Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/tr/66562

Burada, tek tek hücreleri tanımlamak ve metabolizmalarını anlamak için orta kızılötesi fototermal-FISH (MIP-FISH) olarak da bilinen optik fototermal kızılötesi floresan yerinde hibridizasyon (OPTIR-FISH) kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, tek hücre çözünürlüğü ile hücresel metabolizmanın haritalanması da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için geniş çapta uygulanabilir.

Abstract

http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/tr/66562

Karmaşık topluluklar içindeki tek tek hücrelerin metabolik aktivitelerini anlamak, insan hastalıklarındaki rollerini ortaya çıkarmak için kritik öneme sahiptir. Burada, rRNA etiketli FISH problarını ve izotop etiketli substratları birleştirerek OPTIR-FISH platformu ile eşzamanlı hücre tanımlama ve metabolik analiz için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Floresan görüntüleme, rRNA etiketli FISH problarının spesifik bağlanması ile hücre tanımlaması sağlarken, OPTIR görüntüleme, OPTIR spektrumlarında izotop kaynaklı kırmızıya kayma ile tek hücreler içinde metabolik aktiviteler sağlar. Test yatağı olarak ¹³C-glikoz ile kültürlenmiş bakterileri kullanan protokol, izotopik etiketleme, floresan in situ hibridizasyon (FISH), numune hazırlama, OPTIR-FISH görüntüleme kurulumunun optimizasyonu ve veri toplama ile mikrobiyal kültürü ana hatlarıyla belirtir. Ayrıca, görüntü analizinin nasıl gerçekleştirileceğini ve spektral verilerin yüksek verimle tek hücre düzeyinde nasıl yorumlanacağını da gösteriyoruz. Bu protokolün standartlaştırılmış ve ayrıntılı doğası, geniş tek hücreli metabolizma araştırma topluluğu içindeki farklı geçmişlere ve disiplinlere sahip araştırmacılar tarafından benimsenmesini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.

Introduction

http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/tr/66562

Hücresel metabolizma, hücre biyolojisinde temel bir dayanak olarak durur ve hücre sağlığını, işlevini ve çevre ile etkileşimi belirleyen birçok süreci yönlendirir. Metabolizmayı bireysel hücre düzeyinde, özellikle doğal ortamlarda analiz etmek, biyolojik sistemlerdeki heterojen ve karmaşık aktiviteleri ortaya çıkarmak için paha biçilmez bilgiler sağlar¹. Bu, özellikle mikroorganizmaların incelenmesinde çok önemlidir, çünkü birçok mikrop, geleneksel yetiştirme yöntemlerine meydan okuyan benzersiz büyüme gereksinimleri veya çevresel bağımlılıklar sergiler². Örneğin, bazı türler, laboratuvar ortamında kolayca kopyalanamayan spesifik besin bileşimleri veya simbiyotik ilişkiler gerektirebilir, bu nedenle onları standart tekniklerle kültürlenemez hale getirebilir³. Ayrıca, belirli türlerin yetiştirilmesi için gereken uzun süreler, mikrobiyolojik araştırmalar için önemli zorluklar doğurur ve genellikle çalışma ve analiz için pratik zaman çerçevelerinin ötesine uzanır. Bu sınırlamaları aşmak için, polimeraz zincir reaksiyonu ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) gibi alternatif yöntemler, mikrobiyal ekosistemlerin daha doğru ve bütünsel bir görünümünü elde edebilen yetiştirme⁴ gerektirmeden mikrobiyal türlerin tanımlanmasına izin verir. Bununla birlikte, bu analitik teknolojiler hücresel metabolizmayı açıklama yeteneğinden yoksundur. Bu boşluk, mikrobiyoloji alanında devam eden zorlukları vurgulamaktadır: hücresel kimliği ayırt etme ve tek hücre düzeyinde metabolizmayı aydınlatmanın eşzamanlı görevi. Kararlı izotoplarla birleştirilmiş görüntüleme kütle spektrometresi (IMS) gibi tekniklerdeki ilerlemeler, tek hücreli metabolik analiz için güçlü araçlar olarak ortaya^{çıkmıştır5}. Bu deneylerde hücreler, ¹³C veya ¹⁵N gibi izotoplar içeren substratlarla inkübe edildi. Yeni anabolize edilmiş biyomoleküller bu izotopları taşır ve bu da onları m / z spektrumlarında ayırt edilebilir hale getirir. Bununla birlikte, IMS, pahalı enstrümantasyon, karmaşık numune hazırlama, nispeten düşük verim ve m/z spektrumlarını analiz etmek için gereken uzmanlıktan muzdariptir. Moleküler belirteç spesifik floresan görüntüleme ile birleştirildiğinde, artan özgüllük⁶ ile hücresel metabolizmanın aydınlatılmasında ilerlemeler kaydedilmiştir. Bununla birlikte, bu iki yöntem arasında köprü kurmada zorluklar devam etmektedir. IMS ve floresan görüntüleme arasındaki çözünürlük farkı, farklı operasyonel kurulumlarla birleştiğinde, bulguların hizalanmasını ve ilişkilendirilmesini zorlaştırır⁷.

Titreşimsel spektroskopik görüntülemenin kararlı izotop etiketleme ile entegrasyonu, tek hücreli metabolizmanın incelenmesi için yeni bir çözüm sunar. Daha ağır izotopların dahil edilmesi, kimyasal bağların titreşimini yavaşlatır ve titreşim spektrumlarında⁸ kırmızıya kayan tepelere yol açar. Özellikle, titreşimsel görüntüleme, floresan görüntüleme ile karşılaştırılabilir bir uzamsal çözünürlük sağlar ve hem metabolik niceleme hem de hücre tanımlaması tek bir kurulumda gerçekleştirilebilir, bu da görüntü kaydını ve korelasyonu basitleştirir. Son çalışmamız, gelişmiş bir titreşimsel görüntüleme platformunun kombinasyonunu göstermiştir: bakteri topluluklarında glikoz metabolizmasını araştırmak için optik fototermal kızılötesi (OPTIR) ile floresan yerinde hibridizasyon (FISH)⁹ (Şekil 1). OPTIR, optik mikroskopide olduğu gibi mikrometre altı çözünürlük sağlayan, ancak orta IR absorpsiyonundan kaynaklanan ek titreşimsel spektroskopik bilgi ile görünür ışık değişimini algılayarak orta IR absorpsiyonunun fototermal etkisinden yararlanan bir titreşimsel spektroskopik mikroskopi sistemidir. FISH, mikroorganizma kimliğini tek hücre düzeyinde belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Oligonükleotid dizisi, farklı taksonların spesifik 16S dizilerini hedeflemek için tasarlanabilir ve farklı floroforlar eklenebilir. Tasarlanan oligonükleotid problarının hedef rRNA ile spesifik hibridizasyonu, tek tek hücreler içinde hedef türlerin güçlü floresan sinyallerine yol açar ve popülasyon içindeki birden fazla türü tanımlamak için çok kanallı floresan görüntüleme gerçekleştirilebilir. Hem OPTIR hem de floresan görüntüleme optik algılamaya dayandığından, OPTIR ve FISH floresansının birleştirilmesinin uygulanması kolaydır. İki modalite, tek hücreli analiz için aynı optik çözünürlüğü paylaşır ve ek hizalama veya ortak kayıt gerektirmeden rahatça değiştirilebilir.

Bu protokol, gelişmiş tek hücreli yapı-fonksiyon analizi için OPTIR-FISH platformundan yararlanmak için ayrıntılı bir kılavuz sunar. ¹³C-glikoz içeren ortamda büyütülen bakteri örneklerini test yatağı olarak kullandık ve ¹³C-glikozdan de novo protein sentezini ölçtük. Platformun hücreleri tanımlama yeteneğini göstermek için, her türün rRNA hedefli FISH probları kullanılarak etiketlendiği bakteri karışımları kullandık. Bu yaklaşım, Escherichia coli (E. coli) ve Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta) gibi spesifik bakteri suşlarının ve metabolizmalarının kesin tek hücreli tanımlanmasını kolaylaştırdı. Bu protokol, araştırmacılara tek hücre düzeyinde eşzamanlı metabolik profilleme ve tür tanımlama için güçlü bir araç sunar ve hücresel etkileşimler, fizyoloji ve karmaşık ortamlardaki rolleri hakkındaki anlayışımızı ilerletmeyi vaat eder.

Protocol

http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/tr/66562

Bu çalışmada bakteri örneklerinin kullanımı, Boston Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü’nün yönergelerine uygundur.

NOT: Bu protokolde izlenen genel iş akışı Şekil 2’de özetlenmiştir.

1. Bakteri kültürü ve izotop etiketleme (Şekil 2A)

NOT: Burada verilen örnek, saf bir bakteri kültürünü etiketlemek içindir. Bu protokol polimikrobiyal topluluklara uygulanıyorsa, ortam ve etiketleme süresi, topluluğa ve ilgilenilen organizmaların fizyolojisine göre ayarlanmalıdır.

1. Üstel büyüme (log) fazına ulaşmak için tek bir koloniden ve ön kültürden ilgilenilen bakteri suşunu, triptik soya suyu (TSB) veya Luria-Bertani suyu (LB) gibi besin açısından zengin bir ortamda 3 saat boyunca aşılayın. E. coli BW25113, bu protokolde örnek bir suş olarak kullanılır.
   NOT: Günlük aşamasına ulaşma süresi, kullanımdaki türe göre değişecektir. Bu sürenin her suş için uyarlanması gerekir.
2. Bakteri konsantrasyonunu tahmin etmek için optik yoğunluğu 600 nm’de ölçün.
3. İzotopik olarak etiketlenmiş substratlarla desteklenmiş minimal bir büyüme ortamı hazırlayın. E. coli BW25113 için, M9 minimal ortamı% 0.2’lik (a / h) bir nihai konsantrasyonda ¹³C-glikoz ile destekleyin.
   NOT: Kullanılan ¹³C-glikoz (D-glikoz ^U-13C₆,% 99) evrensel olarak etiketlendi, burada tüm karbon atomları ¹³C atomu ile değiştirildi. Minimum büyüme ortamının seçimi, bakteri suşuna bağlı olacaktır. İzotop substratının seçimi, ilgilenilen spesifik metabolik sürece bağlı olacaktır. Genel amaç, izotopik substratın, etiketlenmemiş muadillerine kıyasla ana beslenme kaynağı olarak hizmet etmesidir.
4. İzotopik olarak etiketlenmiş substratı içeren minimum büyüme ortamındaki bakterileri 5 × 10⁵ CFU / mL’lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
   NOT: Genellikle, 1:100 gibi yüksek bir seyreltme oranı kullanılır ve zengin ortamdan gelen etiketlenmemiş besin ihmal edilebilir hale gelir. Alternatif olarak, besin açısından zengin ortamın tamamen uzaklaştırılmasını sağlamak için, 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir yıkama, 4 ° C’de 10 dakika boyunca 14.000 x g’da santrifüjleme ve PBS’de yeniden süspansiyon ve ardından ikinci bir santrifüjleme ve minimum büyüme ortamında son yeniden süspansiyon ile gerçekleştirilebilir.
5. Bakteri örneklerini optimum büyüme koşulları altında orbital sallama inkübatöründe büyütün. Genel olarak, orbital sallama inkübatörünü 220 rpm hıza ve 37 °C sıcaklığa ayarlayın ve aerobik inkübasyon için kültür tüplerini gevşek bir kapakla eğik olarak yerleştirin. E. coli için, 37 ° C’de 24 saatlik aerobik inkübasyon, maksimum ¹³° C etiketlemeye ulaşmak için genellikle yeterlidir.
   NOT: Kuluçka süresi, ilgilenilen metabolik sürece bağlıdır. Daha uzun inkübasyon süresi genellikle daha yüksek izotopik etiketlemeye yol açar. Etiketlenmemiş bir substrat ile aynı koşul altında bir büyüme eğrisi ölçümü, uygun toplama zaman noktalarının belirlenmesine ilişkin içgörü sağlayabilir.
6. 4 ° C’de 10 dakika boyunca 14.000 x g’da santrifüjleme ile istenen zaman noktalarında bakteri hücrelerini toplayın.
7. Süpernatanı çıkarın ve PBS’de eşit hacimde% 4 paraformaldehit (PFA) içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika veya 4 ° C’de 2 saat PFA çözeltisine sabitleyin. Uzun süreli depolama için, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, hücreleri 1 mL %50 (h/h) PBS ve %96 etanol içinde yeniden süspanse edin ve daha fazla kullanıma kadar -20 ° C’de saklayın.

2. Floresan in situ hibridizasyon (FISH) (Şekil 2B)

1. E. coli hücrelerini, bir siyanin5 (Cy5) florofor (Gam42a-Cy5) ile etiketlenmiş Gam42a¹⁰ oligonükleotid probu ve B. teta hücreleri ile hibritleyin Bac303¹¹ oligonükleotid probu ile bir siyanin3 (Cy3) florofor (Bac303-Cy3) ile etiketlenmiş oligonükleotid probu ile standart bir FISH protokolünü takiben.
   NOT: Tanımlama için rRNA-FISH’in temelleri: rRNA molekülleri, mikrobiyal hücreler içinde her yerde dağıldıkları ve doğal olarak amplifiye edildikleri için FISH’in ideal hedefleridir. rRNA ayrıca hem korunmuş hem de değişken dizi bölgeleri içerir, böylece hedef grubun filogenetik derinliği oligonükleotid probunun korunma derecesi ile belirlenebilir. Tasarlanan probun hedef diziye spesifik olarak bağlanmasıyla, etiketli florofor, tek tek hücreler için floresan sinyalleri gösterir.
2. Floresan in situ hibridizasyon için ayrıntılı protokol için daha önce yayınlanmış literatür 12,13,14’e bakın. Aşağıdaki adımlar, mikrobiyal hücreler için standart protokolü kısaca açıklamaktadır.
   1. Dehidratasyon:
      1. Sabit hücreleri (100 μL) 14.000 x g’da 10 dakika boyunca peletlemek için santrifüjleyin, 100 μL% 96 analitik dereceli etanol içinde yeniden süspanse edin ve RT’de 1 dakika inkübe edin.
      2. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca 14.000 x g’da tekrar santrifüjleyin, etanolü çıkarın ve hücre peletinin havada kurumasını bekleyin.
   2. Hibridizasyon: Hücreleri 46 ° C’de 3 saat boyunca çözelti (100 μL) içinde hibritleştirin.
      NOT: Hibridizasyon tamponu, 900 mM NaCl, 20 mM Tris- (hidroksimetil) -amino metan HCl, 1 mM etilendiamin tetraasetik asit,% 0.01 sodyum dodesilsülfat, 100 ng ilgili floresan etiketli oligonükleotid ve sıkı koşullar elde etmek için gerekli formamid konsantrasyonundan oluşur.
   3. Santrifüj: Hibridizasyondan hemen sonra, numuneleri 46 °C’de önceden ısıtılmış bir rotorlu bir santrifüje aktarın ve izin verilen maksimum sıcaklıkta (genellikle 40 °C) 15 dakika boyunca 14.000 x g’da santrifüjleyin.
   4. Yıkayın ve saklayın:
      1. Numuneleri 48 °C’de 15 dakika boyunca uygun sertlikte bir tamponda yıkayın. Daha sonra, hücreleri 14,000 ° C’de önceden ısıtılmış bir rotor ile bir santrifüjde izin verilen maksimum sıcaklıkta 15 dakika boyunca 46 x g’da santrifüjleyin.
      2. Son olarak, hücreleri 500 μL buz gibi soğuk PBS ile yıkayın, 20 μL 1x PBS’de yeniden süspanse edin ve daha fazla kullanana kadar 4 °C’de saklayın.
         NOT: Probun spesifik bağlanması, doğru hibridizasyon sıkılığı ile sağlanır. Hibridizasyon sıcaklığının arttırılması, tuz konsantrasyonunun azaltılması veya denatüran formamid eklenmesiyle yüksek sıkılık elde edilebilir. Formamid, nükleik asit duplekslerini stabilize eden hidrojen bağları ile etkileşime girer. Burada, formamid konsantrasyonu ayarlanırken hibridizasyonda sıcaklık ve tuz konsantrasyonu değiştirilmez. Yeni tasarlanan problar için optimal formamid konsantrasyonu, formamid ayrışma eğrileri¹⁰ kullanılarak deneysel olarak belirlenir. Yayınlanmış problar için gerekli formamid konsantrasyonu probeBase^15’te veya bir literatür taraması ile bulunabilir. Alternatif olarak, tahmin edilen formamid konsantrasyonları, mathFISH¹⁶ kullanılarak in silico analizden elde edilebilir. Yıkama adımında, biraz daha yüksek bir sıcaklık, biraz daha katı bir duruma yol açar ve bu da daha yüksek bir bağlanma özgüllüğüne yol açar.

3. Numune hazırlama (Şekil 2C)

1. Slayt temizleme ve kaplama:
   1. Standartlaştırılmış CaF₂ slaytları kullanın (alet numune tutucusu ile uyumluluk için 10 mm çapında ve 350 μm kalınlığında). CaF_2’yi 15 dakika boyunca %70 etanole batırın ve DI su ile iki kez durulayın.
   2. Temizlenmiş slaytları %0.1 poli-L-lizin çözeltisine aktarın ve gece boyunca 4 °C’de inkübe edin. Slaytları bir kez DI su ile durulayın ve havada kurutun.
2. Hazırlanan hücre örneklerini ışıktan korunarak RT’de çözdürün.
3. Numune kurutma sırasında PBS’den aşırı tuz kristallerini önlemek için 3.3.1-3.3.2 adımlarını izleyin.
   1. Hücreleri iki kez deiyonize su (DI) ile yıkayın. 10 dakika boyunca 14.000 x g’da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
   2. Orijinal DI su hacmini geri ekleyin ve yavaşça girdaplayın. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve DI su ile yıkamayı tekrar ekleyin.
4. (İsteğe bağlı) Karışım numuneleri için, her numuneden aynı hacmi aktarın ve bir santrifüj tüpüne karıştırın.
5. Bakteri hücresi örneklerini 10 dakika boyunca 14.000 x g’da santrifüjleme ile konsantre edin ve süpernatanı çıkarın.
6. Kalan çözeltiyi ~ 30 s boyunca hafifçe girdaplayın ve hazırlanan CaF₂ slaytına 1-2 μL çözelti ekleyin. Numuneyi ışıktan korunurken 30 dakika havayla kurutun.
   NOT: Havayla kuruduktan sonra sürgü üzerinde küçük bir yuvarlak nokta görünmelidir. “Kahve halkası” etkisi nedeniyle, noktanın kenarları daha yüksek bir bakteri hücresi yoğunluğuna sahip olacaktır. Bu santrifüj adımı, verimli tek hücreli bakteri görüntüleme için uygun bir yoğunluğa ulaşmaktır. İdeal konsantrasyon, mikroskop altında tek tek tek bakteri hücrelerinin düzgün ve yoğun bir tabakasına yol açmalıdır. Santrifüjden sonra çıplak gözle görülebilen berrak bir pelet varsa, süpernatanı çıkarın, böylece girdaptan sonra çözelti neredeyse berrak görünür. Süpernatan uzaklaştırma hacmini tahmin etmek için kontrol numunesi üzerinde hızlı bir test yapılabilir. Parlak alan mikroskobu altında optimal seyreltme hacmini incelemek için mikroskop cam lamı üzerine farklı miktarlarda kalan süpernatan içeren bir dizi damlacık biriktirilebilir. Santrifüjlemeden sonra görünür bir pelet yoksa, numuneleri büyük ölçüde konsantre etmek için süpernatantın çoğunu çıkarın. İşin püf noktası, santrifüj tüpünü, menteşe dışarıda olacak şekilde sabit açılı bir rotorda konumlandırmaktır, böylece pelet tüp menteşesinin aynı tarafında görünür. Ek olarak, peleti sağlam tutmak için süpernatan çıkarma sırasında daha fazla hassasiyet için pipet boyutlarını (P1000, P200, P10) küçültün.
7. Slaytı verilen bir numune tutucuya monte edin ve ölçüm sırasında slaydı sabitlemek için küçük noktalar polyester bant kullanın.

4. OPTIR-FISH görüntüleme

NOT: Floresan görüntüleme ve OPTIR görüntüleme, OPTIR sistemi üzerinde gerçekleştirilecektir.

1. Sistem geometrisi:
   1. Bu protokol ile orta IR pompasının ve görünür probun karşı yayılımını, görünür ışığın geriye doğru (epi) algılanmasını kullanın.
   2. Görünür ışığı odaklamak ve geri yansıyan ve saçılan görünür ışığı toplamak için bir hava hedefi (50x 0.8NA) kullanın. Orta IR ışığını odaklamak için bir Cassegrain objektif (40x 0.78NA) kullanın.
   3. Sistemin ayrıca birden fazla floresan filtre setine sahip geniş alanlı bir epi-floresan modülü ile donatıldığından emin olun. Bu protokolde kullanılan floroforlar için, Cy3 algılaması için yeşil floresan proteini (GFP) filtre setini ve Cy5 tespiti için Alexa Fluor 647 filtre setini seçin.
2. Ölçümler için hazırlanın:
   1. Sistemi çalıştırın ve cihaz kontrol yazılımını açın. Başlatmadan sonra, Karşı Prop ve Floresan kaydırıcısını açık konuma getirin.
   2. Hedefi 50x olarak ayarlayın ve ardından IR güç spektrumunu elde etmek için Otomatik arka plan gerçekleştirin. Elde edilen örnek spektrumlarını normalleştirmek veya OPTIR görüntülerini farklı dalga sayılarında normalleştirmek için güç spektrumunu kullanın. Bu, orta IR lazer güç farklılıklarının veri analizi ve niceleme üzerindeki etkisini ortadan kaldıracaktır.
      NOT: Normalizasyon için IR güç spektrumlarının elde edilmesi, ölçülen yoğunluk IR gücüyle doğrusal olarak ilişkili olduğundan, aşağı akış kantitatif analizi için zorunludur. Otomatik arka plan gerçekleştirdikten sonra yazılım, OPTIR spektrumlarını ve OPTIR görüntülerini kullanıcılar için otomatik olarak IR güç spektrumlarına normalleştirecektir. Sistemin_N2 ile temizlenmesi, su buharının etkisini en aza indirebilir ve deneyler arasında tekrarlanabilirliği artırabilir.
3. Numuneyi yüklemek için, numune aşamasını dışarı taşımak için Boşalt düğmesini kullanın. Örnek alanını bulmak ve optimum örnek yoğunluğuna sahip bölgeye gitmek için 10x gibi düşük bir büyütme hedefi kullanın. Kontrol yazılımında objektif yüksekliğini ayarlayarak numuneyi odaklayın. Hedef seçimini 50x olarak değiştirin.
4. Görüntü elde etme
   NOT: Kullanılan numuneler şunlardır: i) E. coli (¹³C-glikoz inkübe edilmiş); ii) E. coli (¹²C-glukoz inkübe edilmiş); iii) B. teta (¹²C-glukoz inkübe edilmiş); iv) E. coli (¹³C-glukoz inkübe edilmiş) ve B. teta (¹²C-glukoz inkübe edilmiş) karışımı.
   1. Parlak Alan Görüntüleri (Şekil 2D): Parlak alan görüntülerine bakarak numuneyi odak noktasına getirin.
   2. Floresan görüntüleri (Şekil 2E): Tasarlanan FISH problarıyla ilişkili floroforları tespit etmek ve yazılımdaki floresan modülünü kullanarak sıralı olarak floresan görüntüleme elde etmek için filtre adı düğmesine (Cy3 için GFP ve Cy647 için Alexa Fluor 5) tıklayarak filtre setini değiştirin. Floroforları ağartmadan önce yeterli sinyal kontrastı elde etmek için ışık yoğunluğunu ve maruz kalma süresini ayarlayın.
      NOT: OPTIR ölçümlerinde kullanılan prob floroforları fotoağartma yapabileceğinden, her zaman OPTIR görüntülerinden önce floresan görüntüler elde edin. Floresan belirteçlerin OPTIR tespiti üzerindeki etkisi ile ilgili endişeleriniz için, Cy5 floroforlu FISH’in, hedef bakteri proteini^9’a kıyasla boyut olarak küçük ve bol miktarda düşük olduğu için OPTIR görüntülerine dayalı olarak aşağıdaki nicelemeyi etkilemediğini gösteren daha önce yayınlanmış bir çalışmaya bakın.
   3. OPTIR görüntüleri (Şekil 2F):
      1. Normal tepe noktasını ve izotop kaynaklı kırmızıya kaymış tepe konumunu belirleyin. ¹³C-glikozdan protein sentezi durumunda, normal amid I zirvesi yaklaşık 1656 cm-1’de tespit edilir ve kırmızıya kaymış tepe yaklaşık 1612 ^cm-1’dir (Şekil 3A).
         NOT: Normal tepe konumu, ilgilenilen biyokimyasal bileşene ve/veya metabolik ürüne bağlıdır. Kaydırılan tepe konumu aynı zamanda etiketleme için hangi izotopun kullanıldığına da bağlıdır. Bu iki dalga sayısı, etiketlenmemiş ve maksimum olarak etiketlenmiş hücrelerin tam spektrumlarının ölçülmesiyle deneysel olarak da belirlenebilir (bkz. adım 4.5)
      2. Yazılımı kullanarak IR pompası dalga boyunu 1656 ^cm-1’e ayarlayın. DC sinyalinin (8 V) doygunluğunu önlemek için prob gücünü ve dedektör kazancını buna göre değiştirin. AC sinyalini en üst düzeye çıkarmak için alt Cassegrain objektif yüksekliğine ince ayar yapın.
         NOT: Numunedeki tipik IR gücü yaklaşık 5 mW’dir ve numunedeki prob gücü, numuneye bağlı olarak yaklaşık 3-15 mW’dir. Hem IR hem de prob gücü, hücrelere zarar vermekten kaçınırken yüksek görüntü kontrastı sağlamak için güç seviyesini optimize etmek için kontrol yazılımı kullanılarak ayarlanabilir.
      3. OPTIR görüntülerini 200 x 200 piksel içerecek şekilde ayarlayın ve tarama hızını 100 μm/s olarak ayarlayın. X ve Y yönlerindeki adım boyutunu 150 nm olarak ayarlayın, böylece görüntü boyutu yaklaşık 30 x 30^μm2 olur.
      4. Görüntüyü elde edin.
      5. IR pompası dalga boyunu 1612 ^cm-1’e ayarlayın ve bu dalga numarasında aynı görüş alanından bir görüntü elde edin.
      6. Her örnek için, istatistiksel analiz için en az üç görüş alanı görüntüleyin.
5. (İsteğe bağlı) Spektral ölçüm: Görüntü elde edildikten sonra, ilgilenilen uzamsal bir özellik bulunuyorsa, spektral ölçümü gerçekleştirin.
   1. Konumları seçin: Yazılımın Spektral modülünde analiz için tek bir nokta seçin veya bir dizi nokta belirtin.
   2. Spektral tarama parametresini ayarlayın. Gereksinimlere göre dalga sayısı kapsama aralığını, tarama hızını ve veri çıkış aralığını seçin.
      NOT: tarama hızı ve veri çıkış aralığı, arka plan edinme adımında (adım 4.2) kullanılanlardan farklıysa, doğru normalleştirme için mevcut spektral tarama parametrelerine dayalı yeni bir arka plan gereklidir.
   3. Ortak ortalama sayısını ayarlayın ve spektral ölçümü başlatın. Artan ortak ortalama, spektrumların sinyal-gürültüsünü de artırır, ancak daha uzun alım süreleri gerektirir.
      NOT: Ortak ortalama alma sırasında önemli bir dalgalanma gözlemlenirse, bu, lazer ısıtmanın neden olduğu numune kararsızlığını gösterebilir. Bu genellikle IR gücünün düşürülmesi ve/veya görünür prob gücünün düşürülmesiyle ele alınabilir.

5. Tek hücre düzeyinde veri işleme ve analizi

1. İzotopik substratlardan metabolik sentezi ölçün (Şekil 2G)
   NOT: İzotopik substratlardan metabolik birleşmenin aşağıdaki nicelleştirilmesi, hedef makromoleküllerin normal ve kaydırılmış tepe noktalarına karşılık gelen iki dalga sayılı OPTIR görüntülerine dayanmaktadır. Tam bir hiperspektral yığınla karşılaştırıldığında, iki dalga sayılı görüntüleme, her bir FOV için gereken süreyi büyük ölçüde azaltabilir ve metabolizma nicelemesi için kritik olan izotopik etkiyi tamamen yeniden yakalarken verimi artırabilir.
   1. Kaymış tepe OPTIR görüntüsünü normal tepe OPTIR görüntüsünden çıkarmak, izotop substratlarından sentez aktivitelerinin görsel bir haritasını oluşturur. Bir gösteri olarak (Şekil 3C), ¹³ C-glikoz ile kültürlenmiş E. coli için, (1656 ^{cm-1-1612 cm-1}) görüntüdeki pozitif pikseller, ¹³C’nin proteinlere aktif olarak dahil edildiğini, dolayısıyla daha yüksek bir protein sentez seviyesini gösterir.
      NOT: Çıkarma işlemi, ImageJ Görüntü Hesaplayıcı işlevi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak, çıkarma işlemi, toplu işleme için tercih edilen herhangi bir programlama dilinde kolayca gerçekleştirilebilir.
   2. Tek hücreli metabolik aktivitenin ölçülmesi
      1. Etiketlenmemiş ve tam etiketli referans numunelerinden katsayıları (Şekil 2G’de h ile temsil edilir) elde edin. İzotop kaynaklı kırmızıya kaymış tepe kısmen normal tepe ile örtüşeceğinden, hem etiketlenmemiş hem de etiketli (izotopik olarak etiketlenmiş substrattan yeni sentezlenmiş) numuneler, normal ve kaydırılmış tepe noktasındaki OPTIR sinyallerine katkıda bulunacaktır. Etiketlenmemiş ve tam etiketli referans numunelerinden normal ve kaydırılmış tepe noktasında normalleştirilmiş OPTIR sinyal yoğunluğunu kullanarak bu farklı katkıları ölçün.
         NOT: Referans numuneler için, etiketlenmemiş referans numuneleri, izotopik olarak etiketlenmiş herhangi bir substrat olmadan büyütülür (veya inkübe edilir). Tam etiketli referans numuneleri genellikle en uzun yetiştirme süresine sahip en yüksek izotopik etiketli substrat konsantrasyonu ile yetiştirilir.
      2. Tek hücreli analiz için, parlak alan görüntülerine dayalı tek hücreli maskeler edinin.
         NOT: Bu maskeyi oluşturmak için blob analizi gibi farklı parçacık algılama ve havza gibi hücre segmentasyon yöntemleri de dahil olmak üzere görüntü işlemede çeşitli teknikler uygulanabilir.
      3. Tek tek hücrelerden OPTIR sinyal yoğunluğunu ölçün. Alınan tek hücreli maskeyi iki OPTIR görüntüsüne (normal tepe noktasında ve kaydırılmış tepe noktasında) uygulayın ve her tek hücre için tek hücreli maske bölgesindeki piksel değerlerinin ortalamasını alın. Tek tek hücrelerden elde edilen ortalama değer, nicelemede kullanılacaktır.
      4. Her hücre için, adım 5.1.2.1’deki katsayılara ve adım 5.1.2.3’teki sinyallere dayalı olarak etiketlenmemiş ve etiketlenmiş biyo bileşenlerin göreceli katkısını hesaplayın.
         NOT: Bir izotopik değiştirme oranı, etiketli biyo bileşenlerin hem etiketli hem de etiketsiz biyo bileşenlerin toplamına göreceli katkısı olarak tanımlanır (Şekil 2G). Bu oran 0 ile 1 arasında olmalıdır. İzotopik replasman oranı, ¹³C-glikoz ila ¹²C-glikoz oranı (sabit bir toplam glikoz miktarı ile) ile doğrusal orantılıdır9. E. coli hücreleri için %5 ¹³C-glikozluk yüksek bir algılama hassasiyeti gösterilmiştir.
2. Çok kanallı floresan görüntülerinden bakteri türlerini tanımlayın (Şekil 2H)
   1. ImageJ (Image > Color > Merge Channels) kullanarak farklı bakteri türleri için görsel rehberlik oluşturmak üzere çok renkli floresan kanallarını birleştirin.
   2. Tek hücreli analiz için, her floresan kanalı için, tek tek hücreler için bir dizi ilgi alanı (ROI) oluşturun.
      NOT: Maskeyi oluşturmak için burada farklı otomatik eşikleme yöntemleri ve hücre segmentasyon yöntemleri dahil olmak üzere görüntü işlemede çeşitli teknikler uygulanabilir.
3. FISH kimliklerini ve OPTIR metabolik aktivitelerini ilişkilendirin (Şekil 2I)
   1. ROI’lerin konumlarını ilişkilendirerek FISH floresan görüntülerinden tek hücre düzeyindeki bakteri kimliklerini doğrudan OPTIR görüntülerinden gelen metabolik aktivitelere bağlayın.
   2. Farklı türlerin metabolik aktivitelerini karşılaştırmak için istatistiksel analiz yapın.
      NOT: Maskeler, floresan görüntülerinden ve OPTIR görüntülerinden ayrı olarak oluşturulur, çünkü OPTIR görüntülerinden tüm hücreler için metabolik aktiviteler analiz edilebilirken, bilinmeyen hücreler floresan kanallarının hiçbirinde görünmez. Bu, tüm hücrelerin metabolik analize dahil edilebilmesini sağlar. Çok sayıda tanımlanmamış hücre varsa, ilgilenilen farklı taksonların rRNA’sını hedefleyen farklı FISH problarının dikkate alınması gerekebilir.

Representative Results

http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/tr/66562

OPTIR-FISH tarafından genetik tanımlama ile tek hücreli mikrobiyal metabolik analiz için genel iş akışı şurada özetlenmiştir: Şekil 2. OPTIR’ın tek hücreli metabolik görüntüleme yeteneğini gösteren temsili sonuçlar şurada gösterilmiştir: Şekil 3. Bu örnekte E. coli hücreleri ile inkübe edilmiştir. ¹²C- veya ¹³24 saat boyunca C-glikoz. Dahil edilmesi ¹³C’nin proteinlere…

Discussion

http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/tr/66562

Burada, mikrobiyal türlerin eşzamanlı olarak tanımlanması ve metabolik aktivitelerin tek hücre çözünürlüğünde ölçülmesi için OPTIR-FISH platformunu uygulamak için ayrıntılı bir protokol tanımladık. Kritik adımlar, spesifik metabolik aktiviteleri incelemek için kararlı izotop etiketlemeli kültürü ve hedef mikrobiyal türleri tanımlamak için yerinde floresan hibridizasyonunu içerir. Çok kanallı floresan görüntüleme ve seçilen dalga sayıları…

Materials

96% Ethanol	ThermoScientific	T032021000
Calcium Fluoride	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamide	ThermoScientific	17899
Luria-Bertani broth	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrument	Photothermal Spectroscopy Corp.	mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS	ThermoScientific	J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Trypic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G