Lite Çoklu Pipet L8-10XLS, 0,5 ila 10 mikro; L
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Pipetleyiciler (Çok Kanallı)Ranin17013803Pipet-Lite Çoklu Pipet L8-20LS+, 2 ila 20&mikro; L
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Pipetleyiciler (Tek Kanallı)Thermo FisherF144802GGilson Pipetman Klasik Pipetler, 1 ila 10 & mikro; L
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda Sıcaklığında
Pipetleyiciler (Tek Kanallı)Thermo FisherF123600Gilson Pipetman Klasik Pipetler, 2 ila 20&mikro; L
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda Sıcaklığında
Pipetleyiciler (Tek Kanallı)Thermo FisherF123601Gilson Pipetman Klasik Pipetler, 20 ila 200&mikro; L
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda Sıcaklığında
Pipetleyiciler (Tek Kanallı)Thermo FisherF123602Gilson Pipetman Klasik Pipetler, 200 ila 1000&mikro; L
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Plaka Sızdırmazlık FilmiBio-RadMSB1001Microseal " B” PCR Plaka Sızdırmazlık Filmi, Yapıştırıcı, Optik
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Plaka DöndürücüThermo Fisher14-100-141Fisherbrand Mini Plakalı Döner Santrifüj, 230 V
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
Ön Kaput FiltresiUSA Scientific4235-3724AirClean Sistemleri için Ön Filtre İş İstasyonları
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklık
R Yazılımıİstatistiksel Hesaplama için R ProjesiUygulanamazR sürüm 4.2.2
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
ÖlçekThermo Fisher01-922-329OHAUS 30430060 PR Serisi Analitik Terazi, 62g Kapasite
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
MakasOfis Depo458612Ofis Deposu Marka Makas, 8", Düz, Siyah, 2
'lik Paket Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
SharpiesSharpie2151734Fırçası İkiz Kalıcı İşaretleyiciler, Siyah
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
Tek Kopya Gen İleri AstarEntegre DNA TeknolojileriÖzelAyrı tabloya bakın
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 ° C; C rehidre edildiğinde
Tek Kopya Gen Ters PrimerEntegre DNA TeknolojileriÖzel Ayrıtabloya bakınız
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 &°; C yeniden sulandırıldığında
Küçük Tüp RafıThermo Fisher21-402-17Thermo Fisher 8601 Kapaklı
Ters Çevrilebilir Mikrotüp Rafları Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Sodyum AsetatThermo FisherJ63560. EQE3M NaOAc pH 5.2
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda Sıcaklığında
Paslanmaz Çelik SpatulaThermo Fisher3990240Bel-Art SP Scienceware Paslanmaz Çelik Numune Alma Kaşığı ve Spatula
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
SYBR YeşilTermo BalıkçıS7563SYBR Green I Nükleik Asit Jel Lekesi – DMSO
Depolama Sıcaklığı ve Koşullarında 10.000X Konsantre: eksi 20 °C C rehidre edildiğinde
Şırınga FiltreleriFisher Scientific09-927-55AGD / X 25 mm Steril Şırınga Filtresi, selüloz asetat filtrasyon ortamı, 0.2 & mu; m
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
ŞırıngalarThermo Fisher148232ABD Luer-Lok İğnesiz Tek Kullanımlık Şırıngalar, 10mL
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
TE TamponFisher ScientificBP2474100TE Tamponu, Tris-EDTA, 1X Çözelti, pH 7.6, Moleküler Biyoloji, Fisher BioReagents
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
Telomer İleri AstarEntegre DNA TeknolojileriÖzel Ayrıtabloya bakınız
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 &°; C rehidre edildiğinde
Telomer Ters AstarEntegre DNA Teknolojilerigörenek Ayrıtabloya bakınız
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: eksi 20 &°; C yeniden sulandırıldığında
UV IşığıUSA Scientific4288-2540İş İstasyonları için UV Ampul
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
VortexThermo Fisher14-955-151Fisherbrand Mini Vorteks Mikser, 115 V, 50/60 Hz
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığında
Tartı TekneThermo Fisher01-549-752Fisherbrand Steril Altıgen Tartı Teknesi, 10mL
Depolama Sıcaklığı ve Koşulları: Oda sıcaklığı
Gerçek

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hemann, M., Strong, M., Hao, L., Greider, C. The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability. Cell. 107 (1), 67-77 (2001).
  2. Xu, L., Li, S., Stohr, B. A. The role of telomere biology in cancer. Ann Rev Pathol: Mech Dis. 8, 49-78 (2013).
  3. Lindrose, A., Drury, S. Minimum reporting recommendations for pcr-based telomere length measurement. Telomere Research Network. , (2020).
  4. Verhulst, S., et al. Commentary: The reliability of telomere length measurements. Int J Epidemiol. 44 (5), 1683-1686 (2015).
  5. Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutat Res. 730 (1-2), 59-67 (2012).
  6. Mundstock, E., et al. Effect of obesity on telomere length: Systematic review and meta-analysis. Obesity. 23 (11), 2165-2174 (2015).
  7. Haycock, P. C., et al. Leucocyte telomere length and risk of cardiovascular disease: Systematic review and meta-analysis. BMJ. 349, 4227(2014).
  8. Astuti, Y., Wardhana, A., Watkins, J., Wulaningsih, W. Cigarette smoking and telomere length: A systematic review of 84 studies and meta-analysis. Environ Res. 158, 480-489 (2017).
  9. Ridout, K. K., Ridout, S. J., Price, L. H., Sen, S., Tyrka, A. R. Depression and telomere length: A meta-analysis. J Affect Disord. 191, 237-247 (2016).
  10. Wang, Q., Zhan, Y., Pedersen, N. L., Fang, F., Hägg, S. Telomere length and all-cause mortality: A meta-analysis. Ageing Res Rev. 48, 11-20 (2018).
  11. Hu, R., Hua, X. G., Jiang, Q. C. Associations of telomere length in risk and recurrence of prostate cancer: A meta-analysis. Andrologia. 51 (7), e13304(2019).
  12. Schneider, C. V., et al. Association of telomere length with risk of disease and mortality. JAMA Inter Med. 182 (3), 291-300 (2022).
  13. Deng, Y., et al. Telomere length and the risk of cardiovascular diseases: A mendelian randomization study. Front Cardiovasc Med. 9, 1012615(2022).
  14. D'mello, M. J., et al. Association between shortened leukocyte telomere length and cardiometabolic outcomes: Systematic review and meta-analysis. Circulation: Cardiovasc Gene. 8 (1), 82-90 (2015).
  15. Wilbourn, R. V., et al. The relationship between telomere length and mortality risk in non-model vertebrate systems: A meta-analysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160447(2018).
  16. Gardner, M., et al. Gender and telomere length: Systematic review and meta-analysis. Exp Gerontol. 51, 15-27 (2014).
  17. Lai, T. -P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160451(2018).
  18. Cawthon, R. Telomere measurement by quatitative pcr. Nuc Acid Res. 30 (10), e47-e53 (2002).
  19. Cawthon, R. M. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative pcr method. Nuc Acid Res. 37 (3), e21-e21 (2009).
  20. Lindrose, A. R., et al. Method comparison studies of telomere length measurement using qpcr approaches: A critical appraisal of the literature. PLoS One. 16 (1), e0245582(2021).
  21. Lin, J., et al. Effects of DNA extraction, DNA integrity, and laboratory on the precision of qpcr-based telomere length measurement - a multi-lab impartial study. bioRxiv. , (2022).
  22. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 474-481 (1997).
  23. Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. Assessment of DNA yield and purity: An overlooked detail of pcr troubleshooting. Clin Microbiol Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).
  24. Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
  25. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  26. Ye, Q., et al. Telomere length and chronological age across the human lifespan: A systematic review and meta-analysis of 414 study samples including 743,019 individuals. Ageing Res Rev. 90, 102031(2023).
  27. Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. Telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence. J Vis Exp. (75), e50246(2013).
  28. Liu, M., et al. Immune-mediated inflammatory diseases and leukocyte telomere length: A mendelian randomization study. Front Genetics. 14, 1129247(2023).
  29. Van Ockenburg, S., et al. Stressful life events and leukocyte telomere attrition in adulthood: A prospective population-based cohort study. Psychol Med. 45 (14), 2975-2984 (2015).
  30. Zong, Z. Q., et al. Ambient air pollution exposure and telomere length: A systematic review and meta-analysis. Public Health. 215, 42-55 (2023).
  31. Tang, L., Li, D., Wang, J., Su, B., Tian, Y. Ambient air pollution, genetic risk and telomere length in uk biobank. J Expo Sci Environ Epidemiol. , (2023).
  32. Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutat Res. 730 (1), 59-67 (2012).
  33. Lin, J., et al. Systematic and cell type-specific telomere length changes in subsets of lymphocytes. J Immunol Res. 2016, 5371050(2016).
  34. Needham, B. L., et al. Socioeconomic status, health behavior, and leukocyte telomere length in the national health and nutrition examination survey, 1999-2002. Soc Sci Med. 85, 1-8 (2013).
  35. Verhulst, S. Improving comparability between qpcr-based telomere studies. Mol Ecol Res. 20 (1), 11-13 (2020).
  36. Dagnall, C. L., et al. Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement. PloS one. 12 (9), e0184098(2017).
  37. Lin, J., Smith, D. L., Esteves, K., Drury, S. Telomere length measurement by qpcr-summary of critical factors and recommendations for assay design. Psychoneuroendocrinology. 99, 271-278 (2019).
  38. Wolf, S. E., et al. Cross-tissue comparison of telomere length and quality metrics of DNA among individuals aged 8 to 70 years. PLOS One. 19 (2), e0290918(2024).
  39. RoDer, B., FruHwirth, K., Vogl, C., Wagner, M., Rossmanith, P. Impact of long-term storage on stability of standard DNA for nucleic acid-based methods. J Clin Microbiol. 48 (11), 4260-4262 (2010).
  40. Dagnall, C., et al. Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement. PLoS One. 12 (9), e0184098(2017).
  41. Shao, W., Khin, S., Kopp, W. C. Characterization of effect of repeated freeze and thaw cycles on stability of genomic DNA using pulsed field gel electrophoresis. Biopreserv Biobank. 10 (1), 4-11 (2012).
  42. Institute for Statistics and Mathematics of WU. The Comprehensive R Archive Network. , Available from: https://cran.r-project.org/ (2024).
  43. Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biol Rev. 85 (4), 935-956 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Monokrom Multiplex PCRTelomer l mMMqPCR AnaliziPeriferik Kan Monon kleer H creleriSYBR GreenStandart E riTeknik TekrarPlaka Kalite Kontrol

İlgili makaleler