Bu protokol, retinal fotoreseptör terminallerinin yapısal özelliklerine odaklanarak, hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması için ayrıntılı adımları açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hacim elektron mikroskobu için retina örneklerinin hazırlanması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Hacim elektron mikroskobu (Volume EM), hücrelerin ve dokuların 3D yapısını nanometre düzeyinde hassasiyetle görselleştirmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Retina içinde, çeşitli nöron türleri iç ve dış pleksiform tabakalarda sinaptik bağlantılar kurar. Konvansiyonel EM teknikleri retina hücre altı organelleri hakkında değerli bilgiler vermiş olsa da, sınırlamaları, doğru ölçümleri engelleyebilecek 2D görüntü verileri sağlamada yatmaktadır. Örneğin, sinaptik iletim için çok önemli olan üç farklı sinaptik vezikül havuzunun boyutunu ölçmek 2D'de zordur. Volume EM, büyük ölçekli, yüksek çözünürlüklü 3D veriler sağlayarak bir çözüm sunar. Numune hazırlamanın Hacim EM'de kritik bir adım olduğunu ve görüntü netliğini ve kontrastını önemli ölçüde etkilediğini belirtmekte fayda var. Bu bağlamda, retinadaki fotoreseptör akson terminallerinin 3D rekonstrüksiyonu için bir numune hazırlama protokolünün ana hatlarını çiziyoruz. Bu protokol üç temel adımı içerir: retina diseksiyonu ve fiksasyonu, örnek yerleştirme işlemleri ve ilgi alanının seçimi.
Giriş
Retina, aralarında sinaps oluşturan iç içe geçmiş nöronal aksonlar ve dendritlerle yoğun bir şekilde doludur1. Mikroskopi, ince, karmaşık ve küçük yapılara sahip olduğu için retina anatomisini incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Elektron mikroskobu (EM), hücre altı organellerin üst yapısını ve nanometre seviye2'de spesifik proteinlerin doğru lokalizasyonunu araştırmak için benzersiz bir güç sağlasa da, iki boyutlu (2D) düzlemle sınırlı görüntüler üretir ve bu da potansiyel anahtar bilgi kaybına yol açar.
Ortaya çıkan yüksek çözünürlüklü hacim elektron mikr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan bakımı ve kullanım protokolleri, Wenzhou Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) tarafından belirlenen yönergeleri takip etti. Tüm fareler 12 saatlik aydınlık ve 12 saatlik karanlık döngüde tutuldu ve standart bir yemek diyeti ile sağlandı.
1. Retina diseksiyonu ve fiksasyonu
- Fareleri (C57BL / 6J, Erkek, 8 haftalık, 20-25 g) intraperitoneal olarak 2,2,2-tribromoetanol (0.25 mg / g vücut ağırlığı) enjekte ederek uyuşturun. Ayak parmağını sıkıştırdıktan sonra arka pençeyi geri çekmeyerek veya göz kırpma refleksi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1A'da geleneksel kimyasal çift fiksasyon yöntemi kullanılarak hazırlanan retinal fotoreseptör terminallerinin görüntüsü, Şekil 1B'de ise OTO yöntemi kullanılarak hazırlanan retinal fotoreseptör terminallerinin görüntüsü gösterilmektedir. Her ikisi de FIB-SEM ile örneklenmiştir. OTO yöntemi kullanılarak hücre zarı yapısının mümkün olduğunca korunabildiği ve hatta veziküllerin ana hatlarının bile net bir şekilde görülebildiği açıkça görülebilir. Ayrıca OTO y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Retina dokusundaki fotoreseptörlerin terminal yapısını analiz etmek için OTO'nun Volume EM numune hazırlama protokolünü uyguladık. Odak noktası, retinanın ayrılması ve sabitlenmesinden başlayarak, fotoreseptör akson terminallerinin 3D rekonstrüksiyonunun sonuçlarını sergilemeye kadar tüm prosedürün detaylandırılmasıydı.
Retina dokusunun ayırt edici özelliği, beyin dokusundan farklı olarak, bölgesel farklılıkların olmamasıdır. Üç kat nöronal hücre gövdesi ve ik.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2022YFA1105503), Devlet Anahtar Sinirbilim Laboratuvarı (SKLN-202103), Çin Zhejiang Doğa Bilimleri Vakfı (Y21H120019) Hibeleri ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-Tribromoetanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Aseton Elektron | Mikroskobu Bilimi | 10000 | |
| Amira 6.8 | Thermo Fisher Scientific | ||
| CaCl2 | Sigma | C-2661 | |
| Gömme kalıbı | Pekin Zhongjingkeyi Teknolojisi | GP10590 | |
| Epon reçine | Elektron Mikroskobu Bilimi | 14900 | |
| Etanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Gluteraldehit | Elektron Mikroskobu Bilimi | 16020 | |
| Helios NanoLab 600i çift ışınlı SEM | FEI | ||
| L-aspartik asit | Sigma | 56-84-8 | |
| Kurşun nitrat | Sigma | 10099-74-8 | |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | Fosfat tamponunun bir bileşeni |
| NaH2PO4. H2O | Sigma | 71507 | Fosfat tamponunun bir bileşeni |
| OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
| Paraformaldehit | Elektron Mikroskobu Bilimi | 157-8 | |
| Potasyum ferrosiyanür | Sigma | 14459-95-1 | |
| Sodyum kakodilat | Sigma | 6131-99-3 | |
| Püskürtme kaplayıcı | Leica | ACE200 | |
| Tiyokarbohidrazid | Sigma | 2231-57-4 | |
| Uranil asetat | TED PELLA | CA96049 |
Kaynaklar
- Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).
- Harris, J. R. Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey. Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).
- Varsano, N., Wolf, S....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
