Yöntem makalesi

Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)

2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66562

⸱

23 Şubat 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Boston University, 2Neuroscience Research Institute, Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of California Santa Barbara, 3Photothermal Spectroscopy Corp., 4School of Biological Sciences, University of Southampton, 5Department of Electrical & Computer Engineering, Photonics Center, Boston University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, tek tek hücreleri tanımlamak ve metabolizmalarını anlamak için orta kızılötesi fototermal-FISH (MIP-FISH) olarak da bilinen optik fototermal kızılötesi floresan yerinde hibridizasyon (OPTIR-FISH) kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, tek hücre çözünürlüğü ile hücresel metabolizmanın haritalanması da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için geniş çapta uygulanabilir.

Özet

Karmaşık topluluklar içindeki tek tek hücrelerin metabolik aktivitelerini anlamak, insan hastalıklarındaki rollerini ortaya çıkarmak için kritik öneme sahiptir. Burada, rRNA etiketli FISH problarını ve izotop etiketli substratları birleştirerek OPTIR-FISH platformu ile eşzamanlı hücre tanımlama ve metabolik analiz için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Floresan görüntüleme, rRNA etiketli FISH problarının spesifik bağlanması ile hücre tanımlaması sağlarken, OPTIR görüntüleme, OPTIR spektrumlarında izotop kaynaklı kırmızıya kayma ile tek hücreler içinde metabolik aktiviteler sağlar. Test yatağı olarak 13C-glikoz ile kültürlenmiş bakterileri kullanan protokol, izotopik etiketleme, floresan in situ hibridizasyon (FISH), numune hazırlama, OPTIR-FISH görüntüleme kurulumunun optimizasyonu ve veri toplama ile mikrobiyal kültürü ana hatlarıyla belirtir. Ayrıca, görüntü analizinin nasıl gerçekleştirileceğini ve spektral verilerin yüksek verimle tek hücre düzeyinde nasıl yorumlanacağını da gösteriyoruz. Bu protokolün standartlaştırılmış ve ayrıntılı doğası, geniş tek hücreli metabolizma araştırma topluluğu içindeki farklı geçmişlere ve disiplinlere sahip araştırmacılar tarafından benimsenmesini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.

Giriş

Hücresel metabolizma, hücre biyolojisinde temel bir dayanak olarak durur ve hücre sağlığını, işlevini ve çevre ile etkileşimi belirleyen birçok süreci yönlendirir. Metabolizmayı bireysel hücre düzeyinde, özellikle doğal ortamlarda analiz etmek, biyolojik sistemlerdeki heterojen ve karmaşık aktiviteleri ortaya çıkarmak için paha biçilmez bilgiler sağlar1. Bu, özellikle mikroorganizmaların incelenmesinde çok önemlidir, çünkü birçok mikrop, geleneksel yetiştirme yöntemlerine meydan okuyan benzersiz büyüme gereksinimleri veya çevresel bağımlılıklar sergiler2. Örneğin, bazı türler, laboratuvar ortamında kolayca kopyalanamayan spesifik besin bileşimleri veya simbiyotik ilişkiler gerektirebilir, bu nedenle onları standart tekniklerle kültürlenemez hale getirebilir3. Ayrıca, belirli türlerin yetiştirilmesi için gereken uzun süreler, mikrobiyolojik araştırmalar için önemli zorluklar doğurur ve genellikle çalışma ve analiz için pratik zaman çerçevelerinin ötesine uzanır. Bu sınırlamaları aşmak için, polimeraz zincir reaksiyonu ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) gibi alternatif yöntemler, mikrobiyal ekosistemlerin daha doğru ve bütünsel bir görünümünü elde edebilen yetiştirme4 gerektirmeden mikrobiyal türlerin tanımlanmasına izin verir. Bununla birlikte, bu analitik teknolojiler hücresel metabolizmayı açıklama yeteneğinden yoksundur. Bu boşluk, mikrobiyoloji alanında devam eden zorlukları vurgulamaktadır: hücresel kimliği ayırt etme ve tek hücre düzeyinde metabolizmayı aydınlatmanın eşzamanlı görevi. Kararlı izotoplarla birleştirilmiş görüntüleme kütle spektrometresi (IMS) gibi tekniklerdeki ilerlemeler, tek hücreli metabolik analiz için güçlü araçlar olarak ortayaçıkmıştır5. Bu deneylerde hücreler, 13C veya 15N gibi izotoplar içeren substratlarla inkübe edildi. Yeni anabolize edilmiş biyomoleküller bu izotopları taşır ve bu da onları m / z spektrumlarında ayırt edilebilir hale getirir. Bununla birlikte, IMS, pahalı enstrümantasyon, karmaşık numune hazırlama, nispeten düşük verim ve m/z spektrumlarını analiz etmek için gereken uzmanlıktan muzdariptir. Moleküler belirteç spesifik floresan görüntüleme ile birleştirildiğinde, artan özgüllük6 ile hücresel metabolizmanın aydınlatılmasında ilerlemeler kaydedilmiştir. Bununla birlikte, bu iki yöntem arasında köprü kurmada zorluklar devam etmektedir. IMS ve floresan görüntüleme arasındaki çözünürlük farkı, farklı operasyonel kurulumlarla birleştiğinde, bulguların hizalanmasını ve ilişkilendirilmesini zorlaştırır7.

Titreşimsel spektroskopik görüntülemenin kararlı izotop etiketleme ile entegrasyonu, tek hücreli metabolizmanın incelenmesi için yeni bir çözüm sunar. Daha ağır izotopların dahil edilmesi, kimyasal bağların titreşimini yavaşlatır ve titreşim spektrumlarında8 kırmızıya kayan tepelere yol açar. Özellikle, titreşimsel görüntüleme, floresan görüntüleme ile karşılaştırılabilir bir uzamsal çözünürlük sağlar ve hem metabolik niceleme hem de hücre tanımlaması tek bir kurulumda gerçekleştirilebilir, bu da görüntü kaydını ve korelasyonu basitleştirir. Son çalışmamız, gelişmiş bir titreşimsel görüntüleme platformunun kombinasyonunu göstermiştir: bakteri topluluklarında glikoz metabolizmasını araştırmak için optik fototermal kızılötesi (OPTIR) ile floresan yerinde hibridizasyon (FISH)9 (Şekil 1). OPTIR, optik mikroskopide olduğu gibi mikrometre altı çözünürlük sağlayan, ancak orta IR absorpsiyonundan kaynaklanan ek titreşimsel spektroskopik bilgi ile görünür ışık değişimini algılayarak orta IR absorpsiyonunun fototermal etkisinden yararlanan bir titreşimsel spektroskopik mikroskopi sistemidir. FISH, mikroorganizma kimliğini tek hücre düzeyinde belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Oligonükleotid dizisi, farklı taksonların spesifik 16S dizilerini hedeflemek için tasarlanabilir ve farklı floroforlar eklenebilir. Tasarlanan oligonükleotid problarının hedef rRNA ile spesifik hibridizasyonu, tek tek hücreler içinde hedef türlerin güçlü floresan sinyallerine yol açar ve popülasyon içindeki birden fazla türü tanımlamak için çok kanallı floresan görüntüleme gerçekleştirilebilir. Hem OPTIR hem de floresan görüntüleme optik algılamaya dayandığından, OPTIR ve FISH floresansının birleştirilmesinin uygulanması kolaydır. İki modalite, tek hücreli analiz için aynı optik çözünürlüğü paylaşır ve ek hizalama veya ortak kayıt gerektirmeden rahatça değiştirilebilir.

Bu protokol, gelişmiş tek hücreli yapı-fonksiyon analizi için OPTIR-FISH platformundan yararlanmak için ayrıntılı bir kılavuz sunar. 13C-glikoz içeren ortamda büyütülen bakteri örneklerini test yatağı olarak kullandık ve 13C-glikozdan de novo protein sentezini ölçtük. Platformun hücreleri tanımlama yeteneğini göstermek için, her türün rRNA hedefli FISH probları kullanılarak etiketlendiği bakteri karışımları kullandık. Bu yaklaşım, Escherichia coli (E. coli) ve Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta) gibi spesifik bakteri suşlarının ve metabolizmalarının kesin tek hücreli tanımlanmasını kolaylaştırdı. Bu protokol, araştırmacılara tek hücre düzeyinde eşzamanlı metabolik profilleme ve tür tanımlama için güçlü bir araç sunar ve hücresel etkileşimler, fizyoloji ve karmaşık ortamlardaki rolleri hakkındaki anlayışımızı ilerletmeyi vaat eder.

Protokol

Bu çalışmada bakteri örneklerinin kullanımı, Boston Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün yönergelerine uygundur.

NOT: Bu protokolde izlenen genel iş akışı Şekil 2'de özetlenmiştir.

1. Bakteri kültürü ve izotop etiketleme (Şekil 2A)

NOT: Burada verilen örnek, saf bir bakteri kültürünü etiketlemek içindir. Bu protokol polimikrobiyal topluluklara uygulanıyorsa, ortam ve etiketleme süresi, topluluğa ve ilgilenilen organizmaların fizyolojisine göre ayarlanmalıdır.

  1. Üstel büyüme (log) fazına ulaşmak için tek bir koloniden ve ön kültürden ilgilenilen bakteri suşunu, triptik soya suyu (TSB) veya Luria-Bertani suyu (LB) gibi besin açısından zengin bir ortamda 3 saat boyunca aşılayın. E. coli BW25113, bu protokolde örnek bir suş olarak kullanılır.
    NOT: Günlük aşamasına ulaşma süresi, kullanımdaki türe göre değişecektir. Bu sürenin her suş için uyarlanması gerekir.
  2. Bakteri konsantrasyonunu tahmin etmek için optik yoğunluğu 600 nm'de ölçün.
  3. İzotopik olarak etiketlenmiş substratlarla desteklenmiş minimal bir büyüme ortamı hazırlayın. E. coli BW25113 için, M9 minimal ortamı% 0.2'lik (a / h) bir nihai konsantrasyonda 13C-glikoz ile destekleyin.
    NOT: Kullanılan 13C-glikoz (D-glikoz U-13C6,% 99) evrensel olarak etiketlendi, burada tüm karbon atomları 13C atomu ile değiştirildi. Minimum büyüme ortamının seçimi, bakteri suşuna bağlı olacaktır. İzotop substratının seçimi, ilgilenilen spesifik metabolik sürece bağlı olacaktır. Genel amaç, izotopik substratın, etiketlenmemiş muadillerine kıyasla ana beslenme kaynağı olarak hizmet etmesidir.
  4. İzotopik olarak etiketlenmiş substratı içeren minimum büyüme ortamındaki bakterileri 5 × 105 CFU / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
    NOT: Genellikle, 1:100 gibi yüksek bir seyreltme oranı kullanılır ve zengin ortamdan gelen etiketlenmemiş besin ihmal edilebilir hale gelir. Alternatif olarak, besin açısından zengin ortamın tamamen uzaklaştırılmasını sağlamak için, 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir yıkama, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleme ve PBS'de yeniden süspansiyon ve ardından ikinci bir santrifüjleme ve minimum büyüme ortamında son yeniden süspansiyon ile gerçekleştirilebilir.
  5. Bakteri örneklerini optimum büyüme koşulları altında orbital sallama inkübatöründe büyütün. Genel olarak, orbital sallama inkübatörünü 220 rpm hıza ve 37 °C sıcaklığa ayarlayın ve aerobik inkübasyon için kültür tüplerini gevşek bir kapakla eğik olarak yerleştirin. E. coli için, 37 ° C'de 24 saatlik aerobik inkübasyon, maksimum 13° C etiketlemeye ulaşmak için genellikle yeterlidir.
    NOT: Kuluçka süresi, ilgilenilen metabolik sürece bağlıdır. Daha uzun inkübasyon süresi genellikle daha yüksek izotopik etiketlemeye yol açar. Etiketlenmemiş bir substrat ile aynı koşul altında bir büyüme eğrisi ölçümü, uygun toplama zaman noktalarının belirlenmesine ilişkin içgörü sağlayabilir.
  6. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleme ile istenen zaman noktalarında bakteri hücrelerini toplayın.
  7. Süpernatanı çıkarın ve PBS'de eşit hacimde% 4 paraformaldehit (PFA) içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika veya 4 ° C'de 2 saat PFA çözeltisine sabitleyin. Uzun süreli depolama için, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, hücreleri 1 mL %50 (h/h) PBS ve %96 etanol içinde yeniden süspanse edin ve daha fazla kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.

2. Floresan in situ hibridizasyon (FISH) (Şekil 2B)

  1. E. coli hücrelerini, bir siyanin5 (Cy5) florofor (Gam42a-Cy5) ile etiketlenmiş Gam42a10 oligonükleotid probu ve B. teta hücreleri ile hibritleyin Bac30311 oligonükleotid probu ile bir siyanin3 (Cy3) florofor (Bac303-Cy3) ile etiketlenmiş oligonükleotid probu ile standart bir FISH protokolünü takiben.
    NOT: Tanımlama için rRNA-FISH'in temelleri: rRNA molekülleri, mikrobiyal hücreler içinde her yerde dağıldıkları ve doğal olarak amplifiye edildikleri için FISH'in ideal hedefleridir. rRNA ayrıca hem korunmuş hem de değişken dizi bölgeleri içerir, böylece hedef grubun filogenetik derinliği oligonükleotid probunun korunma derecesi ile belirlenebilir. Tasarlanan probun hedef diziye spesifik olarak bağlanmasıyla, etiketli florofor, tek tek hücreler için floresan sinyalleri gösterir.
  2. Floresan in situ hibridizasyon için ayrıntılı protokol için daha önce yayınlanmış literatür 12,13,14'e bakın. Aşağıdaki adımlar, mikrobiyal hücreler için standart protokolü kısaca açıklamaktadır.
    1. Dehidratasyon:
      1. Sabit hücreleri (100 μL) 14.000 x g'da 10 dakika boyunca peletlemek için santrifüjleyin, 100 μL% 96 analitik dereceli etanol içinde yeniden süspanse edin ve RT'de 1 dakika inkübe edin.
      2. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca 14.000 x g'da tekrar santrifüjleyin, etanolü çıkarın ve hücre peletinin havada kurumasını bekleyin.
    2. Hibridizasyon: Hücreleri 46 ° C'de 3 saat boyunca çözelti (100 μL) içinde hibritleştirin.
      NOT: Hibridizasyon tamponu, 900 mM NaCl, 20 mM Tris- (hidroksimetil) -amino metan HCl, 1 mM etilendiamin tetraasetik asit,% 0.01 sodyum dodesilsülfat, 100 ng ilgili floresan etiketli oligonükleotid ve sıkı koşullar elde etmek için gerekli formamid konsantrasyonundan oluşur.
    3. Santrifüj: Hibridizasyondan hemen sonra, numuneleri 46 °C'de önceden ısıtılmış bir rotorlu bir santrifüje aktarın ve izin verilen maksimum sıcaklıkta (genellikle 40 °C) 15 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
    4. Yıkayın ve saklayın:
      1. Numuneleri 48 °C'de 15 dakika boyunca uygun sertlikte bir tamponda yıkayın. Daha sonra, hücreleri 14,000 ° C'de önceden ısıtılmış bir rotor ile bir santrifüjde izin verilen maksimum sıcaklıkta 15 dakika boyunca 46 x g'da santrifüjleyin.
      2. Son olarak, hücreleri 500 μL buz gibi soğuk PBS ile yıkayın, 20 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve daha fazla kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
        NOT: Probun spesifik bağlanması, doğru hibridizasyon sıkılığı ile sağlanır. Hibridizasyon sıcaklığının arttırılması, tuz konsantrasyonunun azaltılması veya denatüran formamid eklenmesiyle yüksek sıkılık elde edilebilir. Formamid, nükleik asit duplekslerini stabilize eden hidrojen bağları ile etkileşime girer. Burada, formamid konsantrasyonu ayarlanırken hibridizasyonda sıcaklık ve tuz konsantrasyonu değiştirilmez. Yeni tasarlanan problar için optimal formamid konsantrasyonu, formamid ayrışma eğrileri10 kullanılarak deneysel olarak belirlenir. Yayınlanmış problar için gerekli formamid konsantrasyonu probeBase15'te veya bir literatür taraması ile bulunabilir. Alternatif olarak, tahmin edilen formamid konsantrasyonları, mathFISH16 kullanılarak in silico analizden elde edilebilir. Yıkama adımında, biraz daha yüksek bir sıcaklık, biraz daha katı bir duruma yol açar ve bu da daha yüksek bir bağlanma özgüllüğüne yol açar.

3. Numune hazırlama (Şekil 2C)

  1. Slayt temizleme ve kaplama:
    1. Standartlaştırılmış CaF2 slaytları kullanın (alet numune tutucusu ile uyumluluk için 10 mm çapında ve 350 μm kalınlığında). CaF2'yi 15 dakika boyunca %70 etanole batırın ve DI su ile iki kez durulayın.
    2. Temizlenmiş slaytları %0.1 poli-L-lizin çözeltisine aktarın ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Slaytları bir kez DI su ile durulayın ve havada kurutun.
  2. Hazırlanan hücre örneklerini ışıktan korunarak RT'de çözdürün.
  3. Numune kurutma sırasında PBS'den aşırı tuz kristallerini önlemek için 3.3.1-3.3.2 adımlarını izleyin.
    1. Hücreleri iki kez deiyonize su (DI) ile yıkayın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
    2. Orijinal DI su hacmini geri ekleyin ve yavaşça girdaplayın. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve DI su ile yıkamayı tekrar ekleyin.
  4. (İsteğe bağlı) Karışım numuneleri için, her numuneden aynı hacmi aktarın ve bir santrifüj tüpüne karıştırın.
  5. Bakteri hücresi örneklerini 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleme ile konsantre edin ve süpernatanı çıkarın.
  6. Kalan çözeltiyi ~ 30 s boyunca hafifçe girdaplayın ve hazırlanan CaF2 slaytına 1-2 μL çözelti ekleyin. Numuneyi ışıktan korunurken 30 dakika havayla kurutun.
    NOT: Havayla kuruduktan sonra sürgü üzerinde küçük bir yuvarlak nokta görünmelidir. "Kahve halkası" etkisi nedeniyle, noktanın kenarları daha yüksek bir bakteri hücresi yoğunluğuna sahip olacaktır. Bu santrifüj adımı, verimli tek hücreli bakteri görüntüleme için uygun bir yoğunluğa ulaşmaktır. İdeal konsantrasyon, mikroskop altında tek tek tek bakteri hücrelerinin düzgün ve yoğun bir tabakasına yol açmalıdır. Santrifüjden sonra çıplak gözle görülebilen berrak bir pelet varsa, süpernatanı çıkarın, böylece girdaptan sonra çözelti neredeyse berrak görünür. Süpernatan uzaklaştırma hacmini tahmin etmek için kontrol numunesi üzerinde hızlı bir test yapılabilir. Parlak alan mikroskobu altında optimal seyreltme hacmini incelemek için mikroskop cam lamı üzerine farklı miktarlarda kalan süpernatan içeren bir dizi damlacık biriktirilebilir. Santrifüjlemeden sonra görünür bir pelet yoksa, numuneleri büyük ölçüde konsantre etmek için süpernatantın çoğunu çıkarın. İşin püf noktası, santrifüj tüpünü, menteşe dışarıda olacak şekilde sabit açılı bir rotorda konumlandırmaktır, böylece pelet tüp menteşesinin aynı tarafında görünür. Ek olarak, peleti sağlam tutmak için süpernatan çıkarma sırasında daha fazla hassasiyet için pipet boyutlarını (P1000, P200, P10) küçültün.
  7. Slaytı verilen bir numune tutucuya monte edin ve ölçüm sırasında slaydı sabitlemek için küçük noktalar polyester bant kullanın.

4. OPTIR-FISH görüntüleme

NOT: Floresan görüntüleme ve OPTIR görüntüleme, OPTIR sistemi üzerinde gerçekleştirilecektir.

  1. Sistem geometrisi:
    1. Bu protokol ile orta IR pompasının ve görünür probun karşı yayılımını, görünür ışığın geriye doğru (epi) algılanmasını kullanın.
    2. Görünür ışığı odaklamak ve geri yansıyan ve saçılan görünür ışığı toplamak için bir hava hedefi (50x 0.8NA) kullanın. Orta IR ışığını odaklamak için bir Cassegrain objektif (40x 0.78NA) kullanın.
    3. Sistemin ayrıca birden fazla floresan filtre setine sahip geniş alanlı bir epi-floresan modülü ile donatıldığından emin olun. Bu protokolde kullanılan floroforlar için, Cy3 algılaması için yeşil floresan proteini (GFP) filtre setini ve Cy5 tespiti için Alexa Fluor 647 filtre setini seçin.
  2. Ölçümler için hazırlanın:
    1. Sistemi çalıştırın ve cihaz kontrol yazılımını açın. Başlatmadan sonra, Karşı Prop ve Floresan kaydırıcısını açık konuma getirin.
    2. Hedefi 50x olarak ayarlayın ve ardından IR güç spektrumunu elde etmek için Otomatik arka plan gerçekleştirin. Elde edilen örnek spektrumlarını normalleştirmek veya OPTIR görüntülerini farklı dalga sayılarında normalleştirmek için güç spektrumunu kullanın. Bu, orta IR lazer güç farklılıklarının veri analizi ve niceleme üzerindeki etkisini ortadan kaldıracaktır.
      NOT: Normalizasyon için IR güç spektrumlarının elde edilmesi, ölçülen yoğunluk IR gücüyle doğrusal olarak ilişkili olduğundan, aşağı akış kantitatif analizi için zorunludur. Otomatik arka plan gerçekleştirdikten sonra yazılım, OPTIR spektrumlarını ve OPTIR görüntülerini kullanıcılar için otomatik olarak IR güç spektrumlarına normalleştirecektir. SisteminN2 ile temizlenmesi, su buharının etkisini en aza indirebilir ve deneyler arasında tekrarlanabilirliği artırabilir.
  3. Numuneyi yüklemek için, numune aşamasını dışarı taşımak için Boşalt düğmesini kullanın. Örnek alanını bulmak ve optimum örnek yoğunluğuna sahip bölgeye gitmek için 10x gibi düşük bir büyütme hedefi kullanın. Kontrol yazılımında objektif yüksekliğini ayarlayarak numuneyi odaklayın. Hedef seçimini 50x olarak değiştirin.
  4. Görüntü elde etme
    NOT: Kullanılan numuneler şunlardır: i) E. coli (13C-glikoz inkübe edilmiş); ii) E. coli (12C-glukoz inkübe edilmiş); iii) B. teta (12C-glukoz inkübe edilmiş); iv) E. coli (13C-glukoz inkübe edilmiş) ve B. teta (12C-glukoz inkübe edilmiş) karışımı.
    1. Parlak Alan Görüntüleri (Şekil 2D): Parlak alan görüntülerine bakarak numuneyi odak noktasına getirin.
    2. Floresan görüntüleri (Şekil 2E): Tasarlanan FISH problarıyla ilişkili floroforları tespit etmek ve yazılımdaki floresan modülünü kullanarak sıralı olarak floresan görüntüleme elde etmek için filtre adı düğmesine (Cy3 için GFP ve Cy647 için Alexa Fluor 5) tıklayarak filtre setini değiştirin. Floroforları ağartmadan önce yeterli sinyal kontrastı elde etmek için ışık yoğunluğunu ve maruz kalma süresini ayarlayın.
      NOT: OPTIR ölçümlerinde kullanılan prob floroforları fotoağartma yapabileceğinden, her zaman OPTIR görüntülerinden önce floresan görüntüler elde edin. Floresan belirteçlerin OPTIR tespiti üzerindeki etkisi ile ilgili endişeleriniz için, Cy5 floroforlu FISH'in, hedef bakteri proteini9'a kıyasla boyut olarak küçük ve bol miktarda düşük olduğu için OPTIR görüntülerine dayalı olarak aşağıdaki nicelemeyi etkilemediğini gösteren daha önce yayınlanmış bir çalışmaya bakın.
    3. OPTIR görüntüleri (Şekil 2F):
      1. Normal tepe noktasını ve izotop kaynaklı kırmızıya kaymış tepe konumunu belirleyin. 13C-glikozdan protein sentezi durumunda, normal amid I zirvesi yaklaşık 1656 cm-1'de tespit edilir ve kırmızıya kaymış tepe yaklaşık 1612 cm-1'dir (Şekil 3A).
        NOT: Normal tepe konumu, ilgilenilen biyokimyasal bileşene ve/veya metabolik ürüne bağlıdır. Kaydırılan tepe konumu aynı zamanda etiketleme için hangi izotopun kullanıldığına da bağlıdır. Bu iki dalga sayısı, etiketlenmemiş ve maksimum olarak etiketlenmiş hücrelerin tam spektrumlarının ölçülmesiyle deneysel olarak da belirlenebilir (bkz. adım 4.5)
      2. Yazılımı kullanarak IR pompası dalga boyunu 1656 cm-1'e ayarlayın. DC sinyalinin (8 V) doygunluğunu önlemek için prob gücünü ve dedektör kazancını buna göre değiştirin. AC sinyalini en üst düzeye çıkarmak için alt Cassegrain objektif yüksekliğine ince ayar yapın.
        NOT: Numunedeki tipik IR gücü yaklaşık 5 mW'dir ve numunedeki prob gücü, numuneye bağlı olarak yaklaşık 3-15 mW'dir. Hem IR hem de prob gücü, hücrelere zarar vermekten kaçınırken yüksek görüntü kontrastı sağlamak için güç seviyesini optimize etmek için kontrol yazılımı kullanılarak ayarlanabilir.
      3. OPTIR görüntülerini 200 x 200 piksel içerecek şekilde ayarlayın ve tarama hızını 100 μm/s olarak ayarlayın. X ve Y yönlerindeki adım boyutunu 150 nm olarak ayarlayın, böylece görüntü boyutu yaklaşık 30 x 30μm2 olur.
      4. Görüntüyü elde edin.
      5. IR pompası dalga boyunu 1612 cm-1'e ayarlayın ve bu dalga numarasında aynı görüş alanından bir görüntü elde edin.
      6. Her örnek için, istatistiksel analiz için en az üç görüş alanı görüntüleyin.
  5. (İsteğe bağlı) Spektral ölçüm: Görüntü elde edildikten sonra, ilgilenilen uzamsal bir özellik bulunuyorsa, spektral ölçümü gerçekleştirin.
    1. Konumları seçin: Yazılımın Spektral modülünde analiz için tek bir nokta seçin veya bir dizi nokta belirtin.
    2. Spektral tarama parametresini ayarlayın. Gereksinimlere göre dalga sayısı kapsama aralığını, tarama hızını ve veri çıkış aralığını seçin.
      NOT: tarama hızı ve veri çıkış aralığı, arka plan edinme adımında (adım 4.2) kullanılanlardan farklıysa, doğru normalleştirme için mevcut spektral tarama parametrelerine dayalı yeni bir arka plan gereklidir.
    3. Ortak ortalama sayısını ayarlayın ve spektral ölçümü başlatın. Artan ortak ortalama, spektrumların sinyal-gürültüsünü de artırır, ancak daha uzun alım süreleri gerektirir.
      NOT: Ortak ortalama alma sırasında önemli bir dalgalanma gözlemlenirse, bu, lazer ısıtmanın neden olduğu numune kararsızlığını gösterebilir. Bu genellikle IR gücünün düşürülmesi ve/veya görünür prob gücünün düşürülmesiyle ele alınabilir.

5. Tek hücre düzeyinde veri işleme ve analizi

  1. İzotopik substratlardan metabolik sentezi ölçün (Şekil 2G)
    NOT: İzotopik substratlardan metabolik birleşmenin aşağıdaki nicelleştirilmesi, hedef makromoleküllerin normal ve kaydırılmış tepe noktalarına karşılık gelen iki dalga sayılı OPTIR görüntülerine dayanmaktadır. Tam bir hiperspektral yığınla karşılaştırıldığında, iki dalga sayılı görüntüleme, her bir FOV için gereken süreyi büyük ölçüde azaltabilir ve metabolizma nicelemesi için kritik olan izotopik etkiyi tamamen yeniden yakalarken verimi artırabilir.
    1. Kaymış tepe OPTIR görüntüsünü normal tepe OPTIR görüntüsünden çıkarmak, izotop substratlarından sentez aktivitelerinin görsel bir haritasını oluşturur. Bir gösteri olarak (Şekil 3C), 13 C-glikoz ile kültürlenmiş E. coli için, (1656 cm-1-1612 cm-1) görüntüdeki pozitif pikseller, 13C'nin proteinlere aktif olarak dahil edildiğini, dolayısıyla daha yüksek bir protein sentez seviyesini gösterir.
      NOT: Çıkarma işlemi, ImageJ Görüntü Hesaplayıcı işlevi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak, çıkarma işlemi, toplu işleme için tercih edilen herhangi bir programlama dilinde kolayca gerçekleştirilebilir.
    2. Tek hücreli metabolik aktivitenin ölçülmesi
      1. Etiketlenmemiş ve tam etiketli referans numunelerinden katsayıları (Şekil 2G'de h ile temsil edilir) elde edin. İzotop kaynaklı kırmızıya kaymış tepe kısmen normal tepe ile örtüşeceğinden, hem etiketlenmemiş hem de etiketli (izotopik olarak etiketlenmiş substrattan yeni sentezlenmiş) numuneler, normal ve kaydırılmış tepe noktasındaki OPTIR sinyallerine katkıda bulunacaktır. Etiketlenmemiş ve tam etiketli referans numunelerinden normal ve kaydırılmış tepe noktasında normalleştirilmiş OPTIR sinyal yoğunluğunu kullanarak bu farklı katkıları ölçün.
        NOT: Referans numuneler için, etiketlenmemiş referans numuneleri, izotopik olarak etiketlenmiş herhangi bir substrat olmadan büyütülür (veya inkübe edilir). Tam etiketli referans numuneleri genellikle en uzun yetiştirme süresine sahip en yüksek izotopik etiketli substrat konsantrasyonu ile yetiştirilir.
      2. Tek hücreli analiz için, parlak alan görüntülerine dayalı tek hücreli maskeler edinin.
        NOT: Bu maskeyi oluşturmak için blob analizi gibi farklı parçacık algılama ve havza gibi hücre segmentasyon yöntemleri de dahil olmak üzere görüntü işlemede çeşitli teknikler uygulanabilir.
      3. Tek tek hücrelerden OPTIR sinyal yoğunluğunu ölçün. Alınan tek hücreli maskeyi iki OPTIR görüntüsüne (normal tepe noktasında ve kaydırılmış tepe noktasında) uygulayın ve her tek hücre için tek hücreli maske bölgesindeki piksel değerlerinin ortalamasını alın. Tek tek hücrelerden elde edilen ortalama değer, nicelemede kullanılacaktır.
      4. Her hücre için, adım 5.1.2.1'deki katsayılara ve adım 5.1.2.3'teki sinyallere dayalı olarak etiketlenmemiş ve etiketlenmiş biyo bileşenlerin göreceli katkısını hesaplayın.
        NOT: Bir izotopik değiştirme oranı, etiketli biyo bileşenlerin hem etiketli hem de etiketsiz biyo bileşenlerin toplamına göreceli katkısı olarak tanımlanır (Şekil 2G). Bu oran 0 ile 1 arasında olmalıdır. İzotopik replasman oranı, 13C-glikoz ila 12C-glikoz oranı (sabit bir toplam glikoz miktarı ile) ile doğrusal orantılıdır9. E. coli hücreleri için %5 13C-glikozluk yüksek bir algılama hassasiyeti gösterilmiştir.
  2. Çok kanallı floresan görüntülerinden bakteri türlerini tanımlayın (Şekil 2H)
    1. ImageJ (Image > Color > Merge Channels) kullanarak farklı bakteri türleri için görsel rehberlik oluşturmak üzere çok renkli floresan kanallarını birleştirin.
    2. Tek hücreli analiz için, her floresan kanalı için, tek tek hücreler için bir dizi ilgi alanı (ROI) oluşturun.
      NOT: Maskeyi oluşturmak için burada farklı otomatik eşikleme yöntemleri ve hücre segmentasyon yöntemleri dahil olmak üzere görüntü işlemede çeşitli teknikler uygulanabilir.
  3. FISH kimliklerini ve OPTIR metabolik aktivitelerini ilişkilendirin (Şekil 2I)
    1. ROI'lerin konumlarını ilişkilendirerek FISH floresan görüntülerinden tek hücre düzeyindeki bakteri kimliklerini doğrudan OPTIR görüntülerinden gelen metabolik aktivitelere bağlayın.
    2. Farklı türlerin metabolik aktivitelerini karşılaştırmak için istatistiksel analiz yapın.
      NOT: Maskeler, floresan görüntülerinden ve OPTIR görüntülerinden ayrı olarak oluşturulur, çünkü OPTIR görüntülerinden tüm hücreler için metabolik aktiviteler analiz edilebilirken, bilinmeyen hücreler floresan kanallarının hiçbirinde görünmez. Bu, tüm hücrelerin metabolik analize dahil edilebilmesini sağlar. Çok sayıda tanımlanmamış hücre varsa, ilgilenilen farklı taksonların rRNA'sını hedefleyen farklı FISH problarının dikkate alınması gerekebilir.

Sonuçlar

OPTIR-FISH tarafından genetik tanımlama ile tek hücreli mikrobiyal metabolik analiz için genel iş akışı şurada özetlenmiştir: Şekil 2. OPTIR'ın tek hücreli metabolik görüntüleme yeteneğini gösteren temsili sonuçlar şurada gösterilmiştir: Şekil 3. Bu örnekte E. coli hücreleri ile inkübe edilmiştir. 12C- veya 1324 saat boyunca C-glikoz. Dahil edilmesi 13C'nin proteinlere dönüşmesinin, protein amidleri I ve II'de önemli bir kırmızıya kaymaya neden olduğu gösterilmiştir (Şekil 3A)17,18. Bu nedenle, bu iki anahtar dalga sayısı 12C-proteini (1656 cm)-1, normal amid I bandı) ve 13C-proteini (1612 cm)-1, kaydırılmış amid I bandı) seçildi ve bu iki dalga numarasında OPTIR görüntüleri elde edildi. Karşılık gelen parlak alan görüntüleri, hücrelerin morfolojisini göstermek için de gösterilmiştir (Şekil 3B,E). Çubuk şeklindeki bakteriler, hem parlak alan hem de OPTIR görüntülerinde tek hücre düzeyinde net bir şekilde çözülebilir, bu da OPTIR tekniğinin yüksek uzamsal çözünürlüğünü doğrular (Şekil 3B-G). İle inkübe edilen hücreler için 12C-glikoz (Şekil 3B-D), 1656 cm'de daha yüksek bir yoğunluk-1 gözlenirken, 1612 cm daha yüksek bir-1 ile inkübe edilen hücreler için yoğunluk gözlendi. 13C-glikoz (Şekil 3E-G). Bu tepe kayması, daha ağır karbon izotoplarının protein kütlesine dahil edildiğini gösterir17. Değerlendirme, OPTIR-FISH'in çok tür örneklerinde bakteri taksonlarını ve metabolik aktivitelerini ayırt etme yeteneğini değerlendirmek için genişletildi. İnsan bağırsak mikrobiyomunda yaygın olan iki bakteri türünü yapay olarak karıştırdık: E. coli ve B. thetaiotaomicron (B. theta). E. coli ile inkübe edilmiş hücreler 13C-glukoz, Gammaproteobacteria'nın 23S rRNA'sını hedefleyen bir Gam42a-Cy5 probu ile hibritlendi10. B. theta ile inkübe edilmiş hücreler 12C-glukoz, çoğu Bacteroidaceae türünün 16S rRNA'sını hedef alan Bac303-Cy3 probu ile hibritlendi11. Her ikisi de çubuk şeklinde olduğu için parlak alan görüntülerine dayanarak iki türü ayırt etmek çok zordur (Şekil 4A). Bu nedenle, hibritleştirilmiş probların çok renkli floresan görüntülemesi, analiz edilen her bakteri hücresine taksonomik bir kimlik atamak için gerekliydi (Şekil 4B). 1612 cm'de elde edilen OPTIR görüntüleri çıkarıldığında-1 1656 cm'den itibaren-1, bu iki tür örneklemindeki bir hücre segmentinin pozitif çıkarma değerleri gösterdiğini fark ettik (Şekil 4C), dahil edildiğini gösterir 13C izotopları. Kültür koşullarına bağlı olarak, pozitif çıkarma değerine sahip hücreleri E. colive negatif çıkarma değeri olacak B. theta. Bakteri türlerinin atanması, floresan görüntüleme sonuçlarıyla doğrulanır: pozitif çıkarma değerleri üreten hücreler, aşağıdakilere özgü olan Cy5 kontrastı üretir: E. colive negatif çıkarma değerleri üreten hücreler üretir B. theta-spesifik Cy3 kontrastları. Daha sonra, izotopik değiştirme oranı hesaplandı, bu durumda yeni sentezlendi 13C-proteini 13C-glikoz (Şekil 4D). Beklendiği gibi, iki bakteri türü arasında izotopik yer değiştirme oranında anlamlı bir fark (ikili t-testi, p = 9.74 x 10-33) gözlendi. Bu veri seti, birden fazla örnek türünün bulunduğu karmaşık bir ortamda metabolizmayı incelemek için OPTIR-FISH platformunun uygulanmasının fizibilitesinin altını çizmektedir.

Mikrobiyal analiz; floresan hibridizasyonu, izotop etiketleme, OPTIR görüntüleme, genotip fenotipi.
Şekil 1: Eş zamanlı tür tanımlama ve metabolizma analizi için OPTIR-FISH platformunun şeması. Mikrobiyal topluluğun farklı üyeleri, mikrobiyal ribozomal RNA problarının floresan in situ hibridizasyon yoluyla spesifik bağlanması ile tanımlanabilir ve bağlı floroforların floresan görüntülemesi ile tespit edilebilir. Metabolik aktivite, izotopik substratlarla kültürlenerek analiz edilebilir ve OPTIR görüntüleme ile tespit edilebilir. OPTIR görüntüleme, IR absorpsiyonunun neden olduğu saçılma değişikliğini algılar ve OPTIR, yaygın olarak kullanılan floresan araçlarıyla doğal olarak uyumludur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İzotop etiketleme proses diyagramı: mikrobiyal BALIK, OPTIR analizi, kimlik belirleme, oranlar.
Şekil 2: OPTIR-FISH tarafından genetik tanımlama ile metabolik aktivitenin tek hücreli analizi için genel iş akışı. (A) Bakteri hücreleri, izotopik olarak etiketlenmiş substratlarla kültürlendi. (B) Daha sonra floresan in situ hibridizasyon (FISH) gerçekleştirildi. (C) IR şeffaf slaytta numune hazırlama. (D) Parlak alan görüntüleri, optimum hücre yoğunluğuna sahip bölgeleri tanımlar. (E,H) Farklı FISH floroforlarının çok renkli floresan görüntülemesi, FISH probları tarafından belirtildiği veya bilinmediği gibi tek tek hücrelerin genetik kimliğini ortaya çıkarır. (F,G) Normal ve kaydırılmış zirvede müteakip multispektral OPTIR görüntülemesi, mikrobiyal biyokütleye izotopik katılımı ortaya koymaktadır. Etiketlenmemiş ve tam etiketli numuneler (katsayı h) için OPTIR spektrumlarına atıfta bulunarak, düzenli (cr) ve izotopik (ci) biyo bileşenlerin nispi katkısı ölçülebilir. Metabolize izotopik olarak etiketlenmiş substratlardan protein sentezi, "izotopik replasman oranı" kullanılarak ölçüldü. (I) OPTIR-FISH ile, karmaşık bir popülasyondaki mikrobiyal türlerin metabolik aktivitesinin yüksek verimli bir analizi elde edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

12C / 13C-glikoz kullanılarak E. coli'nin spektroskopisi; OPTRIR spektrumları; parlak alan ve OPTIR görüntüleri.
Şekil 3: Temsili OPTIR spektrumları ve görüntüleme sonuçları. (A) Amid I ve amid II bölgesini kapsayan 12C-glukoz (camgöbeği) ve 13C-glukoz (turuncu) ile kültürlenmiş E. coli hücreleri için OPTIR spektrumları. 13C-glukoz kültürü hücre için berrak kırmızıya kaymış bir amid I zirvesi (1656 cm-1 ila 1612 cm-1) gözlenir. (BD) 12 C-glikoz ve (EG) 13C-glikoz kültür koşulları altında normal amid I ve kaymış amid I bandında E. coli hücrelerinin temsili parlak alan ve OPTIR görüntüleri. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu rakam Bai ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

OPTIR çıkarma, E. coli ve B. teta niceleme tablosu ile parlak alan ve FISH mikroskobu görüntüleri.
Şekil 4: Bakteri karışımlarından elde edilen temsili görüntüler ve miktar tayini sonuçları. E. coli hücreleri 13C-glukoz ile inkübe edildi, ardından oligonükleotid probu Gam42a-Cy5 ile hibridizasyon yapıldı. B. teta hücreleri 12C-glikoz ile inkübe edildi, ardından oligonükleotid probu Bac303-Cy3 ile hibridizasyon yapıldı. (A) Parlak alan görüntüsü, hücre karışımının morfolojisini gösterir. (B) İki renkli floresan görüntüsü, E. coli (kırmızı) ve B. theta'nın (yeşil) dağılımını gösterir. (C) OPTIR çıkarma sonucu (1612 cm-1-1656 cm-1) bakteri hücrelerinin protein metabolizmasını gösterir. (D) 13C-glikozdan yeni sentezlenen 13C-proteinini temsil eden izotopik replasman oranının miktarının belirlenmesi. (İkili t-testi: p = 9.74 x 10-33). Ölçek çubukları: 10 μm. Bu rakam Bai ve ark.9'un izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada, mikrobiyal türlerin eşzamanlı olarak tanımlanması ve metabolik aktivitelerin tek hücre çözünürlüğünde ölçülmesi için OPTIR-FISH platformunu uygulamak için ayrıntılı bir protokol tanımladık. Kritik adımlar, spesifik metabolik aktiviteleri incelemek için kararlı izotop etiketlemeli kültürü ve hedef mikrobiyal türleri tanımlamak için yerinde floresan hibridizasyonunu içerir. Çok kanallı floresan görüntüleme ve seçilen dalga sayılarında OPTIR görüntüleme aynı mikroskopta sırayla gerçekleştirilebilir. Karmaşık topluluk içindeki farklı türlerin metabolik aktivite seviyelerini ortaya çıkarmak için bu görüntülerin nicel olarak nasıl analiz edileceğini gösterdik. Protokol, karmaşık topluluk içindeki çeşitli türlerin kendi doğal ortamlarında metabolik olarak incelenmesi için özellikle çekici olabilir.

Burada örnek olarak bakterileri kullandık, ancak bu protokol mantarlar ve memeli hücreleri gibi diğer organizmalar için uyarlanabilir. Önemli bir nokta, hedef metabolik sürecin titreşim problarını kültür ortamına normal muadilinden bağımsız olarak eklemektir. Örneğin, yağ asitlerinden lipid metabolizması inceleniyorsa, azido etiketli yağ asitleri, yağ asitleri orijinal olarak FBS'den geldiğinden, de-lipid fetal sığır serumundan (FBS) oluşan standart kültür ortamlarına eklenmelidir. Ek olarak, kuluçka süresinin de farklı mantarların veya memeli hücrelerinin büyüme hızıyla eşleşmesi gerekir. Bu, hedef makromoleküllerdeki titreşim problarının etiketleme verimliliğini en üst düzeye çıkarırken hücrelerin normal büyümesini sağlar.

Burada açıklanan protokol, glikozdan protein sentezinin ötesindeki diğer metabolik süreçleri incelemek için de uyarlanabilir. Protein, lipitler, nükleik asitler ve karbonhidratlar dahil olmak üzere tüm ana biyomoleküller OPTIR19,20 ile görüntülenebilir. Ayrıca, 13C, 15N, 18O ve 2H gibi izotopik etiketleme ve küçük moleküllere C≡C ve C≡N gibi titreşim etiketlerinin eklenmesi dahil olmak üzere çok çeşitli etiketleme stratejileri vardır21. Küçük etiket boyutları ve yüksek biyouyumluluk nedeniyle, floresan analoglarına kıyasla metabolizma çalışması için tercih edilen bir yöntemdir. Farklı titreşim probları kullanarak diğer metabolik süreçleri incelemek için, bu protokol, hücre kültürü ve metabolik etiketleme adımlarının yanı sıra ilgili referanslarda 21,22,23 bulunabilen farklı problara ve metabolik ürünlere dayalı dalga sayısı seçimi de dahil olmak üzere değiştirilebilir. Örneklerden bazıları, insan kaynaklı iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) kültür sistemlerinde24 azid-palmitik asitten yeni sentezlenen lipitlerin haritalandırılmasını, makrofaj hücrelerinde23 azidohomoalaninden yeni sentezlenen proteinin görüntülenmesini, PC3 hücrelerinde döteryum-glikoz ile glikoz metabolizmasının görüntülenmesiniiçerir 25 ve insan bağırsak mikrobiyomunda bir aktivite belirteci olarak ağır sudan döteryum katılımının analizi26.

Protokolün potansiyel bir sınırlaması, karmaşık topluluklarda 13C'lik algılama sınırıdır. Burada kullanılan saf kültür için tespit sınırının toplam karbon9'da 13C'nin %5'i olduğunu gösterdik. Ayrıca, tam 13C etiketli E. coli hücresini etiketlenmemiş insan karmaşık bağırsak mikrobiyom örnekleriyle karıştırarak, çeşitli etiketlenmemiş bağırsak mikrobiyom türlerinden kaynaklanan farklı hücresel kimyasal bileşimlerle ilişkili potansiyel spektral varyasyona rağmen, E. coli'yi metabolik profillere dayalı olarak güvenle ayırt edebileceğimizi gösteriyoruz9. Bununla birlikte, mevcut mikrobiyal türlerin benzersiz fizyolojilerinden etkilenen karmaşık mikrobiyal topluluklar, tutarsız 13C asimilasyon oranları sergileyebilir. Bu gibi durumlarda, OPTIR-FISH'in 13C etiketli ve 12C etiketli hücresinin metabolik farklılaşma kabiliyetini karmaşık bir topluluk bağlamında daha fazla test etmeye değer. Platformun performansı daha da geliştirilebilir. Örneğin, geniş alan OPTIR kurulumunu birleştirerek, görüntüleme hızı önemli ölçüde artırılabilir27. Görüntüleme hızını daha da artırmak için makine öğrenimine dayalı gelişmiş gürültü giderme yöntemleriplatforma dahil edilebilir 28,29. Mikrobiyal hücrelerdeki ayrıntılı metabolit dağılımını daha iyi görselleştirmek için, yakın zamanda geliştirilen süper çözünürlük teknolojileri benimsenebilir30,31.

Bu protokolün kritik adımları, oligonükleotid probunun rasyonel tasarımı, formamid konsantrasyonunun optimizasyonu ve hibridizasyon ortamının dikkatli kontrolü ile elde edilebilecek hedef mikroplar için FISH etiketlemesinin verimliliğinin optimize edilmesini içerir. Yüksek verimli analiz için numunelerin uygun bir tek hücre yoğunluğunda hazırlanması, pratikte yüksek verimli üretim için önemlidir. Niceleme için yeterli sinyal elde etmek için sistemi optimize etmek de çok önemlidir. Bu, otomatik arka plan adımı sırasında cihaz kontrol yazılımında otomatik olarak yapılır. Numune hazırlamada, standart CaF2 slaytı yerine farklı türde bir slayt kullanılması gibi bir sapma varsa, yazılımda manuel optimizasyon yapılabilir. Manuel optimizasyon adımı sırasında, orta IR ve görünür ışık arasındaki örtüşme, bir dizi orta IR konumu taranarak optimize edilir. Başlıca zorluklar, ilgilenilen metabolik aktiviteleri ölçmek için en uygun titreşim substratlarının ve karşılık gelen OPTIR dalga sayılarının seçilmesini içerir.

Sonuç olarak, bu çalışma, OPTIR-FISH platformu ile metabolik aktivite ve mikrobiyal tanımlamanın tek hücre düzeyinde aynı anda nasıl elde edilebileceğini göstermektedir. Bu ayrıntılı protokolün, yaygın olarak kullanılan floresan araçlarıyla yüksek uyumluluğa sahip bu yeni titreşimsel görüntüleme platformunun yaygın olarak benimsenmesini teşvik etmek, yaşam bilimleri ve tıbbın çeşitli alanlarında uygulamaları mümkün kılmak ve yeni keşifler için fırsatların kilidini açmak için yararlı bir rehberlik sağlayacağına inanıyoruz.

Açıklamalar

Y.B., Photothermal Spectroscopy Corp. için yarı zamanlı bir danışmandır.

Teşekkürler

Bu çalışma, JCC'ye R01AI141439 Ulusal Sağlık Enstitüsü R35GM136223 tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 96 EtanolThermoScientificT032021000
Kalsiyum FlorürCrystranCAFP10-0.35
D-(+)-GlikozSigma-AldrichG7021-1KG
D-Glukoz (U-13C6,% 99)Cambridge İzotopik LaboratuvarlarıCLM-1396-1
Etilendiamintetraasetik asitSigma-AldrichE9884-100G
formamidThermoScientific17899
Luria-Bertani et suyu Sigma-AldrichL3522-250G
M9 Minimal Tuzlar 5xSIGMAM6030-1KG
OPTIR cihazıFototermal Spektroskopi A.Ş.mIRage LS
Paraforaldehit Çözeltisi, PBSThermoScientificJ19943-K2
poli-L-lizin çözeltisinde %4 %0.1 (a/h) Sigma-AldrichP8920-500ML
Sodyum KlorürSigma-AldrichS9888-25G
Sodyum dodesil sülfatSigma-AldrichL3771-25G
Tris(hidroksimetil)aminometan hidroklorür, %99+ThermoScientificA11379.18
Tripik Soya SuyuSigma-Aldrich22092-500G

Kaynaklar

  1. Evers, T. M. J., et al. Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis. Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).
  2. Overmann, J., Abt, B., Sikorski, J. Present and future of culturing bacteria. Annu Rev Microbiol. 71, 711-730 (2017).
  3. Epstein, S. The phenomenon of microbial uncultivability. Curr Opin Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).
  4. Su, C., Lei, L., Duan, Y., Zhang, K. -Q., Yang, J. Culture-independent methods for studying environmental microorganisms: methods, application, and perspective. Appl Microbiol Biotechnol. 93 (3), 993-1003 (2012).
  5. Musat, N., Foster, R., Vagner, T., Adam, B., Kuypers, M. M. Detecting metabolic activities in single cells, with emphasis on nanoSIMS. FEMS Microbiol Rev. 36 (2), 486-511 (2012).
  6. Jiang, H., Kilburn, M. R., Decelle, J., Musat, N. NanoSIMS chemical imaging combined with correlative microscopy for biological sample analysis. Curr Opin Biotechnol. 41, 130-135 (2016).
  7. Porta Siegel, T., et al. Mass spectrometry imaging and integration with other imaging modalities for greater molecular understanding of biological tissues. Mol Imaging Biol. 20 (6), 888-901 (2018).
  8. Lagunov, O., Drenchev, N., Chakarova, K., Panayotov, D., Hadjiivanov, K. Isotopic labelling in vibrational spectroscopy: a technique to decipher the structure of surface species. Top Catal. 60, 1486-1495 (2017).
  9. Bai, Y., Guo, Z., Pereira, F. C., Wagner, M., Cheng, J. -X. Mid-infrared photothermal-fluorescence in situ hybridization for functional analysis and genetic identification of single cells. Anal Chem. 95 (4), 2398-2405 (2023).
  10. Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M., Schleifer, K. -H. Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of proteobacteria: problems and solutions. System Appl Microbiol. 15 (4), 593-600 (1992).
  11. Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Vancanneyt, M., Schleifer, K. -H. Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment. Microbiology. 142, 1097-1106 (1996).
  12. Daims, H., Stoecker, K., Wagner, M. Fluorescence In Situ Hybridization for the Detection of Prokaryotes. Molecular Microbial Ecology. , Taylor & Francis. London. (2004).
  13. Bridger, J. M., Volpi, E. V. Fluorescence In Situ Hybridization (FISH): Protocols and Applications. , Springer, Humana. Totowa, NJ. (2010).
  14. Wang, D. O., et al. A quick and simple FISH protocol with hybridization-sensitive fluorescent linear oligodeoxynucleotide probes. RNA. 18 (1), 166-175 (2012).
  15. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Res. 44, D586-D589 (2016).
  16. Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. mathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Appl Environ Microbiol. 77 (3), 1118-1122 (2011).
  17. Lima, C., Muhamadali, H., Xu, Y., Kansiz, M., Goodacre, R. Imaging isotopically labeled bacteria at the single-cell level using high-resolution optical infrared photothermal spectroscopy. Anal Chem. 93 (6), 3082-3088 (2021).
  18. Yin, J., et al. Nanosecond-resolution photothermal dynamic imaging via MHZ digitization and match filtering. Nat Commun. 12 (1), 7097(2021).
  19. Bai, Y., Yin, J., Cheng, J. -X. Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect. Sci Adv. 7 (20), (2021).
  20. Xia, Q., Yin, J., Guo, Z., Cheng, J. -X. Mid-infrared photothermal microscopy: principle, instrumentation, and applications. J Phys Chemi B. 126 (43), 8597-8613 (2022).
  21. Du, J., Wang, H., Wei, L. Bringing vibrational imaging to chemical biology with molecular probes. ACS Chem Biol. 17 (7), 1621-1637 (2022).
  22. Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Phys Biol. 16 (4), 041003(2019).
  23. Shi, L., et al. Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes. Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).
  24. Bai, Y., et al. Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems. Nat Commun. 15 (1), 350(2024).
  25. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).
  26. Ge, X., et al. SRS-FISH: A high-throughput platform linking microbiome metabolism to identity at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (26), e2203519119(2022).
  27. Bai, Y., et al. Ultrafast chemical imaging by widefield photothermal sensing of infrared absorption. Sci Adv. 5 (7), 7127(2019).
  28. Zhang, J., Zhao, J., Lin, H., Tan, Y., Cheng, J. -X. High-speed chemical imaging by dense-net learning of femtosecond stimulated Raman scattering. J Phys Chem Lett. 11 (20), 8573-8578 (2020).
  29. Lin, H., et al. Microsecond fingerprint stimulated Raman spectroscopic imaging by ultrafast tuning and spatial-spectral learning. Nat Commun. 12 (1), 3052(2021).
  30. Fu, P., et al. Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy. Nat Photon. 17, 330-337 (2023).
  31. Tamamitsu, M., et al. Mid-infrared widefield nanoscopy. arXiv. , (2023).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tek Hücre Metabolizmasıİzotop EtiketlemeBakteriyel Hücre TanımlamaMetabolik GörüntülemerRNA FISH ProblarıKalsiyum Florür LamlarSpektral Veri Analizi
Optik Fototermal Kızılötesi-Floresan Yerinde Hibridizasyon (OPTIR-FISH)
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.