Çip üzerinde akciğer modelleri, hava-sıvı arayüzünü ve endotel hücre perfüzyonunu taklit ederek, akciğer fizyolojisi çalışmaları için çok önemli olan kan akışını ve besin değişimini simüle ederek geleneksel 2D kültürleri aşıyor. Bu, solunum yolu enfeksiyonlarının anlaşılmasını ve tedavisini ilerletmek için dinamik, fizyolojik olarak doğru bir ortam sunarak akciğer araştırmalarının alaka düzeyini artırır.
Yöntem makalesi
Alveolar mukozal immün yanıtları incelemek için immünokompetan alveol-çip üzerinde model
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan alveolar yapısını ve işlevini taklit etmek için tasarlanmış gelişmiş bir immün yetmezlikli çip üzerinde akciğer modelini tanıtıyoruz. Bu yenilikçi model, insan alveollerindeki ortamı taklit eden bir hava-sıvı arayüzünü destekleyen mikroakışkan perfüze bir biyoçip kullanır. Doku mühendisliği, alveollerin temsili bir doku modelini oluşturmak için endotel hücreleri, makrofajlar ve epitel hücreleri dahil olmak üzere temel hücresel bileşenleri entegre etmek için kullanılır. Model, virüsler, bakteriler ve mantarlar dahil olmak üzere çeşitli patojenlere karşı mukozal bağışıklık tepkilerinin derinlemesine incelenmesini kolaylaştırır ve böylece akciğer bağışıklığı anlayışımızı geliştirir. Bu protokolün birincil amacı, bu alveolün çip üzerinde modelini enfeksiyon çalışmaları için sağlam bir in vitro platform olarak kurmak için ayrıntılar sağlamak ve araştırmacıların pulmoner ortamda patojenler ve konakçının bağışıklık sistemi arasındaki karmaşık etkileşimleri yakından gözlemlemelerini ve analiz etmelerini sağlamaktır. Bu, epitel hücrelerinin havaya gerçekçi bir şekilde maruz kalması için çok önemli olan bir hava-sıvı arayüzünün korunmasının yanı sıra, kan akışı ve endotel hücrelerinin biyomekanik stimülasyonu dahil olmak üzere insan alveollerinin temel fizyolojik koşullarını simüle etmek için mikroakışkan tabanlı tekniklerin uygulanmasıyla elde edilir. Model sistemi, immünofloresan boyama, sitokin profili oluşturma ve koloni oluşturan birim (CFU)/plak analizi gibi bir dizi standartlaştırılmış testle uyumludur ve enfeksiyon sırasında bağışıklık dinamikleri hakkında kapsamlı bilgiler sağlar. Çip üzerinde alveol, gözenekli polietilen tereftalat (PET) zarları ile ayrılmış insan distal akciğer epitel hücreleri (H441) ve insan göbek veni endotel hücreleri (HUVEC'ler) dahil olmak üzere temel hücre tiplerinden oluşur ve birincil monositten türetilmiş makrofajlar epitel ve endotel katmanları arasında stratejik olarak konumlandırılır. Doku modeli, in vitro pulmoner immün yanıtlarda yer alan nüanslı faktörleri inceleme ve analiz etme yeteneğini geliştirir. Değerli bir araç olarak, solunum yolu enfeksiyonlarının patogenezini incelemek ve potansiyel terapötik müdahaleleri test etmek için daha doğru ve dinamik bir in vitro model sağlayarak akciğer araştırmalarının ilerlemesine katkıda bulunmalıdır.
Giriş
İnsan akciğeri, alveolar mukozanın bağışıklık tepkileri arasındaki karmaşık etkileşimlerle solunum ve bağışıklık savunmasında dikkate değer bir role sahiptir1. Alveollerin etkili bir bağışıklık tepkisi oluşturma yeteneği, akciğer enfeksiyonlarını önlemek ve akciğer sağlığını güvence altına almak için hayati önem taşır. Akciğerler sürekli olarak bakteriler, virüsler, mantarlar, alerjiler ve partikül maddeler dahil olmak üzere çok çeşitli potansiyel risklere maruz kaldığından, alveolar mukozal immün yanıtların karmaşıklıklarını anlamak, solunum yolu enfeksiyonlarının, enflamatuar bozuklukların arkasındaki mekanizmaları keşfetmek ve pulmoner hastalıkların tedavisi için kritik öneme sahiptir1.
Solunum yollarının enfeksiyon ve inflamasyonla ilgili süreçlerini in vitro olarak incelemek için, alveolar ortamı ve immün yanıtları sadık bir şekilde taklit edebilecek modeller gereklidir. 2D hücre kültürü ve hayvan modülleri, akciğer bağışıklık tepkisi üzerine biyomedikal araştırmalar için temel araçlar olarak onlarca yıldır kullanılmaktadır. Bununla birlikte, genellikle insan durumlarına çeviri potansiyellerinde sınırlamaları vardır. Çip üzerinde akciğer modelleri, geleneksel in vitro ve in vivo modeller arasındaki boşluğu doldurmaya katkıda bulunabilir ve insana özgü bağışıklık tepkilerini incelemek için yeni bir yaklaşım sağlayabilir 2,3. Çip üzerinde akciğer modelleri, akciğer hücrelerinin solunum yolunun fizyolojik koşullarını özetlemesi ve daha doğru ve sağlam bir doku modeli geliştirmesi için gerekli olan hava-sıvı arayüzünü taklit edebilir. Bu kültür tekniği, hücre farklılaşmasının, işleyişinin ve ilaçlara veya hastalıkla ilgili uyaranlara verilen yanıtların in vitro2 hassas bir şekilde incelenmesini sağlar.
Bu çalışmada, kan akışını taklit etmek için perfüzyon ve endotel hücrelerinin biyomekanik stimülasyonunu uygulayarak ve hava fazı4'e maruz kalan epitel hücreleri ile bir hava-sıvı arayüzü dahil ederek insan alveolünün mikroakışkan tabanlı bir modelini sunuyoruz. İnsan alveolünün fiziksel yapısını ve biyolojik etkileşimlerini taklit eden, özellikle hava-sıvı arayüzüne odaklanan mikroakışkan perfüze edilmiş bir çip üzerinde alveol geliştirdik. Bu arayüz, pulmoner ortamın doğru bir şekilde modellenmesi için gerekli olan solunum epitel hücrelerinin farklılaşmasında çok önemli bir rol oynar. Model, gözenekli polietilen tereftalat (PET) zarları ile ayrılan ve hücre katmanları arasına yerleştirilmiş birincil monosit türevi makrofajlar ile ayrılmış insan distal akciğer epitel hücreleri (H441) ve insan göbek veni endotel hücrelerini (HUVEC'ler) kullanır. Bu kurulum, alveolün karmaşık hücresel düzenlemesini kopyalar ve akciğer dokusunun fizyolojik işlevinde önemli bir faktör olan hava-sıvı arayüzünü doğru bir şekilde simüle etmek için kritik öneme sahiptir.
Model geliştirmenin arkasındaki mantık, hem dolaşımdaki hem de dokuda yerleşik bağışıklık hücrelerini entegre etmeye kadar uzanır. Bu yaklaşım, insan solunum yolu enfeksiyonlarına karşı inflamatuar konak yanıtını doğru bir şekilde taklit etmek ve patojen-konak etkileşimlerini incelemek için dinamik bir ortam sağlamak üzere tasarlanmıştır. Makrofajların varlığı, solunum yolu enfeksiyonlarına karşı ilk savunma hattını yansıtan ani bağışıklık tepkilerinin ve bunların patojenlerle etkileşimlerinin incelenmesine izin verir. Ayrıca, biyoçip platformunun tasarımı, alveol fonksiyonunu in vitro olarak çoğaltmak için çok önemli olan hem biyofiziksel hem de biyokimyasal ipuçlarının uygun ve hassas bir şekilde manipüle edilmesini kolaylaştırır. Bu esneklik, insan enfeksiyonlarına katkıda bulunan faktörlerin incelenmesinde, araştırmacıların çeşitli hastalık durumlarını yansıtacak şekilde koşulları ayarlamasına veya potansiyel terapötik müdahaleleri test etmesine olanak tanır. Platformun gelişmiş mikroskopi, mikrobiyolojik analizler ve biyokimyasal atık analizi dahil olmak üzere çoklu okuma teknolojileriyle uyumluluğu, faydasını artırır. Bu yetenekler, hücresel davranışın, patojen proliferasyonunun ve bağışıklık tepkilerinin etkinliğinin değerlendirilmesi dahil olmak üzere enfeksiyonlara doku yanıtının kapsamlı bir değerlendirmesine izin verir.
Hava-sıvı arayüzünü kopyalamaya ve insan enfeksiyonlarını in vitro olarak incelemek için bağışıklık hücrelerini entegre etmeye odaklanan bir çip üzerinde insan alveol modeli oluşturmak ve kullanmak için ayrıntılı bir protokol ve teknikler sunuyoruz.
Protokol
HUVEC hücreleri göbek kordonlarından izole edilir ve 4. pasaja kadar kullanılır. Primer monositler, tam kandan sağlıklı donörlerden izole edilir. Çalışma, Jena, Almanya'daki Jena Üniversite Hastanesi etik kurulu tarafından onaylanmıştır (3939-12/13). Helsinki Bildirgesi'ne göre, çalışma için hücre bağışlayan tüm bireyler bilgilendirilmiş onamlarını verdiler.
1. Gün 1: Biyoçipin hazırlanması
- Biyoçipler farklı boyutlarda ve modellerde mevcuttur. Buradaki deneyler için BC002 modelini kullanın. Biyoçipi bir cam Petri kabına yerleştirin, kabı doldurun ve tüm boşlukları steril %70 etanol (EthOH) ile yıkayın. Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Daha sonra, boşlukları 2x steril ddH2O ile yıkayın. ddH2O'yu çıkarın.
- Her iki boşluğun biyoçip zarını steril kollajen IV çözeltisi ile kaplayın (0.5 mM asetik asit içinde 0.5 mg / mL; Dulbecco'nun magnezyum ve kalsiyum içeren fosfat tamponlu salininde 1:100 konsantrasyon kullanın PBS (+/+)) kollajen IV çözeltisini mavi uçlu 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak her iki boşluktan nazikçe akıtarak. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 15 dakika inkübe edin.
NOT: Tüm protokol boyunca mavi filtreli (P1000) uçlu 1.000 μL'lik bir pipet kullanılması önerilir. Filtre ucunun açıklığının çapı, kanalları birbirine bağlayan portların açıklığını tamamen kaplar ve bu da hava kabarcıklarının çipe girmesini önler. - 30 dakikalık inkübasyondan sonra, kalan kollajen ve asetik asidi temizlemek için alt ve üst bölmeleri 2x steril PBS (+/+) ile yıkayın.
- 1:100 (h/v) Penisilin / Streptomisin (10.000 U / mL) ekleyerek EC ortamını hazırlayın. Her boşluğun üst haznesini 250 μL EC ortamı ve alt hazneyi 150 μL EC ortamı ile doldurun.
- HUVEC'i birleşik bir T25 şişesinden hasat edin: Magnezyum ve kalsiyum PBS (-/-) içermeyen 5 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini ile yıkayın, PBS'de (-/-) 1 mL% 0.25 Tripsin + 1 mM EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin. 5 mL PBS (+/+) +% 5 FCS ekleyerek tripsin aktivitesini durdurun ve 50 mL'lik konik bir tüpte oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 1 mL EC ortamında yeniden süspanse edin.
- Hücre sayımı yaparken 1:10 seri seyreltme kullanın. 90 μL hücre ortamına 10 μL yeniden süspanse hücre peleti ekleyin. Örnekleri dikkatlice birleştirin. 10 μL tripan mavisi lekesi olan bir mikrosantrifüj tüpü kullanın. Hücre sayma odası slaytlarını kullanarak hücre çözeltisini tripan mavisi (1: 1) ile seyreltin. Hücreleri bir Neubauer Odası ile manuel olarak veya otomatik bir hücre sayacı ile sayın. Hücre sayılarını belirleyin ve konsantrasyonu 200 μL'de 0,4 x 106 hücre olarak ayarlayın.
- Biyoçipin üst odasındaki endotel hücre ortamını, askıya alınmış HUVEC'ler içeren 200 μL EC ortamı ile değiştirin. Kanallarda veya haznelerde hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için nazikçe pipetleyin. Biyoçiplerin bulunduğu cam Petri kabını 37 °C ve %5 CO2'ye yerleştirin.
2. Gün 2: Hücre tabakasının kontrolü
- 2. Günde, üst odadaki HUVEC hücre tabakasının birleşip birleşmediğini görsel olarak kontrol edin. 300 μL EC ortamı ile üst bölmede ortam değişimi gerçekleştirin. Hücrelerin zardan ayrılmasını önlemek için nazikçe pipetleyin. 24 saat sonra günlük medya alışverişi yapın. Biyoçiplerin bulunduğu cam Petri kabını 37 °C ve %5 CO2'ye geri yerleştirin.
3. Gün 3: Alt odanın hazırlanması
- Endotel hücreleri tabakasının birleşimini görsel olarak kontrol edin. Bu noktada, birleşik bir tabaka ve parke taşı benzeri morfolojinin varlığını belirleyin (Şekil 1). 300 μL EC ortamı ile üst bölmede ortam değişimi gerçekleştirin.
- Daha sonra, epitel tabakasını oluşturan hücreleri tohumlamak için alt odayı hazırlayın. Alt hazneyi 150 μL RPMI ortamı ile nazikçe yıkayın (1:100 (h/h) Penisilin / Streptomisin (10.000 U / mL),% 5 fetal serumu, 1 μM deksametazon ekleyin).
- Alt bölme için, boşluk başına 200 μL RPMI ortamında (RPMI) asılı kalan 0.5 x 106 H441 hücresi tohumlayın.
- H441 hücrelerinin toplanması
- Hücreleri 5 mL PBS (-/-) ile bir kez yıkayın. PBS'ye 2 mL% 0.25 Tripsin + 1 mM EDTA ekleyin (-/-).
- Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 5 dakika inkübe edin. Kuluçka süresi, katmanın birleştiğine bağlı olarak değişir. 5-7 dakika içinde hücreler tamamen ayrılmalıdır.
- Tripsin aktivitesini 10 mL PBS (+/+) +% 5 FBS ile durdurun, hücreleri toplayın ve 4 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın, peleti 1 mL RPM'de yeniden süspanse edin ve sayın.
- Hücre çözeltisini alt hazneye nazikçe pipetleyerek hazne başına 0,5 x10 6 hücre tohumlayın. Tüm bağlantı noktalarını kapatın ve hücrelerin PET zarına yapışabilmesi için biyoçipi ters çevirin. Biyoçipi baş aşağı tutun ve gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
4. Gün 4 - Gün7: Hücrelerin bakımı ve monositlerin toplanması
- Üst ve alt haznede günlük orta değişimi gerçekleştirin. Üst hazne için, 300 μL EC ortamı ile ortam değişimini gerçekleştirin.
- Alt hazne için 200 μL RPMI+ (RPMI ortamı artı 1:100 (h/h) Penisilin / Streptomisin (10.000 U / mL), 10 ng / mL GM-CSF,% 10 otolog insan serumu, 1 μM deksametazon) kullanın. 7. günde, monositleri tohumlamak için boşluğu hazırlamak için alt hazneyi RPMI+ ile yıkayın.
- Tohum 0.1 x 106 monosit, alt bölmede 200 μL RPMI+ içinde asılı kalır.
- Monositlerin toplanması
- Hücreleri 1 mL PBS (-/-) ile yıkayın ve 37 ° C'de 4 mg / mL Lidokain + 5 mM EDTA ve% 5 CO2 içeren önceden ısıtılmış PBS'de (-/-) 37 ° C'de 7 dakika inkübe edin.
- Hücreleri toplayın ve 7 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin, hücreleri 1 mL RPMI+ içinde yeniden süspanse edin ve sayın. Biyoçip portlarını, hücrelerin zara yapışması için aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
5. Gün 8: Biyoçip perfüzyonu
- Bu noktada, biyoçiplerin akışa bağlanmaya ve perfüze edilmeye hazır olduğundan emin olun. Perfüzyona başlamadan önce boş bir inkübatör hazırlayın ve peristaltik pompayı içine yerleştirin.
- Biyoçiplerin perfüzyonu
- Sterilize edilmiş hortumu biyoçipe takmadan önce, hortumu 200 μL PBS (+/+) ve ardından 200 μL EC ortamı ile yıkayın. Borunun iç çapı 0,5 mm'dir ve daha uzun (20 cm) ve daha kısa (12 cm) kenarlardan oluşur ve iki peristaltik pompa durdurucusu ile bölünmüştür. Boruyu bir kenara koyun ve rezervuarları ortam için hazırlayın.
- Üst ve alt bölmelerde, ilgili taze hazırlanmış hücre kültürü ortamı ile yıkayarak ortam değişimi gerçekleştirin.
- Rezervuarı biyoçipin çıkış tarafına yerleştirin ve rezervuarı boru ile birlikte biyoçipin girişine bağlayın (Şekil 2). Hortumu rezervuara ve biyoçipe bağlayın, böylece rezervuar ile biyoçip arasında dairesel bir ortam perfüzyonu olur.
- Her şey portlara bağlandıktan sonra, rezervuarı 500 μL'lik bir EC ortamı ile doldurun. Biyoçipi, 21 μL/dk akış hızına sahip bir perfüzyon üzerindeki tüpe bağlayın (Şekil 2). Kabarcıkların yerleştirilmesi için perfüzyonun ilk 15 dakikası boyunca yakından gözlemleyin. Her iki odada da günlük olarak orta değişim gerçekleştirin.
6. Gün 9 - Gün 11: Hava-sıvı arayüzünün kurulması
- Perfüzyonu durdurun, rezervuarları boşaltın ve steril bir güvenlik kabini altında taze hazırlanmış besiyeri ile yeniden doldurun. Rezervuarlara 500 μL EC ortamı pipetleyin ve alt hazneyi 200 μL RPMI+ ile nazikçe yıkayın. Perfüzyonu 21 μL/dk'lık bir perfüzyon hızıyla tekrar başlatın.
- Hava Sıvı Arayüzü (ALI)
- ALI'yi 12. günden deneyin sonuna kadar (14. gün) kurun. ALI kültürü sırasında, epitel hücrelerini havaya maruz bırakın.
- ALI kültürünü oluşturmak için, çipteki tüm hücre tiplerini korumak için yeni bir vasküler ortam EC (1:100 (h/h) Penisilin / Streptomisin (10.000 U / mL), 10 ng / ml GM-CSF,% 20 otolog insan serumu, 1μM deksametazon ekleyin) hazırlayın. Bu noktada, ortam daha yüksek bir AS konsantrasyonu (% 20) içerir.
- Steril bir güvenlik kabininin altındaki alt bölmedeki tapaları açın ve Şekil 3'te gösterildiği gibi bir hava kabarcığı görünene kadar ortamı dikkatlice ıslatın. Kanaldaki ve haznedeki tüm sıvının çıkarıldığından emin olun ve portları dikkatlice kapatın.
- Rezervuarları EC (-/-) ortamı ile doldurun ve 21 μL/dk akış hızı ile perfüzyon kültürüne devam edin. 14. güne kadar sadece üst haznede besiyeri değiştirin ve epitel hücrelerini sadece hava ile alt haznede tutun.
7. Gün 14: Doku toplama ve analizi
- Biyoçipi akıştan ayırın. Hortumu çıkarın ve mikroskopta hücre birleşmesi olup olmadığını kontrol edin. Alt odadaki hava nedeniyle, hücre katmanları bulanık görünebilir ve görselleştirilmesi zor olabilir. Bu noktada, model daha fazla deney için hazırdır.
- Biyoçipte dokunun fiksasyonu ve boyanması
- Hücre kültürü ortamını çıkarmak için boşlukları PBS (+/+) ile yıkayın. PBS (-/-) içinde çözülmüş 300 μL %4 paraformaldehit (PFA) pipetleyin ve alt hazneye 200 μL pipetleyin ve RT'de 10 dakika inkübe edin.
NOT: PFA gibi sabitleme kimyasallarıyla çalışırken çeker ocak kullanın. Atıkları uygun şekilde toplayın ve atın. - Hazneleri 3x PBS (+/+) ile yıkayın. Fiksasyondan sonra, biyoçipleri 4 ° C'de saklayın veya doğrudan hücrelerin immünofloresan boyaması için kullanın.
- Geçirgenlik için, PBS'de (+/+) 300 μL% 0.25 Triton X-100 pipetleyin. RT'de 30 dakika inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, her iki odayı PBS (+/+) ile yıkayın ve her iki odadaki PBS'de (+/+) 300 μL% 3 Sığır serum albümini (BSA) pipetleyin. RT'de 1 saat inkübe edin.
- Bu arada, immünofloresan boyama için antikor panelini hazırlayın. Antikor panelini immünofloresan boyamaya hazırlamak için, antikorları seyreltmek için yeterli miktarda %3 BSA içeren bir tüp kuruldu. Her zar için 50 μL antikor dilüsyonları kullanın. Primer antikor panelleri için 1:100 ve sekonder antikor panelleri için 1:200 seyreltme oranı kullanın. Ek olarak, ikincil antikor paneli için DAPI'yi 1: 2.000 seyreltme oranında hazırlayın. Karşılık gelen antikorlar için bakınız (Tablo 1).
- Biyoçip içindeki hücrelere doğrudan erişmek için yapıştırma folyosunun çıkarılması gerekir. Mikroakışkan odalarını açmak için, boşluğun dışından tam bir kesim yapın ve yapıştırma folyosunu çıkarın. Neşter ile biyoçipe kapatılmış kenarları çıkararak zarı kesin.
NOT: Neşterin keskinliğinden kaynaklanan herhangi bir zar hasarını ve yaralanmayı önlemek için bu adım sırasında hassas ve doğru bir şekilde çalışın. - Zarı biyoçipten ayırdıktan sonra, zarı iki parçaya bölün. Membran parçalarını bir cımbızla toplayın ve boyama için mikroskobik bir slayt üzerine yerleştirin.
- Membran parçası başına 50 μL antikor çözeltisi pipetleyin. Gece boyunca 4 °C'de ışıktan korunarak inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, zarı 500 μL PBS'ye (-/-) 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve zarı 3x'i PBS'de (+/+) her biri 5 dakika boyunca yıkayın. Yıkadıktan sonra, 50 μL ikincil antikor solüsyonunu pipetleyin ve RT'de ışıktan korunarak 1 saat inkübe edin.
- Membranı PBS (+/+) 3x ile her biri 5 dakika boyunca yıkayın. Bu arada, deney için mikroskobik slaytları hazırlayın ve etiketleyin. Sürgünün üzerine bir damla montaj ortamı yerleştirin ve ilgili membranı yerleştirin. Bu adımı tüm membranlar için tekrarlayın. Sonunda, membranın üstüne bir damla daha montaj ortamı koyun ve bir kapak camı kullanın. 4 °C'de saklayın.
- Hücre kültürü ortamını çıkarmak için boşlukları PBS (+/+) ile yıkayın. PBS (-/-) içinde çözülmüş 300 μL %4 paraformaldehit (PFA) pipetleyin ve alt hazneye 200 μL pipetleyin ve RT'de 10 dakika inkübe edin.
Sonuçlar
Morfolojik değişikliklerin ve işaretleyici proteinlerin ekspresyonunun incelenmesi, immünofloresan boyama kullanılarak gerçekleştirilebilir. 14 gün boyunca birlikte kültürlendikten sonra, vasküler ve epitel tarafları, ilgili hücre belirteçlerinin ekspresyonu için analiz edilir. Bu yöntem, enfeksiyonla ilgili fonksiyonel bir biyolojik okuma olarak hastalık modellemesi için gerekli olan vasküler ve epitel bileşenlerinin etkileşimlerini ve bütünlüğünü incelemek için kullanışlıdır. İmmünofloresan boyama, sitokin salınımı, LDH salınımı gibi hücre ölüm belirteçlerinin atık analizi ve hücrelerin morfometrisindeki değişiklik dahil olmak üzere niceliksel analiz, morfolojik değerlendirme ve fonksiyonel tahlillerle desteklenebilir5. Vasküler tarafta, VE-kaderin gibi endotel hücre bağlantı proteinlerinin bütünlüğü ve morfolojisi, birleşme ve endotel bariyeri oluşumunudeğerlendirmek için incelenebilir 6 (Şekil 4A). Perfüzyondan sonra, endotel hücre tabakası, endotel hücre sınırlarında açıkça yapılandırılmış bir VE-kaderin ekspresyonu ile birleşmelidir. Membranın alt kısmı, E-kaderin ve Yüzey Aktif Madde Protein A (SP-A)7 gibi epitel belirteçleri için immün olarak boyanabilir. Pulmoner yüzey aktif maddenin önemli bir bileşeni ve karmaşık bir lipit ve protein karışımı olan SP-A'nın ekspresyonu, epitelyal hava-sıvı arayüzündeki yüzey gerilimini azaltır ve böylece ekshalasyon sırasında alveollerin çökmesini in vivo olarak önler ve uygun akciğer fonksiyonunu ve gaz değişimini korur 6,8. Modelimizde, epitel hücreleri ALI tedavisinden sonra SP-A'yı eksprese eder ve immünofloresan boyama ile görselleştirilebilir (Şekil 4B). Epitel hücre tabakasının birleşmesi ve bütünlüğü, alveolar epitel hücrelerinin önemli bir epitelyal bileşke belirteci olan E-kaderin için immünofloresan boyama ile doğrulanabilir (Şekil 4C). Makrofajların varlığı, makrofaj yapıcı protein CD686 için immünofloresan boyama ile doğrulanabilir (Şekil 4C). Viral, bakteriyel veya fungal enfeksiyonu incelemek için lütfen Deinhardt-Emmer ve ark.6, Schicke ve ark.7 ve Hoang ve ark.9'da sağlanan enfeksiyon modelleriyle ilgili ayrıntıları bulun.
Şekil 1: 3. günde biyoçipte birleşen bir HUVEC tabakasının temsili görüntüsü. Görüntü, 10x büyütmeli parlak alan mikroskobunu göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Çip üzerinde alveol ve ALI indüksiyonu için kurulum. (A) Çip üzerinde alveol modeli için perfüzyon kurulumunun temsili görüntüsü ve (B) ortamı emerek ve hücrelere hava vererek odada bir ALI'yi indüklemenin temsili bir görüntüsü. Hazne içinde hava kabarcığı oluşması, hücrelerin havaya maruz kaldığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Çip üzerinde alveolün şematik genel bakışı. 14 günlük kültür için ayrıntılı bir protokol, biyoçip içindeki hücrelerin tohumlanması ve büyütülmesi için önemli adımları gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Endotel ve epitel hücre tabakalarının immünofloresan boyanması. (A) VE-cadherin (turuncu) eksprese eden HUVEC endotel hücreleri, (B) SP-A (kırmızı) ve (C) E-kaderin (turuncu), SP-A (kırmızı) ve CD68 (yeşil) ekspresyonu eksprese eden (B-C) H441 epitel hücreleri. DAPI (mavi) DNA'yı boyar ve hücre çekirdeğini gösterir. Ölçek çubuğu 50 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Kavite | Hücre |
| Üst Boşluk | Endotel (0.4 x 106) |
| Alt Boşluk | Epitel (0.5x106H441+ 1x105 monosit) |
Tablo 1: Biyoçipteki hücre tohumlamasına genel bakış.
Tartışma
Çip üzerinde alveol modeli, insan alveolünün çok katmanlı bir doku modelini temsil eder ve akciğer epitel hücreleri, endotel hücreleri ve makrofajlar dahil olmak üzere alt solunum yolunun temel hücre tiplerini entegre eder ve endotel astarının orta perfüzyonu ile bir ALI'de organotipik bir düzenlemede kültürlenir. Farklı katmanlardaki hücreler, hücreler arası epitel bariyerlerinin oluşturulmasında merkezi olan, akciğer epitel hücrelerinin kalsiyuma bağımlı bir adezyon molekülü olan E-kaderin gibi spesifik hücre işaretleyici proteinleri eksprese eder 5,10. E-kaderin, fiziksel bir bariyer elemanı oluşturur ve çevredeki zararlı patojenlere ve maddelere karşı immünolojik yanıtı kontrol eder10,11. H441 epitel hücreleri ayrıca, immünomodülatör ve antibakteriyel aktiviteyearacılık ederek enfeksiyona karşı konak savunmasının ilk hattında da çok önemli olan yüzey aktif madde proteini A'yı eksprese eder 8. Bağışıklık hücrelerinin alveol modeline entegre edilmesi, hücresel karmaşıklığını arttırır, böylece enflamatuar tetikleyicilere, yani enfeksiyon sırasında bağışıklık tepkisini daha iyi çoğaltır. Bu bağlamda, model, influenza virüsü A ve insan fırsatçı patojeni Staphylococcus aureus'un (S. aureus) ko-enfeksiyonunu incelemek için kullanılmıştır5. Çalışmada, epitel hücrelerinin viral enfeksiyonunun, endotel hücrelerinde önemli hasara neden olan ve bariyer fonksiyonu kaybına yol açan önemli bir enflamatuar yanıtı tetiklediği pnömonide bir ko-enfeksiyon mekanizması ortaya çıkarılmıştır. Başka bir çalışmada, model, S. aureus enfeksiyonunun, muhtemelen bakteriyel proteazlara bağlı olarak, akciğerlerde çok önemli bir bağışıklık savunma bileşeni olan yüzey aktif madde protein-A'nın (SP-A) hücre dışı seviyelerini azalttığını göstermek için kullanıldı6. SP-A'nın ekspresyonu, S. aureus veya influenza virüsü A'dan doğrudan etkilenmezken, özellikle makrofajların varlığında bakteriyel enfeksiyonlara yanıt olarak yüksek oranda üretilen bir sitokin olan TNF-α tarafından önemli ölçüde aşağı regüle edilir. Bu sonuçlar, bakteriyel mono ve süper enfeksiyonların akciğerdeki SP-A seviyelerini düşürebileceğini ve potansiyel olarak bakteriyel pnömoninin sonucunu kötüleştirebileceğinigöstermektedir 6. Ayrıca, alveol modeli, alveolün Aspergillus fumigatus ile mantar enfeksiyonunu ve immünofloresan boyama ve sitokin profillemesi dahil olmak üzere moleküler biyolojik tahlillerle birlikte yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve algoritma tabanlı görüntü analizinden yararlanarak antifungal ilaçların etkinliğini incelemek için kullanılmıştır7. Çip üzerinde alveolde invaziv pulmoner aspergillozun modellenmesi, mantarın büyümesini kısmen engelleyebilecek insan makrofajlarının temel işlevlerini ortaya çıkardı. Makrofajlar, artan sayıda invaziv mantar hifleri ile ilişkili olan proinflamatuar sitokinlerin ve kemokinlerin salınmasında merkezi bir rol oynadı. Ek olarak, çalışma, fungistatik ilaç kaspofunginin mantar büyümesini etkili bir şekilde sınırladığını ve diğer çalışmalardan elde edilen bulgularla uyumlu olarak mantar yapısında morfolojik değişikliklere neden olduğunu doğruladı. Bu çalışmalar, enfeksiyonun hücresel hedeflerini belirlemek ve ilaçları klinik olarak anlamlı konsantrasyonlarda test etmek için model platformunun potansiyelini doğrulamaktadır.
Çip üzerinde alveolün kurulması sırasında göz önünde bulundurulması gereken birkaç husus vardır. Hassas hücre tohumlama, tek tip hücre dağılımı ve katman oluşumu elde etmek için kritik öneme sahiptir. Hücre katmanlarının bütünlüğünü ve işlevselliğini tehlikeye atabilecek şekilde birbirlerini aşırı büyütmeden birleşme elde etmek için hücrelerin uygun yoğunlukta tohumlandığından emin olun. ALI kurulum işlemi sırasında, ortamı apikal taraftan dikkatlice çıkarın ve kontaminasyonu önlemek için portları kapatın. Sıcaklık, CO2 seviyeleri ve ortam bileşimi gibi optimal ko-kültür koşullarının korunması, hem endotel hem de epitel hücrelerinin hayatta kalması ve etkileşimi için kritik öneme sahiptir. Hücre katmanlarını rahatsız etmekten veya hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçınmak için orta değişiklikleri her zaman dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Kontaminasyon riskini en aza indirmek için nazikçe pipetleyin ve kullanılan tüm ekipmanların steril olduğundan emin olun. Hava kabarcıklarını önlemek için yavaşça pipetleyin ve orta değişiklikler sırasında baloncukların kaçmasına izin vermek için çipi eğin. Kontaminasyonu en aza indirmek için temiz, steril ve kontrollü bir ortamda çalışın. Modelle sonraki deneyler için 3B modeli oluşturmak ve sürdürmek için gereken karmaşıklığı ve hassasiyeti göz önünde bulundurun. Hücre katmanları doğru şekilde oluşmuyorsa, donöre ve partiye bağlı olarak hücre büyümesinde farklılıklar olabileceğinden, hücre yoğunluğunu ve hücre gruplarını optimize etmeyi düşünün.
Model, mevcut yöntemlere göre önemli iyileştirmeler sunarken, bazı sınırlamaların dikkate alınması gerektiğini de kabul etmek önemlidir. Böyle bir sınırlama, mikroakışkan cihazın çalışmasıyla ilişkili karmaşıklık ve maliyettir. Çip üzerinde organ modellerini çalıştırmak, çip üzerinde alveol modelini benimsemek için mikroakışkanlarda özel ekipman ve uzmanlık gerektirir. Ek olarak, bu model alveolar ortamın birçok temel özelliğini başarılı bir şekilde kopyalayabilse de, in vivo olarak bulunan tüm hücresel etkileşimleri ve mekanik kuvvetleri tam olarak kopyalayamaz. Örneğin, model kapsamlı bir bağışıklık sistemine veya insan akciğerindeki tüm hücre tiplerine sahip değildir, bu da patojen-konak etkileşim çalışmalarının doğruluğunu etkileyebilir.
Bu sınırlamalara rağmen, çip üzerinde akciğer modeli, Transwell sistemleri gibi geleneksel 2D hücre kültürlerine kıyasla ilerlemeler sunar. Model, dinamik, perfüze bir ortamda çok katmanlı bir dokuda bir hava-sıvı arayüzü, endotel ve epitel hücreleri ve bağışıklık bileşenlerini bir araya getirerek, akciğer fizyolojisini, hastalığını ve tedavi yanıtlarını in vitro olarak incelemek için fizyolojik olarak daha ilgili bir yaklaşımı temsil eder. Bu, insan solunum yolu enfeksiyonları hakkındaki anlayışımızı ilerletmek ve daha etkili tedaviler geliştirmek için çok önemlidir. Modelin biyofiziksel ve biyokimyasal ipuçlarını hassas bir şekilde manipüle etme yeteneği, hastalığın ilerlemesi ve ilaç etkisi mekanizmalarını incelemek için önemli bir özelliği temsil eder. İnsan hücresi materyalinin kullanılması, hayvan deneylerinde görülen türler arası farklılıkları daha da azaltabilir. Çoklu biyobelirteç analizlerinin entegrasyonu, tek bir deneyden elde edilebilecek verilerin derinliğini ve genişliğini daha da artırır ve bu da in vitro deneylerin maliyetlerinin azaltılmasına katkıda bulunur. Sınırlamalarını kabul etmekle birlikte, çip üzerinde akciğer modeli, solunum yolu hastalığı araştırmalarında ileriye doğru atılmış önemli bir adımı temsil ediyor ve geleneksel yöntemlere daha doğru, etik ve verimli bir alternatif sunuyor.
Açıklamalar
K.R., Dynamic42 GmbH'nin CEO'sudur ve şirkette hisse sahibidir. A.S.M., Dynamic 42 GmbH'nin bilimsel danışmanıdır ve şirkette hisse sahibidir. Diğer tüm yazarların çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
H.K. ve A.S.M., Leibniz Derneği'nin Stratejik Ağı finansman hattı tarafından finanse edilen Leibniz Bilim Kampüsü InfectoOptics Jena'dan sağlanan finansmanı kabul etti. M.A. ve A.S.M., Federal Federal Meclis'in bir kararı temelinde Federal Ekonomi ve Enerji Bakanlığı tarafından finanse edilen IGF projesi IMPROVE tarafından desteklendi. A.S.M ayrıca, Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860 kapsamında Microverse Mükemmeliyet Dengesi Kümesi'nin mali desteğini de kabul etti.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Sarf malzemeleri< / güçlü > | |||
| Hücre sayma odası slaytları (Kontes) | Invitrogen | C10283 | |
| Hücre kültürü Multiwell Plakaları, 24 Kuyulu, steril | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Hücre kültürü Çok Kuyulu Plakalar, 6 Kuyulu, steril | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| Lamel (24x40mm; #1.5) | Menzel-Glä ser | 15747592 | |
| Eko mendil | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Şahinler 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
| Şahinler 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI | |
| Gazlı bez çubuğu | Noba | PZN 2417767 | |
| Eldiven Nitril 3000 | Meditrade | 1280 | |
| Mikroskop slaytları | Menzel-Glä ser | AAAA000001##12E | |
| Çok Kuyulu Plakalar 24 Kuyulu, steril | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Pasteur pipetleri (cam) 150mm | Yardımcı | 40567001 | |
| Pasteur pipetleri (cam) 230mm | Yardımcı | 40567002 | |
| Yuvarlak tabanlı tüpler (PS, 5mL) | Falcon | 352052 | |
| Güvenlik-Multifly-Set, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 | |
| Neşterler | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
| Serolojik pipetler 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
| Serolojik pipetler 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
| Serolojik pipetler 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
| Serolojik pipetler 50mL | Greiner Bio-One | 768 160-TRI | |
| Serolojik pipetler 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
| S-Monovette, 7,5ml Z-Jel | Sarstedt | 1.1602 | |
| S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
| Softasept N | Braun | 3887138 | |
| T25 şişesi | Greiner Bio-One | 690 960 | |
| Uçlar steril 10 ve mikro; L | Greiner Bio-One | 771 261 | |
| Uçlar steril 1250 ve mikro; L | Greiner Bio-One | 750 261 | |
| Uçlar steril 300 ve mikro; L | Greiner Bio-One | 738 261 | |
| Uçlar steril olmayan 10 ve mikro; L | Greiner Bio-One | 765 290 | |
| Uçlar steril olmayan 1000 ve mikro; L | Greiner Bio-One | 739 291 | |
| Uçlar steril olmayan 200 ve mikro; L | Greiner Bio-One | 686 290 | |
| Cımbız (Prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | |
| Kimyasallar | |||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 | |
| Etanol %96 | Nordbrand-Nordhausen | 410 | |
| Floresein izotiyosiyanat (FITC)-dekstran (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Floresan Montaj Ortamı | Dako | S3023 | |
| Metanol | VWR | 20847.295 | |
| Saponin | Fluka | 47036 | |
| Tergazyme | Alconox | 1304-1 | |
| Hücre kültürü | |||
| Kollajen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
| EDTA çözeltisi | Sigma-Aldrich | E788S | |
| Endotel Hücre Büyüme Ortamı | Promocell | C-22020 | |
| Endotel Hücre Büyüme Ortamı ek karışımı | Promocell | C-39225 | |
| Fetal sığır Serumu | Sigma-Aldrich | E2129-10g | |
| H441 | ATCC | ||
| İnsan rekombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
| Lidokain | Sigma-Aldrich | L5647-15G | |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
| RPMI | Gibco | ||
| Tripan mavi lekesi% 0.4 | İnvitrojen | T10282 | |
| Tripsin | Gibco | 15090-046 | |
| < güçlü > birincil antikorlar< / güçlü > | |||
| Cadherin-5 / VE-Cadherin (keçi) | BD | 610252 | |
| CD68 (tavşan) | CellSignaling | 76437 | |
| E-Cadherin (keçi) | Ar-Ge D | AF748 | |
| SP-A (fare) | Abcam | ab51891 | |
| İkincil antikorlar | |||
| AF488 (eşek anti fare) | Invitrogen | R37114 | |
| AF647 (eşek anti fare) | invitrojen | A31571 | |
| AF647 (eşek anti tavşan) | Invitrogen | A31573 | |
| Cy3 (eşek anti keçi | jackson araştırma | 705-165-147 | |
| Mikroakışkan< / güçlü> | |||
| Chip | Dinamik 42 | BC002 | |
| Erkek Luer Lock (küçük) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
| Erkek mini luer fişleri, dört sıra, PP, yeşil | Mikroakışkan yonga atölyesi | 09-0558-0336-11 | |
| Erkek mini luer fişleri, dört sıra, PP, opak | Mikroakışkan yonga atölyesi | 09-0556-0336-09 | |
| Erkek mini luer fişleri, dört sıra, PP, kırmızı | Mikroakışkan yonga atölyesi | 09-0557-0336-10 | |
| Fişler | Cole Parmer | GZ-45555-56 | |
| Rezervuar 4.5mL | ChipShop | 16-0613-0233-09 | |
| Boru | Dinamik 42 | ST001 | |
| Ekipman< / güçlü > | |||
| Otoklav | Tuttnauer | 5075 ELV | |
| Santrifüj | Eppendorf | 5424 | |
| CO2 İnkübatör | Heracell | 150i | |
| Kontes otomatik hücre sayacı | Invitrogen | C10227 | |
| Akış Sitometresi | BD | FACS Canto II | |
| Dondurucu (-20 &° C; C) | Liebherr | LCexv 4010 | |
| Dondurucu (-80 &°; C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 | |
| Buzdolabı | Liebherr | LCexv 4010 | |
| Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R | |
| Mikroskop | Leica | DM IL LED | |
| Orbital çalkalayıcı | Heidolph | Reax2000 | |
| Peristaltik pompa | REGLO Dijital MS-4/12 | ISM597D | |
| Pipetler 10 ve mikro; L | Eppendorf Research plus | 3123000020 | |
| Pipetleri 100&mikro; L | Eppendorf Research plus | 3123000047 | |
| Pipetleri 1000&mikro; L | Eppendorf Research plus | 3123000063 | |
| Pipetleri 2.5 ve mikro; L | Eppendorf Research plus | 3123000012 | |
| Pipetleri 20&mikro; L | Eppendorf Research plus | 3123000039 | |
| Pipetleri 200&mikro; L | Eppendorf Research plus | 3123000055 | |
| Terazi | Sartorius | 6101 | |
| Terazi | Sartorius | TE1245 | |
| Steril tezgah | Kojair | Biowizard SL-130 | |
| Su banyosu | Julabo | SW-20C | |
| Floresan Mikroskop Kurulumu | |||
| Apotome.2 | Zeiss | ||
| Aydınlatma cihazı | Zeiss | HXP 120 C | |
| Mikroskop | Zeiss | Axio Observer 5 | |
| Optik Kesit Alma | Zeiss | ApoTome | |
| Güç Kaynağı Mikroskobu | Zeiss | Eplax Vp232 | |
| Software | |||
| ZEN Mavi Baskı | Zeiss |
Kaynaklar
- Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351(2022).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577(2020).
- King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227(2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
Yeniden basım ve izinler
