Yöntem makalesi

13C 6-LC-MS ile İlişkili Glikoz Etiketlemesi: İkincil Metabolit Sentezinde Bitki Birincil Organlarının Tanımlanması

1.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66578

⸱

22 Mart 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Pharmacy, Ya'an People's Hospital

Bu makalede

Özet

Sıvı kromatografisi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile birleştirilmiş 13C6-Glikoz etiketleme yöntemi çok yönlüdür ve tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezinde yer alan birincil organlar ve yollar ile bu ikincil metabolitlerin kapsamlı kullanımı hakkında gelecekteki çalışmaların temelini oluşturur.

Özet

Bu makale, ikincil metabolit sentezinde yer alan birincil organları sertifikalandırmak için yeni ve etkili bir yöntem sunmaktadır. Paris'teki en önemli ikincil metabolit olarakpolyphylla var. yunnanensis (Franch.) El. (PPY), Paris saponin (PS) çeşitli farmakolojik aktivitelere sahiptir ve PPY artan talep görmektedir. Bu çalışma, Paris saponinleri VII (PS VII) sentezinde yer alan birincil organları kesin olarak sertifikalandırmak için yaprak, rizom ve kök-vasküler-demet 13C6-Glikoz besleme ve besleme dışı dört tedavi oluşturmuştur. Sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) birleştirilerek, farklı tedavilerde yaprak, rizom, gövde ve kökün 13C/12C oranları hızlı ve doğru bir şekilde hesaplandı ve dört tip PS izotopik iyon tepe noktası (M-) oranı bulundu: (M+1) -/M-, (M+2) -/M-, (M+3) -/M− ve (M+4) -/M−. Sonuçlar, kök-vasküler-demet ve rizom besleme tedavilerinin rizomlarındaki 13C/12C oranının, besleme dışı tedaviye göre anlamlı derecede yüksek olduğunu göstermiştir. Yemsiz tedavi ile karşılaştırıldığında, yapraklardaki PS VII moleküllerinin (M+2) −/M− oranı, yaprak ve gövde-vasküler-demet besleme uygulamaları altında önemli ölçüde artmıştır. Aynı zamanda, beslemesiz tedavi ile karşılaştırıldığında, köksap tedavisi altındaki yapraklardaki PS VII moleküllerinin (M + 2) - / M - oranı önemli bir fark göstermedi. Ayrıca, gövde, kök ve köksaptaki PS VII moleküllerinin (M+2) −/M− oranı dört tedavi arasında fark göstermedi. Yemsiz muamele ile karşılaştırıldığında, yaprak besleme muamelesi altındaki yapraklarda Paris saponin II (PS II) molekülünün (M+2) −/M− oranı önemli bir fark göstermedi ve yaprak besleme muamelesi altındaki yapraklarda PS II moleküllerinin (M+3) -/M- oranı daha düşüktü. Veriler, PS VII'nin sentezlenmesi için birincil organın yapraklar olduğunu doğruladı. Tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezinde yer alan birincil organların ve yolların gelecekte tanımlanması için temel oluşturur.

Giriş

Bitkilerdeki ikincil metabolitlerin biyosentetik yolları, oldukça spesifik ve çeşitli birikim organlarını içeren karmaşık ve çeşitlidir1. Şu anda, birçok tıbbi bitkide ikincil metabolitler için spesifik sentez bölgeleri ve sorumlu organlar iyi tanımlanmamıştır. Bu belirsizlik, tıbbi materyallerin hem verimini hem de kalitesini optimize etmek için tasarlanmış yetiştirme yöntemlerinin stratejik ilerlemesi ve uygulanmasının önünde önemli bir engel teşkil etmektedir.

Moleküler biyoloji, biyokimyasal ve izotop etiketleme teknikleri, tıbbi bitkilerde 2,3,4,5 ikincil metabolitlerin sentez yollarını ve bölgelerini çözmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bu metodolojilerin her biri, verimlilik ve doğruluktaki farklılıklar gibi benzersiz güçlü yönler ve sınırlamalar sergiler. Örneğin moleküler biyoloji yaklaşımları, biyosentetik yollar içindeki bölgeleri tam olarak belirlemede yüksek hassasiyet sunar, ancak özellikle zaman yoğundur. Faydaları, halka açık genomik dizilerden yoksun türler için daha da kısıtlanır ve bu teknikleri bu tür durumlar için daha az uygulanabilir hale getirir6. Buna karşılık, 3C / 12C, 2H / 1H ve 18O / 16O gibi izotopik oranları kullanan izotop etiketleme teknikleri, ikincil metabolitlerinsentezi, taşınması ve depolanması mekanizmalarını araştırmak için hızlı ve erişilebilir bir yol sağlar 7,8. Yapraklardaki organik bileşiklerin ve kararlı izotopların mekansal dağılımını ortaya çıkarabilirler, böylece yaprakların yaşam döngüleri boyunca deneyimledikleri çevresel koşulların yeniden yapılandırılmasına izin verirler9. Ayrıca, 13C6-Glikoz 10 ve 13C 6-Fenilalanin11 gibi harici izotopik etiketlerin uygulanması, karbon etiketli ikincil metabolitlerin üretilmesini sağlayarak bunların üretimi ve işlevi hakkındaki anlayışımızı geliştirir.

Geleneksel karbon izotop etiketleme teknikleri, biyosentetik yollarının ve taşıma mekanizmalarının son derece türe özgü doğası nedeniyle ikincil metabolitlerin sentezinden sorumlu spesifik organların belirlenmesinde zorluklarla karşılaşmaktadır. Sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS), ilaçların kimyasal sentezinde eksojen izotopların izlenmesi ve absorpsiyon, dağıtım, metabolizma ve atılım gibi in vivo süreçlerin araştırılması için sağlam bir yöntem sunarak bu alanda çok önemli bir analitik araç olarak öne çıkmıştır12. LC-MS'nin üstün hassasiyeti, basitliği ve güvenilirliği, onu bitkilerde ikincil metabolitlerin üretimini izlemek için ideal bir seçim haline getirir13. Son zamanlarda, LC-MS, farklı numuneler arasında etiketleme verimliliğinin değerlendirilmesini sağlayan harici izotop etiketleme tekniklerindeki uygulaması için giderek daha fazla tercih edilmeye başlanmıştır. Bu metodoloji, tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezinde yer alan birincil organlar hakkında kritik bilgiler sağlar ve bu bileşiklerin sentez organlarını tanımlamak için biyolojik yöntemlere paha biçilmez bir tamamlayıcı olarak hizmet eder14,15. Sonuç olarak, bu yaklaşım sadece çeşitli örnekler arasında etiketleme verimliliklerinin karşılaştırılmasını kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda bitki ikincil metabolitlerinin oluşumunda rol oynayan kilit organlara ışık tutar ve böylece biyosentezleri hakkındaki anlayışımızı geliştirir.

Tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezlenmesinden sorumlu birincil organları tanımlamak için karbon izotop etiketlemesini LC-MS tespiti ile birleştiren yeni bir yöntem tanıttık. Paris saponin (PS), antikanser, immünomodülasyon ve anti-inflamasyon16 gibi çeşitli farmakolojik aktivitelere sahiptir ve PPY artan talep görmektedir17. Bu nedenle, PPY fidelerini araştırma deneği olarak kullandık ve LC-MS yöntemi ile ilişkili 13C 6-Glukoz etiketlemesini kullanarak Paris saponin VII (PS VII) (Şekil 1B) sentezlemek için birincil organın yapraklar olduğunu deşifre ettik. Yaklaşımımız, yaprak, rizom ve kök-vasküler demetlere 13C6-Glikoz beslemesinin yanı sıra beslemeyen bir kontrolü içeren dört farklı tedaviyi içeriyordu. 13C6-Glikoz seçimi stratejiktir, çünkü solunum yoluyla hızlı bir şekilde asetil koenzim A'ya metabolize edilir ve bu da daha sonra PS sentezini kolaylaştırır. 13° C'nin doğal bolluğunu kullanarak, çeşitli bitki organlarındaki 13C / 12C oranlarını değerlendirmek ve PS VII ve Paris saponins II (PS II) (Şekil 1B) moleküllerindeki izotopik iyon tepe oranlarını analiz etmek için bir Gaz Kromatografisi Kararlı İzotop Oranı Kütle Spektrometresi (GC-IRMS) sistemi kullandık. 13C etiketli bitki ikincil metabolit öncüsünden ve en son kütle spektrometresi tekniklerinden yararlanan metodolojimiz, geleneksel karbon izotop etiketleme yöntemlerine daha basit ve daha doğru bir alternatif sunar. Bu yeni yaklaşım, yalnızca tıbbi bitkilerde ikincil metabolit sentezinde yer alan organlar hakkındaki anlayışımızı derinleştirmekle kalmaz, aynı zamanda bu bileşiklerin biyosentetik yollarına yönelik gelecekteki araştırmalar için sağlam bir temel oluşturur.

Protokol

1. Deneysel hazırlık

  1. Bitki büyümesi sırasında seranın bağıl neminin %75, gündüz/gece sıcaklıklarının 20 °C/10 °C olduğundan, fotoperiyodun 12 saat gündüz ve 12 saat geceden oluştuğundan ve ışık yoğunluğunun 100 μmol·m-2·s-1 olduğundan emin olun. LED lamba ile bitki kanopisi arasında 30 cm'lik bir mesafe bırakarak ışık yayan diyot (LED) lambalar aracılığıyla ışınım sağlayın.
    NOT: Fotoperiyot ve ışık yoğunluğu, Yunnan'daki büyüme döneminde güneşlenme saatlerinin sayısına göredir. Işınım rutin olarak bir kuantum sensörü tarafından ölçülür (bkz. Malzeme Tablosu). Tıbbi bitkinin özelliklerine göre çevresel parametrelerde gerekli değişiklikleri yapar. Bu çevresel koşullar, bitkinin özelliklerine ve bölgesel güneş ışığı profiline göre dikkatli bir şekilde kalibre edildikten sonra, deney süresi boyunca bu ortamlarda tutarlılığı korumak çok önemlidir. İlk kurulduktan sonra çevresel parametrelerde keyfi olarak yapılan değişiklikler, deneyin bütünlüğünü ve sonuçların güvenilirliğini tehlikeye atabilir.
  2. Deneyimizin doğruluğunu ve özgüllüğünü sağlamak için hidroponik bir yaklaşım18 kullanın. Yıkanmış 2 yaşındaki PPY fidelerinin (Wenshan, Yunnan Eyaletinden (104 ° 11 "E, 23 ° 04" K) hasat edilmiş) uyum sağlamak için 3 gün boyunca 1/4 standart Hoagland besin çözeltisine daldırıldığından emin olun.
    1. Hoagland'ın besin ( Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisini talimatlara göre hazırlayın; 4 L arıtılmış suya 1.26 g Hoagland tozu ve 0.945 g Kalsiyum nitrat tozu ekleyin. 13C6-Glikoz ( Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisini standart kılavuzda açıklandığı gibi hazırlayın; 100 mL arıtılmış suya veya Hoagland'ın besin çözeltisine 0.2 g 13C6-Glikoz tozu ekleyin.
    2. Hidroponik tankı ve oksijen pompasını hazırlayın (Şekil 2; Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Hidroponik kurulumda, etiketleme için 13C6-Glikoz çözeltisinin kullanılması, toprak mikroorganizmalarının etkisini ortadan kaldırır, böylece çözeltinin tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin hızlı sentezine doğrudan katkıda bulunmasını sağlar. 13C 6-Glikozun bitkiler tarafından emilim koşullarını optimize etmek için, oksijen pompasının akış hızının 4 ila 8 L / dak arasında düzenlenmesi zorunludur. Bu kontrollü akış hızı, fidelerin su yüzeyinin üzerinde yüzmesini önlemek için çok önemlidir, bu da 13C 6-Glikozu etkili bir şekilde emme yeteneklerini önemli ölçüde engelleyebilir. Fidelerin doğru derinliğe batırılmış halde tutulması, etiketleme bileşiğinin verimli bir şekilde alınmasına izin verir, böylece hidroponik sistemdeki metabolit sentez işleminin başarısını sağlar.

2. Karbon etiketleme deneyi işlemi

  1. Yaprakların PS sentezlemek için birincil organ olduğunu göstermek için dört tedavi oluşturun ve PPY'de PS VII ve PS II'nin sentez organlarını ve yollarını izleyin.
    1. Tedavi 1'de, PPY fidesi beslenmez; Tedavi 2'de, PPY fide yapraklarına% 0.2 13 C6-Glikoz püskürtün; Tedavi 3'te, PPY fide rizomlarını %0.2 13 C6-Glikoz ile besleyin; Tedavi 3'te, PPY fidesini gövde insizyonunda %0.2 13 C6-Glikoz ile besleyin (Şekil 2A).
      NOT: Tedavi 1 kontrol grubu olarak ayarlanmıştır. Tedavi 2, yaprakların PS'yi sentezleyebildiğini göstermek için ayarlanmıştır. Tedavi 3 ve 4, rizomların 13C6-Glikoz alabileceğini göstermek için ayarlanmıştır.
    2. Tedavi 1 ve 2'de, PPY fidelerini normal Hoagland'ın besin çözeltisinde kültürleyin. Tedavi 2'nin yapraklarına sabah, öğleden sonra ve akşam bir kez 5 mL% 0.2 13C6-Glikoz çözeltisi püskürtün.
    3. Tedavi 3 ve 4'te, PPY fidelerini Hoagland'ın %0.2 13 C6-Glikoz içeren besin çözeltisinde kültürleyin. Tedavi 4'te, PPY fidelerinin saplarını ortadan kesmek için bir neşter kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız), ancak damar demetlerini bağlı tutun.
    4. Her tedavinin 3 gün boyunca etiketlenmesine izin verin ve besin çözeltisini her 1,5 günde bir değiştirin. Deneyi randomize bir blok tasarımı kullanarak yapın ve her tedaviyi 3 kez tekrarlayın.
      NOT: Yaprakları püskürtürken, püskürtülen yaprakların arkasına emici bir kağıt yerleştirmek önemlidir. Bu, su damlacıklarının aşağıdaki besin çözeltisine düşmesini önler, aksi takdirde deneyin sonuçlarını etkileyebilir. Saplardaki kesiklerin tümü çıkarılmaz, ancak çıplak gözle görülebilen kanallar takılıdır.

3. Numune alma ve hazırlama yöntemleri

  1. 3 günlük 13C6-Glikoz deneyinin sonunda her tedaviden yaprakları, gövdeleri, rizomları ve kökleri ayrı ayrı toplayın. Yüzey kirliliklerini gidermek için toplanan bitki organlarını iyice yıkayın.
    NOT: 13°C bolluğunun yokluğu, yıkamanın temiz olduğunu kanıtlayan yıkama solüsyonunun LC-MS analizi ile bulunabilir19.
  2. Yıkanmış bitki organlarını kurutmak için elektrikli sabit sıcaklıkta bir yüksek kurutma fırını ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın. 30 dakika boyunca 105 ° C'de başlayın ve ardından sabit ağırlığa kadar 60 ° C'ye ayarlayın. Kurutulmuş bitki organlarını tam otomatik bir numune hızlı öğütücü kullanarak toz haline getirin (Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Toz, farklı bitki organlarında PS VII, II ve 13C / 12C oranlarının kantitatif analizi için kullanılır.
  3. Her numune için 30 mg tozu doğru bir şekilde tartmak için bir elektronik analitik terazi kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 2 mL %75 v/v etanol-suya yerleştirin. Bir CNC ultrasonik temizleyici kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 25 ° C'de 20 dakika (60 kHz) ultrasonik ekstraksiyon yapın, 2 kez tekrarlayın; Ekstraksiyon çözeltilerini birleştirin ve üç paralel numune hazırlayın20.
    NOT: Numune ağırlığındaki hatalar en aza indirilmelidir.
  4. Ekstraksiyon çözeltisini kurutmak için nitrojen kullanın, ardından kromatografik metanol içinde 1 mL'lik bir hacme kadar çözün. Enjeksiyondan önce, filtrasyon için 0.22 μm'lik bir organik faz filtresi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın (Şekil 2B).
    NOT: Nitrojen gazı ile fön çekerken ekstraktı üflemeyin; Ekstrakt, safsızlıkların minimum düzeyde karışmasını sağlamak için mikro gözenekli bir zardan geçirilmelidir.

4. LC-MS kurulumu ve çalışması

  1. MS ayarı
    1. Anahtarını açık konuma çevirerek vakum pompasını etkinleştirin. Argon gazı silindirindeki ana valfi açın, ardından yaklaşık 0,3 MPa'lık bir hedef basınç elde etmek için kısmi basınç valfini ayarlayın. Bunu takiben, nitrojen gazı vanasının da açık olduğundan emin olun.
    2. MS kontrol yazılımını başlatın (Malzeme Tablosuna bakın). Yazılım panelindeki ısıtılmış elektrosprey iyonizasyon kaynağına (HESI Kaynağı) tıklayın ve kılcal voltaj (negatif mod için 3.0 kV), kılcal sıcaklık (350 °C), kılıf gazı (N2) akış hızı (35 keyfi birim), yardımcı gaz (N2) akış hızı (15 isteğe bağlı birim) dahil olmak üzere parametreleri girin), PS'nin moleküler kütlesine dayalı tam tarama yoluyla (m/z 100-1.500 arasında çalıştırılır). İyon kaynağını etkinleştirmek için Uygula düğmesine tıklayın.
      NOT: Deney koşulları için yeterli vakum derecesini sağlamak için en az 8 saat bekleyin. Analizden önce argon ve nitrojenin gaz basıncının yeterince yüksek olup olmadığını kontrol edin.
  2. LC ön çalıştırma
    1. % 0.1 formik asidi su ile karıştırarak mobil faz A'yı hazırlayın ve mobil faz B için asetonitril kullanın (bkz . Malzeme Tablosu). Çözünmüş gazları ortadan kaldırmak için her iki fazı da bir ultrason banyosu sonikatöründe 15 dakika boyunca gazdan arındırın. Ardından, mobil faz A'yı ilgili sıvı geçişine bağlayın ve aynısını mobil faz B için de yapın. Son olarak, temizleme sıvısı için 1:9 v/v metanol-su solüsyonunu karıştırın ve pompa ve enjektör şişelerini manuel olarak doldurun.
      NOT: Ultrason banyosu sonikatörünün frekansı 40 kHz'dir.
  3. LC metodunun kurulması
    1. Metot düzenleme penceresine erişmek için "Instrument Setup" (Enstrüman Kurulumu) düğmesini seçin.
    2. Yeni bir LC-MS cihaz yönteminin oluşturulmasını başlatmak için "Yeni" düğmesine basın.
    3. LC yöntemi için toplam çalışma süresini ayarlayın. Ardından, metot düzenleme penceresine basınç sınırı, toplam akış hızı, akış gradyanı, numune sıcaklığı, kolon sıcaklığı ve hazır sıcaklık deltası için gerekli değerleri girin.
      NOT: LC-MS cihaz yöntemi ayarları, ilgilenilen analite ve kullanılan sıvı kromatografi kolonunun tipine göre uyarlanmıştır. En iyi sonuçlar için, 40 ° C'de tutulan bir BEH C18 sütunu ile 0,3 mL / dak'lık bir akış hızı kullanın (bkz. Gradyan elüsyonu şu şekilde yapılandırılır: %10 B'den başlayın, 8 dakika boyunca doğrusal olarak %30 B'ye, ardından 8 ila 16 dakika arasında %45 B'ye, 16 ila 24 dakika arasında %50 B'ye ve 24 ila 30 dakika arasında %70 B'ye yükselin. Bunun hemen ardından, gradyanı 0,1 dakika içinde başlangıçtaki %10 B durumuna geri döndürün ve 2,9 dakika daha orada tutun. Her analiz için 5 μL'lik bir numune hacmi enjekte edin. LC-MS cihaz yöntemi ayarları, analiz edilecek spesifik maddeye ve kullanılan sıvı kromatografi kolonunun tipinebağlıdır 21.
  4. MS satın alma
    1. Ayarlar sekmesinde, MS yöntemi yapılandırması için Genel MS veya MSn deney türünü seçin. Alım süresini, polariteyi (pozitif veya negatif), kütle aralığını yönlendirme valf numarasını ve yön değiştirme valf süresini ayarlamak için gerekli değerleri girin. Bu bilgileri girdikten sonra, bu ayarları bir enstrüman metodu olarak sonlandırmak ve kaydetmek için "Kaydet" düğmesine tıklayın.
      NOT: Kromatografi sütunu olmayan varsayılan ayarlar aşağıdaki gibidir: edinme süresi, 2 dakika; polarite, pozitif veya negatif; kütle aralığı, 100 ila 1.500.
  5. Konvansiyonel yöntemlere göre çok aşamalı kütle spektrometresi gerçekleştirin.
    1. Çok aşamalı kütle spektrometrisinde veri toplama için her zaman veriye bağlı toplama (DDA) modunu kullanın. DDA modunda, kütle spektrometresi, tandem MS'in ilk aşamasında her tarama sırasında en yoğun beş iyonu tanımlar ve bunlar daha sonra parçalanır ve tandem kütle spektrometrisinin ikinci aşamasında incelenir.
      NOT: Toplanan MS ve MS/MS verileri, daha sonraki analizler ve veritabanı aramaları için kullanılabilir.

5. Manuel veri toplama, analiz ve hesaplama

  1. Veri toplama ve analizi
    1. MS'den tüm kütle spektrumlarını açmak için ham dosyalara çift tıklayın. İyon ve karşılık gelen parça iyonları arasındaki m/z fark değerlerini manuel olarak hesaplayın.
    2. PS'nin kütlesini ve parçalarını doğru bir şekilde hesaplayarak PS'leri tanımlamak için kontrol ve numune işlemlerinin ve işlenmemiş parçaların ham veri dosyalarını kütle spektrometresi analiz yazılımına aktarın.
      NOT: PS VII ve PS II, orijinal standart çözümlerin saklama süreleri ve koelüsyonu ile karşılaştırılarak tanımlanır. LC-MS, moleküler iyon tepe noktalarının konumlarında bir dizi küçük tepe noktası tespit eder. Her bir izotopik iyon tepe noktası serisinin oranı sabittir. Ekzojen 13C izotopları verildiğinde, bitkideki toplam 13C bolluğu artar ve bitki ikincil metabolitlerinin izotop iyon pikleri serisinin oranları değişir. Kütle hatasının maksimum toleransı 5 ppm olarak ayarlanmıştır.
    3. Temel tepe noktasını belirlemek için m/z 500-1,500 kütle aralığını tarayın. Hedef molekülün kesin moleküler ağırlığına ve alıkonma süresine göre doğru moleküler ağırlığı 4 ondalık basamağa kadar belirleyin. Seri izotop iyon akışının tepe alanını arayın ve M−, (M+1) −, (M+2) −, (M+3) − ve (M+4) − için değerler türetin. Mobil faz formik asit içerdiğinde, negatif iyonlar ayrıca şunları içerir: (M+COOH) -, (M+COOH+1) -, (M+COOH+2) -, (M+COOH+3) - ve (M+COOH+4) -.
      NOT: m/z 500-1,500 kütle aralığındaki piklerin seçilmesi, PS VII ve PS II için moleküler iyon piklerinin tanımlanmasının doğruluğunu artırır. Örneğin, PS VII'nin negatif iyon kütle spektrumu (C51H82O21, 1030.5349) esas olarak formik asit-su karışımındaki COOH- iyonları ile iyonlaşır. Gözlenen seri izotop iyonları arasında 1029.53−, 1030.54−, 1031.54−, 1032.55−, 1033.55− bulunur ve 1079.56−'ye kadar uzanır.
  2. Veri hesaplama
    1. 13° C'nin doğal bolluğunun etkisini azaltmak için, farklı tedaviler altında her organ için etiketli ve etiketsiz iyon akımlarının oranlarını hesaplayın, özellikle (M + 1) - / M - (M + 2) - / M - (M + 3) - / M - ve (M + 4) - / M ... 13C katılımının doğru bir değerlendirmesi için etiketli ve doğal olarak oluşan izotoplar arasında ayrım yapmak için, denklem (1) kullanarak n = 2, 3, 4 için bu oranları hesaplayın.
      Oran = A (M+2) -&��/− (1)
      Not: (M+2) - (M+2+COOH) - ve (M+2) -; M− (M+COOH) - ve M− içerir.
      NOT: Burada, M- , (M+COOH) - ve M - için iyon akımlarının birleşik tepe alanlarını ifade eder, esas olarak formik asit-suda COOH- ile iyonize edilir. A , tepe alanını temsil eder. Örneğin, PS VII oranlarını hesaplamak için kullanılan formüller aşağıdaki gibi gösterilmiştir:
      Oran+1= (A1030.54+A1076.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Oran+2= (A1031.54+A1077.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Oran+3= (A1032.55+A1078.56)/(A1029.53+A1075.55)
      Oran+4= (A1033.55+A1079.56)/(A1029.53+A1075.55)

Sonuçlar

Rizomlarda 13C6-Glikoz tedarikinin başarılı olduğunu doğrulamak için, rizomlardaki 13C / 12C izotop oranlarını daha fazla analiz ettik. Tedavi 3 ve 4'ün 13C / 12C izotop oranları, Tedavi 2'ninkinden çok daha yüksekti (Şekil 1A). Sonuçlar, Tedavi 3 ve 4'ten 13C6-Glikozun yutma yoluyla rizomlara girdiğini gösterdi.

(M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M− ve (M+4) −/M− gibi 13C izotop tepe noktalarının oranları tipik olarak sabit kalır. Dışsal olarak eklenen 13C ile etiketlenmiş bileşikler, etiketlenmemiş muadilleriyle aynı moleküler yapıya, benzer moleküler ağırlıklara, fizikokimyasal özelliklere ve alıkonma sürelerine sahiptir. Bununla birlikte, bu etiketli bileşikler kütle spektrometresi kullanılarak analiz edildiğinde, izotop iyon tepe noktalarının oranları değişti. Çalışmamızda, çeşitli tedavilerde PPY'nin dört farklı organında PS VII ve PS II'yi tespit etmek için LC-MS kullandık (Şekil 3). Tedavi 1 ile karşılaştırıldığında, sonuçlar, eksojen 13C ile muamele edilen PPY'nin yapraklarında PS VII (M + 2) - / M - oranında önemli bir artış olduğunu göstermiştir (Şekil 3B). Özellikle PPY yapraklarının 13C6-Glikoz ile püskürtüldüğü Tedavi 2'de, iki adet 13C atomu ile işaretlenmiş PS VII sentezlenmiştir. Bununla birlikte, Tedavi 4'te, yapraklardaki PS VII moleküllerinin (M + 2) - / M- oranı, rizom ve beslemesiz tedavi arasında anlamlı bir fark göstermedi ve PS VII moleküllerinin oranları (M + 1) - / M - (M + 3) - / M - (M + 4) - / M... dört tedavinin tamamında gövde, rizom ve kökte önemli bir fark göstermedi (Şekil 3A, C,D). Ek olarak, PS II moleküllerinin (M+2) −/ M− oranı Tedavi 2'de yavaş yavaş artmıştır (Şekil 3F). Tedavi 1 ve 2 arasındaki yapraklarda PS II moleküllerinin (M+1) −/M− ve (M+4) −/M− oranlarında kayda değer bir fark yoktu (Şekil 3E, H), PS II moleküllerinin oranı (M+3) −/M− Tedavi 2'deki yapraklarda Tedavi 1'e kıyasla gözle görülür bir azalma gösterdi (Şekil 3G). Bu bulgular, PS VII'nin sentezinin, PSS'nin bilinen biyosentetik yolu ile uyumlu olarak, 13C6-Glikoz ile muamele edilen yapraklarda gerçekten meydana geldiğini göstermektedir.

Yaklaşımımız, PS II sentezinin aksine, PPY'de PS VII sentezi için birincil organ olarak yaprağı önermektedir. Özellikle, 13C etiketli PS VII, 13C 6-Glikoz ile yaprak muamelesini takiben köksapta yoktu, bu da PS VII'nin yapraklardan rizomlara yavaş taşınmasını ima ediyordu. Buna karşılık, kök-vasküler-demet ve rizom etiketleme tedavilerinden sonra rizomda 13C etiketli PS II tespit edildi, bu da bu aşamada olası rizom sentezini gösterdi ve PS II sentez yerlerinin daha fazla araştırılmasını gerektirdi. Yapraklardaki PS VII molekülleri için (M+2) -/M- oranının özel tespiti, 13C6-Glikozun metabolik kaderi ile uyumludur; emilimden sonra, iki 13C izotopu ile asetil-CoA üretmek için glikoliz yoluyla metabolize edilir. PS'yi izoprenoid bir bileşik olarak düşünürsek, asetil-CoA'dan biyosentezi ya mevalonik asit (MVA) ya da 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfat (MEP) yolu yoluyla ilerler (Şekil 4), (M+2) −/M− PS III oluşumuna yol açar. Bu nedenle, çalışmamız yaprağı PPY'de PS VII sentezi için kesin organ olarak tanımlamaktadır.

figure-results-1
Şekil 1: Dört tedavinin rizomlarındaki 13C /12C izotop oranı. (A) Tedavi 4 ve 3'ün rizomlarındaki 13C /12C izotoplarının oranları, Tedavi 1 ve 2'ninkinden çok daha yüksekti, bu da 13C 6-Glikozun kök besleme yoluyla rizomlara önemli ölçüde girdiğini gösteriyor. Her sütun, üç kopyanın ortalamasını (± SE) temsil eder. Sütunlardaki harfler, dört işlemde 13C / 12C izotop oranında önemli ölçüde farklı anlam ifade eder (p < 0.05). Kısaltma: PS = Paris saponinleri. (B) PS VII'nin (C51H82O21, 1030.5349) yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi, negatif iyonunu 16.83 dakikalık bir tutma süresiyle tespit etti. 13C'nin doğal bolluğu nedeniyle (12.000'de 12C'ye kıyasla tam moleküler ağırlığı 13.003 olan), (M-1)-, (M+2)-, (M+3)– ve (M+4)− dahil olmak üzere bir dizi izotop zirvesi, PS VII moleküler iyon zirvesi M− ile aynı tutma süresinde ortaya çıkar. Bu zirveler esas olarak formik asitli sudaki COOH− iyonlaşmasından kaynaklanıyordu. Büyütülmüş bir çubuk diyagram bu izotop zirvelerini vurgular. (M+1)−/M−, (M+2)−/M−, (M+3)−/M− ve (M+4)−/M− iyon akımı oranları hesaplandı. Bu oranlardaki değişiklikleri analiz ederek, saponinlerin biyosentezini izleyebilir ve çıkarabiliriz. Burada, M-, (M+COOH)- ve M- için iyon akımının birleşik tepe alanlarını temsil ediyordu. Şekil 1B, Wen ve ark.24'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: 13C6-Glikoz etiketleme ve veri entegrasyonu iş akışı. Fideler 3 gün boyunca% 0.2 13C6-glikoz püskürtülerek ve beslenerek etiketlendi; daha sonra, her bir organdan elde edilen ekstraktlar, LC / MS ve GC / IRMS ile izotopik olarak analiz edildi ve PS sentezinin organa özgü analizi için tepe entegrasyonu ve verilerle birleştirildi. (A) Farklı organlarda glikozun beslenmesini gösteren şematik bir diyagram. 1-4 arası tedaviler beslenmeyen, sırasıyla yaprak, gövde-vasküler-demet ve rizom ile beslenmiştir. (B) Kurutulmuş PPY dokusundan bir öğütme ve nitrojen üfleme aleti vasıtasıyla yapılan ekstrakte edilmiş sıvının LC-MS analizi için adımlar. Kısaltmalar: LC/MS = sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi; PPY = Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) El. -Mzt.; PS = Paris saponini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Bitki organlarının 13C6-Glikoz beslemesi yoluyla Paris saponin VII ve Paris saponin II biyosentezinin izlenmesi. (İ.Ö.) Dört tedavinin her bir organında PS VII moleküllerinin (M + 1) - / M - (M + 2) - / M - (M + 3) - / M - (M + 4) - / M oranı. PS VII moleküllerinin (M+2) −/M− oranı, Tedavi 2 ve Tedavi 3'ün yapraklarında önemli ölçüde artmıştır. Kök, kök ve rizomda, PS VII moleküllerinin (M + 2) - / M - oranı dört tedavi arasında belirgin bir fark göstermedi. (E-H) Dört tedavinin her bir organında PS VII moleküllerinin (M + 1) - / M - (M + 2) - / M - (M + 3) - / M - (M + 4) - / M oranı. Tedavi 1 ile karşılaştırıldığında, yapraklardaki PS II moleküllerinin (M + 2) - / M - oranları, Tedavi 2 kapsamında hiçbir fark göstermemiştir. Tedavi 2'de, PS II moleküllerinin (M + 1) - / M - ve (M + 4) - / M - oranı, Tedavi 1 ile karşılaştırıldığında yapraklarda belirgin bir fark yoktur. PS II moleküllerinin (M+3) −/M− oranları, Tedavi 1'e kıyasla yapraklarda azalmıştır. Paris saponin VII, PS VII. Her sütun, üç kopyanın ortalamasını (± SE) temsil eder. "*" beslenmeyen tedaviden anlamlı bir fark gösterdi (p < 0.01'de t-testi). Kısaltma: PS = Paris saponinleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: MVA yoluna giren eksojen 13C6-Glikoz tarafından üretilen PS VII'nin tanımı. MVA yolu aracılığıyla PS VII molekülleri (M + 2) - / M- üretmek için 13C6-Glikoz etiketli asetil koenzim A'nın metabolizmasının şematik diyagramı. Etiketli karbon kırmızı ile gösterilir; Etiketlenmemiş karbon gridir. Glikolizin etkisi altında, 13C6-Glikoz, iki asetil koenzim A (M + 2) - molekülüne bölünür, bu daha sonra MVA yolu boyunca izopentenil pirofosfat ve dimetil propenil pirofosfat üretir ve daha sonra katalitik geranilgeranil pirofosfat sentaz üretimi yoluyla siklik atenol üretir, farnezil pirofosfat sentaz, skualen sentaz, skualen epoksijenaz, sikloatenol sentaz Sikloartenol, daha sonra oksidasyon, dekarboksilasyon, indirgeme ve kolesterol elde etmek için diğer reaksiyonlar, bir dizi sitokrom P450 enzimi yoluyla kolesterol, glikosiltransferazlar ve furostanoid saponin 26-O-β-glukozidaz iki etiketli karbon içeren PS VII moleküllerinin oluşumunun geç modifikasyonu. (M+2) - iki karbonun COOH-'sinin bu noktada iyonize olduğunu ve iki karbon için etiket sayısının (M+2) -/M- kullanılarak türetilebileceğini gösterir. Standart protokoller kullanılarak, izotopik gövde ayrı ayrı tanımlanır ve iyonik akımlar, izotoplar için etiketleme verileri elde etmek üzere bölünür. M− değeri sabittir. Kısaltma: PS = Paris saponinleri; PS VII = Paris saponin VII; MVA = Mevalonat yolu; GPPS = Geranilgeranil pirofosfat sentaz; FPPS = Farnezil pirofosfat sentaz; SQS = Skualen sentaz; SQE = Skualen epoksijenaz; CYP'ler = Sitokrom P450 enzimleri; UGT'ler = Glukuronik transferaz; F26G = Furostanoid saponin 26-O-β-glukozidaz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, bitki fizyolojik özellikleri, dokuları, organları ve ikincil metabolitleri ile ilgili kapsamlı araştırmalara bağlıdır. Protokolde özetlenen deneysel tasarım yaklaşımı, bitki ikincil metabolitlerinin biyosentetik yolaklarını araştırmak için sağlam bir temel oluşturmaktadır. Bu deneydeki kritik faktörler (1) çok yıllık fidelerin yaşının belirlenmesi ve (2) doğru izotop etiketleme-tespit zamanlamasının seçilmesidir. Tıbbi bitkiler, her biri farklı ikincil metabolit sentezi ve birikimi modellerine sahip çok yıllık ve yıllık olarak kategorize edilir. Bu deney, tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin birincil sentetik organlarını, bu metabolitlerin sentez hızını analiz ederek aydınlatmayı amaçlamaktadır. Bu nedenle, bu sentez modellerine ve oranlarına karşılık gelen büyüme yıllarını ve aşamalarını dikkatli bir şekilde seçmek önemlidir.

PPY çok yıllık bir şifalı bitkidir ve PS içeriği yıldan yıla birikir. Bununla birlikte, PS sentez hızının, çok yıllıklarda kullanılan PPY22'den farklı olmadığı gösterilmiştir. Aynı zamanda 2 yaşındaki fidelerin büyüklerine göre daha küçük olması hidroponiği kolaylaştırır. Bu nedenle, bu çalışmada 2 yaşındaki PPY fidanları kullanılmıştır. Bu, seçilen bitkilerin en yüksek sekonder metabolit sentezi oranını sergilemesini sağlar. Farklı türler arasında ikincil metabolitlerin sentez ve taşıma oranlarındaki değişimi kabul etmek çok önemlidir23. Etiketleme-algılama periyodu için en uygun uzunluk bu oranlar ile belirlenir. Araştırmalar, PPY yapraklarındaki şeker ve PS içeriğinin 3 gün içinde azaldığını göstermektedir24, bu da önemli moleküler ağırlıkları nedeniyle PS için yavaş bir taşıma süreci olduğunu ve bu zaman dilimi içinde tamamlanması muhtemel olmadığını göstermektedir. Birkaç saatten daha kısa bir tedavi süresi, etiketli PS 5,25 için yetersiz sentez ve tespit zorluklarına yol açabilir. Tersine, tedavinin 3 günden fazla uzatılması, PS'nin yapraklardan rizoma yer değiştirmesi riskini taşır ve bu da deneysel sonuçları bozabilir. Bu nedenle, özellikle yaprak spreyi ve rizom etiketleme yöntemleri için organ girişimini en aza indirmek ve böylece daha doğru deneysel sonuçlar sağlamak için 3 günlük bir ara etiketleme periyodu seçilir.

Nicotiana tabacum 26,27 ve Brassica napus28 ile ilgili önceki izotop etiketleme çalışmaları, başarılı 13C6-Glikoz emilimi ve bitki dokularına entegrasyon göstermiştir. Araştırmamızda, hidroponik olarak yetiştirilen, 2 yaşındaki PPY fidelerine odaklandık, 13C6-Glikoz besleme tedavileri uyguladık yapraklar, rizomlar ve kök-vasküler demetler için besleme tedavileri ve kontrol besleme dışı tedaviler. LC-MS tespitini kullanarak, etiketlemeden sonraki üçüncü günde, kök-vasküler-demet ve rizom besleme tedavilerinden elde edilen rizomlardaki 13C / 12C oranının, beslenmeyen kontrollere göre önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulduk, bu da etkili 13C6-Glikoz asimilasyonunu ve etiketleme yaklaşımımızın başarısını doğruladı (Şekil 2). Çalışmamızda, PPY'nin dört farklı organında PS VII ve PS II molekülleri için dört tip izotopik iyon tepe oranını aynı anda analiz ettik: (M + 1) - / M - (M + 2) - / M , (M + 3) - / M - ve (M + 4) - / M ... Daha da önemlisi, yaprak etiketleme işleminde, yapraklardaki PS VII molekülünün (M+2) -/M- oranlarının, beslemesiz işleme göre önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gözlemledik. Köksap altındaki yapraklarda PS VII moleküllerinin (M+2) −/M− oranı ve hiçbir fark olmaksızın beslenmez tedavi (Şekil 3B). Ek olarak, yemsiz muamele ile karşılaştırıldığında, yaprak besleme muamelesi altındaki yapraklarda Paris saponins II (PS II) molekülünün (M+2) −/M− oranı önemli bir fark olmaksızın ve yaprak besleme muamelesi altındaki yapraklarda PS II moleküllerinin (M+3) −/M− oranları daha düşüktü (Şekil 3G). Kök-vasküler demet ve rizom etiketleme tedavileri, beslenmeyen tedaviye kıyasla rizomlardaki PS II moleküllerinin (M + 1) - / M- ve (M + 4) - / M- oranlarında önemli farklılıklar göstermiştir (Şekil 3E, H).

Bu yaklaşımı diğer tıbbi bitkilere uyarlarken, bitkinin birincil ikincil metabolitlerinin öncülerine göre uyarlanmış işaretleyici bileşiklerin seçilmesi ve işaretleyici özgüllüğünün sağlanması çok önemlidir. Hedef bileşik esas olarak gövdede sentezlenirse, etiketleme bileşiği gövdeye verimli bir şekilde taşınabilmeli ve gövdede metabolize edilebilmelidir. PS VII için (M+2) −/M− gibi beklenen izotopik oranlar yoksa, sentez yolunu yeniden değerlendirin ve etiketleme bileşiklerinin uygunluğunu onaylayın. Besin çözeltisindeki etiketleme bileşiğinin konsantrasyonunun, istenen organ içindeki hedef bileşiklere yeterli alımı ve entegrasyonu sağlamak için ayarlanması gerekebilir. LC-MS tespit parametreleri, ilgilenilen spesifik etiketli metabolitleri etkili bir şekilde tespit etmek için optimizasyon gerektirebilir. Bu, incelenen bitki türüne ve organa özgü bileşiklerin duyarlılığını ve özgüllüğünü artırmak için iyonizasyon modu gibi kütle spektrometresi ayarlarının ayarlanmasını içerebilir. Kök-vasküler-demet ve rizom etiketleme işlemlerinden elde edilen rizomlarda 13C / 12C oranları tespit edilmezse, Hoagland besin çözeltisindeki 13C6-Glikoz konsantrasyonu ve etiketleme süresi, tespit elde edilene kadar arttırılmalıdır. Bu çalışmada oluşturulan 13C6-Glikoz besleme yöntemleri ve analitik teknikler, çeşitli tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentez organlarının tanımlanması için sonuçların analizine ve yorumlanmasına rehberlik etmelidir.

Bu deneydeki yapraklar, rizomlar ve kök-vasküler demetler için 13C6-Glikoz besleme ve besleme dışı tedaviler, geleneksel karbon izotop etiketleme yöntemlerine kıyasla ikincil metabolitlerin sentez organlarının tanımlanmasında daha fazla özgüllük sunar. Bununla birlikte, zorluklar devam etmektedir. Önemli bir sınırlama, tüm şifalı bitkiler için uygun, herkese uyan tek bir etiketleme algılama zaman çerçevesinin olmamasıdır. En uygun zaman diliminin seçilmesi etiketleme etkinliğini artırır. Ek olarak, sonuçları analiz etmek için oranların kullanılması, büyük, karmaşık izomerlerde fonksiyonel grup konumlarının farklılaşmasını zorlaştırır. Bu nedenle, bu metodolojiyi kullanmadan önce kapsamlı bir literatür taraması ve ön deneyler yapılması tavsiye edilir. Bu strateji sadece doğruluk ve verimlilik sağlamakla kalmaz, aynı zamanda bitki biyolojisi ve farmakolojisi için de önemli etkilere sahiptir. Bu yöntemin, organik bileşik yapılarını analiz etmek için önde gelen bir teknik olan nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ile entegre edilmesi, 13C etiketleme konumlarının hassas bir şekilde tanımlanmasına olanak tanır. Bu yöntem, tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezinde organ özgüllüğünü belirlemek için ayrıntılı ve etkili bir yaklaşım sunarak, bitki ikincil metabolitlerinin biyosentetik yolaklarının araştırılmasının yolunu açmaktadır.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Gençlik Programı (No. 82304670) tarafından finanse edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.1 Formik asit suChengdu Kelong Kimyasal Reaktif Fabrikası44890
13< / sup>C < sub > 6 < / sub>-Glikoz tozuMERCK110187-42-3
AsetonitrilChengdu Kelong Kimyasal Reaktif Fabrikası44890
OTOMATIK NUMUNE ALMA MAKİNESİ ŞIŞELERBiosharp Biyoteknoloji Şirketi44866
BEH C18 sütunSuları, Milfor, MA1.7 & mu; m, 2.1 * 100 mm
CNC ultrasonik temizleyiciKunshan Ultrason Instrument Co, LtdKQ-600DE
Bileşik DiscovererTM ve nbsp; yazılımThermo Scientific, Fremont, CA3
Bileşik DiscovererTM ve nbsp; yazılım & nbsp;Thermo Scientific, Fremont, CA3
Elektrikli sabit sıcaklık yüksek kurutma fırınıDHG-9146A
Elektronik analitik teraziSedolis Scientific Instruments Beijing Co., LtdSOP
Etanol ve nbsp;Chengdu Kelong Kimyasal Reaktif Fabrikası44955
Tam otomatik numune hızlı öğütücüŞangay Jingxin TeknolojisiTissuelyser-48
Gaz Kromatografisi-Kararlı İzotop Oranı Kütle SpektrometresiThermo FisherDelta V Avantajı
Hoagland çözümüSigma-AldrichH2295-1L
Hidroponik tankJRD1020421
Isodat yazılımıThermo Fisher Scientific3
Sıvı kromatografisi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresiAgilent Technology Agilent 1260 -6120 
Azot üretim cihazıPEAK SCIENTIFICGenius SQ 24
Organik faz filtresiTianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd44890
Oksijen pompasıMagic DragonMFL
Kuantum sensörüHighpointUPRtek
NeşterHandskit11-23
Serpme canCHUSHIWJ-001
Xcalibur ve nbsp; yazılımıThermo Fisher Scientific4.2

Kaynaklar

  1. Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
  2. Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H. The effect of developmental and environmental factors on secondary metabolites in medicinal plants. Plant Physiol Biochem. 148, 80-89 (2020).
  3. Liu, S., et al. Genetic and molecular dissection of ginseng (panax ginseng mey.) germplasm using high-density genic snp markers, secondary metabolites, and gene expressions. Front Plant Sci. 14, 1165349(2023).
  4. Chen, X., Wang, Y., Zhao, H., Fu, X., Fang, S. Localization and dynamic change of saponins in cyclocarya paliurus (batal.) iljinskaja. PloS One. 14 (10), e0223421(2019).
  5. Yuan, M., et al. Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by lc-ms/ms. Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).
  6. Cavalli, F. M. G., Bourgon, R., Vaquerizas, J. M., Luscombe, N. M. Specond: A method to detect condition-specific gene expression. Genome Biol. 12 (10), 101(2011).
  7. Epron, D., et al. Pulse-labelling trees to study carbon allocation dynamics: A review of methods, current knowledge and future prospects. Tree Physiology. 32 (6), 776-798 (2012).
  8. Varman, A. M., He, L., You, L., Hollinshead, W., Tang, Y. J. Elucidation of intrinsic biosynthesis yields using 13c-based metabolism analysis. Microb Cell Fact. 13 (1), 42(2014).
  9. Meng-Meng, G., Zhen-Yu, Z., Yu, Z., Qiu-Lin, Y., Ying, W. Systematic extraction and stable isotope determination of different biomarkers from single leaf of reticulate vein plants. Journal of Shaanxi University of Science & Technology. 41 (01), 72-79 (2023).
  10. Zhang, H., et al. A convenient lc-ms method for assessment of glucose kinetics in vivo with d-[13c6]glucose as a tracer. Clin Chem. 55 (3), 527-532 (2009).
  11. Chassy, A. W., Adams, D. O., Waterhouse, A. L. Tracing phenolic metabolism in vitis vinifera berries with 13c6-phenylalanine: Implication of an unidentified intermediate reservoir. J Agric Food Chem. 62 (11), 2321-2326 (2014).
  12. Lozac'h, F., et al. Evaluation of cams for 14c microtracer adme studies: Opportunities to change the current drug development paradigm. Bioanalysis. 10 (5), 321-339 (2018).
  13. Sulyok, M., Stadler, D., Steiner, D., Krska, R. Validation of an lc-ms/ms-based dilute-and-shoot approach for the quantification of > 500 mycotoxins and other secondary metabolites in food crops: Challenges and solutions. Anal Bioanal Chem. 412 (11), 2607-2620 (2020).
  14. Serra, F., et al. Inter-laboratory comparison of elemental analysis and gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometry (gc-c-irms). Part i: Delta13c measurements of selected compounds for the development of an isotopic grob-test. J Mass Spectrom. 42 (3), 361-369 (2007).
  15. Jung, J. -Y., Oh, M. -K. Isotope labeling pattern study of central carbon metabolites using gc/ms. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 101-108 (2015).
  16. Ding, Y. G., et al. The traditional uses, phytochemistry, and pharmacological properties of paris l. (liliaceae): A review. J Ethnopharmacol. 278, 114293(2021).
  17. Cunningham, A. B., et al. Paris in the spring: A review of the trade, conservation and opportunities in the shift from wild harvest to cultivation of paris polyphylla (trilliaceae). J Ethnopharmacol. 222, 208-216 (2018).
  18. Madikizela, L. M., Ncube, S., Chimuka, L. Uptake of pharmaceuticals by plants grown under hydroponic conditions and natural occurring plant species: A review. Sci Total Environ. 636, 477-486 (2018).
  19. Tagami, K., Uchida, S. Online stable carbon isotope ratio measurement in formic acid, acetic acid, methanol and ethanol in water by high performance liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry. Anal Chim Acta. 614 (2), 165-172 (2008).
  20. Li, Y., et al. The combination of red and blue light increases the biomass and steroidal saponin contents of paris polyphylla var. Yunnanensis. Ind Crops Prod. 194, 116311(2023).
  21. Wang, G., et al. Tissue distribution, metabolism and absorption of rhizoma paridis saponins in the rats. J Ethnopharmacoly. 273, 114038(2021).
  22. Peng, S., et al. Progress in the study of differences in the types and contents of steroidal saponins in paris. Polyphylla smith var. Chinensis (franch.) hara. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 24 (05), 2014-2025 (2022).
  23. Alami, M. M., et al. The current developments in medicinal plant genomics enabled the diversification of secondary metabolites' biosynthesis. Int J Mol Sci. 23 (24), 15932(2022).
  24. Wen, F., et al. The synthesis of paris saponin vii mainly occurs in leaves and is promoted by light intensity. Front Plant Sci. 14, 1199215(2023).
  25. Siadjeu, C., Pucker, B. Medicinal plant genomics. BMC Genomics. 24 (1), 429(2023).
  26. Tian, C., et al. Top-down phenomics of arabidopsis thaliana: Metabolic profiling by one- and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy and transcriptome analysis of albino mutants. J Biol Chem. 282 (25), 18532-18541 (2007).
  27. Masakapalli, S. K., et al. Metabolic flux phenotype of tobacco hairy roots engineered for increased geraniol production. Phytochemistry. 99, 73-85 (2014).
  28. Schwender, J., Ohlrogge, J. B., Shachar-Hill, Y. A flux model of glycolysis and the oxidative pentosephosphate pathway in developing brassica napus embryos. J Biol Chem. 278 (32), 29442-29453 (2003).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

LC MS AnaliziParis Saponinizotop Oran l mG vde Vask ler DemetiRizom BeslemeUltrasonik EkstraksiyonK tle Spektrometrik Analiz
13C 6-LC-MS ile İlişkili Glikoz Etiketlemesi: İkincil Metabolit Sentezinde Bitki Birincil Organlarının Tanımlanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.