Yöntem makalesi

Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu

2.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66566

⸱

19 Nisan 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

Bu makalede

Özet

Burada, nakledilen farenin sol akciğerini iki foton mikroskobu kullanarak intravitalal olarak görüntülemek için bir protokol sunuyoruz. Bu, murin akciğer naklini takiben hücresel dinamikleri ve etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek için değerli bir araçtır.

Özet

Akciğer nakli sonrası komplikasyonlar büyük ölçüde grefte yanıt veren konak bağışıklık sistemi ile ilgilidir. Bu tür bağışıklık tepkileri, donör ve alıcı hücreler arasındaki karışma ile düzenlenir. Bu süreçlerin daha iyi anlaşılması, klinik öncesi hayvan modellerinin kullanımına dayanır ve greft içi bağışıklık hücresi trafiğini gerçek zamanlı olarak inceleme becerisi ile desteklenir. İntravital iki foton mikroskobu, tek fotonlu konfokal mikroskopiye göre büyük bir avantaj sağlayan, minimum foto hasarı ile birkaç yüz mikrona kadar derinliklerde doku ve organları görüntülemek için kullanılabilir. İntravital iki foton mikroskobu sırasında promotöre özgü floresan protein ekspresyonu ve/veya floresan boya etiketli hücrelerin evlat edinici transferi ile transgenik farelerin seçici kullanımı, tek hücrelerin fizyolojik ortamlarında dinamik olarak incelenmesine olanak tanır. Grubumuz, fare akciğerlerini stabilize etmek için bir teknik geliştirdi ve bu da naif akciğerlerde ve ortotopik olarak nakledilen pulmoner greftlerde hücresel dinamikleri görüntülememizi sağladı. Bu teknik, vasküler sistem içindeki ve interstisyumdaki hücresel davranışın ayrıntılı olarak değerlendirilmesine ve ayrıca çeşitli hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerin incelenmesine izin verir. Bu prosedür, akciğer nakli sonrası inflamatuar ve tolerojenik yanıtları düzenleyen bağışıklık mekanizmalarını incelemek için kolayca öğrenilebilir ve uyarlanabilir. Ayrıca diğer patojenik pulmoner durumların incelenmesine de genişletilebilir.

Giriş

Akciğer nakli, son dönem akciğer hastalığından muzdarip birçok hasta için son seçenektir; Ancak akciğer nakli sonrası uzun dönem sağkalım diğer solid organ nakillerine göre zayıftır. 5 yılda sağkalım sadece ~%60-70%1'dir, bu oran kalp2'de %80-90 ve böbreklerde %85-90'dır3. Akciğer transplantasyonu sonrası primer greft disfonksiyonu, antikor aracılı rejeksiyon ve kronik akciğer allogreft disfonksiyonu gibi birçok komplikasyon, allogrefte karşı konak immün yanıtına bağlıdır. Örneğin, grubumuz, transplantasyona bağlı iskemi-reperfüzyon hasarını takiben nötrofillerin akciğer allogreftine hızla alındığını ve kan monositlerini çevreleyen dinamik kümeler oluşturduğunu göstermiştir4. Donör ve alıcı hücreler arasındaki karışma, zararlı alloimmün yanıtlardan 5,6,7 sorumludur ve bu dinamik hücre etkileşimlerini canlı bir hayvan modelinde inceleme yeteneği paha biçilmezdir.

İki foton mikroskobu, dokuların minimum foto ağartılması ile birkaç yüz mikrona kadar olan derinlikler için yüksek çözünürlüklü intravital görüntülemeye izin verir 8,9. Neokorteks10,11, cilt 12,13 ve böbrek 14,15 dahil olmak üzere çeşitli doku ve anatomik bölgelerde kullanılır. Daha yakın zamanlarda, akciğer ve kalp gibi statik olmayan organlara uyarlanmıştır 4,16,17. Bu protokolde, murin ortotopik sol akciğer naklini takiben görüntü stabilize edilmiş, ventilasyonlu ve perfüze edilmiş pulmoner greftlerin görüntülenmesi için bir teknik tarif edilmiştir. Nakil modelinin önemli bir yararı, donör ve alıcıyı ayrı ayrı genetik olarak manipüle etme yeteneğidir. Bireysel hücre popülasyonları, knock-in floresan protein ekspresyonu ile transgenik fare suşları, floresan etiketli hücrelerin5 evlat edinici transferi veya hücreye özgü belirteçleri 4,16,17,18 bağlamak için floresan etiketli antikorların intravenöz enjeksiyonu ile görselleştirilebilir.

Görüntüleme sırasında akciğeri stabilize etmek için, bu protokol akciğerin bir kapak camına yapıştırılmasını içerirken, diğer gruplar özel yapım bir geri dönüşümlü vakum cihazı19 kullanarak emme stabilizasyonunu tanımlamıştır. Protokolümüzün, daha geniş bir görüntüleme alanı ve bir mikroskopi laboratuvarında yaygın olarak bulunan malzemeleri (kapak camı ve yapıştırıcı dahil) kullanarak göreceli kurulum kolaylığı dahil olmak üzere çeşitli avantajları vardır. Bu yapıştırma tekniği akciğeri üst yüzeyde kısıtladığı için ventilasyon hareketini azaltması ve daha derin görüntülemeye olanak sağlaması beklenir. Bu intravital görüntüleme tekniği, bağışıklık hücresi davranışının ve etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak ayrıntılı bir şekilde gözlemlenmesine olanak tanır ve bu da akciğer naklini takiben inflamatuar ve tolerojenik yanıtları düzenleyen bağışıklık mekanizmalarının incelenmesine katkıda bulunur.

Protokol

Tüm hayvan işleme prosedürleri, Ulusal Sağlık Hizmetleri ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı Enstitüleri yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Anestezi ve entübasyon

NOT: Daha önce tarif edildiği gibi ortotopik fare sol akciğer nakli gerçekleştirilir20,21. 20-25 g C57BL / 6 (B6) farelerden elde edilen akciğerler, cinsiyet ve yaş uyumlu B6 alıcılarına nakledilir. B6. LysM-GFP raportör fareler, akciğer greftlerine nötrofil infiltrasyonunu görselleştirmek için seçilmiş deneyler için alıcı olarak kullanılır. Alıcı fareler, akciğer naklinden hemen sonra görüntülenebilir.

  1. İntraperitoneal ketamin (80-100 mg / kg) ve ksilazin (8-10 mg / kg) uygulamasıyla fareleri yeniden anestezize edin. Ek ağrı kontrolü için sürekli salimli buprenorfin (0.5-1.0 mg / kg) deri altına uygulayın. Bir pençe tutamıyla yeterli anestezi derinliğini onaylayın.
    NOT: Akciğer nakli ile planlanan intravital görüntüleme arasındaki süre iki saatten azsa, başlangıç ketamin dozunun% 50'si ile anestezik yeniden doz alabilir.
  2. Elektrikli bir kesme makinesi kullanarak sol göğsün tamamındaki tüyleri alın ve fazla kırpılmış tüyleri çıkarmak için göğsü silin.
  3. Kornea kurumasını önlemek için farenin gözlerine ilaçsız oftalmik merhem sürün.
  4. Fareyi daha önce tarif edildiği gibi 20 G'lik bir anjiyokateter ile orotrakeal olarak yeniden entübe edin21.
  5. 120 nefes/dk hızında oda havası ve 0,5 cc tidal hacim ile havalandırın.
  6. Tüm prosedür boyunca endotrakeal olarak% 1 izofloran verin.
  7. Görüntüleme sırasında kan damarlarını görselleştirmek için, görüntülemeden en az 5 dakika önce intravenöz olarak 50 μL fosfat tamponlu salin içinde 20 μL 655 nm hedeflenmemiş kuantum noktası (q-dots) enjekte edin.

2. Görüntüleme için sol akciğerin cerrahi hazırlığı

  1. Fareyi sağ lateral dekübit konumuna getirin (bkz. Şekil 1A).
  2. Göğüs derisini üç kez% 0.75 iyot ve% 70 etanol karışımı ile dezenfekte edin.
  3. Sol torakotomiyi (fare akciğer naklinden itibaren) üçüncü interkostal boşluktan tekrar açın (bkz. Şekil 1A).
  4. Sol torakotomi bölgesi üzerindeki cildin ve yumuşak dokunun 1,5 cm x 1,5 cm ölçülerinde bir kısmını çıkarın (bkz. Şekil 1B).
  5. Kaburga rezeksiyonundan önce, hemostaz elde etmek için herhangi bir mikrovaskülatürü tromboze etmek için önce kaburgaları ~ 10 s boyunca klempleyin (bkz. Şekil 1C, D).
  6. Akciğeri çıkarmak için yeterince büyük bir görüntüleme penceresi oluşturmak için 3. ila 5. kaburgaların kısımlarını rezeke edin (~ 0.8 cm kraniyokaudal ve ~ 1.0 cm anteroposterior, Şekil 1D, E).
  7. Elektrokoter ile kaburga kenarlarından herhangi bir ek kanamayı durdurun.
    NOT: Görüntüleme süresi boyunca aşırı kan kaybını önlemek için kaburgaların kesik kenarında hemostaz elde etmek çok önemlidir.
  8. Sağ göğsün altına küçük bir yumru (4 cm x 4 cm gazlı bez 3 kez uzunlamasına katlanır) yerleştirin (bkz. Şekil 1E).
  9. Pamuklu çubuklar kullanarak, akciğer greftini göğüsten kaldırın ve akciğerin alt kısmını 1 cm x 3 cm'lik tuzlu suya batırılmış gazlı bez şeridine yerleştirin (bkz. Şekil 1F).
    NOT: Bu tuzlu suya batırılmış gazlı bez şeridi, akciğerin kaymasını önler, akciğer için nemli bir ortam sağlar, akciğeri rezeke edilen kaburgaların keskin kenarlarından korur ve akciğeri kalp hareketinden ayırır. Çevresel görüntüleme odası akciğer üzerine uygulandıktan sonra (Şekil 1G, H, bölüm 3'te açıklanmıştır), görüntüleme süresi boyunca açık göğüs boşluğundan minimum ısı ve sıvı kaybı olmalıdır.

3. Görüntüleme odası hazırlığı

NOT: Bir görüntüleme odası özel olarak üretilmiştir (bkz. Şekil 2A). Bu görüntüleme odası, bir taban plakası ve aralarına farenin yerleştirildiği ve her iki tarafta yaylı cıvatalarla yerine sabitlendiği bir üst plakadan oluşur (Şekil 2B). Üst plaka, ~ 2 cm çapında dairesel bir kesik içerir. Üst plakanın ön tarafındaki bu açıklığa, objektif merceği koruyacak şekilde uygun boyutta siyah bir O halkası yerleştirilir (Şekil 2C). 24 mm x 50 mm'lik bir kapak camı, yüksek vakumlu gres kullanılarak üst plakanın arkasına yapıştırılır, bu da su geçirmez bir sızdırmazlık sağlayacaktır. Bu kapak camı, aşağıdaki akciğere yapışarak ve görüntüleme ortamını (yani su) yukarıda tutarak görüntüleme penceresi görevi görecektir. Dairesel görüntüleme penceresinin içine vakum yağı girmediğinden emin olun. Kapak camı her yeni görüntüleme deneyi için değiştirilecektir. Taban plakası, bir termokupl sıcaklık probu kullanılarak 35-37 °C'ye ısıtılır (Şekil 2A).

  1. Entübe fareyi, açık sol göğüs yukarı bakacak şekilde görüntüleme odasının taban plakasına yerleştirin (bkz. Şekil 1G, H). Fareyi ipek bantla yüzüne, ön pençelerine ve kuyruğuna sabitleyin (bkz. Şekil 1H ve Şekil 2A).
  2. Üst plakaya takılı kapak camının alt tarafına ( Şekil 2C'de gri daire, altta) yapıştırıcı sürün ve ortada 0.8-1.0 cm'lik tutkalsız bir daire bırakın.
    NOT: Tutkalsız dairenin boyutu ile hareket artefaktının miktarı arasında bir denge vardır; Bu nedenle, dairenin çapının 1.0 cm'yi geçmemesi tavsiye edilir.
  3. Yapıştırıcı akciğer yüzeyine temas edecek şekilde kapak camı akciğerle temas edene kadar üst plakayı indirin (bkz. Şekil 1G).
    NOT: Sol akciğer, görüntülenecek alan olan ortada temiz, tutkalsız bir daire ile kapak camına yapıştırılacaktır.
  4. Kapak camını akciğere karşı tutun ve yapıştırıcı alanı çevredeki dokuya yapışacak şekilde akciğeri 1-2 saniye şişirin. Fare endotrakeal tüpünden ventilatöre giden çıkış tüpünü tıkayarak akciğer şişirmesini gerçekleştirin.
    NOT: Akciğeri 1-2 saniyeden daha uzun süre şişirmeyin, çünkü bu aşırı barotravmaya neden olabilir.
  5. Akciğer dokusu üzerindeki baskıyı azaltmak için üst plakayı hafifçe geri çekin. Görüntüleme penceresi içindeki akciğer alanının ventilasyonla hareket etmediğinden emin olun.
  6. Kelebek somunu her bir cıvatanın üzerine sabitleyerek üst plakanın her iki ucunu da sabitleyin (bkz. Şekil 2B).

4. İki fotonlu görüntüleme

NOT: İntravital mikroskopi için 20x veya 25x >1.0 sayısal açıklıklı (NA) suya daldırma objektifine sahip sabit aşamalı, dik bir mikroskop kullanılmalıdır. Aşağıda, bu çalışmada B6 ila B6 için kullanılan kurulum yer almaktadır. LysM-GFP, 655 nm q-dot kan damarı etiketlemeli sol akciğer nakli. Bu protokolü uygularken, mikroskobun, lazerlerin ve dikroik filtrelerin kurulumu, spesifik deneyin ihtiyaçlarına ve kullanılan floresan raportörlere göre uyarlanabilir.

  1. Tüm görüntüleme odasını entübe edilmiş alıcı fare (B6 sol akciğer, B6'ya nakledildi. 655 nm q-noktalı LysM-GFP) mikroskop sahnesine (bkz. Şekil 2A).
  2. 480 nm, 560 nm ve 635 nm dalga boylarında dikroik filtreler kullanın, bu da sinyalleri GFP raportöründen, q-noktalarından ve kollajen tarafından üretilen ikinci harmonik üretim (SHG) sinyalinden (445 nm) uygun şekilde ayıracaktır. Bu filtreler, belirli deneye göre uyarlanabilir.
    NOT: Kollajen tarafından üretilen SHG sinyali, alveolar hava boşluklarını temsil eden karanlık krater benzeri yapıları sınırlar ( Şekil 3'teki beyaz oklara bakınız).
  3. Uyarma için titanyum-safir femtosaniye darbeli lazeri 890 nm'ye (yakın kızılötesi aralık içinde) ayarlayın. Yeterli bir sinyal elde etmek için mümkün olan en düşük lazer gücünü kullanın.
    NOT: Sinyal ayrımını en üst düzeye çıkarmak için lazer ayarları, belirli deney için ayarlanmalıdır.
  4. Üst plakadaki kapak camını tamamen kaplamak için ~1 mL su uygulayın, bu O-ring ve kapak camının vakumlu gres contası tarafından üst plakaya yerinde tutulacaktır (bkz. Şekil 1G ve Şekil 2C).
  5. Mikroskopta 20x >1.0 NA suya daldırma objektifini kullanın. Objektif merceğin belirli deneye göre uyarlandığından emin olun.
    NOT: Daha büyük NA, daha fazla ışık toplama, daha yüksek kontrast ve daha ayrıntılı görüntüler sağlar. Suya daldırma objektifleri, su veya tampon biyolojik dokularla daha uyumlu olduğu için tercih edilir.
  6. Mikroskobun objektifini suya indirin ve akciğerin yüzeyine odaklanın.
  7. Taban plakası ısıtıcısını etkinleştirin ve sıcaklığı 35-37 °C'de tutun.
    NOT: Doku sıcaklığının korunamaması veya akciğere yeterli perfüzyon sağlanamaması ile ilgili endişeler varsa, taban plakasına ek olarak üst plakayı ısıtmak için iki ek direnç takılabilir (bkz. Ek Şekil 1).
  8. Tercih ettiğiniz edinme yazılımıyla görüntü yığınları elde edin.
    NOT: Karartma perdelerinin/panjurlarının kullanılmasını ve tüm ışık kaynaklarının stratejik olarak örtülmesini gerektirebilecek satın alma sırasında odanın tamamen karanlık olduğundan emin olun.

5. Video edinme

NOT: Aşağıdaki parametreler, belirli deneye göre uyarlanabilir. Adım 5.1-5.3, B6 ila B6 için kullanılan spesifik parametreleri açıklar. Referans kılavuzu olarak kullanılabilecek Lysm-GFP murin sol akciğer nakli.

  1. Video hızında çift yönlü bir tarayıcı kullanarak, xy tarama boyutlarını 512 x 512 piksel olarak ayarlayın.
  2. Bir xyz step ünitesi kullanarak, adım başına ortalama 10 kare ile 21 adımlı bir z yığınının hızlandırılmış kayıtlarını alın. Her yığının elde edilmesi yaklaşık 20 saniye sürer, bu da kare ortalaması için gereken süreyi, step motorun hareket etmesi ve konumunu kontrol etmesi için gereken süreyi ve 100 ms'lik bir gecikmeyi içerir.
    NOT: Bu çalışmada kullanılan mikroskop üzerindeki çift yönlü tarayıcı, 30 kare/sn video hızında çalışır. Bu, spesifik mikroskop kurulumuna bağlı olarak değişebilir.
  3. Doku parankimi içindeki lökosit göçünün hızlandırılmış görüntülemesini elde etmek için 80 ardışık z-yığını elde edin. Bu, 20 s/yığında yaklaşık ~27 dakika sürer.
    NOT: Dokuya aşırı lazer maruziyetini önlemek için yığın boyutu, kare ortalaması, lazer gücü ve hızlandırılmış kaydın toplam uzunluğu en aza indirilmelidir. Kullanılan floresan raportörler parlaksa (yani GFP) ve lazer gücü düşükse, 10 kare ortalama, 512 x 512 piksel tarama ile 21 adımlı bir z yığınını ~27 dakika boyunca 20 saniye aralıklarla tekrarlamak fare tarafından iyi tolere edilir. Daha uzun görüntüleme süreleri isteniyorsa, toplam lazer maruziyetini aynı tutmak için yığın başına alım süresi artırılmalıdır (yani, ~ 1,5 saat boyunca yığın başına 1 dakika). Bu ayarların, kullanılan floresan raporlayıcılara göre optimize edilmesi gerekecektir.
  4. Görüntü alımının sonunda fareyi ötenazi yapın. Ötenazi yapmak için, fareyi ketamin (80-100 mg / kg) ve ksilazin (8-10 mg / kg) ile uyuşturun ve ardından servikal çıkık yapın. Tipik görüntüleme hazırlıkları, farenin canlılığını 2 saate kadar kolayca koruyacaktır.
    NOT: Bu süreyi uzatmak için ek sıvı takviyesi, izofluran ile anestezi ve sıcaklık regülasyonuna dikkat edilmesi gerekebilir.
  5. Imaris ile video oluşturmayı tamamlayın. Diğer görüntüleme yazılımları (ImageJ gibi) da kullanılabilir.
    NOT: Görüntüler, kanal karışmasını gidermek için kontrast geliştirme, yumuşatma ve kanal aritmetiği kullanılarak çekim sonrasında işlenebilir.

Sonuçlar

4 ° C'de 1 saat soğuk iskemik depolamadan sonra, sol akciğeri bir B6 faresinden ortotopik olarak bir B6'ya naklettik. LysM-GFP fare4 ve daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi intravital iki fotonlu görüntüleme gerçekleştirildi. Nakil sonrası 2 saat (Şekil 3A) ve 24 saat (Şekil 3B) olmak üzere iki zaman noktasında görüntüleme gerçekleştirdik. Kan damarları, görüntülemeden hemen önce enjekte edilen q-noktaları ile kırmızı renkle etiketlenir. Ek olarak, 24 saat4'te q-dot alan monositleri görselleştirebiliriz. Yeşil etiketli alıcı kaynaklı nötrofiller, nakilden 24 saat sonra ilgili videoda akciğer greftine sızarken görülebilir (Ek Video 1). Alveoller, kollajenden gelen SHG'ye bağlı olarak koyu renkli kraterler olarak görselleştirilebilir ( Şekil 3'te beyaz oklar). Transplantasyondan 24 saat sonra, nakilden 2 saat sonrasına kıyasla akciğerde daha fazla nötrofil olduğunu gözlemliyoruz (Şekil 3).

figure-results-1
Şekil 1: Farenin iki fotonlu görüntüleme için hazırlanması. (A) Sol torakotomi üzerinde cilt yeniden açıldı. (B) Sol göğsün üzerinden eksize edilen deri ve yumuşak doku. (C,D) Kaburgalar bölünmeden önce 10 saniye boyunca kenetlenir. (E) Sol 3rd-5. kaburgalar, ~ 0.8 cm kraniyokaudal x 1.0 cm anteroposterior ölçülerinde bir pencere oluşturmak için rezeke edildi. (F) Sol akciğer, sol göğüsten çıkarılmış ve bir gazlı bez şeridi üzerine yerleştirilmiştir. (G) Sol akciğerin üzerinde görüntüleme penceresi olan bir görüntüleme odası. (H) Mikroskop tablasına yerleştirilen görüntüleme odası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Görüntüleme odası kurulumu. (A) Mikroskop tablasına yerleştirilen görüntüleme odası. (B) Üst plakayı sol akciğerin üzerine sabitlemek için yaylı cıvata mekanizmasının büyütülmüş görünümü. (C) O-ring ve kapak camı uygulanmış üst plakanın önü ve arkası. Beyaz çizgiler, kapak camını üst plakaya yapıştırmak için vakumlu gresin uygulandığı alanı temsil eder. Gri daire, kapak camına uygulanacak bir tutkal halkasını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: B6'dan B6'ya fare sol akciğer naklinin iki fotonlu intravital görüntülemesi. 1 saat soğuk iskemik depolamalı LysM-GFP fare. Görüntüleme, transplantasyondan (A) 2 saat ve (B) 24 saat sonra yapılır. Kırmızı, q noktalarını temsil eder. Yeşil, B6'dan gelen nötrofilleri temsil eder. LysM-GFP alıcısı. Mavi, kollajen açısından zengin alveollerden elde edilen SHG'yi temsil eder. Beyaz oklar alveolar hava sahalarını gösterir. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Ek ısıtma sağlamak için iki rezistans takılı üst plaka. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: B6'dan B6'ya nakledilen fare sol akciğerinin iki fotonlu hızlandırılmış görüntülemesi. Transplantasyondan 24 saat sonra gerçekleştirilen 1 saat soğuk iskemik depolamaya sahip LysM-GFP faresi. Kırmızı, q noktalarını temsil eder. Yeşil, LysM-GFP alıcısından gelen nötrofilleri temsil eder. Mavi, kollajen bakımından zengin alveollerden ikinci harmonik nesli temsil eder. Ölçek çubuğu 20 μm'yi temsil eder. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

İki foton uyarımı ilk olarak 1931'de Maria Göppert-Mayer tarafından doktora tezinde tanımlandı ve daha sonra nükleer kabuk yapısını22,23 tanımladığı için Nobel Fizik Ödülü'nü kazandı. Geleneksel floresan mikroskobu, emisyon dalga boylarından daha kısa ve daha yüksek enerjili uyarma dalga boyları ile tek foton uyarımına dayanır. Tek foton mikroskobunun aksine, iki foton mikroskobu, her biri yayılan floresan sinyalinin24,25,26 dalga boyundan daha uzun dalga boylarına sahip iki foton tarafından eşzamanlı uyarılmayı içerir. Dokudaki tek bir odak noktasını uyarmak için iki ayrı fotonun birlikte lokalize olması gerektiğinden, iki foton uyarımı uzamsal olarak küçük bir numune hacmine kadardır, bu da optik kesitlemeyeizin verir 24,25,26 ve odak noktasını içeren düzlemin üstünde ve altında daha az fotoağartma vardır27. İki foton tarafından aynı anda uyarılma olasılığı çok düşüktür, bu nedenle bir floresan emisyon sinyali25,26,27 için gereken uyarma yoğunluğunu elde etmek için bir femtosaniye darbeli lazer gereklidir. Uyarma lazeri yakın kızılötesi aralıktadır (700-1100 nm), bunun bir avantajı daha az saçılmadır, bu da ışığındokuya daha derinlemesine nüfuz etmesine izin verir 28. Görüntüleme derinliği, lazerin salınım hızına ve gücünebağlıdır 24. Akciğer içinde ~500-600 μm görüntüleme derinlikleri elde edilebilir17. Bu nedenle, görüntüleme derinliği ve düşük foto ağartma kombinasyonu, iki foton mikroskobunu organların intravital görüntülemesi için oldukça uygun hale getirir.

İki foton mikroskobu, cilt12,13, lenf düğümleri29, venöz endotel30, beyin korteksi10,11, böbrek 14,15 ve karaciğer 31,32 gibi birçok farklı doku ve anatomik bölgede kullanılmıştır. Örneğin, fare dermisinde, steril fiziksel yaralanmayı takiben nötrofil sürüsünü tanımlamak için intravital iki fotonlu görüntüleme kullanılmıştır12. Bir venöz tromboz modelinde, kan monositleri ve nötrofiller, inferior vena kava30'un endotelyumu boyunca sürünerek görüntülendi. İnsan mikrogliası, bir insan beyni organoid modeline33 ksenotransplante edildikten sonra in vivo olarak başarılı bir şekilde görüntülendi. İki foton mikroskobundaki sürekli gelişmelerle, intravital görüntüleme daha derinlerde ve hatta statik olmayan organlarda bile mümkündür. Örneğin, farelerde neokortekste 1000 μm'ye kadar olan derinlikler, bir Ti:Al2O3 rejeneratif amplifikatör34 kullanılarak görüntülenmiştir.

Torasik organlarda intravital görüntülemenin zorluklarından biri de görüntü sabitlemedir. Atan kalp ve akciğer solunumlarından gelen hareket nedeniyle, hareket artefaktları görüntü kalitesini önemli ölçüde azaltabilir. Organ 4,7'nin yapıştırılması, aspirasyonstabilizasyonu 19,35,36,37 ve posteriori hareket düzeltmesi38 dahil olmak üzere kalp ve akciğer görüntüleme için çeşitli stabilizasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Akciğeri görüntüleme tekniğimiz, akciğer yüzeyinin stabilize bir kapak camına yapıştırılmasına dayanır. Akciğeri perfüze, ventilasyonlu ve in vivo bulunan koşulları simüle eden normotermik tutuyoruz. Looney ve ark.19 tarafından tarif edilen emme-stabilizasyon yöntemiyle karşılaştırıldığında, bu protokolün birçok avantajı vardır. İlk olarak, özel bir aspirasyon cihazının oluşturulmasına gerek yok. Bunun yerine, görüntüleme odamız ve üst plakamız, bir mikroskopi laboratuvarında kolayca bulunabilen malzemelerle yapılabilir. Ek olarak, emme cihazıyla (4 mm'lik bir iç çapa sahip) karşılaştırıldığında, bu çalışmada kullanılan yapıştırma tekniği daha geniş bir görüntüleme yüzey alanına (10 mm'ye kadar) izin verir. Çevresel yapıştırma ile, tutkal çemberi içindeki akciğerin alanı yeterince kısıtlanır ve ventilasyon hareketi en aza indirilir. Emme tekniği ile karşılaştırıldığında, kapak camı yaklaşımı, akciğer yüzeyinin dışbükey deformasyonunu önler, bu da subplevral kılcal kan akışını etkileyebilir. Sistemimizin dezavantajları, pleuroparenkimal bileşkeyi bozmadan lamel çıkarılamamasıdır. Böylece burada kullanılan yapıştırma tekniği ile akciğerin ikinci kez görüntülenmesi mümkün olmazken, aspirasyon tekniği seri görüntülemeye olanak sağlar. Ek olarak, torakotomi kullanımı, pozitif basınçlı ventilasyon ile birlikte fizyolojik olmayan normal negatif intratorasik basıncın kaybını gerektirir. İki fotonlu görüntülemenin ek sınırlamaları, sınırlamaları aşağıda tartışılmaktadır.

İntravital görüntüleme sırasında göğüs açıkken, fizyolojik bir ortama mümkün olduğunca yakın tutmak çok önemlidir. Farenin üzerinde bulunduğu taban plakası 35-37 ° C'lik bir sıcaklıkta tutulur. Yalnızca taban plakası ısıtıldığında, fare çekirdek sıcaklığının (bir rektal prob ile ölçülen) birkaç saat boyunca iyi bir şekilde düzenlendiğini bulduk. Deneyimlerimize göre, hücre hareketliliği ve davranışı yalnızca sıcaklık 32 °C'nin altına düştüğünde gözle görülür şekilde etkilenir ve bu kurulumla gerçekleşmesi pek olası değildir. Bu görüntüleme odasının ilk kurulumu sırasında doku normotermisi veya akciğer perfüzyonunun korunmasında bir zorlukla karşılaşılırsa, taban plakasına ek olarak üst plakayı ısıtmak için iki ek direnç takılabilir (Ek Şekil 1). Görüntüleme odası optimize edildikten sonra, her görüntüleme deneyi sırasında farenin iç sıcaklığını rutin olarak izlemek gerekli değildir. Ek olarak, açık göğüs boşluğu üzerine yerleştirilen tuzlu suya batırılmış gazlı bez ve görüntülenecek akciğer bölgesinin etrafındaki tıkayıcı yapıştırıcı halkası kombinasyonunun, görüntüleme sırasında sıvı kayıplarını en aza indirmede etkili olduğunu bulduk.

Önemli bir teknik husus, torasik görüntüleme penceresi oluşturulurken kaburga rezeksiyonu sırasında iyi bir hemostaz elde edilmesidir. Sol 3. ila 5. kaburgaların bazı kısımları rezeke edilir ve bu kesilen kaburgalardan devam eden kanama, görüntüleme sırasında farenin hayatta kalmasını tehlikeye atacaktır. Bununla mücadele etmek için, önce kaburgaların mikrovaskülatürü tromboze etmek için 10 saniye boyunca rezeke edilecekleri yere proksimal olarak klemplenmesini öneririz (bkz. Şekil 1C, D). Daha sonra, kaburgaların rezeksiyonunu takiben, kaburgaların kesilen kenarları elektrokoter ile liberal olarak pıhtılaştırılmalıdır. Son olarak, keskin kaburga kenarlarının akciğeri delmesini önlemek için görüntüleme sırasında sol akciğeri tuzlu suya batırılmış gazlı bez şeridinin üzerine yerleştirmek (bkz. Şekil 1F) çok önemlidir. Teknik hususların bu kombinasyonu ile, akciğer hasarı veya normal perfüzyon paternlerinin kaybı olmadan birkaç saat boyunca minimum hareket artefaktı ile akciğer parankimi içindeki bağışıklık hücresi kaçakçılığının net videolarını çekebiliriz.

İki foton mikroskobu, bulaşıcı hastalık ve steril inflamasyon modellerini incelemek için akciğerlerde kullanılmıştır. Bir grup, influenza virüsü39 ile fare akciğerlerinin tekrarlanan zorluklarını takiben yerleşik bellek B hücresi motilitesini ve göçünü incelemek için iki fotonlu görüntüleme kullandı. Ek olarak, iki foton mikroskobu deri, böbrek ve pankreas adacık transplantasyonunda kullanılmaktadır 40,41,42,43. Bir nakil modeliyle, verici ve alıcı, kendi hücre popülasyonlarını incelemek için genetik olarak değiştirilebilir. Bildiğimiz kadarıyla, grubumuz murin akciğer nakillerinde intravital iki fotonlu görüntülemeyi ilk yapan gruptu4. Nakil aracılı iskemi-reperfüzyon hasarını takiben hızlı nötrofil alımı ve kümelenmesi gözlendi, bu da kan monositlerinin farmakolojik tükenmesi ile azaldı4. Daha sonraki çalışmalarda, alıcı dalak kaynaklı monositlerin, IL-1B44 üretimi yoluyla nötrofil ekstravazasyonunu kolaylaştırdığını gösterdik. Bu çalışmalarda intravital görüntüleme, nakil sonrası inflamatuar yanıtı azaltmak için olası terapötik hedefler olarak nötrofil ekstravazasyonunun yukarı akış düzenleyicilerini ortaya çıkarmamıza izin verdi45. Ek olarak, heterotopik transplantasyonu takiben atan fare kalplerinde intravital görüntüleme de gerçekleştirdik16. Miyokarda nötrofil alımını görselleştirdik ve kardiyak greft hücrelerinin ferroptotik hücre ölümünün kalp nakli sonrası inflamasyonu başlattığını bulduk46. Aterosklerotik plaklara monositik trafiği görselleştirmek için nakledilen aort kemerlerine benzer bir stabilizasyon tekniği uyguladık47. Bu çalışmalar, statik olmayan nakledilen torasik organların intravital görüntülemesinin fizibilitesini ve faydasını göstermiştir.

Son olarak, farklı hücre tiplerini ve akciğer parankimini görselleştirmek için yöntemleri tartışmaya değer. Hücreleri etiketlemek için iki ana yöntem kullanılır - 1) floresan proteinlerin zincirleme mutasyonlarına sahip transgenik fare suşları ve 2) hücreleri lekelemek için floresan etiketli antikorlar. İki foton mikroskobu ile bağışıklık hücrelerini tanımlamak için yaygın olarak kullanılan transgenik fare suşları arasında nötrofiller için LysM-GFP48, çeşitli interstisyel makrofaj popülasyonları için CX3Cr1-GFP49,50, klasik monositler için CCR2-GFP51, B hücreleri için CD19-tdTomato52 ve düzenleyici T hücreleri için Foxp3-GFP5 bulunur. Özellikle, CX3Cr1 tek başına hücreleri kesin olarak tanımlamak için yeterli değildir, ancak bu, interstisyel makrofajlarınkiyle tutarlı hücre morfolojisi ve konumu ile desteklenebilir. Alveolar makrofajlar, otofloresansları53,54, ayırt edici morfolojileri ve davranışları (yani, hızlandırılmış kayıtların zaman çözünürlüğünde motilite eksikliği) nedeniyle etiketleme olmadan görüntülenebilir. Aynı zamanda otofloresan olan eozinofillerle karşılaştırıldığında, alveolar makrofajlar 890 nm uyarılma ile daha büyük ve önemli ölçüde daha parlaktır54. Alternatif olarak, alveolar makrofajlar, boya agregatlarının54 intrapulmoner uygulaması yoluyla fagositik işlevlerine göre de etiketlenebilir.

Nakil alıcılarında bağışıklık hücrelerinin görselleştirilmesi, floresan etiketli hücrelerin intravasküler adoptif transferi veya hücreye özgü yüzey belirteçlerine karşı floresan etiketli antikorların enjeksiyonu yoluyla da gerçekleştirilebilir18,55. İki foton mikroskobunun bir başka doğal yararı, kollajen56 gibi doku içindeki belirli çift kırılmalı yapılar tarafından SHG'dir. Bu fenomen, ek floresan boyalar olmadan alveolar yapının içsel bir göstergesi olarak işlev gören alveolar keselerdeki yüksek kollajen içeriği nedeniyle akciğer görüntüleme için özellikle yararlıdır. Ayrıca, alveoller ayrıca 655 nm q-noktaları ile etiketlenmiş alveolar kılcal damarlarla sınırlandırılır. Son olarak, kan damarları intravenöz q-dot enjeksiyonu (bu protokolde tarif edildiği gibi) veya rodamin B dekstran ile işaretlenebilir. İntravital iki fotonlu bir mikroskopi deneyi tasarlarken, sızıntı riskini ve kanallar arasında zayıf farklılaşma riskini en aza indirmek için en fazla dört farklı emisyon kanalının kullanılmasını öneririz.

Açıklanan tutkal stabilizasyon tekniğimizin ana sınırlamalarından biri, potansiyel doku hasarı ve akciğer yüzeyinde kalıntı yapıştırıcı olmadan kapak camının akciğerden çıkarılamamasıdır. Bu nedenle, akciğer, birkaç gün boyunca birden fazla zaman noktasında değil, yalnızca bir kez görüntülenebilir. Bu sınırlamayı ele almak için, bir grup, akciğerin seri görüntülenmesine izin veren yarı kalıcı bir torasik görüntüleme penceresi tanımlamıştır57. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, bu yaklaşım uzun süreli görüntüleme için yeterli akciğer stabilizasyonuna izin vermemektedir. Bu teknik, akciğeri birkaç saat boyunca görüntüleme yeteneği sağlar, bu da transplantasyonu takiben doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkileri hakkında önemli bilgiler sağlar.

İki fotonlu görüntülemenin diğer sınırlamaları arasında, sistemin bakımı için gereken pahalı ön kurulum maliyeti ve uzmanlık yer alır. Tarama alanları, immünofloresan görüntülemeye kıyasla nispeten küçüktür. Termal ve fotohasar, dikkatli bir edinim parametresi optimizasyonu olmadan önemli olabilir. İki foton uyarma noktası yayılma fonksiyonu geniştir, bu da özellikle z boyutunda çözünürlüğü biraz sınırlar. Ek olarak, iki fotonlu görüntüleme, ilgilenilen hücrelerin floresan olarak etiketlenmesini gerektirir ve bazı hücreler, tek bir hücre işaretleyici ile açık bir şekilde etiketlenemez. Aynı anda görüntülenebilen sinyallerin sayısı genellikle dört veya daha az ile sınırlıdır. Son olarak, anestezi, cerrahi ve görüntüleme, fizyolojik bir ortamı korumak için en iyi çabalara rağmen, deneysel sonuçları ve yorumları karıştırabilecek akciğer naklinin üzerinde ek iltihaplanma ve fizyolojik değişikliklere neden olabilir. Gelecekteki yönelimler, minimal invaziv intravital görüntüleme yöntemlerinin geliştirilmesini içerir (daha küçük bir torakotomi veya bronkoskopik yaklaşım gibi).

Sonuç olarak, intravital iki foton mikroskobu, çoklu hastalık süreçlerini incelemede paha biçilmez bir araçtır. Burada, murin akciğer nakli sonrası hücre trafiğinin intravital gözlemine ve farklı hücre popülasyonları arasındaki dinamik etkileşimlere izin veren güvenilir bir akciğer immobilizasyonu ve iki fotonlu görüntüleme tekniğini açıklıyoruz. Bu teknik, nakil sonrası bağışıklık ortamı hakkındaki anlayışımızı genişletmiştir ve akciğer nakli ve diğer akciğer hastalığı süreçlerinin incelenmesinde vazgeçilmez bir araç olmaya devam edecektir.

Açıklamalar

Yazarlar konuyla ilgili herhangi bir açıklama bildirmemiştir.

Teşekkürler

Bu çalışma, NIH 1P01AI11650 ve Barnes-Yahudi Hastanesi Vakfı'ndan alınan hibelerle desteklenmektedir. Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki In Vivo Görüntüleme Çekirdeği'ne teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.75 povidon-iyotAplicareNDC 52380-0126-2Dezenfektan için
1 inç 20G IV kateterTerumoSROX2025CAEndotrakeal tüp (ETT) için1
inç ipek bantDurapore3M ID 7100057168Fareyi yerinde sabitlemek için
20x suya daldırmalı uzun objektif lensOlympusN20X-PFH
3M Vetbond yapıştırıcıMedi-Vet.com10872Kapak camını akciğere yapıştırmak için
655 nm hedeflenmemiş kuantum noktalarıThermoFisherQ21021MPKan damarlarının etiketlenmesi için
%70 etanolSigmaAldrich EX0281Dezenfektan için
Argent High Temp İnce Uçlu Kotery KalemMcKesson231
Siyah O halka (2 cm)HırdavatçıN/AÖzel yapım görüntüleme için hazne
Cıvata (2)HırdavatçıN/AÖzel yapım görüntüleme odası için
Pirinç başparmak somunu (2)HırdavatçıN/AÖzel yapım görüntüleme odası için
Buprenorfin 1.3 mg/mLFidelis Hayvan SağlığıNDC 86084-100-30Ağrı kontrolü için
Bukalemun titanyum-safir femtosaniye darbeli lazerTutarlıN/A
Kapak camı (24 mm x 50 mm)Thomas Scientific1202F63Özel yapım görüntüleme odası için
Kavisli sivrisinek kelepçesi (1)Fine Science Tools13009-12
Çift kanallı ısıtıcı kontrol cihazıWarner InstrumentsTC-344B
İnce makas (1)Güzel Bilim Araçları15040-11
Sabit kademeli dik mikroskopOlympusBX51WI
Gazlı bez (1 cm x 3 cm'ye kadar kesilmiş)McKesson476709Sol akciğerin altına yerleştirmek için
Yüksek vakumlu gresDow CorningN/AKapak camını üst plakaya yapıştırmak için
İzofluran %1Sigma Aldrich26675-46-7Anestezi için
Ketamin hidroklorür 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06Anestezi için
Metal levha (3 cm x 7 cm)HırdavatçıN/A Özelyapım görüntüleme odası için
Sivri uçlu pamuk uçlu aplikatörlerSolon56225Akciğeri manipüle etmek ve künt diseksiyon için
Power Pro Ultra kesmemakinesi Oster078400-020-001
Puralube Vet göz merhemiMedi-Vet.com11897Göz kurumasını önlemek için
Küçük hayvan ventilatörüHarvard Aparat55-0000
Düz forseps (1)Güzel Bilim Araçları91113-10
Üç kanallı deklanşör sürücüsüUniblitzVMM-D3Rezonans tarayıcı
x.y.z optik step motorÖnceki BilimselOptiScan II
Ksilazin 20 mg / mLAkornNDC 59399-110-20Ağrı kontrolü için

Kaynaklar

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report - 2021; Focus on recipient characteristics. J Heart Lung Transplant. 40 (10), 1060-1072 (2021).
  2. Khush, K. K., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: 37th adult heart transplantation report-2020; focus on deceased donor characteristics. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1003-1015 (2020).
  3. Wang, J. H., Skeans, M. A., Israni, A. K. Current status of kidney transplant outcomes: Dying to survive. Adv Chronic Kidney Dis. 23 (5), 281-286 (2016).
  4. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  5. Li, W., et al. Bronchus-associated lymphoid tissue-resident Foxp3+ T lymphocytes prevent antibody-mediated lung rejection. J Clin Invest. 129 (2), 556-568 (2019).
  6. Kurihara, C., et al. Crosstalk between nonclassical monocytes and alveolar macrophages mediates transplant ischemia-reperfusion injury through classical monocyte recruitment. JCI Insight. 6 (6), e147282(2021).
  7. Spahn, J. H., et al. DAP12 expression in lung macrophages mediates ischemia/reperfusion injury by promoting neutrophil extravasation. J Immunol. 194 (8), 4039-4048 (2015).
  8. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
  9. Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2 (11), 872-880 (2002).
  10. Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
  11. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  12. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Ashworth, S. L., Sandoval, R. M., Tanner, G. A., Molitoris, B. A. Two-photon microscopy: visualization of kidney dynamics. Kidney Int. 72 (4), 416-421 (2007).
  15. Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9(+) cell to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203-12213 (2020).
  16. Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. J Clin Invest. 122 (7), 2499-2508 (2012).
  17. Nava, R. G., et al. Two-photon microscopy in pulmonary research. Semin Immunopathol. 32 (3), 297-304 (2010).
  18. Li, W., et al. Necroptosis triggers spatially restricted neutrophil-mediated vascular damage during lung ischemia reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (10), e2111537119(2022).
  19. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  20. Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 4 (1), 86-93 (2009).
  21. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7 (6), 1672-1679 (2007).
  22. Grzybowski, A., Pietrzak, K. Maria Goeppert-Mayer (1906-1972): two-photon effect on dermatology. Clin Dermatol. 31 (2), 221-225 (2013).
  23. Göppert-Mayer, M. Uber Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Ann Phys. 401 (3), 273-294 (1931).
  24. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  25. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Diaspro, A., et al. Multi-photon excitation microscopy. Biomed Eng Online. 5, 36(2006).
  27. Williams, R. M., Piston, D. W., Webb, W. W. Two-photon molecular excitation provides intrinsic 3-dimensional resolution for laser-based microscopy and microphotochemistry. FASEB J. 8 (11), 804-813 (1994).
  28. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  29. Chtanova, T., et al. Dynamics of neutrophil migration in lymph nodes during infection. Immunity. 29 (3), 487-496 (2008).
  30. von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  31. Stanciu, S. G., et al. Experimenting liver fibrosis diagnostic by two photon excitation microscopy and Bag-of-Features image classification. Sci Rep. 4, 4636(2014).
  32. Hsiao, C. Y., et al. Improved second harmonic generation and two-photon excitation fluorescence microscopy-based quantitative assessments of liver fibrosis through auto-correction and optimal sampling. Quant Imaging Med Surg. 11 (1), 351-361 (2021).
  33. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126 (2023).
  34. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  35. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  36. Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  37. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  38. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infect Immun. 82 (2), 864-872 (2014).
  39. MacLean, A. J., et al. Secondary influenza challenge triggers resident memory B cell migration and rapid relocation to boost antibody secretion at infected sites. Immunity. 55 (4), e718 718-733 (2022).
  40. Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (31), 12863-12868 (2011).
  41. Camirand, G. New perspectives in transplantation through intravital microscopy imaging. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 6-12 (2013).
  42. Camirand, G., et al. Multiphoton intravital microscopy of the transplanted mouse kidney. Am J Transplant. 11 (10), 2067-2074 (2011).
  43. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17 (6), 744-749 (2011).
  44. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  45. Li, W., et al. Resolvin D1 prevents injurious neutrophil swarming in transplanted lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (31), e2302938120(2023).
  46. Li, W., et al. Ferroptotic cell death and TLR4/Trif signaling initiate neutrophil recruitment after heart transplantation. J Clin Invest. 129 (6), 2293-2304 (2019).
  47. Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-Brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (5), 1030-1036 (2018).
  48. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  49. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Analyses of microglia effector function using CX3CR1-GFP knock-in mice. Methods Mol Biol. 1041, 307-317 (2013).
  50. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute Crit Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  51. Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circ Res. 124 (2), 263-278 (2019).
  52. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), e134700(2020).
  53. Lohmeyer, J., Friedrich, J., Rosseau, S., Pralle, H., Seeger, W. Multiparameter flow cytometric analysis of inflammatory cells contained in bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 172 (1), 59-70 (1994).
  54. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), e111 110-125 (2020).
  55. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  56. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  57. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761(2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İntravital GörüntülemeAkciğer TransplantasyonuFare Akciğer Greftiİmmün Hücre TrafiğiOrtotopik Akciğer TransplantasyonuNötrofil İnfiltrasyonuDüzenleyici T HücreleriGörüntüleme PenceresiPulmoner Allogreft
Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.