Yöntem makalesi

Frenik Motor Nöron Dejenerasyonu ve Kompanzasyonunun Kantitatif Biyobelirteçleri Olarak Sıçan Diyafram Motor Ünitesi Bağlantı Sonuç Ölçütlerinin Değerlendirilmesi

1.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66568

⸱

19 Nisan 2024

 ,  ,  ,  , 
1NextGen Precision Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Sciences, University of Missouri, 3Department of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Missouri, 4Department of Neurology, University of Missouri, 5Department of Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri, 6Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada, sıçan diyaframlı motor ünitesi bağlantısını ölçmek için motor ünite sayısını ve boyutunu tahmin etmek için in vivo bir yöntem sunuyoruz. Bu tekniklere adım adım bir yaklaşım açıklanmaktadır.

Özet

Ventilasyon kas fonksiyonunun kaybı, motor nöron hasarı ve nörodejenerasyonun bir sonucudur (ör., sırasıyla, servikal omurilik yaralanması ve amyotrofik lateral skleroz). Frenik motor nöronlar, merkezi sinir sistemi ile kas arasındaki son bağlantıdır ve ilgili motor birimleri (tek bir motor nöron tarafından innerve edilen kas lifi grupları), nöromüsküler ventilasyon sisteminin en küçük fonksiyonel birimini temsil eder. Bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP), tek motor ünite potansiyeli (SMUP) ve motor ünite sayısı tahmini (MUNE), hayvan modellerinde zaman içinde motor ünite bütünlüğünün uzunlamasına değerlendirilmesini sağlayan yerleşik elektrofizyolojik yaklaşımlardır, ancak çoğunlukla ekstremite kaslarına uygulanmıştır. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, preklinik kemirgen çalışmalarında, frenik MUNE, motor ünite boyutu (SMUP olarak temsil edilir) ve CMAP'yi ölçmek için uzunlamasına kullanılabilecek bir yaklaşımı tanımlamak ve daha sonra bu yaklaşımların bir motor nöron kaybı modelinde faydasını göstermektir. Motor nöron hasarı ve hastalıklarında nöronal hasar, dejenerasyon ve rejenerasyon için hassas, objektif ve translasyonel olarak ilgili biyobelirteçler, deneysel araştırma keşiflerine klinik testlere önemli ölçüde yardımcı olabilir ve hızlandırabilir.

Giriş

C3'ten C6 miyotom seviyelerine kadar uzanan frenik motor nöronlar (MN'ler), merkezi sinir sisteminden (MSS) diyafram kasına1 son bağlantıyı oluşturur. Frenik motor üniteler (MU), solunumsal nöromusküler sistemin en küçük fonksiyonel ünitesini oluşturan tek bir spinal MN ve onun innerve diyafram kas liflerinden oluşur. Ventilasyon fonksiyonu, frenik MU havuzunun koordineli aktivasyonu ile elde edilen diyafram kasının yeterli kasılmasını gerektirir 2,3. Amyotrofik lateral skleroz (ALS) dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalık, ciddi ventilasyon bozukluğuna neden olur ve sonuçta ölüm nedenine katkıda bulunur4.

Motor ünitesi (MU) havuzunun bütünlüğünü in vivo olarak değerlendirmek ve izlemek için çeşitli elektrofizyolojik yaklaşımlar kullanılabilir. Bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP), periferik sinir stimülasyonundan sonra belirli bir kas veya kas grubundaki tüm kas liflerinin toplam depolarizasyonunu yansıtır ve ALS 5,6 ve spinal müsküler atrofi (SMA) dahil olmak üzere bir dizi nöromüsküler duruma duyarlıdır7,8,9. CMAP değerlendirmesinin bir sınırlaması, teminat filizlenmesinin, MU kaybı10 varlığında bile CMAP genliğinin ve alanının korunmasına yol açabilmesidir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, hem motor ünite numarasını hem de11 boyutunu değerlendirmek için CMAP tekniğinde değişiklikler yapılmıştır. Ek olarak, diyafram CMAP'nin bir elektrofizyolojik sistem tarafından fonksiyonel değerlendirmesini araştıran bir in vivo çalışma, motor ünite numarası tahmini12 için açıklanan diyafram CMAP kayıt tekniğinin kullanılmasının da mümkün olabileceğini düşündürmektedir.

Artımlı motor birim sayısı tahmini (MUNE) tekniği ilk olarak 1970'lerin başında McComas ve ark. insanlarda ekstansör digitorum brevis kası için13. Artımlı MUNE yaklaşımı, tek motor ünite tepkilerinin indeksleri olarak nicel, ya hep ya hiç submaksimal artışları kaydetmek için kademeli olarak artan bir stimülasyonun sağlandığı geleneksel CMAP kayıt tekniğinin bir modifikasyonuydu. Toplanan ve ortalaması alınan artışlar, tek bir motor birim potansiyelinin (SMUP) boyutu için bir tahmin hesaplamak için kullanıldı. Hesaplanan bu boyut daha sonra incelenen kası innerve eden MU'ların sayısını tahmin etmek için CMAP genliğine bölündü11. MUNE, motor ünite kaybını tespit etmede ve izlemede yüksek hassasiyet gösterir ve CMAP genliği veya alan14,15 gibi ölçümlerde gözlemlenebilir değişikliklerden önce motor ünite disfonksiyonunun tanımlanmasına olanak tanır. ALS hastalarında, MUNE'nin son derece hassas olduğu kanıtlanmıştır ve hastalık başlangıcı, ilerlemesi ve prognozu için önemli bir biyobelirteç olarak hizmet etmektedir 16,17.

Nörodejenerasyon, nöral yaralanma ve doğal yaşlanma süreci gibi durumlarda MU fonksiyonunu değerlendirmek için çok sayıda MUNE adaptasyonu geliştirilmiş ve yaygın olarak kullanılmıştır 18,19,20,21. İlk tanımlamadan bu yana, hem insan çalışmalarında hem de hayvan modellerinde hem elektrofizyolojik tepkileri hem de artımlı kuvvet (mekanik) ölçümlerini kullanan çeşitli uyarlamalar kullanılmıştır22. MUNE, kas ile motor nöron bağlantısının non-invaziv fonksiyonel bir değerlendirmesini sağlar. Uzunlamasına MUNE uygulamak, hem klinik hem de klinik öncesi ortamlarda hastalık veya indüklenmiş fenotip ilerlemesinin anlaşılmasını ve terapötik müdahalelerin koruyucu veya rejeneratif etkilerinin değerlendirilmesini sağlar. MUNE ölçümlerinin etkinliğinden bağımsız olarak, tekrarlanabilirlik ve tekniğin insan vücudunun çoğu boyunca MU havuzları için klinik önemi ne olursa olsun, çabalar büyük ölçüde kemirgen kaslarındaki uzuv kaslarına odaklanmıştır 10,23,24,25.

Bu nedenle, bu çalışmanın amaçları, MUNE, motor ünite boyutu (SMUP olarak temsil edilir) ve CMAP'yi ölçmek için klinik öncesi kemirgen çalışmalarında uzunlamasına kullanılabilecek in vivo değerlendirmeler olarak bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP), SMUP ve frenik motor ünite numarası (MUNE) elde etmeye yönelik bir yaklaşımı tanımlamaktı. Ayrıca, frenik bir MN dejeneratif ajan olan saporine konjuge kolera toksin B fragmanının (CTB-SAP) intraplevral uygulamasını takiben diyafram MU sayısı kaybını vurgulayan temsili veriler sunuyoruz.

Protokol

Tüm prosedürler, Missouri Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak onaylandı ve yürütüldü. Deneyler, 11 ila 15 haftalık yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanları üzerinde yapıldı. Bu sıçanlar çiftler halinde barındırıldı ve 12:12 aydınlık-karanlık döngüsü altında tutuldu, standart ticari peletlenmiş gıdalara ve HCl ile arıtılmış suya her zaman erişim sağlandı.

1. Hayvan hazırlama ve anestezi verme

  1. Fareleri tutarken uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
  2. Uygun indüksiyonu sağlamak için% 3-5 izofluran ile inhalasyon anestezisi uygulayın. Sıçan yeterince uyuşturulduktan sonra, sırtüstü pozisyona getirin ve% 1-3 inhale izofluran ile anesteziyi sürdürün. Geri çekilme yanıtı olmadığından emin olmak için forseps kullanarak arka bacak ayak pedine hafifçe baskı uygulayarak anestezi derinliğinin yeterliliğini kontrol edin.
    NOT: Sıçanın büyüklüğüne ve ağırlığına bağlı olarak, anestezi derinliğini izleyin ve izofluran konsantrasyonunu buna göre ayarlayın.
  3. CMAP genliğini ve gecikmesini etkileyebilecek sıcaklık değişikliklerini önlemek için termostatik bir ısıtma plakası kullanarak sıcaklığı 37 °C'de tutun.
  4. Kuruluğu önlemek için gözlere veteriner petrol bazlı bir merhem sürün. Solunum hızını gözlemleyerek ve forseps ile ayak tabanına baskı uyguladıktan sonra geri çekilme tepkilerini kontrol ederek anestezi derinliğini izleyin.
  5. Makas kullanarak incelenecek olan göğsün ve boynun alt üçte birlik kısmından tüyleri alın. Tüm deney boyunca farenin solunumunu izleyin.
    NOT: CMAP ve MUNE kayıtlarını ve anestezinin kesilmesini takiben, yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar hayvanı ev kafesine geri koymayın.

2. Elektrot yerleşimi ve kurulumu

  1. Şekil 28'de gösterildiği gibi CMAP, SMUP ve MUNE'yi kaydetmek için bir çift 1 G monopolar iğne elektrodu yerleştirin.
    1. Aktif (E1) iğne elektrodunu, son kaburga sınırının altındaki orta klaviküler çizginin üzerine deri altına ve referans (E2) iğne elektrodunu ksifoid işlemi ile son sternokostal kıkırdak arasındaki açıya deri altına yerleştirin.
      NOT: İğne elektrotları diyafram kasına yerleştirilmemelidir; bunun yerine deri altı bölgeye yerleştirilmelidirler.
  2. Karotis tabakasındaki frenik sinirin uyarılması için, sinir stimülasyonu için katot ve anot olarak bir çift 28 G monopolar iğne elektrotu kullanın ve yaklaşık 1 cm ile ayrılarak ön ve orta skalen kasları arasında lateral boynun üzerine deri altına yerleştirin. Uyarıcı iğnelerin yerleşiminin dördüncü boyun omurlarının (C4) altındaki seviyede olduğundan emin olun.
    NOT: Frenik sinirin veya başka bir yapının yaralanmasını önlemek için uyarıcı elektrotları çok derine yerleştirmekten kaçının. Şekil 1'de elektrot yerleşimi gösterilmektedir.
  3. Toprak elektrodu için kuyruğa tek kullanımlık bir yüzey elektrodu yerleştirin.

3. Veri toplama

  1. Frenik CMAP
    1. Frenik siniri uyarmak için 0.1 ms süreli ve 60 ila 100 mA arasında değişen yoğunluğa sahip monofazik katodik kare dalga darbeleri uygulayarak frenik CMAP yanıtlarını kaydedin.
    2. Yanıtın genliği daha fazla artış göstermeyi bırakana kadar uyaran yoğunluğunu aşamalı olarak artırırken CMAP yanıtları elde edin. Supramaksimal stimülasyonu sağlamak için, uyaran yoğunluğunu maksimum bir yanıt ortaya çıkarmak için kullanılan seviyenin yaklaşık% 120'sine yükseltin ve ek bir yanıt kaydedin. CMAP boyutu artık artmıyorsa, bu yanıtı en yüksek CMAP olarak düşünün.
      NOT: CMAP kaydı sırasında eşzamanlı kas aktivitesi gürültüsünü en aza indirmek için ekshalasyon sırasında stimülasyon verilmesi tercih edilir.
    3. CMAP'nin tepeden tepeye genliklerini milivolt (mV) cinsinden ölçün ve belgeleyin (Şekil 2).
      NOT: CMAP genliği, tabandan tepeye ve tepeden tepeye değerlendirilebilir. Klinik elektrodiagnostik sistemler genellikle, izoelektrik taban çizgisinden ilk negatif tepe noktasına kadar hesaplanan tabandan tepeye değerlendirmek için varsayılan olarak kullanılır.
  2. Ortalama tek motor ünitesi potansiyeli (SMUP) boyutu ve MUNE hesaplaması
    1. Artımlı bir stimülasyon tekniği kullanarak ortalama SMUP boyutunu hesaplayın.
      1. Artımlı yanıtları ortaya çıkarmak için, 1 Hz frekansında 0.1 ms'lik bir süre ile submaksimal stimülasyon uygulayın, minimal ya hep ya hiç yanıtı elde edilene kadar yoğunluğu 0.03 mA'lık artışlarla kademeli olarak artırın. 2 mA ile 10 mA arasında değişen bir uyaran yoğunluğu ile ilk yanıtı elde edin.
      2. İlk yanıt 2 mA ile 10 mA arasında bir uyaran yoğunluğu ile gerçekleşmezse, gerekli uyaran yoğunluğunu azaltmak veya artırmak için uyarıcı katodun pozisyonunu değiştirin, boyundaki frenik sinire yaklaştırın veya uzaklaştırın, sırasıyla.
      3. İlk artımlı yanıt, 2 mA ila 10 mA arasında değişen bir uyaran yoğunluğu ile elde edilirse, ilk yanıtı kaydedin ve adım 3.2.2'de aşağıdaki kriterleri karşılayan toplam 9 ek artış elde etmek için 0,03 mA'lık artışlarla ayarlayarak giderek daha yüksek uyaran yoğunluklarına sahip ek artışlar elde edin.
        NOT: Her SMUP, her bir artışın bir önceki artıştan çıkarılmasıyla ölçülür.
    2. Artımlı yanıtları ölçerken, her bir artışın aşağıdaki ölçütleri karşıladığından emin olun:
      1. Artımlı yanıtların ilk negatif tepe noktasının, maksimum CMAP yanıtının negatif tepe noktasıyla zamansal olarak hizalandığından emin olun.
        NOT: Solunum döngülerinden kaynaklanan arka plan gürültüsü nedeniyle gözlemlenen hafif hareketler, deneyin doğası gereğidir. Bununla birlikte, canlı gözlem sırasında SMUP'ların tutarlı bir şekilde bulunması, söz konusu belirli CMAP için kimliklerini doğrular.
      2. Diyafram solunumla ilgili dinamik bir kas olduğundan, her solunum döngüsü temel hareketi indükleyebilir. Bu nedenle, üç yinelenen yanıtta tutarlılığı onaylayarak her artımlı yanıtta kararlılığı ve fraksiyonlama olmadığını doğrulayın.
        NOT: Düşük genlikli uyarılmış potansiyelleri, özellikle ilk SMUP'u, solunum aktivitesine bağlı arka plan gürültüsünden ayırt etmek için, uyanık kalmak ve 3-4 solunum döngüsü boyunca gözlemlemek önemlidir. Ayrıca, doğruluk için tepe noktalarının CMAP'ninkilerle hizalandığından emin olun.
      3. Her artışın farklı ve bir öncekinden daha büyük olduğundan emin olun. Bu nedenle, artımlı yanıtları gerçek zamanlı olarak görsel olarak ayırt edin ve bunları daha önce kaydedilen artışların üzerine binerken gözlemleyin.
        NOT: Artışlarda tutarlılığı ve önceden tanımlanmış kriterlere uygunluğu sağlamak için her genlikte uyaranın birden fazla kopyası gerçekleştirilebilir.
      4. Her bir artışı yukarıda belirtilen kriterlerle görsel olarak doğruladıktan sonra, artış genliğinin en az 25 μV olduğunu onaylayın. Artış 25 μV'nin altındaysa, ölçümü atın ve yanıtı yeniden değerlendirin.
      5. 10 artımlı yanıtın kaydedilmesini takiben, her bir artış yanıtının genliğinin, son yanıtın toplam genliğini temsil eden 10 artışın tümünün birleşik genliğinin üçte birinden büyük olmadığını doğrulayın. Bu kriter karşılanmazsa, 10 artımlı yanıtın ölçümünü tekrarlayın.
        NOT: Üçte bir eşiği, her bir artımlı yanıtın tek bir motor ünitesinin aktivasyonunu temsil ettiği varsayımına dayanmaktadır. Herhangi bir artımlı yanıtın genliği, on artışın tümünün birleşik genliğinin üçte birini aşarsa, yanıtın yalnızca tek bir motor ünitesinin aktivasyonuna atfedilemeyebileceğini düşündürür. Bunun yerine, ek motor ünitelerin işe alınmasından veya elektriksel gürültü veya artefaktlar gibi spesifik olmayan aktivitelerin varlığından etkilenebilir22,26.
      6. SMUP'ların ortalama genliğini tahmin etmek için, 10 artışın değerlerinin ortalamasını alın. Ortalama SMUP genliğini ölçmenin başka bir yöntemi, son artımlı yanıtın tüm genliğini toplam artış sayısına11 bölmektir.
    3. Maksimum CMAP genliğini (tepeden tepeye) ortalama SMUP genliğine (tepeden tepeye) bölerek MUNE'yi belirleyin. Bazı elektrofizyolojik sistemlerde, SMUP'lar mikrovolt (μV) cinsinden kaydedilirken, CMAP genellikle milivolt (mV) cinsinden ifade edilir. Gerekirse, MUNE'yi hesaplamadan önce CMAP ve SMUP ölçümlerini aynı birimlere dönüştürün.
      NOT: Tepeden tepeye CMAP, ortalama SMUP ve MUNE tipik olarak klinik elektromiyografi sistemleri tarafından otomatik olarak hesaplanır:
      figure-protocol-1
      CMAP = Bileşik Kas Aksiyon Potansiyeli
      SMUP = Tek Motor Ünite Potansiyeli
      MUNE = Motor Birim Sayısı Tahmini

Sonuçlar

Bu raporda özetlenen CMAP, SMUP ve MUNE teknikleri, minimal invaziv elektrot yerleştirilerek diyafram kasındaki nöromüsküler fonksiyonun kaydedilmesini sağlar (Şekil 1). Genlik ve alan parametreleri, supramaksimal CMAP boyutunu karakterize etmek için kullanılabilir ve kas grubu çıktısının genel bir ölçüsünü sağlar (Şekil 2). Bununla birlikte, mevcut yöntemlerimizde, hem CMAP hem de SMUP boyutlarını ölçmek için genliğe güveniyoruz. CMAP, SMUP ve MUNE, nöromüsküler hastalığın çeşitli sıçan modellerinde nöromüsküler fonksiyonu ölçmek için kullanılabilir. MN dejenerasyonu bağlamında MU kaybını göstermek için, sıçanlara frenik MN'leri ve ekstra CTB'yi (25 μg) hedeflemek için CTB-SAP (25 μg) ile bilateral intraplevral enjeksiyon uygulandı ve kontrol sıçanlarına konjuge olmayan CTB (25 μg) ve SAP (25 μg) verildi1,27.

Şekil 3'te, intraplevral CTB-SAP enjeksiyonundan yedi gün sonra erişkin bir kontrol sıçanı ve erişkin bir sıçandaki (12 hafta) bulgular karşılaştırılmıştır. CTB-SAP'nin intraplevral enjeksiyonunu takiben, kontrol sıçanındaki 74 fonksiyonel motor ünitenin normal bulgularına kıyasla MUNE tahmini 60 fonksiyonel motor ünitede azalır. Bununla birlikte, CTB-SAP sıçanındaki (14.25 mV tepeden tepeye) CMAP genliği, muhtemelen kollateral filizlenmeye bağlı olarak kontrole (14.5 mV tepeden tepeye) kıyasla minimum değişiklikler sergilemiştir. Şekil 4'te, diyafram CMAP, SMUP ve MUNE bilateral olarak elde edildi ve başlangıç/enjeksiyon öncesi (n = 14), ayrıca 7 (n = 14), 14 (n = 14), 21 (n = 6) ve 28 (n = 14) enjeksiyondan gün sonra ortalama alındı. Şekil 4'te, gruplar arasında temel fark bulunamamıştır. MUNE zaman (p < 0.05), CTB-SAP (p < 0.001) ve etkileşim süresi x CTB-SAP (p < 0.01) için anlamlı bir değişiklik gösterdi ve CTB-SAP sıçanlarında MUNE'nin ~% 40 azalması ile birlikte. CTB-SAP sıçanlarının ortalama SMUP'u zamanla (p < 0.05) ve CTB-SAP (p < 0.01) ile anlamlı bir değişiklik gösterdi, ancak SMUP genliğinde ~% 50-60 artış ile anlamlı bir etkileşim göstermedi. CMAP önemli bir değişiklik göstermedi.

figure-results-1
Şekil 1: Elektrot yerleşimi. (A) uyarıcı katot ve (B) anot, ön ve orta skalen kasları arasındaki lateral boyuna yaklaşık 1 cm aralıklarla deri altından yerleştirilir. (C) "aktif" elektrot (E1) ve (D) "referans" kayıt elektrodu (E2), ksifoid süreç ile son kostosternal kıkırdak arasındaki açıyı takip ederek, son kaburga sınırından aşağı orta klaviküler çizgi üzerine yerleştirilir. Ek olarak, (E) tek kullanımlık bir disk elektrodu, artefaktları en aza indirmek için bir zemin olarak kuyruk üzerine yerleştirilmiştir. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Bileşik kas aksiyon potansiyeli. Sol hemidiyafram kasından kaydedilen temsili bir CMAP yanıtının bir örneği. CMAP tepeden tepeye genlik, negatif tepe voltajından pozitif tepe voltajına kadar belirlenir. Kısaltma: CMAP = Bileşik kas aksiyon potansiyeli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: CTB-SAP intraplevral enjeksiyonundan yedi gün sonra bir kontrol sıçanından ve yetişkin bir sıçandan iki temsili CMAP ve MUNE kaydı. (A) Tepeden tepeye genliği 14.5 mV olan bir kontrol yetişkin sıçanında (12 haftalık) sol frenik bileşik kas aksiyon potansiyeli (CMAP). Ekran hassasiyeti = 1 mV/bölme ve ekran süresi 1 ms/bölme. (B) Toplam genliği 1.940 mV olan on müteakip artımlı yanıt, ortalama SMUP boyutunu (0.194 mV) belirlemek için 10'a bölünür. Ekran hassasiyeti = 0,2 mV/bölme ve 1 ms/bölme süpürme hızı. Hesaplanan MUNE = 74 (MUNE=CMAP/ortalama SMUP (14.5 mV/ 0.194 mV)) (C) CTB-SAP enjeksiyonundan yedi gün sonra frenik CMAP, CMAP tepeden tepeye genlikte neredeyse hiç değişiklik göstermedi, 14.25 mV. Ekran hassasiyeti = 1 mV/bölme ve 1 ms/bölme süpürme hızı. (D) Ortalama 2.360 mV'luk bir SMUP boyutu elde etmek için toplam tepeden tepeye genliği 10'a bölünen 0.236 mV ile on müteakip artımlı yanıt. Ekran hassasiyeti = 0,2 mV/bölme ve 1 ms/bölme süpürme hızı. Böylece, hesaplanan MUNE 60 idi. Kısaltmalar: CMAP = bileşik kas aksiyon potansiyeli; MUNE = motor ünite sayısı tahmini; CTB-SAP = saporine konjuge kolera toksin B fragmanı; SMUP = tek motor ünitesi potansiyeli. *Elektriksel stimülasyonun neden olduğu artefaktı gösterir; Elektriksel uyaranın genliği ile CMAP arasındaki kontrastın yanı sıra artımlı tepkiler nedeniyle, uyaranın yalnızca bir kısmını grafiklendirdiğimizi belirtmek önemlidir. Daha iyi erişilebilirlik için artımlı yanıtların görselleştirilmesini geliştirmek için kör renkli kolay renkler kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: CDB-SAP'YI takiben CMAP, SMUP ve MUNE'nin elektrofizyolojik değerlendirmesi. Gruplar arasında temel fark bulunmadı (hem CTB-SAP hem de kontrol gruplarında yedi adet 11 haftalık erkek sıçan). (A) CMAP önemli bir değişiklik göstermedi. (B) CTB-SAP sıçanlarının ortalama SMUP'u zaman içinde (p < 0.05) ve CTB-SAP ile (p < 0.01) anlamlı bir etkileşim olmaksızın önemli bir değişiklik gösterdi, bu da SMUP genliğinde% 50-60'lık bir artışa işaret etti. (C) CTB-SAP enjeksiyonundan yedi gün sonra, ortalama MUNE '.07 oranında önemli ölçüde azalarak 102.58'den 20.54±e 72.43'e ± 15.59 tahmini fonksiyonel motor birim (Ortalama ± SD) azalmıştır. Bu azalma, 28 günde ,75'lik ek bir düşüşle devam etti (MUNE: 60,64 ± 11,33, p < 0,01). Başlangıçta, enjeksiyondan 7, 14 ve 28 gün sonraki tüm ölçümler 14 sıçandan elde edildi, n = 7 sıçan konjuge CTB-SAP enjekte edildi ve n = 7 sıçan kontrol grubu olarak konjuge olmayan CTB ve SAP aldı. 21. günde altı sıçan kullanıldı. CMAP, SMUP ve MUNE verileri ortalama olarak sunuldu ve karşılaştırmalar iki yönlü varyans analizi kullanılarak yapıldı. Yıldız işaretleri çeşitli zaman noktalarındaki farklılıkları gösterir: *p < 0.05 ve **p < 0.01. Kısaltmalar: CMAP = bileşik kas aksiyon potansiyeli; MUNE = motor ünite sayısı tahmini; CTB-SAP = saporine konjuge kolera toksin B fragmanı; SMUP = tek motor ünitesi potansiyeli. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

ALS gibi MN dejeneratif hastalıklarda, ventilasyonda yer alan MU'ların değerlendirilmesi çok önemlidir28. ALS hastalarında respiratuar MN dejenerasyonu ortaya çıkmasına rağmen, MN ölümünün spesifik başlangıcı ve ilerlemesi tam olarak anlaşılamamıştır 29,30,31. Bu yönün önemini kabul ederek, hem genetik temelli (örneğin, SOD1 2,32) hem de genetik temelli olmayan (örneğin, CTB-SAP intraplevral enjeksiyon 3,27,33) çeşitli modeller, nörodejeneratif hastalıkların hayvan modellerinde solunum yetmezliğini taklit etmek için kullanılmıştır. Buna göre, potansiyel tedavi etkilerinin teşhisi, izlenmesi ve değerlendirilmesi için bir biyobelirteç tanımlamak bu modeller için avantajlıdır. Ek olarak, biyobelirteçler klinik öncesi araştırma bulgularının klinik çevirisini kolaylaştırabilir.

Kemirgen dejeneratif modellerde innerve edici MN'lerin sayısını ölçmek için, retrograd izleyiciler ve adenovirüsler dahil olmak üzere farklı etiketleme teknikleri kullanılmıştır 25,34,35,36. Daha önce, servikal omuriliğin ön boynuzundaki frenik motor nöronları etiketlemek için immünohistokimya kullanılmıştır 2,3,33. Etiketleme teknikleri, MN değerlendirmeleri için değerli olsa da, MU'ların işlevselliğini değerlendirmede sınırlamalara sahiptir ve boylamsal değerlendirmeler için uygun değildir37. Objektif elektrofizyolojik değerlendirmeler, özellikle insanlar ve kemirgenler arasındaki motor sistemlerin fonksiyonel ve anatomik özelliklerindeki belirgin yapısal farklılıklar göz önüne alındığında, başarılı türler arası çeviri için çok önemlidir38,39. Nörobiyolojik farklılıkların dahil edilmesi, kemirgen modellerinden elde edilen bulguların hastalara aktarılmasında bir zorluk teşkil etmektedir. MUNE, MN fonksiyonunun objektif bir elektrofizyolojik ölçüsü olarak hizmet ederek bu engellerin üstesinden gelir ve MN dejeneratif model deneylerinde bir biyobelirteç olarak fonksiyonel MU bağlantısının değerlendirilmesine izin verir 3,40.

CMAP, SMUP ve MUNE araştırma çalışmalarında ve nöromüsküler bozukluğu olan hastaları değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır 9,10,11. Bu potansiyel biyobelirteçler minimal invazivdir ve zaman içinde aynı birey içindeki fonksiyonun uzunlamasına değerlendirilmesini sağlar. Daha da önemlisi, MU'nun kortikal MN'ler tarafından aktivasyonunu veya işe alımını doğrudan ölçmeseler de, MN bütünlüğünün ve işlevsel muadili olan MU'nun klinik olarak anlamlı bir tahminini sağlarlar. MN dejeneratif hastalıkların kemirgen modelleri, insan hastalıklarının altında yatan fizyopatolojik mekanizmaların anlaşılması ve etkili tedavilerin klinik öncesi ilerlemesi için çok önemlidir. Türler arasında çevrilebilen sonuç ölçümleri ve biyobelirteçlerin geliştirilmesi, umut verici klinik öncesi bulguların klinik çalışmalara çevrilmesini kolaylaştırabilir ve hızlandırabilir11. Ölçümlerin göreceli karmaşıklığı göz önüne alındığında, bu teknikleri sıçan uzuvlarından diyafram kasına uyarladık ve rafine ettik. Bu çeviri, sıçan çalışmalarında daha geniş kullanım ve uygulamayı kolaylaştırmak için görsel bir formatta sunulmuştur.

Deneyimlerimize göre, klinik elektrodiagnostik sistemler bu bağlamda özetlenen çalışmalar için çok uygundur. Bu uygunluk, muayene eden kişi ile elektrodiagnostik sistem arasındaki arayüzdeki gelişmiş ergonomiden kaynaklanır ve rahat kontrolü kolaylaştırır. Laboratuvar grubumuzda, iki anahtarlamasız amplifikatör kanalına sahip iki kanallı bir sistem kullanılmaktadır. Bu kanallar 24 bit Analogdan Dijitale Dönüştürücü ile donatılmıştır ve kanal başına 48 kHz örnekleme hızında çalışır. Donanım kazancı, bölüm başına 10nV ila 100 mV aralığında ayarlanabilir. 0,2 Hz ile 5 kHz arasında değişen bir aralığa sahip düşük frekanslı bir filtre kullandık ve yüksek frekanslı filtre ayarları 30 Hz ile 10 kHz arasında bir aralığı kapsıyordu. Ek olarak, 0 ila 100 mA arasında değişen ayarlanabilir yoğunluğa ve 0,02 ila 1 ms süreye sahip bir sabit akım stimülatörü kullandık. Klinik sistemlerin çoğu, CMAP, SMUP ve MUNE yanıtlarını kaydetmek için uygun olan karşılaştırılabilir özellikler sunar. Bu sistemler, istenen verilerin doğru bir şekilde kaydedilmesini sağlamak için buna göre ayarlanabilir. Örneğin, CMAP genliği tabandan tepeye ve tepeden tepeye değerlendirilebilir. Klinik elektrodiagnostik sistemler genellikle, izoelektrik taban çizgisinden ilk negatif tepe noktasına kadar hesaplanan tabandan tepeye değerlendirmek için varsayılan olarak kullanılır.

Diyaframdan CMAP, SMUP ve MUNE yanıtları elde etme süreci birkaç önemli adımı içerir. Yeterli elektrot derinliği ile birlikte tutarlı ve doğru elektrot yerleşimi, genlikleri güvenilir bir şekilde ölçmek ve kayıt sırasında arka plan gürültülerini en aza indirmek için çok önemlidir. Uyarıcı elektrotların yanlış yerleştirilmesi istenmeyen sonuçlara yol açabilir. Uyarıcı elektrotların çok arkaya yerleştirilmesi, brakiyal pleksus uyarımına abartılı ön ayak kas kasılmalarına neden olabilirken, C4 seviyesinden daha yüksek yerleştirme, frenik sinirin uyarılmasını daha zor hale getirebilir. Daha derin yerleştirme, karotis artere zarar verme veya vagus sinirini uyandırma riskini taşır ve potansiyel olarak kardiyak iletkenlik sorunlarına neden olur. Kayıt elektrotlarını son kaburgadan daha yükseğe veya daha aşağıya yerleştirerek, sırasıyla interkostal veya rektus abdominis stimülasyonundan ölçümler yapılabilir. Diğer kaslardan kayıt yapmaktan kaçınmak için, CMAP gecikmesinin diyafram negatif tepe noktasının tipik olarak 1.5-3.5 ms olduğuna ve karakteristik şeklinin Şekil 2'de gösterildiğine dikkat edin. Gözlemlerimiz, iğne elektrotlarının diyafram kası için disk şeklindeki elektrotlara kıyasla daha tutarlı CMAP, SMUP ve MUNE kayıtları verdiğini göstermiştir. Bu gelişmiş tutarlılık, diyafram kasının kubbe şekline ve interkostal ve rektus abdominis kasları gibi yakındaki diğer kasların varlığına atfedilir. Ek olarak, iğne elektrotlarının esnek bir şekilde yerleştirilmesi de bir diğer avantajlı faktördür. Elektriksel stimülasyon yoğunluğu ile ilgili olarak, frenik siniri uyarmak için 60 ila 100 mA arasında bir aralık kullandık, bu da diğer motor sistemler için bildirilen aralıkları aşıyor. Bu fark, frenik sinirin boyundaki daha derin yerleşiminden kaynaklanır ve sırasıyla siyatik sinir ve brakiyal pleksusun arka bacak ve ön ayaktaki daha yüzeysel yerleşimlerine kıyasla.

Ortalama SMUP'u elde etmek, CMAP'a kıyasla daha büyük teknik zorluklar doğurur. Milivolt yerine mikrovolt aralığındaki daha küçük tepki boyutu, arka plan gürültüsünün etkisini daha belirgin hale getirir. Arka plan gürültüsünü azaltmak için toprak elektrodu, katot ve anodu ayarlayarak elektrot yerleşimini optimize etmeyi düşünün. Ek olarak, deney düzeneğinde yakındaki elektrikli cihazlardan minimum parazit olduğundan emin olun. Hücre içi elektrofizyoloji uygulamalarında yaygın olarak kullanılan bir Faraday kafesi bu kurulum için gerekli değildir. Bireysel SMUP yanıtlarının görsel olarak tanımlanması, tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar için pratik gerektiren zorlu bir beceridir. Diyafram dinamik bir kas olduğundan, taban çizgisi her ventilasyon döngüsünde değişebilir. SMUP artışlarına karşı dikkatli olmak, önceki SMUP ile uyum sağlamak, bu zorluğun üstesinden gelmede kritik bir faktördür. Ek olarak, SMUP'ların maksimum CMAP'nin gecikme süresi içinde başlatılmasını sağlamak, doğru kayıtlar için önemlidir.

Diyafram kaydının bir başka zorluğu da, soldan sağa değişen kalınlıklarla karakterize edilen ve karaciğerin sağ tarafa uyguladığı basınçtan etkilenen bu kasın asimetrik doğasıdır41. Bunu ele almak için, sol ve sağ hemidiyaframlarda ayrı ayrı elektrofizyolojik ölçümler yaptık. Bunu takiben, CMAP, SMUP ve MUNE yanıtlarının ortalamalarını ayrı ayrı hesapladık.

CMAP yanıtı, belirli bir kasta kas liflerinin kolektif depolarizasyonunu yansıttığından, frenik MN'yi diyafram kası lifine etkileyen herhangi bir patoloji, CMAP boyutunda bir azalmaya neden olabilir. Bu nedenle, bilateral hemidiyaframlardan ortalama CMAP'nin hesaplanması, solunum nöromüsküler sisteminin genel fonksiyonel durumunun mükemmel bir değerlendirmesini sunar. Teminat filizlenmesi gibi telafi edici değişiklikler, MN veya motor aksonal kayıp11 varlığında bile CMAP boyutunun korunmasına yol açabilir. Bireysel artışların kaydedilmesi, tek MU'ların (SMUP boyutu) ortalama çıktısının tahmin edilmesine olanak tanıyarak, solunum sisteminin MU'larının işlevsel durumu hakkında daha ayrıntılı bilgiler sunar. Bu nedenle, MUNE tekniği, frenik MN'lerin veya aksonların diyaframa girişini değerlendirmek için gerekli hale gelir. Bu biyobelirteçlerin MN hastalıklarını incelemek için tedavilerin klinik öncesi deneylerinde uygulanması, klinik çalışmalara translasyonu iyileştirme potansiyeline sahiptir.

Açıklamalar

WDA, NMD Pharma, Avidity Biosciences'tan araştırma fonu ve NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics, Catalyst Pharmaceuticals ve Novartis'ten danışmanlık ücretleri aldı.

Teşekkürler

Bu çalışma, Missouri Omurilik Yaralanması/Hastalığı Araştırma Programı'ndan (NLN ve WDA) Omurilik Yaralanması/Hastalığı Araştırma Programı Hibesi ile finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2 mL Cam ŞırıngaKent Scientific CorporationSOMNO-2ML
50 mL, Model 705 RN şırıngaHamilton Company7637-01İntraplevral enjeksiyon yapmak için kullanılır
5008 - Formulab DietLabDiet0001325
Otoklavlanabilir 26 G iğneler (26S RN 9.52 mm 40°)Hamilton Company7804-04İntraplevral enjeksiyon yapmak için kullanılır
Kolera toksini B-alt birimi (CTB)MilliporeSigmaC9903Hayatta kalan motor nöronları etiketlemek için intraplevral enjeksiyon için kullanılır
Saporine konjuge kolera toksini B-alt birimi (CTB-SAP)Gelişmiş Hedefleme SistemleriIT-14Motor nöron ölümüne neden olmak için intraplevral enjeksiyon için kullanılır
Çıkarılabilir KabloTechnomed202845-0000kaydedici elektrodu elektrodiagnostik makinesine bağlamak için
Uçlu tek kullanımlık 2" x 2" disk elektrotCadwell302290-000toprak elektrodu
tek kullanımlık monopolar iğneler 28 GTechnomed202270-000katot ve anot uyarıcı elektrotlar- kayıt elektrotları
EMG iğne kablosu (Amp/stim anahtar kutusu)Cadwell190266-200monopolar elektrotları elektrodiagnostik stimülatöre bağlamak için
Yardım Eden Eller demir tabanlı timsah klipsiRadio Shack64-079Kayıt elektrodu yerleşiminin sürdürülmesi 
İzofluran (250 mL şişe)Piramal Healthcare
monoject kavisli uçlu sulama şırıngasıCovidien81412012elektrot jeli uygulaması için kullanılır
RightTemp Homeotermik Isınma ile PhysioSuite Fizyolojik İzleme SistemiKent Scientific CorporationPS-RTKızılötesi ısıtma pedi, rektal prob ve ped sıcaklık probu içerir
Pro düzeltici Evcil Hayvan Bakım SetiOster078577-010-003epilasyon için makaslar
Saporin (SAP)Gelişmiş Hedefleme SistemleriPR-01İntraplevral enjeksiyon için kullanılır (kendi kendine enjekte edildiğinde kontrol ajanı)
Sierra Summit EMG sistemiCadwell Industries, Inc., Kennewick, WAtaşınabilir elektrodiagnostik sistem
SomnoSuite Düşük Akışlı Dijital Anestezi SistemiKent Scientific CorporationSOMNODökülme önleyici, buhar önleyici şişe üstü adaptör içerir; Y adaptör hortumu; kömür süpürücü filtresi
Sprague-Dawley sıçanEnvigo kolonisi 208a, Indianapolis, IN
Veteriner petrol bazlı oftalmik merhem Puralube26870kornea yaralanmasını önlemek için anestezi sırasında uygulanır
, ,

Kaynaklar

  1. Mantilla, C. B., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
  2. Nichols, N. L., Satriotomo, I., Harrigan, D. J., Mitchell, G. S. Acute intermittent hypoxia induced phrenic long-term facilitation despite increased sod1 expression in a rat model of als. Exp Neurol. 273, 138-150 (2015).
  3. Nichols, N. L., Craig, T. A., Tanner, M. A. Phrenic long-term facilitation following intrapleural ctb-sap-induced respiratory motor neuron death. Respir Physiol Neurobiol. 256, 43-49 (2018).
  4. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  5. Boërio, D., Kalmar, B., Greensmith, L., Bostock, H. Excitability properties of mouse motor axons in the mutant sod1g93a model of amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 41 (6), 774-784 (2010).
  6. Shibuya, K., et al. Motor cortical function determines prognosis in sporadic als. Neurology. 87 (5), 513-520 (2016).
  7. Lewelt, A., et al. Compound muscle action potential and motor function in children with spinal muscular atrophy. Muscle Nerve. 42 (5), 703-708 (2010).
  8. Mcgovern, V. L., et al. Smn expression is required in motor neurons to rescue electrophysiological deficits in the smnδ7 mouse model of sma. Hum Mol Genet. 24 (19), 5524-5541 (2015).
  9. Arnold, W. D., et al. Electrophysiological biomarkers in spinal muscular atrophy: Preclinical proof of concept. Ann Clin Transl Neurol. 1 (1), 34-44 (2014).
  10. Harrigan, M. E., et al. Assessing rat forelimb and hindlimb motor unit connectivity as objective and robust biomarkers of spinal motor neuron function. Sci Rep. 9 (1), 16699(2019).
  11. Arnold, W. D., et al. Electrophysiological motor unit number estimation (mune) measuring compound muscle action potential (cmap) in mouse hindlimb muscles. J. Vis. Exp: JoVE. (103), e52899(2015).
  12. Martin, M., Li, K., Wright, M. C., Lepore, A. C. Functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons. J. Vis. Exp: JoVE. (99), e52605(2015).
  13. Mccomas, A., Fawcett, P. R. W., Campbell, M., Sica, R. Electrophysiological estimation of the number of motor units within a human muscle. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 34 (2), 121-131 (1971).
  14. Felice, K. J. A longitudinal study comparing thenar motor unit number estimates to other quantitative tests in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 20 (2), 179-185 (1997).
  15. Vucic, S., Rutkove, S. B. Neurophysiological biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 31 (5), 640-647 (2018).
  16. Carleton, S., Brown, W. Changes in motor unit populations in motor neurone disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 42 (1), 42-51 (1979).
  17. Yuen, E. C., Olney, R. K. Longitudinal study of fiber density and motor unit number estimate in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Neurology. 49 (2), 573-578 (1997).
  18. Gooch, C. L., et al. Motor unit number estimation: A technology and literature review. Muscle Nerve. 50 (6), 884-893 (2014).
  19. Henderson, R. D., Ridall, P. G., Hutchinson, N. M., Pettitt, A. N., Mccombe, P. A. Bayesian statistical mune method. Muscle Nerve. 36 (2), 206-213 (2007).
  20. Shefner, J., et al. Multipoint incremental motor unit number estimation as an outcome measure in als. Neurology. 77 (3), 235-241 (2011).
  21. Stein, R. B., Yang, J. F. Methods for estimating the number of motor units in human muscles. Ann Neurol. 28 (4), 487-495 (1990).
  22. Shefner, J. M. Motor unit number estimation in human neurological diseases and animal models. Clin Neurophysiol. 112 (6), 955-964 (2001).
  23. Ahad, M., Rutkove, S. Correlation between muscle electrical impedance data and standard neurophysiologic parameters after experimental neurogenic injury. Physiol Meas. 31 (11), 1437(2010).
  24. Kasselman, L. J., Shefner, J. M., Rutkove, S. B. Motor unit number estimation in the rat tail using a modified multipoint stimulation technique. Muscle Nerve. 40 (1), 115-121 (2009).
  25. Ngo, S., et al. The relationship between bayesian motor unit number estimation and histological measurements of motor neurons in wild-type and sod1g93a mice. Clin Neurophysiol. 123 (10), 2080-2091 (2012).
  26. Feasby, T., Brown, W. Variation of motor unit size in the human extensor digitorum brevis and thenar muscles. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 37 (8), 916-926 (1974).
  27. Nichols, N. L., Vinit, S., Bauernschmidt, L., Mitchell, G. S. Respiratory function after selective respiratory motor neuron death from intrapleural ctb-saporin injections. Exp Neurol. 267, 18-29 (2015).
  28. Nichols, N. L., et al. Ventilatory control in als. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 429-437 (2013).
  29. Cifra, A., Nani, F., Nistri, A. Respiratory motoneurons and pathological conditions: Lessons from hypoglossal motoneurons challenged by excitotoxic or oxidative stress. Respir Physiol Neurobiol. 179 (1), 89-96 (2011).
  30. Kobayashi, Z., et al. Fals with gly72ser mutation in sod1 gene: Report of a family including the first autopsy case. J Neurol Sci. 300 (1), 9-13 (2011).
  31. Su, M., Wakabayashi, K., Tanno, Y., Inuzuka, T., Takahashi, H. An autopsy case of amyotrophic lateral sclerosis with concomitant alzheimer's and incidental lewy body diseases. No to shinkei= Brain and nerve. 48 (10), 931-936 (1996).
  32. Lladó, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the sod1 g93a transgenic rat model of als. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
  33. Borkowski, L. F., Smith, C. L., Keilholz, A. N., Nichols, N. L. Divergent receptor utilization is necessary for phrenic long-term facilitation over the course of motor neuron loss following ctb-sap intrapleural injections. J Neurophysiol. 126 (3), 709-722 (2021).
  34. Nicolopoulos-Stournaras, S., Iles, J. F. Motor neuron columns in the lumbar spinal cord of the rat. J Comp Neurol. 217 (1), 75-85 (1983).
  35. Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: An approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons. Sci Rep. 6 (1), 33058(2016).
  36. Mchanwell, S., Biscoe, T. The localization of motoneurons supplying the hindlimb muscles of the mouse. Phil. Trans. R. , 477-508 (1981).
  37. Nair, J., et al. Histological identification of phrenic afferent projections to the spinal cord. Respir Physiol Neurobiol. 236, 57-68 (2017).
  38. Courtine, G., et al. Can experiments in nonhuman primates expedite the translation of treatments for spinal cord injury in humans. Nat Med. 13 (5), 561-566 (2007).
  39. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Sci Transl Med. 7 (302), 134(2015).
  40. Arnold, R., et al. Nerve excitability in the rat forelimb: A technique to improve translational utility. J Neurosci Methods. 275, 19-24 (2017).
  41. Boriek, A., Rodarte, J., Reid, M. Shape and tension distribution of the passive rat diaphragm. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 280, R33-R41 (2001).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Frenik Motor N ronlarDiyafram Motor niteleriMotor nite Say s TahminiBile ik Kas Aksiyon PotansiyeliTek Motor nite PotansiyeliElektrofizyolojik De erlendirmeN rom sk ler FonksiyonKollateral FilizlenmeS an N rodejenerasyon ModeliBoylamsal Biyobelirte ler
Frenik Motor Nöron Dejenerasyonu ve Kompanzasyonunun Kantitatif Biyobelirteçleri Olarak Sıçan Diyafram Motor Ünitesi Bağlantı Sonuç Ölçütlerinin Değerlendirilmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.