Yöntem makalesi

Tek Yer Fıstığında (Arachis spp.) Aflatoksinlerin ve Stilbenoid Fitoaleksinlerin Tahribatsız SPE-UPLC Tabanlı Miktar Tayini Tohum

DOI:

10.3791/66574

⸱

19 Nisan 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Peanut Research Laboratory, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ultra performanslı sıvı kromatografisi kullanarak tek fıstık tohumlarında aflatoksinlerin ve stilbenoid fitoaleksinlerin miktar tayini için orta verimli bir yöntem gösteriyoruz. Bu yöntem, aflatoksijenik Aspergillus türleri tarafından zorlanan yabani Arachis türlerinin analizleri için özel olarak geliştirilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aflatoksinler, başta Aspergillus flavus olmak üzere bazı mantar türlerinin oldukça kanserojen ikincil metabolitleridir. Aflatoksinler genellikle yer fıstığı da dahil olmak üzere ekonomik açıdan önemli tarımsal ürünleri kirleterek insan ve hayvan sağlığı için yüksek risk oluşturur. Dar genetik taban nedeniyle, yer fıstığı çeşitleri mantar patojenlerine karşı sınırlı direnç gösterir. Bu nedenle, Aspergillus'a toleransı olan çok sayıda yabani fıstık türü, bilim adamları tarafından hastalık direnci kaynakları olarak önemli ölçüde dikkate alınmıştır.

Aflatoksinlere direnç için bitki germplazmını araştırmak zordur, çünkü aflatoksin birikimi normal bir dağılım izlemez, bu da binlerce tek fıstık tohumunun analizine duyulan ihtiyacı belirler. Yeterince hidratlı yer fıstığı (Arachis spp.) tohumları, Aspergillus türleri tarafından enfekte edildiğinde, savunma fitoaleksinleri olarak kabul edilen biyolojik olarak aktif stilbenler (stilbenoidler) üretebilir. Yer fıstığı stilbenleri mantar gelişimini ve aflatoksin üretimini engeller. Bu nedenle, Aspergillus istilasına karşı tohum direncinin/duyarlılığının doğasını açıklamak için yer fıstığı stilbenoidleri için aynı tohumları analiz etmek çok önemlidir. Yayınlanan yöntemlerin hiçbiri aflatoksinler ve/veya stilben fitoaleksinler için tek tohum analizleri sunmamaktadır.

Çevre dostu, ucuz sarf malzemeleri kullanan, hassas ve seçici olan böyle bir yönteme olan talebi karşılamaya çalıştık. Ek olarak, yöntem tohumun sadece yarısını kullandığı ve embriyonik ekseni içeren diğer yarısını sağlam bıraktığı için tahribatsızdır. Böyle bir teknik, yer fıstığı bitkisinin çimlenmesine ve büyümesine, aflatoksin ve stilbenoid analizi için kullanılan aynı tohumdan tam olgunluğa izin verir. Bu yöntemin entegre kısmı olan Aspergillus ile tohumların manuel olarak zorlanması, yöntemdeki diğer adımlara göre daha fazla zaman ve emek gerektiren sınırlayıcı bir adımdır. Yöntem, Aspergillus'a dirençli türleri tanımlamak ve bu mantar patojenine karşı yeni genetik direnç kaynaklarını belirlemek ve karakterize etmek için yabani Arachis germplazmının araştırılması için kullanılmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yer fıstığı (Arachis hypogaea L.), dünyanın en önemli gıda ürünlerinden biridir. 100'den fazla ülkede yetiştirilmekte ve toplam üretimi 45 milyon tonu aşmaktadır1. Yer fıstığı, mısır ve pamuk tohumu gibi tarımsal ürünler genellikle aflatoksin üreten toprak kaynaklı mantarlar olan Aspergillus türleri tarafından istila edilir2. Bu ürünler, çevresel koşullar yüksek sıcaklıklar ve kuraklık ile karakterize edildiğinde, hasat öncesi aflatoksin kontaminasyonuna karşı özellikle hassastır. Aflatoksinler bilinen en güçlü kanserojenler arasındadır3. Dünyadaki tarımsal emtiaların dörtte birinikirletiyorlar 4 ve dünya nüfusunun yaklaşık yarısını kronik olarak aflatoksinlere maruz bırakıyorlar5. Yüksek kanserojenlikleri ve toksisiteleri nedeniyle, gıdalardaki aflatoksin varlığı, dünyanın çoğu ülkesinde pratik olarak kabul edilebilir en düşük sınırlarda düzenlenmektedir6.

Avrupa Birliği (AB), insani tüketim ürünlerindeki aflatoksin B1 için maksimum 2 ng/g ve toplam aflatoksinler (B1, B2, G1 ve G2) için maksimum 4 ng/g seviyesini yasalaştırmıştır7. Bu tür düşük limitler, aflatoksinlerle kontamine olmuş malları işleyen tarım ve gıda endüstrisi üzerinde önemli bir baskı oluşturmaktadır. Kontamine yer fıstığının aflatoksin izlemesi ve yeniden işlenmesi, aflatoksinlerin gıda zincirine girmesini önlemek için pasif ve maliyetli bir strateji olarak kabul edilebilir. Bu nedenle, yer fıstığı endüstrisinin tüm büyük segmentleri, genellikle mantar hastalıklarına karşı sınırlı direnç gösteren mevcut yer fıstığı çeşitlerinin aflatoksin kontaminasyonu nedeniyle muazzam kar kayıpları yaşamaktadır. Aflatoksin problemini çözmek için ileriye dönük bir yaklaşım, gen introgresyonu yoluyla mantara dirençli yer fıstığı çeşitlerinin elde edilmesi, yani genetik bilginin dirençli yabani yer fıstığı türlerinden elit çeşitlere aktarılmasıdır. Son yıllarda 8,9, yabani yer fıstığı türleri, genetik hastalık direncinin kaynakları olarak önemli ölçüde dikkate alınmıştır, çünkü kültür yer fıstığının dar genetik tabanı artık yer fıstığı bitkisine ihtiyaç duyulan direnç özelliklerini sağlayamamaktadır10,11. Yabani yer fıstığı türlerinden başarılı bir şekilde introgresyon, binlerce tek, küçük ve kıt tohumun analizini gerektirir (Şekil 1A) 12.

figure-introduction-1
Şekil 1: Tek tohum analizi akış şeması. (A) Farklı pazar tipi yer fıstığı çeşitlerinin karşılaştırmalı büyüklüğü ile yabani Arachis spp. (1) Virginia; (2) koşucu; (3) İspanyolca; (4) yabani Arachis spp. (B) Yabani Arachis spp. (levha A, tohum 4) üç bölüme ayrılmış, (5) embriyonik eksenli yarım tohum; Tohumun bu kısmı bir bitki yetiştirmek için kullanılır (E). (C) (6) ve (7) numaralı parçalar bir matkap ucu ile delinir ve (D) mantar sporları ile aşılanır. 30 °C'de 72 saat inkübasyondan sonra, tohum parçalarından biri (6) veya (7) aflatoksin ve fitoaleksin analizleri için, diğeri ise RNA/transkriptom dizilimi için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Mantar patojenlerine karşı yer fıstığı direnci, fitoaleksinler 13,14,15,16,17 ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Yer fıstığı fitoaleksinleri, ekzojen uyaranlara, özellikle mantar istilasına maruz kaldıktan sonra bitki dokularında biyosentezlenen ve biriken antimikrobiyal stilbenoidler ile temsil edilir 16,17,18. Mantar istilası bölgesinde yeterli konsantrasyonda fitoaleksin birikimi mantar büyümesini engeller ve bitki savunması için kritik öneme sahiptir 19,20,21. Fitoaleksinler inhibitör konsantrasyonlara(16,22) biriktiğinde patojen büyümeyi durdurur. Yer fıstığında aflatoksijenik mantarlara karşı savunma bileşikleri olarak stilbenoidlerin rolü, 30 yılı aşkın bir süre önce saha deneylerindedeğerlendirildi 13. Bu deneyler, yer fıstığı stilbenoidlerinin hasat öncesi aflatoksin kontaminasyonunda çok önemli bir direnç faktörü olduğu hipotezini açıkça destekledi. Bu tür kanıtlar, stilbenlerin tarlada zarar görmüş yer fıstığında doğal olarak üretildiği gerçeğine dayanmaktadır; stilbenler, aflatoksijenik mantarlara karşı kayda değer biyolojik aktivite gösterir; Tohumlardaki aflatoksin kontaminasyonu, yalnızca yer fıstığı kuraklığa bağlı tohum dehidrasyonu nedeniyle fitoaleksin sentezi kapasitesini kaybettiğinde tespit edildi. Başka bir saha deneyi seti, fitoaleksin üretimi ile tarımsal açıdan önemli yer fıstığı hastalıklarına karşı yer fıstığı genotip direnci arasındaki ilişkiyi doğruladı17.

Mantar istilasına karşı yer fıstığı direncinin doğal fitoaleksin bazlı mekanizmasının daha iyi anlaşılması, aflatoksin kontaminasyonunun kontrolü için umut verici bir stratejidir 15,17.Bu nedenle, aflatoksin analizlerine ek olarak, aynı tohumların fitoaleksinler için kantitatif olarak analiz edilmesi önemlidir. Bu direnç mekanizması tam olarak araştırılmamış ve anlaşılmamış olsa da, mantara dayanıklı yeni çeşitler için yer fıstığı bitkilerinin ıslahı ve genetik olarak değiştirilmesi için çok önemlidir23. Farklı ürünlerde aflatoksin tayini için çeşitli analitik prosedürlerin varlığına rağmen, özellikle geleneksel yöntemlerin analitik ve maliyet etkin gereksinimleri karşılamadığı durumlarda, belirli araştırmalar için hala basit yöntemlere ihtiyaç vardır. Yer fıstığı endüstrisi, tarım ve özel laboratuvarlar tarafından kullanılan modern temizleme yöntemlerinin çoğu antikor bazlı24 ve immünoassay 25,26,27 cihazlarıdır. Seçici ve hassastırlar, ancak yaygın adsorbanlarla dolu mini sütunlardan önemli ölçüde daha pahalıdırlar. Ek olarak, bu yöntemlerin hiçbiri birkaç miligram ağırlığındaki numunelerin analizi için tasarlanmamıştır. Magnezyum silika jel (Florisil) ile paketlenmiş mini kolonların28 analitik kullanımına ilişkin önceki araştırmamıza dayanarak, bu prosedürü devam eden ve ileriye dönük ön ıslah ve ıslah programlarının ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirdik.

Bu çalışmanın amacı, tek yer fıstığı tohumlarında aflatoksinlerin ve fitoaleksinlerin kantitatif tayini için tahribatsız, orta verimli, çevre dostu bir yöntem geliştirmekti. Böyle bir yöntem geliştirilmiştir. Yayınlanmış yöntemlere göre avantajları, daha yüksek hassasiyet, aflatoksinleri ve fitoaleksinleri tek tohum ekstraktında analiz etme yeteneği, numuneleri tartma ihtiyacının olmaması ve daha küçük hacimli sarf malzemeleri sayesinde daha düşük maliyettir. Entegre yöntemin akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Genetik analizler ve diğer adımlar bu metinde belirtilmiş ve önerilen yöntemin önemini ve tüm prosedürle nasıl entegre edildiğini göstermek için şekilde gösterilmiştir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mantar mücadelesi için tohumların hazırlanması

  1. Aflatoksijenik Aspergillus flavus NRRL 3357'yi bir test tüpünde 30 ° C'de 6 gün boyunca eğimli bir Patates Dekstroz Agar (PDA) üzerinde inkübe edin. Tween 20 (1 L damıtılmış steril suda 100 μL Tween) ile 10 mL su ile test tüpünden mantar sporlarını hasat edin, bir huniye yerleştirilmiş cam yününden süzün ve sporları kullanım kılavuzuna bakarak bir hemositometre ile sayın.
  2. Spor süspansiyonunu steril su ile 1.000 spor / μL konsantrasyonuna seyreltin. Konsantrasyonu bir hemositometre ile onaylayın.
    NOT: Spor süspansiyonunu zorlu deneylerden en geç 2 saat önce hazırlayın.
  3. Fıstık kabuklarını yavaşça kırın ve kabuklarını çıkarın. Tohumları, tohum hacmi beher hacminin 1 / 5'ini geçmeyecek şekilde steril bir behere yerleştirin, beher hacminin yaklaşık% 70'ine% 0.05 hidrojen peroksit çözeltisi ekleyin ve tohumların 3 saat boyunca su emmesine izin verin.

figure-protocol-1




figure-protocol-2

figure-protocol-3



figure-protocol-4





Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tohumlarda aflatoksin miktar tayini için geliştirilen yöntem, yabani yer fıstığı türlerinin aflatoksin birikimine direnç açısından değerlendirilmesi prosedürünün tamamının özüdür. Özel olarak paketlenmiş mini sütunlar ve filtreler, büyük hacimli solventlerin olmaması, maliyetli ve gereksiz 0,22 veya 0,45 μm ticari filtreler ve pompalama cihazları nedeniyle önemli ölçüde tasarruf sağlar ve genel prosedürü basitleştirir. Aflatoksin analizleri yöntemi, Tablo 1'de görüldüğü gibi öğütülmüş tohumlardan test edilen 1.0-50.0 ng/g aflatoksin aralığında yüksek geri kazanım, doğruluk ve hassasiyet sağlar. Yüksek derecede kontamine olmuş numuneler, doğrusal test edilen değere seyreltildi. Şekil 5C , dört ana aflatoksinin, B1, B2, G1 ve G2'nin 5 dakikalık elüsyon süresi içinde temel olarak ayrılmasını göstermektedir, bu da yer fıstığı tohumlarının mantar mücadelesi prosedürün sınırlayıcı aşaması olduğundan ve UPLC analizlerinden değil, kabul edilebilir.

Önerilen yöntem, aflatoksin B1 için 2 pg'lik bir kantitasyon limiti ile yeterince hassastır (Şekil 5D). Ekstraktların yüksek saflığı, yabani bir Arachis türüne sahip bir tarladan hasat edilen saflaştırılmış tohum ekstraktının bir UPLC'sinden (Şekil 5E) görüldüğü gibi aflatoksinlerin kesin olarak ölçülmesine izin verir. Daha önce yayınlanmış bir mini sütun yöntemi29, önerilen yönteme (Şekil 5G) kıyasla mantarla mücadele edilen yer fıstığı tohumları (Şekil 5F) için tatmin edici saflık elde etme yeteneğine sahip değildir. Şekil 5F'den, aflatoksinler B2, G1 ve G2'nin, birçoğu aflatoksinlerden sonra ayrıştırılan stilbenoid fitoaleksinler ve mantar metabolitleri olan yüksek konsantrasyonlarda enterferans yapan safsızlıkların varlığı nedeniyle güvenilir bir şekilde tespit edilemediği ve miktarının belirlenemediği açıktır. Buna karşılık, Şekil 5G, magnezyum silika jel kolonunun aflatoksin fraksiyonundaki safsızlıkların giderilmesindeki yüksek verimliliğini göstermektedir. Mavi kromatogram, kolondan 1 mL metanol-su (90:10) karışımı ile yıkanan enterferans yapan safsızlıkları sunar; siyah kromatogram, aflatoksinler M1 ve B1'in gizlenmemiş zirvelerini gösterir. Bu kromatogram, zorlu bir yabani tür tohumunun ekstraktını temsil eder. Aflatoksin B1 seviyesi 48 ng/g'dır.

Yer fıstığı fitoaleksinlerinin kantitasyonu, bir tarladan elde edilen doğal bir tohum veya mantarla mücadele eden bir tohum olabilen aynı tohumdaki aflatoksinlerin analizlerine değerli bir katkı sağlar. Şekil 5H, zorlu bir tohumdan elde edilen fıstık savunma stilbenoidlerinin tipik bir kromatogramını göstermektedir. Bileşiklerin ayrılması, aflatoksin analizleri için kullanılan aynı analitik kolon kullanılarak gerçekleştirilir. Kolon ve seçilen kromatografik koşullar, stilbenoidlerin güvenilir bir şekilde kantitasyonuna izin veren piklerin tatmin edici bir şekilde ayrılmasını sağlar. Sorunlu tohumlarda aflatoksin-fitoaleksin ilişkisinin değerlendirilmesi bu sunumun kapsamı dışındadır ve yöntem burada, yazarların laboratuvarında birkaç yıldır kullanılan ve yararlı olduğu kanıtlanmış potansiyel bir araştırma aracı olarak önerilmektedir.

figure-results-6
Şekil 6: Majör aflatoksinlerin ve stilben türevi yer fıstığı fitoaleksinlerinin yapıları. (A) Majör aflatoksinlerin yapıları: 1, B, 1; 2, B, 2; 3, G1; 4, G2. (B) Başlıca stilben türevi yer fıstığı fitoaleksinlerinin yapıları: 6, resveratrol; 7, Araşidin-1; 8, Araşidin-2; 9, Araşidin-3; 10, IPD (3 "-izopentadienil-3,5,4" -trihidroksistilben); 11, SB-1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Spike seviyesia
(ng/g)		Aflatoksinler
B1B2G1G2
5085.87 (0.97)82.33 (0.67)86.63 (2.89)84.01 (0.86)
591.43 (2.76)87.32 (0.47)88.08 (2.08)87.73 (0.77)
181.21 (3.16)85.33 (1.98)81.76 (4.66)88.46 (3.24)

Tablo 1: Florisil sütunu ve 1.2 mL aflatoksin fraksiyonu elüsyon karışımı kullanılarak yer fıstığı tohumlarından aflatoksinlerin geri kazanımı. [ortalama (SD), %; n = 5]. Georgia 06G yer fıstığı çeşidine ait aflatoksin içermeyen öğütülmüş numuneler (50 g), 50, 5 veya 1 ng/g seviyesinde aflatoksin stok çözeltisi içeren bir mikro şırınga yardımıyla eşit şekilde çivilenmiş ve oda sıcaklığında 16 saat bekletilmiştir . Aflatoksinler B1 ve G1 için ani değerler verilmiştir; aflatoksinlerB2 ve G2 için 0.33 çarpma faktörü kullanılmalıdır.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki deneyimlerimize28 dayanarak, Aspergillus'a dirençli türleri tanımlamak ve bu fırsatçı mantara karşı yeni genetik direnç kaynaklarını belirlemek ve karakterize etmek için yabani Arachis germplazm koleksiyonlarının araştırılması için uygun, basit, ucuz, çevre dostu, kimyasal bir prosedür geliştirdik. Bu yöntem, katı faz ekstraksiyonu (SPE) tekniği ile tohum ekstraktı saflaştırmasına ve Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC) ile aflatoksin miktar tayinine dayanır ve yeterince yüksek geri kazanım, hassasiyet ve doğruluk ile karakterize edilir. Önerilen "Florisil" yöntemi, aflatoksinleri28 güçlü ve seçici bir şekilde tutmak için Florisil'in (magnezyum silika jel) benzersiz özelliğine dayanan tek mini sütun temizleme prosedürünün bir modifikasyonudur. Orijinal yöntemde olduğu gibi, tohum örnekleri MeOH-H2O karışımı ile ekstrakte edildi, ancak yayınlanan 80:20 (h / v) ile karşılaştırıldığında 90:10 (h / v) gibi farklı bir oranda. Bu değişiklik, aynı aflatoksin geri kazanım hızı ile solventlerin temizleme kolonundan akış hızını 2,5 kata kadar artırmıştır. Bu 90:10 (h/h) metanol-su karışımı, 1 g substratta 5-50 ng aflatoksin konsantrasyonlarına eşdeğer başak seviyelerinde ekstraksiyon çözücüsüne eklenen aflatoksinler B1, B2, G1 ve G2 standartlarının yaklaşık %100 geri kazanımını sağladı ve ayrıca çivili fıstık tohumu örneklerinden yeterince yüksek geri kazanımlar sağladı (Tablo 1).

Aflatoksinlerin Florisil adsorbandından sadece büyük hacimlerde aseton30, aseton-metanol31,32 ve aseton-su karışımları 33,34,35,36 ile ayrıştırılabileceği gösterilmiştir. Bu araştırma sırasında, asitleştirilmiş asetonitrilin, Florisil'den aflatoksinleri ayrıştırma kabiliyetinde asetona benzer şekilde davrandığını keşfettik. Bildiğimiz kadarıyla, asetonitrilin bu özelliği literatürde bildirilmemiştir. Bu özelliğin keşfi, saflaştırılmış ekstraktın doğrudan UPLC sistemine enjekte edilmesine izin verir, bu da hazırlama süresini önemli ölçüde azaltan solvent buharlaştırma adımını atlayabilir. Asetonitril aseton (aseton-asetonitril-su-%88 formik asit (65:31:3.5:0.5, h/v)) ile karıştırıldığında bile, saflaştırılmış elüatlardan suyun pürüzsüz, eksiksiz ve hızlı bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlayarak çözücü buharlaşma süresini önemli ölçüde azalttı. Asetonitrilin varlığı, iki ek yıkama çözücüsünün, metanol ve kloroform-metanol karışımının gerekli olduğu yayınlanmış bir yönteme kıyasla, Florisil kolonundaki safsızlıkları etkili bir şekilde gidermek için tek bir çözücü, metanol-su (90:10, v/h) karışımının kullanılmasına izin verdi. 28

Ortalama olarak, aflatoksinlerin elüsyonu için 1.2 mL kullanıldığında aflatoksin B1 standart geri kazanımı ~% 98 idi. 50 mg Florisil miktarı, 1.2 mL elüsyon çözücüsünün mini sütunu namlunun tepesine kadar doldurması ve aynı zamanda tatmin edici bir geri kazanım sağlaması için seçildi (Tablo 1). Bu yaklaşım, kolon varilinin yalnızca bir kez doldurulması gerektiğinden temizleme prosedürünü hızlandırır. Bu projenin ilk aşamalarında, nispeten büyük bir parçacık boyutuna, 100-200 ağa sahip ticari bir Florisil fraksiyonunun, adsorbanın sadece 3 mm'lik bir katmanını tutan küçük bir kolon için uygun olup olmayacağı açık değildi. Bu nedenle, ABD standart test elekleri 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 ve >400 mesh kullanılarak ticari 100-200 mesh ürününden elde edilen farklı Florisil fraksiyonlarını araştırdık. Tüm bu fraksiyonlar, tatmin edici bir geri kazanım ile tekrarlanabilir, neredeyse eşleşen sonuçlar sağladı. Daha küçük parçacık boyutu fraksiyonları, UV ışığı altında kolonda daha dar aflatoksin bantları göstermesine rağmen, bu fraksiyonlar, ticari 100-200 gözenekli üründen hiçbir şekilde üstün değildi. Ek olarak, 100-200 ağ fraksiyonu, tüm prosedür için en kısa elüsyon sürelerini (8-12 dakika) gösterdi.

Gradyan UPLC çözücü dağıtımı, aflatoksinlerin tatmin edici bir şekilde ayrılmasına ve ayrıca polar olmayan safsızlıkların kolondan tamamen uzaklaştırılmasına izin verdi (Şekil 5G). Bu yaklaşım, kusursuz kolon çalışmasına ve yüzlerce numunenin analizinin tekrarlanabilir sonuçlarına yol açtı. Florisil sütunundan çıkarılan aflatoksinlerin kimliği daha önce açıklandığı gibi doğrulandı. 28 Burada kullanılan 3 mm çaplı analitik UPLC kolonu, aynı kimyanın 2,1 mm çapındaki kolonuna kıyasla daha yüksek konsantrasyonlarda aflatoksinler B1, B2, G1 ve G2'nin daha yüksek seçicilik ve daha güvenilir bir şekilde ayrıldığını göstermiştir. Ayrıca, 3 mm'lik kolonun uzun ömürlülüğü (1.200'den fazla enjeksiyon), 2.1 mm'lik kolonun (800 enjeksiyona kadar) ömründen önemli ölçüde daha yüksekti. 3 mm'lik kolon daha yüksek bir mobil faz oranı (%40 daha fazla) gerektirse de, bu dezavantaj kolonun yukarıdaki avantajlarından daha iyi performans gösterdi.

Florisil mini kolonu, Aspergillus metabolitleri ile yoğun şekilde kontamine olmuş yer fıstığı tohumlarının ekstraktlarının saflaştırılması için etkiliydi (Şekil 5G); Bu tür tohumlar ayrıca mantar istilasına yanıt olarak tohumlar tarafından üretilen yüksek seviyelerde stilbenoid fitoaleksin içeriyordu. Tüm bu safsızlıklar, tohumlardaki aflatoksin konsantrasyonunu 106 kat22'ye kadar aşabilir ve bu da bu tohumları aflatoksin analizleri için zorlu nesneler haline getirir. Şekil 5G , aflatoksin tutma süreleri içinde kromatogramda enterferans yapan piklerin eksikliğini göstermektedir, bu da aflatoksin tespitini ve kantitasyonunu test edilen tüm seviyelerde tavizsiz hale getirmiştir (Tablo 1). Tablo 1'de görüldüğü gibi, yöntemin doğruluğu ve kesinliği, aynı zamanda aflatoksin tespiti için en kritik aralık olan test edilen 1.0-50.0 ng/g aralığında yeterince yüksekti. Çeşitli yabani fıstık genotipleri için farklı seviyelerdeki geri kazanımlar tekdüzeydi ve beş farklı ekstraksiyon için standart sapmalar esasen düşüktü.

Yöntem ayrıca, 10.000 ng / g'ın üzerinde toplam aflatoksinler içeren sıfırdan son derece yüksek seviyelere kadar doğal olarak kontamine olmuş yer fıstığı, pamuk, mısır ve pirinç tohumları üzerinde de test edildi. Mısır, pamuk tohumu ve pirinçten 5 ng/g düzeyinde aflatoksin B1, B2, G1 ve G2 geri kazanımı sırasıyla %76.1 ile %93.7, %77.1 ile %86.6 ve %90.5 ile %96.2 arasında değişmiştir. Pirinçten aflatoksinlerin en yüksek geri kazanımına, eluentin "saflığı", yani neredeyse herhangi bir safsızlık eksikliği eşlik etti. Ayrıca, pirinç, ortalama olarak 19 mg / tohum test edilen en küçük tek nesneyi temsil etti.

Bir Florisil sütunu kullanılarak tek bir fıstık tohumu için (bombardıman, tartma, ekstraksiyon, santrifüjleme ve saflaştırma dahil) toplam hazırlama süresi 20 dakikayı geçmedi. Florisil mini sütununun maliyeti, ticari temizleme sütunlarından >10 kat daha azdır. Yayınlanan prosedüre kıyasla daha düşük hacimlerde adsorban, çözücü ve nitrojen gazı kullanılmasından ek tasarruf sağlanır28. Mini kolon, çalışması için pompalama veya vakum cihazları gerektirmez ve belirsiz bir raf ömrüne sahiptir.

Bitki germplazmını aflatoksinlere direnç açısından araştırmak son derece zordur çünkü mikotoksin birikimi normal bir dağılım izlemez37,38; Bu olgunun üstesinden gelmek için tek tohumlarda çok sayıda aflatoksin analizine ihtiyaç vardır. Aflatoksin içeriğinin yanı sıra, kantitatif fitoaleksin bileşimi ile ilgili bilgiler, tek bir tohumdan elde edilebilecek (Şekil 1A) ve belirli bir bitkiye kadar izlenebilecek (Şekil 1E) geniş bir bilgi birikimi ışığında oldukça değerlidir. Yöntem, arazi ırkları, gelişmiş ıslah hatları ve elit fıstık çeşitleri dahil olmak üzere yüzlerce katılımı taramak için başarıyla kullanılmıştır. Yöntem, yer fıstığı ön ıslah ve ıslah araştırma programlarında kullanılmak üzere önerilmektedir ve mantar direnci için yer fıstığı genlerinin karakterizasyonuna yardımcı olabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, USDA-ARS CRIS projesi 6044-42000-011-00D ve CRIS projesi 6044-21000-005-000-D tarafından mali destek almıştır. Mini sütun tutma rafını yaptığı için Dan Todd'a teşekkür ederiz. Bu makalede ticari adlardan veya ticari ürünlerden bahsedilmesi, yalnızca belirli bilgiler sağlama amaçlıdır ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onay verildiği anlamına gelmez.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Aseton, Optima FisherScientificA929-4
Asetonitril, OptimaFisher ScientificA996-4
Beraat BEH C18 2.1 x 5mm Van-Guard sütun öncesiWaters Corporation186003975
Beraat BEH C18 3 x 100mm sütunWaters Corporation186004661
Beraat BEH C18 2.1 x 100mm sütunSular Şirketi
Aflatoksinler B1, B2, G1 ve G2Sigma-AldrichA9441-1VL5 & mikro elde etmek için ticari şişenin içeriğini 5 mL metanol içinde çözün; aflatoksinler B1 ve G1 ve 1.5 & mikro için g / mL; B2 ve G2 için g / mL
Aflatoksin B1 (1mg)Sigma-AldrichA6636-1MG
Aflatoksin B2 (1mg)Sigma-AldrichA9887-1MG
Aflatoksin G1 (1mg)Sigma-AldrichA0138-1MG
Aflatoksin G2 (1mg)Sigma-AldrichA0263-1MG
Aflatoksin M1 (10 & mikro; g)Sigma-AldrichCRM46319
Agar, Granül (2kg)Becton DickinsonBD214510
Alümina oksit bazik (60-325 mesh)Fisher ScientificA941-500
Bazal ortaMurashige ve SkoogM5519
Boncuk Ruptor 24 & nbsp;Omni International19-042E Beher
(1000mL)Corning (Pyrex)10001L
Beher (250mL)Corning (Pyrex)1000250
Beher (400mL)Corning (Pyrex)1000400
Beher (600mL)Corning (Pyrex)1000600
Bıçak, neşterTüy#10
Santrifüj (LSE Kompakt)CorningModel: 6755
Santrifüj, mikroCorning Model: 6770
Seramik boncuklar (2,8 mm)Omni International19-646
Seramik boncuklar (6,5 mm)Omni International19-682
Chromeleon 7 serisi YazılımThermo Scientific
Matkap ucuKyocera078961,6 mm
Matkap ucuKyocera073572,0 mm
Matkap ucuKyocera079852,34 mm
Etanol (200 geçirmez)Decon Labs2805M
Evaporatör, nitrojenorganimation111066 konumlu
Excel, MicrosoftMicrosoftOffice 365
Filtre kağıdı (# 3)Cytiva Whatman1004-090
Filtre kağıdı kesici, paslanmaz çelik (ID 11,5 mm)Bilinmiyor Filtre
kağıdı, cam elyafCytiva Whatman934-AH
Şişe (2800mL)Corning (Pyrex)44202XL
Florisil (100-200 ağ)Fisher ScientificF101-500
ForsepsIntegra Lifescience ( Miltex)PM-0300
Formik asit (%88, ACS)Fisher ScientificA118P-500
Dondurucu (-80oC)Fisher ScientificTSX70086D
Hunisi (15 x 80mm)DWK Yaşam Bilimleri (Kimax)2902060
Gelzan (orta)Caisson Labs G024
Cam çubuk (ısmarlama)Özel yapım
Cam yünüCorning (Pyrex)3950
Sap, neşter ve nbsp;Tüy# 7
HemositometreHausser Scientific3100
Hidrojen peroksitFisher ScientificH325-4%30, Sertifikalı ACS
Buz kovası, kapaklı yuvarlakCorning432122
Kuluçka MakinesiPercival136VL
Kimtech BİLİM Markası KimwipesKimtech341208.2" x 4.39 "
Kimtech SCIENCE Marka KimwipesKimtech3425616.4" x 14.43 "
Laboratuvar önlüğüCenmedB113660SBXL
Metanol, OptimaFisher ScientificA454-4
Mini sütun rafı (özel)Özel yapım
Mikser, dokunmatik (maxi mix II)Termolyne37600 (model 231)
Nitril eldiven &MicroflexXC310M
Azot gazı, sıkıştırılmış (ultra yüksek saflıkta)Jones Kaynak
Kağıt havluGeorgia-Pacific20023 (D400)
pH metreFisher Scientific (Accumet)13-636-AB15
pH/ATC elektrotFisher Scientific (Accumet)13-620-111
PhCR Fotokimyasal ReaktörSular (Vicam)600001222
Pipet, pastörFisher Scientific13-678-20D9"
Pipetleyici (1 mL) (Referans 2)Eppendorf4924000088
Pipetleyici (10 μ L) (Referans)Eppendorf022470051D
Pipet uçları: 10 μ L, 200 μ L, 1 mLEppendorfF144054M
Pipetleyici (200 & mikro; L)(Ergofit) Fisher Scientific12-146-679
Tabak, petri (100x15mm)Fisher ScientificFB0875713
Patates Dekstroz Agar (500g)Becton Dickinson   
Takviyeli boncuk tüpü (2 mL)Omni International19-660
Takviyeli boncuk tüpü (7 mL)Omni International19-651
Repipetör, Dispensette III (10mL)Brandtech4701141
ResveratrolSigma-AldrichR5010-100MG
Kepçe (ısmarlama)Özel yapım
vidalı kavanoz (250 mL) Corning (Pyrex)1395250
Silika jel, küresel (200-400 mesh) Supelco97727-U100 g
Sodyum HidroksitFisher ScientificS318-500
SPE özü temiz 1,5 mL polipropilen kolon Amerikan Kromotografi MalzemeleriSP-5122382
SPE özü temiz PP frits (1,5 mL mini sütun için)Amerikan Kromotografi MalzemeleriSP-3119414
Spektrofotometre, UV görünürFisher Scientific14-385-351 (Genesys 50)
Test tüpüCorning (Pyrex)982516X16x125mm
Test tüpü (Tek Kullanımlık)(16x125mm)Fisher Scientific14-961-31
Test tüpü (Tek kullanımlık)(150x250mm)Fisher Scientific14-961-34
Thermo Vanquish DAD dedektörü (UPLC)Thermo ScientificVF-D11-A-01
Thermo Vanquish Fluourescense dedektörü (UPLC)Thermo ScientificVF-D51-A
Thermo Vanquish kuaterner pompa F (UPLC)Thermo ScientificVF-P20-A
Thermo Vanquish Split Numune Alıcı FT (UPLC)Thermo ScientificVF-A10-A-02
Tween 20 (polisorbat 20) (enzim sınıfı)Fisher ScientificBP337-500
Flakon kapakları (4 mL)Fisher ScientificC4015-75A
Flakon kapakları (otomatik numune alma cihazı)Fisher ScientificC4010-60A
Şişeler ve kapaklar (16 mL)Thermo ScientificB7800-4
Şişeler, cam (4 mL)Fisher ScientificC4015-1
Şişeler, polipropilen (otomatik numune alma cihazı) (400 mL)Fisher ScientificC4010-11
Su, Optima Balıkçı BilimselW6-4
186002352BD213400

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Janila, P., et al. Molecular breeding for introgression of fatty acid desaturase mutant alleles (ahFAD2A and ahFAD2B) enhances oil quality in high and low oil containing peanut genotypes. Plant Sci. 242, 203-213 (2016).
  2. Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells. Toxins (Basel). 5 (8), 1447-1461 (2013).
  3. American Association for Cancer Research: AACR. An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20. Cancer Res. 40 (1), 1-12 (1980).
  4. Turner, P. C. The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth. Scientifica. , 21(2013).
  5. Williams, J. H., et al. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. Am. J. Clin. Nutr. 80 (5), 1106-1122 (2004).
  6. van Egmond, H. P., Jonker, M. A. Worldwide regulations on aflatoxins. Aflatoxinandfood safety. Abbas, H. K. , Taylor and Francis. Baca Raton, Florida. 77-93 (2005).
  7. European Commission. Commission Regulation (EC) 1525/98. Off. J. Eur. Comm. L. 201, 43-46 (1998).
  8. Bressano, M., et al. Introgression of peanut smut resistance from landraces to elite peanut cultivars (Arachis hypogaea L). PLoS ONE. 14 (2), e0211920(2019).
  9. de Blas, F. J., et al. Identification of smut resistance in wild Arachis species and its introgression into peanut elite lines. Crop Sci. 59 (4), 1657-1665 (2019).
  10. Mallikarjuna, N., Pande, S., Jadhav, D. R., Sastri, D. C., Rao, J. N. Introgression of disease resistance genes from Arachis kempff-mercadoi into cultivated groundnut. Plant Breeding. 123 (6), 573-576 (2004).
  11. Moretzsohn, M. C., et al. Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome. BMC Plant Biol. 4, 1-10 (2004).
  12. Arias, R. S., et al. New tools to screen wild peanut species for aflatoxin accumulation and genetic fingerprinting. BMC Plant Biol. 18 (1), 170(2018).
  13. Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts. Mycopathologia. 105 (2), 117-128 (1989).
  14. Paxton, J. D. Biosynthesis and accumulation of legume phytoalexins. Mycotoxins and phytoalexins. Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. , CRC Press. Boca Raton, Florida. 485-499 (1991).
  15. Cole, R. J., Dorner, J. W. Peanut phytoalexins. Mycotoxins and phytoalexins. Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. , CRC Press. Boca Raton, Florida. 501-509 (1991).
  16. Subba Rao, P. V., Strange, R. N. Chemistry, biology, and role of groundnut phytoalexins in resistance to fungal attack. Handbook of phytoalexin metabolism and action. Daniel, M., Purkayastha, R. P. , Marcel Dekker. New York. 199-227 (1995).
  17. Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes. J. Agric. Food. Chem. 55 (6), 2195-2200 (2007).
  18. Paxton, J. Phytoalexins: a working redefinition. J. Phytopathol. 101, 106-109 (1981).
  19. Mansfield, J. W. The role of phytoalexins in disease resistance. Phytoalexins. Bailey, J. A., Mansfield, J. W. , John Wiley. New York. 153-288 (1982).
  20. Strange, R. N. Resistance: the role of the hypersensitive response and phytoalexins. Plant response to foliar pathogens. Ayers, P. G. , Biosis Scientific. Oxford. 39-56 (1992).
  21. Sobolev, V. S., et al. Biological activity of peanut (Arachis hypogaea) phytoalexins and selected natural and synthetic stilbenoids. J. Agric. Food Chem. 59 (5), 1673-1682 (2011).
  22. Sobolev, V. S. Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus Species. J. Agric. Food Chem. 56 (6), 1949-1954 (2008).
  23. Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain. J. Agric. Food Chem. 57 (1), 62-68 (2009).
  24. Trucksess, M. W., et al. Immunoaffinity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography postcolumn derivatization for determination of aflatoxins in corn, peanuts, and peanut butter: collaborative study. J. AOAC Int. 74 (1), 81-88 (1991).
  25. Dorner, J. W., Blankenship, P. D., Cole, R. J. Performance of two immunochemical assays in the analysis of peanuts for aflatoxin at 37 field laboratories. J. AOAC Int. 76 (3), 637-643 (1993).
  26. Stroka, J., Anklam, E. Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste, fig paste, and paprika powder: collaborative study. J. AOAC Int. 83 (2), 320-340 (2000).
  27. Pal, A., Acharya, D., Saha, D., Roy, D., Dhar, T. K. In situ sample cleanup during immunoassay: a simple method for rapid detection of aflatoxin B1 in food samples. J. Food Prot. 68 (10), 2169-2177 (2005).
  28. Sobolev, V. S. Simple, rapid, and inexpensive cleanup method for quantitation of aflatoxins in important agricultural products by HPLC. J. Agric. Food Chem. 55 (6), 2136-2141 (2007).
  29. Sobolev, V. S., Dorner, J. W. Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography. J. AOAC Int. 85 (3), 642-645 (2002).
  30. Levi, C. P., Borker, E. Survey of green coffee for potential aflatoxin contamination. J. AOAC. 51 (3), 600-602 (1968).
  31. Levi, C. P. Collaborative study on a method for detection of aflatoxins B1 in green coffee beans. J. AOAC. 52 (6), 1300-1303 (1969).
  32. Scott, P. M. Note on analysis of aflatoxins in green coffee. J. AOAC. 51, 609(1968).
  33. Bicking, M. K. L., Kniseley, R. N., Svec, H. J. Coupled-column system for quantitating low levels of aflatoxins. J. AOAC. 66 (4), 905-908 (1983).
  34. Kamimura, H., et al. Simple, rapid cleanup method for analysis of aflatoxins and comparison with various methods. J. AOAC. 68 (3), 458-461 (1985).
  35. Hoogenboom, L. A., et al. Genotoxicity testing of extracts from aflatoxin-contaminated peanut meal, following chemical decontamination. Food Addit. Contam. 18 (4), 329-341 (2001).
  36. Castro, L., Vargas, E. A. Determining aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in maize using Florisil clean up with thin layer chromatography and visual and densitometric Quantitation. Cienc. Tecnol. Ailment. Campinas. 21, 115-122 (2001).
  37. Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev, V. S. RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem. J. Vis. Exp. (106), e53398(2015).
  38. Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots. Peanut Sci. 31 (1), 59-63 (2004).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Aflatoksin KantifikasyonuSPE UPLC Y ntemiYer F st Tohumu AnaliziAspergillus DirenciYabani Arachis GermplazmasFitoaleksin EkstraksiyonuMagnezyum Silika JelTohum Canl lMikotoksin Profillendirme

İlgili makaleler