Ayrıntılı protokolümüz, insan bağırsak mukozasını 3D yapılar ve çeşitli hücre tipleri ile simüle eden, mikrobiyal kolonizasyona yanıt olarak bağışıklık tepkilerinin ve hücresel fonksiyonların derinlemesine analizini sağlayan gelişmiş çip üzerinde bağırsak modelinin oluşturulmasını ve kullanımını özetlemektedir.
Yöntem makalesi
Bağırsak mukozal bağışıklık tepkilerini analiz etmek için immünokompetan çip üzerinde bağırsak modeli
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Epitelyal 3D organotipik, villus benzeri ve kript benzeri yapıları yeniden oluşturan gelişmiş bir çip üzerinde bağırsak modeli geliştirilmiştir. İmmünkompetan model, İnsan Göbek Veni Endotel Hücreleri (HUVEC), Caco-2 bağırsak epitel hücreleri, dokuda yerleşik makrofajlar ve doku içinde kendi kendini organize eden, insan bağırsak mukozasının özelliklerini yansıtan dendritik hücreleri içerir. Bu platformun benzersiz bir yönü, dolaşımdaki insan birincil bağışıklık hücrelerini entegre etme ve fizyolojik alaka düzeyini artırma kapasitesidir. Model, bağırsak bağışıklık sisteminin bakteri ve mantar kolonizasyonu ve enfeksiyonuna tepkisini araştırmak için tasarlanmıştır. Genişletilmiş boşluk boyutu nedeniyle model, geçirgenlik deneyleri, sitokin salınımı ve bağışıklık hücresi infiltrasyonu gibi çeşitli fonksiyonel okumalar sunar ve epitel hücre tabakası tarafından oluşturulan 3D yapıların immünofloresan ölçümü ile uyumludur. Bu vesileyle, hücre farklılaşması ve işlevi hakkında kapsamlı bilgiler sağlar. Çip üzerinde bağırsak platformu, mikrofizyolojik perfüze edilmiş bir biyoçip platformu içinde canlı bir mikrobiyotanın vekilleri ile insan konak dokusu arasındaki karmaşık etkileşimleri aydınlatmadaki potansiyelini göstermiştir.
Giriş
Çip Üzerinde Organ (OoC) sistemleri, geleneksel 2B hücre kültürü ile hayvan modelleri arasındaki boşluğu doldurabilen, gelişmekte olan bir 3B hücre kültürü tekniğini temsil eder. OoC platformları tipik olarak, zarlar veya hidrojeller gibi çok çeşitli iskeleler üzerinde büyütülen dokuya özgü hücreleri içeren bir veya daha fazla bölmeden oluşur1. Modeller, bir veya daha fazla tanımlanmış organotipik fonksiyonu taklit etme yeteneğine sahiptir. Pompalar, hücresel atık ürünlerin uzaklaştırılması, gelişmiş hücresel farklılaşma için beslenme ve büyüme faktörleri sağlanması ve temel in vivo koşulların yeniden oluşturulması için hücre kültürü ortamının sürekli mikroakışkan perfüzyonunu sağlar. Bağışıklık hücrelerinin entegrasyonu ile OoC sistemleri, in vitro 2'de insan bağışıklık tepkisini taklit edebilir. Bugüne kadar çok çeşitli organlar ve fonksiyonel birimler sunulmuştur1. Bu sistemler, ilaç testi 5,7 ve enfeksiyon çalışmaları6,8 için kolaylaştırılabilen vaskülatür 3, akciğer4, karaciğer 2,5 ve bağırsak6 modellerini içerir.
Burada, endotel astarı ve dokuda yerleşik makrofajlarla birleştirilmiş villus benzeri ve kript benzeri yapıların organotipik bir 3D topografyasını oluşturan insan epitel hücrelerini entegre eden bir çip üzerinde insan bağırsağı modeli sunuyoruz. Model, mikroskobik bir slayt formatında mikroakışkan olarak perfüze edilmiş bir biyoçip içinde kültürlenir. Her biyoçip iki ayrı mikroakışkan boşluktan oluşur. Her boşluk, gözenekli bir polietilen tereftalat (PET) zarı ile bir üst ve alt odaya bölünür. Zarın kendisi aynı zamanda hücrelerin her iki tarafta büyümesi için iskele görevi görür. Zarın gözenekleri, hücre katmanları arasında hücresel karışmayı ve hücre göçünü mümkün kılar. Her odaya iki dişi luer kilit boyutunda bağlantı noktası ile erişilebilir. İsteğe bağlı olarak, ek bir mini-luer kilit boyutlu bağlantı noktası, üst veya alt bölmeye erişim sağlayabilir (Şekil 1).
OoC platformu, tek bir deneyden elde edilebilecek bir dizi okuma sunar. Çip üzerinde bağırsak, hücre işaretleyici ekspresyonu, metabolizasyon oranları, bağışıklık tepkisi, mikrobiyal kolonizasyon ve enfeksiyonve bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için perfüze edilmiş 3D hücre kültürü, atık su analizi ve floresan mikroskobunu birleştirmeye yönelik olarak uyarlanmıştır 3,6,8. Model, dokuda yerleşik bağışıklık hücrelerini ve canlı mikroorganizmaların konakçı doku ile doğrudan temasını içerir, bu da yayınlanan diğer modellere kıyasla bir avantajdır9. Ayrıca, epitel hücreleri, canlı bir mikrobiyota ile kolonizasyon için fizyolojik olarak ilgili bir arayüz sağlayan üç boyutlu yapılar halinde kendi kendini organize eder6.
Protokol
Bu protokol, birincil insan monositlerini izole etmek için sağlıklı donörlerden biyoçip başına ~ 20 mL taze kana erişim gerektirir. Tüm bağışçılar, Jena Üniversite Hastanesi etik kurulu tarafından onaylanan bu çalışmaya katılmak için yazılı, bilgilendirilmiş onam verdiler (izin numarası 2018-1052-BO). Malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın. Tüm çözeltilerin ve ortamların bileşimi hakkında ayrıntılar için Tablo 1'e bakın.
1. Genel biyoçip işleme açıklamaları
- Bir rezervuar şeridini dikkatlice ayırın ve tek rezervuarlar ve kapaklar elde etmek için ısıtılmış bir bıçak kullanarak kapakları çıkarın. Silikon borunun tam oturması için kapağın deliğini genişletin.
- Silikon borunun iç çapı 0,5 mm'dir, asimetriktir ve iki peristaltik pompa durdurucu ile daha uzun (20 cm) ve daha kısa (12 cm) kenarlara ayrılmıştır. Bir tüpü bir erkek luer kilit bağlayıcısına ve tüpün karşı tarafındaki kapağa bağlayarak biyoçip başına her simetriden iki tüpü birleştirin. Ayrıca biyoçip başına dört rezervuar monte edin.
NOT: Hortumları ve rezervuarları önceden hazırlayın ve kullanmadan önce otoklavlayarak sterilize edin. Silikon borunun sınırlı bir ömrü olduğundan, 3-5 deneyden sonra boruyu değiştirin. Uyuşturucu testi gibi belirli araştırma ilgi alanları için, her deney için yeni borular hazırlanması tavsiye edilir. Bu protokolün birçok adımı paralel olarak çalışır; Şekil 2'de gösterildiği gibi bir günde gerçekleştirilen farklı adımları vurgulayan genel bakış şekline bakın.
Şekil 1: Çip üzerinde bağırsak modelinin şematik gösterimi. (A) Biyoçip enine kesitsel bir görünümde sunulmaktadır. (B) Tüm biyoçipin yanı sıra düz, çıkarılabilir PET membranın boyutu görülebilir. Dişi luer kilit boyutu portları dahil olmak üzere üst haznenin toplam hacmi, alt hazne için sırasıyla 290 μL ve 270 μL'dir. (C) Bağırsak biyoçipinin şematik bir bileşimi, farklılaşmış bağışıklık hücreleri ve bir mukus tabakası dahil olmak üzere villus benzeri ve kript benzeri yapılara benzeyen üç boyutlu büyüme epiteli görülebilir. PET zarın diğer tarafı endotelyal bir tek tabaka ile kaplıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Model oluşturma zaman çizelgesine ve deney düzeneğine şematik genel bakış. Bu şekil, sunulan protokolün şematik genel bakışını göstermektedir. Hücrelerin tohumlanması ve LPS ile epitel zorluğu gibi önemli prosedürler oklarla gösterilir. Kısaltmalar: HUVEC'ler = insan umbilikal venöz endotel hücreleri; LPS = lipopolisakkarit. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Biyoçip sterilizasyonu
- 15 cm çapında,% 70 denatüre edilmemiş etanol ile steril bir cam Petri kabını doldurun. Biyoçipi, biyoçipin tüm portları tamamen etanol çözeltisi ile kaplanacak şekilde içine yerleştirin.
- Bağlantı noktası başına iki kez, çipin tüm odalarından 1 mL p etanol çekin. Oda sıcaklığında (RT) 45-60 dakika inkübe edin.
NOT: Biyoçipin içinde hava sıkışmadığından emin olun. Bu noktadan itibaren biyoçip sistemine hava girmemeli ve boşluklar sıvı ile dolu kalmalıdır. - Petri kabındaki etanolü çıkarın ve tüm portlar tamamen kaplanana kadar steril çift damıtılmış su (ddH2O) ile değiştirin. Yine, port başına iki kez, biyoçip boşluğundan 1 mL ddH2O çekin. Petri kabındaki ddH2O'yu yenileyin ve işlemi tekrarlayın.
- Petri kabındaki tüm sıvıyı çıkarın. Bundan sonra, tamamen sterilize edilmiş biyoçipleri, steril bir ortamın dışında olduklarında kapalı Petri kabının içinde saklayın. Biyoçip içindeki sıvının buharlaşmasını azaltmak için Petri kabına 2-5 mL ddH2O'luk küçük bir rezervuar (örneğin, 50 mL'lik bir tüpün kapağı) ekleyin.
NOT: Biyoçipler kullanılıncaya kadar steril bir ortamda muhafaza edildiği takdirde 3 gün öncesine kadar sterilize edilebilir. Bu, tek bir günde iş yükünde esneklik sağlar.
3. HUVEC'in hasadı ve tohumlanması
NOT: İnsan umbilikal venöz endotel hücreleri (HUVEC'ler),10'dan önce yayınlandığı gibi umbilikal kordlardan izole edildi.
- HUVEC'leri tohumlamadan önce, zarı insan kollajen IV ile kaplayın. Bunun için, Dulbecco'nun magnezyum ve kalsiyum (PBS +/+) içeren fosfat tamponlu tuzlu suyunda bir kollajen stok çözeltisinin (Tablo 1) 1:100 oranında seyreltilmesini hazırlayın. İlgili hazneye 350 μL seyreltilmiş stok çözeltisi ekleyin. RT'de 5 dakika inkübe edin.
NOT: Biyoçipi steril başlıkta tutuyorsanız, fazla ortamı toplamak için altına steril bir doku yerleştirmenizi öneririz. - Kalan kollajen ve asetik asidi yıkamak için tüm odaları 350 μL PBS +/+ ile iki kez yıkayın. Daha sonra, her odaya 350 μL endotel hücre büyümesi (EC) -ortamı ekleyin.
NOT: Buradan biyoçipler hücre tohumlaması için hazırdır ve kullanılana kadar 37 °C'de saklanabilir.
Sonuçlar
Bu temsili sonuçlar, çip üzerinde bağırsak modelinin farklı doku katmanlarını gösterir. Protokol bölüm 11'de tarif edildiği gibi immünofloresan lekelidirler. Görüntüler epifloresan veya konfokal floresan mikroskobu ile z-yığınları olarak çekildi ve ortogonal bir projeksiyona işlendi. Mikroskobik kurulum ve yazılım hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Şekil 5, HUVEC'ler ve makrofajlardan oluşan bariyer oluşturan bir endotelyal tek tabaka olan vasküler tabakayı göstermektedir. Endotel hücreleri için VE-Cadherin ve von Willebrand faktörü ve makrofajlar için CD68 gibi temsili hücresel belirteçler boyanır. C2BBe1 hücrelerinden oluşan üç boyutlu epitel tabakası Şekil 6 ve Şekil 7'de gösterilmiştir. Doku bütünlüğü, E-Cadherin ve ZO-1'in boyanması ile doğrulanır. Beklenen tüm doku belirteçlerinin ve doku polarizasyonunun ayrıntılı bir analizi Maurer ve ark.6'da bulunabilir. Şekil 8, bağırsak villus benzeri yapıların üç boyutlu büyümesinden yoksun örnek bir görüntüyü göstermektedir. Tipik bir üç boyutlu hücre katmanıyla karşılaştırıldığında (Şekil 6), lekeli çekirdeklerin sayısı oldukça azalır ve hücreler yalnızca tek katmanlı olarak bulunur. Bu spesifik fenotip, hücre proliferasyonunu inhibe eden hücre kültürü ortamına bir histon deasetilaz inhibitörünün eklenmesiyle oluşturulmuştur. Bariyer geçirgenliği, FITC-dekstran kullanılarak yapılan bir geçirgenlik testi ile değerlendirilir. Şekil 9A'da gösterildiği gibi, fırsatçı patojenik C. albicans ile enfeksiyon üzerine geçirgenlik artmıştır. Enfeksiyon, sitokinler IL-1β, IL-6, IL-8 ve IL-10'un vasküler ortam süpernatanına artan salınımına neden olur (Şekil 9B)8.
Şekil 5: Çip üzerinde bağırsağın sabitlenmiş vasküler tarafı. Beş günlük perfüzyondan sonra vasküler bariyerin temsili immünofloresan görüntüsü. Doku metanol ile fikse edildi. Bir epifloresan mikroskobu ile 1 μm'lik kesitlerden oluşan bir z-yığını alındı ve bu z-yığınının ortogonal bir maksimum izdüşümü görüntülendi. (A) Çekirdek içindeki DNA, DAPI ile boyandı. (B) Tamamen farklılaşmış monosit türevi makrofajlar CD68'i eksprese eder ve vasküler dokunun her yerine yayılır. (C) HUVEC'ler, VE-Cadherin gibi adherens bağlantılarının oluşumu ile doku bütünlüğünü gösteren birleşik bir tabaka oluşturur. Ek olarak, (D) von Willebrand faktörü HUVEC'ler tarafından yüksek oranda ifade edilmektedir. Son olarak, (E) tüm işaretçiler bir katmanda gösterilir. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; HUVEC'ler = insan göbek venöz endotel hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Çip üzerinde bağırsağın sabitlenmiş epitel tarafı. 5 günlük perfüzyondan sonra polarize epitel hücre tabakasının temsili immünofloresan görüntüsü, bağlantı proteinleri E-Cadherin ve ZO-1'i eksprese eder. Doku metanol ile fikse edildi. Epifloresan mikroskobu ile 1 μm'lik kesitlerden oluşan bir z-yığını alındı. Bu z-yığınının ortogonal bir maksimum projeksiyonu görüntülenir. (A) Çekirdeklerdeki DNA DAPI ile boyandı. E-Cadherin ile boyanmış (B) aderens bağlantılarının ve (C) ZO-1 ile boyanmış apikal sıkı bağlantıların oluşumu ile sıkı bir epitel bariyeri gelişir. Sıkı bağlantılar ve aderens bağlantıları, (D) kaplama görüntüsünde görüldüğü gibi apikal hücre zarında birlikte lokalize olur. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltma: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Villus benzeri büyüme ile çip üzerinde bağırsağın sabitlenmiş epitel tarafı. Altı günlük perfüzyondan sonra üç boyutlu epitel hücre tabakasının temsili immünofloresan görüntüsü. Doku Carnoy fiksatifi ile tespit edildi. Konfokal lazer tarama mikroskobu ile 1 μm'lik kesitlerden oluşan bir z-yığını alındı ve (A) bu z-yığınının ortogonal bir maksimum projeksiyonu görüntülendi. Çekirdeklerdeki DNA Hoechst ile boyandı. Ek olarak, doku, insan müsinini lekeleyen bir lektin olan buğday tohumu aglütinini ile boyandı. (B) Epitelin villus benzeri ve kript benzeri yapılarının üç boyutlu büyümesi, z-yığınının x ve y kesitlerinde tespit edilebilir. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltma: WGA = buğday tohumu aglütinini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Villus benzeri büyüme olmaksızın bağırsağın çip üzerinde sabitlenmiş epitel tarafı. Hücre proliferasyonunu önleyen bir histon deasetilaz inhibitörü olan suberoylanilid hidroksamik asit (SAHA) ile tedavi edilen epitel hücre tabakasının temsili immünofloresan görüntüsü. Doku metanol ile fikse edildi. Epifloresan mikroskobu ile 1 μm'lik kesitlerden oluşan bir z-yığını alındı. Bu z-yığınının ortogonal bir maksimum projeksiyonu görüntülenir. (A) Çekirdeklerdeki DNA DAPI ile boyandı. (B)'de adherens bağlantıları E-Cadherin ile, (C)'de ise sıkı bağlantılar ZO-1 ile boyanır. Sıkı kavşaklar ve aderans kavşakları, bindirme görüntüsünde (D) görüldüğü gibi birlikte lokalize olur. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltma: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Entegre doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin patojene bağlı bağışıklık tepkisi: Bu şekil Kaden ve ark.8'den değiştirilmiştir. C. albicans SC5314 ile enfekte olmamış (-) veya enfekte (+) çip üzerinde bağırsak modeli, (A) FITC-Dekstran (3-5 kDa) ile geçirgenlik ve (B) sitokin sekresyonu açısından analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm/ortam | Kompozisyon | |
| Kollajen stok çözeltisi | 0.5 mM asetik asit içinde 0.5 mg / mL kollajen IV | |
| İzo-tampon | PBS -/-, 1 mg / mL sığır serum albümin fraksiyonu V, 2 mM EDTA | |
| Monosit farklılaşma ortamı | Hematopoetik hücre ortamı +% 10 insan otolog serumu + 10 ng / mL rekombinant makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) + 10 ng / mL rekombinant granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) | |
| Tripsin ayrışma reaktifi | PBS'de% 0.25 tripsin + 1 mM EDTA -/- | |
| Monosit ayırma reaktifi | PBS'de 4 mg / mL lidokain + 5 mM EDTA -/- | |
| EC şartlandırılmış ortam | EC-medium + insan otolog serumu +10 ng/mL M-CSF + 10 ng/mL GM-CSF | |
| C2-orta | DMEM yüksek glikoz (4.5 g/L) + FBS + %1 GlutaMax + %1 MEM esansiyel olmayan amino asit çözeltisi + 1 mM sodyum piruvat + 10 μg/mL insan holo-transferrin | |
| Floresein izotiyosiyanat (FITC)-dekstran stok çözeltisi | Fenol kırmızısı içermeyen önceden ısıtılmış C2 ortamında 1 mg / mL | |
| Engelleme ve geçirgenleştirme çözümü | PBS'de %3 normal eşek serumu (NDS) + %0.1 saponin +/+ | |
| Boyama çözeltisi | PBS'de% 0.3 normal eşek serumu (NDS) +% 0.1 saponin +/+ | |
| Yıkama çözeltisi | PBS'de saponinin% 0.1'i +/+ | |
| Carnoy'un sabitleyicisi | ` etanol, 0 kloroform, buzlu asetik asit | |
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan çözümlerin listesi ve bileşimi. Kısaltma: PBS -/- = Dulbecco'nun magnezyum ve kalsiyum içermeyen fosfat tamponlu tuzlu suyu.
Tartışma
Sunulan protokol, çip üzerinde immünokompetan bir bağırsak modeli oluşturmak için gerekli adımları detaylandırır. İmmünofloresan mikroskobu, sitokin ve metabolit analizi, akış sitometrisi, protein ve genetik analiz ve geçirgenlik ölçümü gibi spesifik teknikleri ve olası okuma yöntemlerini tanımladık.
Açıklanan model,daha önce tarif edildiği gibi, mukus salgılayan, emici, enteroendokrin ve Paneth hücre benzeri popülasyonların yönlerini temsil eden 3 boyutlu bir bağırsak epitel hücreleri tabakası ile birlikte kültürlenmiş birincil HUVEC'ler, monosit türevli makrofajlar ve monosit türevli dendritik hücrelerden oluşur. Protokol adımlarını gerçekleştirirken bazı kritik noktaların göz önünde bulundurulması gerekir. Tüm adımlarda, mikroakışkan sistem içinde hava kabarcığı oluşumu önlenmelidir. Bu nedenle, biyoçipi veya hortumu tutarken her zaman ters pipetleyin (ikinci duraktan hacmi alın ve yalnızca ilk durağa kadar dağıtın). Biyoçip içindeki hücreler üzerinde yüksek basınç veya kesme kuvvetlerini önlemek için, biyoçipte pipetleme yaparken her zaman nazikçe pipetleyin ve karşı bölmeyi kapalı tutun (örneğin, üst bölmedeki ortamı değiştirirken, alt bölmeyi ilgili tapalarla kapatın). Biyoçip, bir PET zarının iki tarafındaki hücrelerin tohumlanmasına izin verir. Bu nedenle, model, PET zarının altında bağırsak villus benzeri yapılarla veya zar üzerinde yukarı doğru büyüyerek kurulabilir. Araştırma ilgisine bağlı olarak, hücrelerin bir veya diğer oryantasyonunun, akış ortamında asılı kalan dolaşımdaki hücrelerin yerçekimine yardımcı hücre bağlanması gibi fiziksel etkileşim açısından belirli faydaları vardır.
Mikroakışkan ortam akışı nedeniyle, polarize bağırsak hücreleri, yoğun bir sıkı bağlantı ağı ve yapışkan bağlantı noktaları6 ile derin bir apikal doku bariyerini şekillendiren kript benzeri ve villus benzeri yapılara benzeyen üç boyutlu bir doku oluşturur. Ek olarak, entegre doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, bağırsak bariyer fonksiyonunu arttırır ve donöre özgü bağışıklık tepkileri de dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara karşı sitokin ve bağışıklık hücresi yanıtlarının ayrıntılı olarak araştırılmasına izin verir 3,6. Model, insan bağırsağının mikrobiyal kommensallerini (örneğin, Lactobacillus rhamnosus6) ve patojenlerini (örneğin, Candida albicans 6,8) incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir platform sunar. Model, bağırsak mikrobiyal bileşim değişikliklerinin mekanizmalarını ve mukozal immün yanıtın düzenlenmesini araştırmak için kullanıldı6. Çalışmada, bağırsak lümeninin fizyolojik immün toleransının nasıl yeniden oluşturulacağını ve canlı mikroorganizmalar tarafından homeostatik kolonizasyonun nasıl destekleneceğini gösterdik. Ayrıca, modelin luminal tarafının probiyotik Lactobacillus rhamnosus ile ön kolonizasyonu, Candida albicans'ın doku invazyonunu azalttı ve in vivo duruma benzer şekilde vasküler kompartmana translokasyonunu sınırladı. Çalışma, modelin in vitro fizyolojik olarak ilgili koşullar altında bağırsağın mikrobiyal etkileşimlerini, bağışıklık tepkilerini ve patojenite mekanizmalarını inceleme potansiyelini kanıtladı.
Yine de, bu çip platformunun sınırlamaları vardır, yani insan bağırsağını tam olarak temsil edemeyen kanserden türetilmiş bağırsak hücrelerinin kullanımı ve birincil endotel ve bağışıklık hücrelerinin kullanımı. Hipoksik kültür koşulları, insan bağırsağının in vivo durumunu daha iyi yansıtmak için modelin perfüze koşullar altında bir hipoksi inkübatöründe kültürlenmesiyle oluşturulabilir.
Kim ve ark.14,15 tarafından yayınlanan "çip üzerinde bağırsak" modeli gibi diğer OoC platformlarıyla karşılaştırıldığında, sunulan doku modelini oluşturan ilk hücre sayısı yaklaşık 10 kat daha yüksektir. Bu, örneğin, tekil bir deney içinde üç adede kadar immünofloresan boyama panelinin aynı anda analiz edilmesini sağlar. Daha büyük hücre sayıları, akış sitometrisi, western blot analizi ve sitokin profili oluşturma ve laktat dehidrojenaz (LDH) ölçümü gibi hücre kültürü süpernatanları gerektiren diğer standart kullanıma hazır tahliller dahil olmak üzere uç nokta analizlerini daha da kolaylaştırır. Tek bir deneyden birden fazla okuma elde etmek, genel maliyetleri ve deney süresini azaltır. Endüstri arayüzleri ve ayak izleri (çipin mikroskobik kayma formatı, luer lock formatındaki portlar ve 96 kuyulu matris üzerinde hizalanmış) içeren standartlaştırılmış biyoçip platformu sayesinde geniş bir üretici yelpazesinden kullanıma hazır donanım çözümleri mevcuttur. Bu aynı zamanda farklı malzemelerden ve gözenek boyutlarından birçok zarı da içerir. Gözenek boyutu, hücre büyümesini ve doku bütünlüğünü16 ve ayrıca hücre göçünü etkileyebilir.
Özetle, bu protokol, insan bağırsak ortamının önemli unsurlarını kopyalayan ayrıntılı ve uyarlanabilir bir çip üzerinde bağırsak modeli sunar. Bağırsak mikrobiyotası ve bağırsak konak dokusu hakkında, özellikle konak immün yanıtları ve bağırsak patofizyolojisine odaklanarak kapsamlı araştırmalar yürütmek için ölçeklenebilir ve etkili bir platform sağlar. Bu nedenle, model, geleneksel in vitro modeller ile insan biyolojisi arasındaki boşluğu doldurma yeteneğine sahiptir ve bu da onu bağırsak biyolojisi üzerine derinlemesine çalışmalar için önemli bir araç haline getirir.
Açıklamalar
M.R., Dynamic42 GmbH'nin CEO'sudur ve şirkette hisse sahibidir. A.S.M., Dynamic 42 GmbH'nin bilimsel danışmanıdır ve şirkette hisse sahibidir.
Teşekkürler
Çalışma, İşbirlikçi Araştırma Merkezi PolyTarget 1278 (proje numarası 316213987) tarafından V.D.W. ve A.S.M. A.F. ve A.S.M. ayrıca Almanya'nın Mükemmeliyet Stratejisi - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860. kapsamında "Balance of the Microverse" Mükemmeliyet Kümesi tarafından sağlanan mali desteği de kabul eder. Astrid Tannert ve Jena Biyofotonik ve Görüntüleme Laboratuvarı'na (JBIL) konfokal lazer tarama mikroskobu ZEISS LSM980'e erişim sağladıkları için teşekkür ederiz. Şekil 1C ve Şekil 2 Biorender.com ile oluşturulmuştur.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 96 oyuklu plaka siyah, şeffaf alt | Thermo Fisher | 10000631 | Sarf Malzemeleri |
| Asetik asit | Roth | 3738.4 | Kimyasallar |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure, eşek, anti-fare IgG (H + L) | Jackson İmmüno Araştırma | 715-545-150 | İkincil Antikor Vasküler Boyama ve Epitel Boyama |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure, eşek, tavşan önleyici IgG (H + L) | Jackson Immuno Research | 711-605-152 | İkincil Antikor Epitel Boyama |
| Alexa Fluor 647, eşek, tavşan önleyici IgG (H + L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | İkincil Antikor Vasküler Boyama |
| Axiocam ERc5s kamera | Zeiss | 426540-9901-000 | Teknik ekipman |
| Bazal Orta MV, fenol kırmızısı içermeyen | Promocell | C-22225 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Biyoçip | Dinamik 42 | BC002 | Mikroakışkan sarf malzemeleri |
| BSA fraksiyon V | Gibco | 15260-037 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| C2BBe1 (Caco-2 klonu) | ATCC | CRL-2102 | Epitel Hücre Kaynağı |
| Kloroform | Sigma | C2432 | Kimyasallar |
| CO2 İnkübatör | Heracell | 150i | Teknik ekipman |
| İnsan plasentasından kollajen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Lameller (24 x 40 mm; # 1.5) | Menzel-Glä ser | 15747592 | Sarf Malzemeleri |
| Cy3 AffiniPure, eşek, anti-keçi IgG (H + L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | İkincil Antikor Vasküler Boyama |
| Cy3 AffiniPure, eşek, sıçan önleyici IgG (H + L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | İkincil Antikor Epitel Boyama |
| Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| DMEM yüksek glikoz | Gibco | 41965-062 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| DMEM fenol kırmızısı olmayan yüksek glikoz | Gibco | 31053028 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| EDTA çözeltisi | Invitrogen | 15575-038 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Endotel Hücre Büyüme Ortamı | Promocell | C-22020 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Endotel Hücre Büyüme Ortamı ek karışımı | Promocell | C-39225 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Etanol %96, denatüre edilmemiş | Nordbrand-Nordhausen | 410 | Kimyasallar |
| Fetal sığır Serumu | invitrojen | 10270106 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Floresein izotiyosiyanat (FITC)-dekstran (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | Kimyasallar |
| Floresan Montaj Ortamı | Dako | S3023 | Kimyasallar |
| Gentamisin (10mg/mL) | Sigma Aldrich | G1272 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| GlutaMAX Takviyesi (100x) | Gibco | 35050061 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Epitel boyama |
| Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, İnsan Plazma | Kırlangıç | 616397 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| İnsan rekombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| İnsan rekombinant M-CSF | Peprotech | 300-25 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Aydınlatma cihazı | Zeiss | HXP 120 C | Floresan Mikroskobu Kurulumu |
| Lazer Tarama Mikroskobu | Zeiss | CLSM980 | Floresan Mikroskobu Kurulumu |
| Lidokain hidroklorür | Sigma-Aldrich | L5647 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Lipopolisakkarit (LPS) | Sigma | L2630 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Loftex Mendil | Loftex | 1250115 | Sarf Malzemeleri |
| Düşük bağlantı tüpleri (PS, 5 mL) | Falcon | 352052 | Sarf malzemeleri |
| Üst kapak için Luer adaptörü (M) | Mo Bi Tec | M3003 | Mikroakışkan sarf malzemeleri |
| Erkek mini luer tapaları, dörtlü sıra, PP, opak | Mikroakışkan yonga atölyesi | 09-0556-0336-09 | Mikroakışkan sarf malzemeleri |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi | Gibco | 11140 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Metanol | Roth | 8388.2 | Kimyasallar |
| Mikroskobu | Zeiss | Axio Observer 5 | Floresan Mikroskobu Kurulum |
| Mikroskop slaytları | Menzel | MZ-0002 | Sarf Malzemeleri |
| Monoklonal, fare, anti-insan CD68 Antikor ( KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | Primer Antikor Vasküler Boyama |
| Monoklonal, sıçan, anti-insan E-Cadherin antikoru (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | Primer Antikor Epitelyal Boyama |
| Multiskan Go plaka okuyucu | Thermo Fisher | 51119300 | Teknik ekipman |
| Normal eşek serumu | Biozol | LIN-END9010-10 | Kimyasal |
| Optik Kesit | Zeiss | ApoTome | Floresan Mikroskobu Kurulumu |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Fişler | Cole Parmer | GZ-45555-56 | Mikroakışkan sarf malzemeleri |
| Poliklonal, keçi, anti-insan VE-Cadherin Antikoru | R& D Systems | AF938 | Primer Antikor Vasküler Boyama |
| Poliklonal, tavşan, anti-insan Von Willebrand Faktör Antikoru | Dako | A0082 | Primer Antikor Vasküler Boyama |
| Poliklonal, tavşan, anti-insan ZO-1 antikoru | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 61-7300 | Primer Antikor Epitelyal Boyama |
| Güç Kaynağı Mikroskobu | Zeiss | Eplax Vp232 | Floresan Mikroskop Kurulumu |
| Primovert mikroskop | Zeiss | 415510-1101-000 | Teknik ekipman |
| Reglo ICC peristaltik pompa | Ismatec | ISM4412 | Teknik ekipman |
| SAHA (Vorinostat) | Sigma Aldrich | SML0061-25MG | Kimyasallar |
| Saponin | Fluka | 47036 | Kimyasallar |
| S-Monovette, 7.5 mL Z-Jel | Sarstedt | 01.1602 | Sarf malzemeleri |
| S-Monovette, 9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | Sarf malzemeleri |
| Sodyum Piruvat | Gibco | 11360-088 | Hücre kültürü sarf malzemeleri |
| Tankı 4.5 mL | ChipShop | 10000079 | Mikroakışkan sarf malzemeleri |
| Tripan mavi lekesi %0.4Invitrogen | T10282 | Hücre kültürü sarf malzemeleri | |
| Tripsin | Gibco 11538876 | Hücre kültürü sarf malzemeleri | |
| Boru | Dinamik 42 | ST001 | Mikroakışkan sarf malzemeleri |
| Cımbız (Prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | Sarf malzemeleri |
| Buğday Tohumu Aglütininin (WGA) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | W32464 | Epitel Boyama |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | Hücre kültürü sarf malzemeleri, Hematopoetik hücre ortamı |
| Zellkultur Multiwell Platten, 24 Kuyu, steril | Greiner Bio-One | 662 160 | Sarf malzemeleri |
| Zellkultur Multiwell Platten, 6 Kuyulu, steril | Greiner Bio-One | 657 160 | Sarf Malzemeleri |
| Zen Blue Yazılımı | Zeiss | Sürüm 3.7 | Mikroskopi Yazılımı |
Kaynaklar
- Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
- Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. Functional integration of natural killer cells in a microfluidically perfused liver on-a-chip model. BMC Res Notes. 16 (1), 285(2023).
- Raasch, M., et al. Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions. Biofabrication. 7 (1), 015013(2015).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with Staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Kaden, T., et al. Generation & characterization of expandable human liver sinusoidal endothelial cells and their application to assess hepatotoxicity in an advanced in vitro liver model. Toxicology. 483, 153374(2023).
- Maurer, M., et al. A three-dimensional immunocompetent intestine-on-chip model as in vitro platform for functional and microbial interaction studies. Biomaterials. 220, 119396(2019).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Kaden, T., et al. Modeling of intravenous caspofungin administration using an intestine-on-chip reveals altered Candida albicans microcolonies and pathogenicity. Biomaterials. 307, 122525(2024).
- Shah, P., et al. A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface. Nat Commun. 7, 11535(2016).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Mosig, S., et al. Different functions of monocyte subsets in familial hypercholesterolemia: Potential function of cd14+ cd16+ monocytes in detoxification of oxidized ldl. FASEB J. 23 (3), 866-874 (2009).
- Peterson, M., Mooseker, M. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeieton of the c2bbe clones of the human intestinal cell line, caco-2. J Cell Sci. 102, Pt 3 581-600 (1992).
- Shin, W., Hinojosa, C. D., Ingber, D. E., Kim, H. J. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow-dependent physical cues in a microengineered gut-on-a-chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol (Camb). 5 (9), 1130-1140 (2013).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Karra, N., Fernandes, J., James, J., Swindle, E. J., Morgan, H. The effect of membrane properties on cell growth in an 'airway barrier on a chip'. Organs-on-a-Chip. 5, 10025(2023).
Yeniden basım ve izinler
