Yöntem makalesi

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

DOI:

10.3791/66610

⸱

1 Mart 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Tibetan Medicine, University of Tibetan Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy / Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, bileşikler ve protein molekülleri arasındaki bağlanmayı tespit etmek için benzersiz bir yöntemi tanımlar ve minimum protein numune kaybı ve yüksek veri doğruluğu avantajları sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklı moleküller arasındaki etkileşimlerin araştırılması, hastalık patogenezini anlamanın ve ilaç hedeflerinin taranmasının çok önemli bir yönüdür. Tibet tıbbı Vicatia thibetica'da aktif bir bileşen olan umbelliferon, bilinmeyen bir mekanizma ile immünomodülatör bir etki sergiler. CD40 proteini, bağışıklık tepkisinde önemli bir hedeftir. Bu nedenle, bu çalışma, floresan enzim belirteçleri kullanarak CD40 proteini ve umbelliferon arasındaki etkileşimleri analiz etmek için diferansiyel taramalı floresan teknolojisi ilkesini kullanmaktadır. Başlangıçta, protein floresan turuncu boyanın stabilitesi deneysel olarak doğrulandı ve 1:500'lük optimal seyreltme oranı belirlendi. Daha sonra, CD40 proteininin sıcaklıkta erime (Tm) değerinin, konsantrasyondaki bir artışla azalma eğiliminde olduğu gözlendi. İlginç bir şekilde, CD40 proteini ve umbelliferon arasındaki etkileşimin, CD40 proteininin termal stabilitesini arttırdığı bulundu. Bu çalışma, floresan mikroplakalar ve floresan boyalar kullanarak küçük moleküllü bileşiklerin ve proteinlerin bağlanma potansiyelini tespit etmeye yönelik ilk girişimi temsil etmektedir. Teknik, yüksek hassasiyet ve doğruluk, protein stabilitesi, protein yapısı ve protein-ligand etkileşimleri alanlarında umut verici ilerlemeler ile karakterize edilir, böylece daha fazla araştırma ve araştırmayı kolaylaştırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Umbelliferous familyasından bir bitki olan Vicatia thibetica H. Boissieu, Tibet tıbbında yaygın olarak kullanılır ve beş temel bileşenin (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew. ve Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. Esas olarak kuzeybatı Yunnan, batı Sichuan, Tibet ve diğer bölgeler gibi güneybatı Çin'de dağıtılan kurutulmuş kökü, Angelica1'in yerel bir ikamesi olarak hizmet eder. Kokusuyla bilinen kök, genellikle güveç baharatı olarak kullanılır ve Tibet kerevizi olarak adlandırılan yapraklar nefis yemeklere katkıda bulunur. Bu nedenle, Vicatia thibetica sadece eşsiz bir şifalı bitki olarak değil, aynı zamanda Tibet'te bir besin kaynağı olarak da önem taşımaktadır.

Hem yerel hem de uluslararası araştırmalar, Vicatia thibetica'nın adet kanamasını düzenlemek için faydalı olan kan yenileyici ve qi (güç veya enerji) canlandırıcı özelliklere sahip olduğunu göstermektedir. Çarpıntı ve kan eksikliğinden kaynaklanan düzensiz adet dismenoresi semptomlarını ele almak için kullanılır ve vücut bağışıklığının antioksidan düzenlenmesi gibi farmakolojik etkiler gösterir2. Vicatia thibetica'nın alkol özütü, siklofosfamid tarafından indüklenen bağışıklığı baskılanmış farelerde vücut kütlesini ve organ indeksini geri kazanma yeteneğini göstermiştir. Ek olarak, serumdaki süperoksit dismutaz aktivitesini arttırır ve malondialdehit içeriğini azaltır, bu da antioksidan kapasitede bir iyileşme ve lipid peroksidasyonu üzerinde dengeleyici bir etki olduğunu düşündürür 2,3. Aynı zamanda, sadece vücudun hematopoietik işlevini objektif olarak yansıtmakla kalmayıp aynı zamanda bağışıklık sisteminde çok önemli bir rol oynayan kan hücrelerinin ve hemoglobinin sayısını artırır 2,3.

Asiküler kristaller ve acı bir tat ile karakterize edilen umbelliferon, küçük bir moleküler ağırlığa sahiptir, uçucudur ve buharla damıtılabilir. Kolayca süblimleşir, suda düşük çözünürlüğe ve organik maddede yüksek çözünürlüğe sahiptir. Vicatia thibetica'nın ana kimyasal bileşenlerinden biri olan umbelliferon, hidrokortizonun neden olduğu immünosupresyon fare modellerinde hücresel bağışıklık, humoral bağışıklık ve spesifik olmayan bağışıklık üzerinde immünomodülatör etkiler sergiler 4,5.

Tümör nekroz faktörü reseptör süper ailesinin bir üyesi olan hücre yüzey molekülü CD40, bağışıklık hücrelerinde yaygın olarak eksprese edilir6. CD40L olarak da bilinen homolog ligandı CD154, aktive edilmiş T lenfositleri tarafından eksprese edilen bir tip II transmembran proteinidir. CD40 aktivasyonu, dendritik hücrelerin (DC) ve monositlerin yüzeyindeki ko-stimülatör moleküllerin ekspresyonunu yukarı regüle etme kapasitesine sahiptir. Bu işlem, majör histouyumluluk kompleksi (MHC) moleküllerinin antijen sunum fonksiyonunu teşvik eder ve ayrıca CD8 + T hücreleriniaktive eder 7.

Makrofajlar, tümör mikroçevresinin oluşumunda ve düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar ve CD40 aktivasyonu, tümör mikroçevresinin makrofajlar tarafından yeniden şekillenmesini artırabilir8. CD40 sinyal aktivasyonu, B hücrelerinin proliferasyonunu ve aktivasyonunu önemli ölçüde etkiler. B hücreleri, CD40 tarafından aktive edildiğinde, etkili antijen sunan hücreler olarak işlev görebilir. Antijenleri sunarlar, efektör T hücresi aktivitesi oluştururlar ve böylece anti-tümör etkilerine katkıda bulunurlar9. Ayrıca, tümör hücrelerinde CD40 aktivasyonu apoptozu indükleyebilir ve tümör büyümesini inhibe edebilir10. CD40 esas olarak Lyn, Fyn, Syk ve diğerleri dahil olmak üzere reseptör olmayan tirozin protein kinazların aktivitesini kontrol ederek sinyalleri iletir. Ek olarak, Bcl-xL, Cdk4 ve Cdk6 proteinlerini uyarma, Rel/NF-kB transkripsiyon faktörlerini aktive etme ve CG-2 ve PI3K10'u fosforile etme yeteneğine sahiptir.

Diferansiyel Taramalı Floresan (DSF) yöntemi, tampon bileşimi, sıcaklık ve küçük moleküllü ligandlar gibi çeşitli çevresel koşulların protein yapılarının termal stabilitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. DSF için yaygın olarak kullanılan boya, turuncu, çevreye duyarlı, hidrofobik bir boyadır. Normal koşullar altında, protein yapısı katlanır ve hidrofobik segmentini dahili olarak gizler. Sıcaklık arttıkça, proteinin hidrofobik bölgesi daha fazla açığa çıkar ve bu da doğal protein yapısının kademeli olarak parçalanmasına neden olur. Boya, açıkta kalan bu protein kısmına seçici olarak bağlanır ve floresansını arttırır. Tm değerleri daha sonra floresan sinyali algılamadaki11 değişikliklerin izlenmesiyle hesaplanır. Bir dereceye kadar, Tm değerlerindeki değişiklikler, mutasyonlar, tamponlardaki değişiklikler veya ligand bağlanması nedeniyle protein stabilitesindeki değişimleri ölçebilir. Ayrıca, protein katlama işlemi12 sırasında yapısal değişiklikleri gösterebilir. Bu yaklaşım, kesin veriler, geniş bir sıcaklık aralığı, yüksek hassasiyet ve minimum protein numune kaybısunar 13.

Bu çalışmada, floresan tayini, floresan kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) aparatı yerine floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu modifikasyon, floresan kantitatif PCR cihazı olmayan laboratuvarlarda DSF tespitini mümkün kılar, bu da yöntemi daha az karmaşık hale getirir ve cihaz kurulumu için gereken adımları azaltır, böylece deneysel süreci basitleştirir. Ancak, bu yaklaşımın bazı dezavantajları vardır. Karmaşıklık azalırken, prosedür daha hantal hale gelir. Farklı sıcaklıklarda manuel floresan algılaması gereklidir ve sistemden otomatik ve sürekli floresan toplanması sağlanamaz. Bu nedenle, bu çalışma, CD40 proteini ve umbelliferon arasındaki etkileşimi araştırmak için DSF tekniğini kullandı ve Tibet tıbbının moleküler mekanizmalarına yeni bakış açıları sağladı.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bileşik çözelti, protein çözeltisi ve boya, bir PBS çözeltisine dahil edildi. Daha sonra, numuneler, dijital ısıtma çalkalama kuru banyosu kullanılarak kademeli olarak ısıtıldı ve proteinlerin termal stabilitesi, karmaşık sistem içindeki floresan yoğunluğundaki değişimin ölçülmesiyle değerlendirildi. Ayrıntılı adımlar aşağıda özetlenmiştir ve Şekil 1'de protokole genel bir bakış gösterilmektedir.

1. Çözelti hazırlama

  1. 616.75 μL DMSO çözeltisine 0.1 mg umbelliferon ekleyerek 1 mM'lik bir umbelliferon çözeltisi hazırlayın (bkz.
  2. 500 μL ddH 2O çözeltisine 0.1 mg CD40 ekleyerek 200 μg / mLCD40protein çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
  3. 9 μL fosfat tamponlu tuzlu suya (PBS) 1 μL 5000x turuncu boya ekleyerek 500x turuncu boya çözeltisi hazırlayın (bkz.
    NOT: Yukarıdaki işlemleri buz üzerinde gerçekleştirin ve pipet minimum 0,1 μL aralığına sahip olduğundan, sonraki kullanımı kolaylaştırmak için başlangıçta turuncu protein boyasını 10 kat seyreltin.

2. Boya performans testi

  1. 500x turuncu boyayı bir PBS çözeltisine ekleyin ve boya elde etmek için seyreltin: 1:500, 1:1000, 1:2000 ve 1:4000 PBS oranları.
    NOT: DMSO'nun nihai konsantrasyonunun %2'yi (h/v) aşmadığından emin olun.
  2. Floresan mikroplaka okuyucuyu açın ve 10 dakika önceden ısıtın.
  3. Bilgisayarı ve veri toplama yazılımını sırayla açın (bkz. Malzeme Tablosu).
  4. Cihaz'a tıklayın, ilgili floresan mikroplaka modelini seçin ve veri toplama yazılımında Tamam'ı seçin.
    NOT: Cihaz ile yazılım arasında başarılı bir bağlantı sağlamak için veri toplama yazılımını açmadan önce floresan mikroplakanın ön ısıtmayı bitirmesini ve paneldeki sıcaklığı görüntülemesini bekleyin.
  5. Edinme Ayarları'na tıklayın ve veri toplama yazılımında Floresans'ı seçin.
  6. Programı Dalga Boyları arayüzünde düzenleyin: Lm1 = 470 nm, 570 nm ve ardından Tamam'ı seçin.
    NOT: Turuncu boya, 300 nm'de UV ışığı veya 470 nm'de görünür ışıkla uyarılabilir ve emisyon 570 nm'de ölçülebilir.
  7. 100 μL / oyukta 96 oyuklu plakalara farklı konsantrasyonlarda turuncu boya (1:500, 1:1000, 1:2000 ve 1:4000) ve PBS ekleyin.
    NOT: Çözeltiyi PBS'ye eklemeden önce DMSO'da çözün ve boyanın çökelme eğilimi nedeniyle tam çözünmeyi sağlamak için hazırlama işlemi sırasında 2000 x g'da iyice girdaplayın.
  8. 96 oyuklu plakayı cihazın algılama aşamasına yerleştirin, veri toplama yazılımındaki Oku düğmesine tıklayın ve her boya konsantrasyonunun floresansını her seferinde 2 dakika aralıklarla oda sıcaklığında 13 kez ölçün.
  9. Her belirlemeden sonra Dışa Aktar düğmesine tıklayın, XML XLS TXT'ye Aktar'ı seçin, Tüm Plakalar'ı seçin, ardından Çıktı Biçiminde Plaka'yı seçin ve son olarak daha fazla analiz için verileri "XLS" formatında bir klasöre kaydetmek için Tamam'a tıklayın.
    NOT: Bu adımlar, sürekli ölçümün oda sıcaklığında turuncu boyanın otofloresansı üzerindeki etkisini belirlemeye ve optimum boyama konsantrasyonunu belirlemeye yardımcı olur.
  10. Dijital ısıtmalı çalkalama kuru banyosunu açın, ısıtma sıcaklığını 35 °C'ye ve ısıtma süresini 2 dakikaya ayarlayın.
  11. Boyanın optimum seyreltme oranını 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın ve 2 dakika boyunca dijital ısıtma çalkalama kuru banyosuna yerleştirin.
  12. PBS çözeltisini ve 35 ° C'de ısıtılan boyama çözeltisini, oyuk başına 100 μL'lik bir hacimde 96 oyuklu plakaya ekleyin.
  13. 96 oyuklu plakayı cihazın algılama aşamasına yerleştirin ve veri toplama yazılımındaki Oku düğmesine tıklayın.
  14. Isıtma sıcaklığını 40 °C'ye ve ısıtma süresini 2 dakikaya ayarlayın.
  15. 96 oyuklu plakadaki boya solüsyonunu 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne geri pipetleyin ve cihazda 2 dakika ısıtın.
  16. Boya çözeltisinin absorbansını sırasıyla 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ve 95 °C'de test etmek için adım 2.12-2.15 ve adım 2.9'daki işlemleri tekrarlayın.
    NOT: Bu adımlar, 35 °C ila 95 °C arasında bir gradyanda sürekli ısıtma altında turuncu boyanın otofloresan stabilitesinin belirlenmesine yardımcı olur. Hızlı sıcaklık düşüşlerinden veya deneysel hatalara yol açabilecek yanlış sıvının eklenmesinden kaçınmak için hızlı çalışmak çok önemlidir.

3. Proteinin erime sıcaklığının (Tm) tespiti

  1. Sırasıyla 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL ve 1:500 nihai konsantrasyonlar elde etmek için CD40 proteini ve turuncu boyayı PBS çözeltisi ile birleştirin.
  2. CD40 protein çözeltisinin sırasıyla 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ve 95 °C sıcaklıklarda absorbansını değerlendirmek için adım 2.2-2.6 ve adım 2.10-2.16'da belirtilen işlemleri tekrarlayın.
  3. Verileri kaydetmek ve analiz etmek için adım 2.9'u tekrarlayın ve ardından veri analiz yazılımı kullanarak Tm değerini hesaplayın (bkz. Malzeme Tablosu).
  4. Sırasıyla 5 μg / mL, 10 μg / mL, 15 μg / mL, 20 μg / mL, 10 μM ve 1:500 nihai konsantrasyonlar elde etmek için PBS çözeltisine CD40 proteini, umbelliferon ve portakal boyası ekleyin.
    NOT: PBS'de boya, CD40 proteini ve umbelliferonun eşit dağılımını sağlamak için çözelti hazırlama sırasında kuvvetli girdaplama gereklidir.
  5. Sırasıyla 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ve 95 °C sıcaklıklarda CD40-umbelliferone kompleksleri çözeltisinin absorpsiyonunu ölçmek için adım 3.2-3.3'teki işlemleri tekrarlayın.
    NOT: Bu adımlar, umbelliferona optimal CD40 protein bağlanma konsantrasyonunu belirlemeyi amaçlayan CD40 proteini ve CD40-umbelliferone komplekslerinin Tm değerlerini belirlemek için gerçekleştirilmiştir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Turuncu boya, hem oda sıcaklığında hem de yüksek sıcaklıklarda Ex = 470 nm ve Em = 570 nm'de sürekli olarak kararlı floresan uyarımı sergiledi. 1:500'lük bir optimal seyreltme oranı belirlenmiştir (Şekil 2A,B). CD40 proteininin konsantrasyonu 15 μg/mL'nin altında olduğunda Tm değerinin saptanması zor olmuştur (Şekil 3A,B). Bununla birlikte, 15 μg/mL'lik bir konsantrasyonda, CD40 protein konsantrasyonundaki bir artışla 45.79 °C'ye düşen 51.82 °C'lik stabil bir Tm değeri tespit edilmiştir (Şekil 3C,D).

Şekil 3'te gösterildiği gibi, CD40 proteininin umbelliferona bağlanmasının CD40 proteininin Tm değerini etkilediği açıktır. Spesifik olarak, 15 μg/mL ve 20 μg/mL konsantrasyonlarında CD40 proteininin Tm değerleri ve ayrıca 10 μM umbelliferon sırasıyla 62.08 °C ve 65.27 °C'ye yükselmiştir.

figure-results-1
Şekil 1: Protokole genel bakış. Bir floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak DSF prensibine dayalı olarak CD40 proteininin umbelliferona bağlanma kapasitesinin kaydedilmesi işleminin akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Turuncu boya seyreltme oranlarının taranması ve stabilite testleri. (A) Oda sıcaklığında farklı seyreltme oranlarına sahip boyaların floresan stabilitesi. (B) 35-95 ° C'de 1:500 seyreltme oranına sahip boyaların floresan stabilitesi. Hata çubukları ortalama ± SEM, n = 4'ü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: DSF prensibine göre CD40 proteininin umbelliferona bağlanma kapasitesini kaydetmek için bir floresan mikroplaka okuyucu kullanmanın sonuç grafikleri. (AD) Sırasıyla 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL CD40 Proteini ve CD40 + 10 μM umbelliferon Tm Profilleri. Hata çubukları ortalama ± SEM, n = 4'ü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Termal kayma tahlili veya termal floresan tahlili olarak da bilinen DSF, yavaş, programlanmış bir sıcaklık artışı sırasında test numunesinin veya boyanın floresan sinyalindeki değişiklikleri izleyerek numunelerdeki proteinlerin termal denatürasyon sürecini tespit etmek için kullanılan bir tekniktir. Başlangıçta Pantoliano14 tarafından kurulan DSF, yüksek verimli bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Ana prosedür, bilgisayar kontrollü ısıtılmış bir plaka üzerindeki sıcaklığın yükseltilmesini, uzun dalga boylu bir ultraviyole lamba kullanılarak uyarma ışığının yayılmasını ve floresan boyaların proteinlere bağlanmasından kaynaklanan floresan sinyal yoğunluğundaki değişiklikleri yakalamayı içerir.

Proteinlerin üst düzey yapısını karakterize eden çok önemli bir gösterge olan Tm değeri, bir sıcaklık artışı sırasında protein ilacının denatürasyonunun yarısına karşılık gelen sıcaklığı temsil eder. Daha yüksek Tm değerleri, protein denatürasyonu için daha yüksek bir sıcaklık gereksinimi olduğunu gösterir ve bu da daha kararlı bir protein yapısını gösterir. Tm değerlerini tespit etmek için şu anda tanınan yöntem, 1960'larda başlatılan diferansiyel taramalı kalorimetridir (DSC)15. DSC, emilen ve boşaltılan ısı miktarını elde etmek için programlanmış sıcaklık kontrolü altında sıcaklığın bir fonksiyonu olarak test edilen nesneye ve bir referans nesneye iletilen güç farkını ölçer. Termal kararlılık analizi için altın standarttır16,17.

DSF, DSC'ye göre üç avantajı nedeniyle yaygın kullanım kazanmıştır: (1) Daha az numune tüketimi: DSC tipik olarak 400 μL'lik bir numune hacmi gerektirirken, DSF sadece 20-25 μL gerektirir. (2) Daha geniş konsantrasyon aralığı: DSC, önemli bir denatürasyon zirvesi elde etmek için genellikle 0.2-2 mg / mL protein konsantrasyonları gerektirirken, DSF 0.005-200 mg / mL aralığındaki numuneleri analiz edebilir. (3) Daha yüksek numune verimi: DSC bir seferde yalnızca bir numuneyi analiz edebilirken, DSF aynı anda 96 veya daha fazla numuneyi tarayabilir18. Bu avantajlar nedeniyle DSF, protein stabilitesi, protein yapısı ve konformasyonu, protein-ligand etkileşimleri ve protein stabilizatörlerinin, inhibitörlerin, kofaktörlerin ve daha fazlasının etkilerinin incelenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

DSF ve DSC'ye ek olarak, birkaç başka moleküler etkileşim tekniği de mevcuttur. Yüzey plazmon rezonansı (SPR), iki ortamın arayüzünde meydana gelen optik bir fenomendir ve fotonlar veya elektronlar tarafından indüklenebilir. Işık optik olarak yoğun bir ortamdan optik olarak seyrek bir ortama yayıldığında toplam yansımayı içerir. Yüzey plazmon rezonansının meydana geldiği açı SPR açısı olarak bilinir. SPR biyosensörleri, moleküller arası etkileşimleri gerçek zamanlı olarak izlemek için SPR açılarındaki değişiklikleri kullanır 19,20. Mikro Ölçekli termoforez (MST), bağlanmanın neden olduğu biyomoleküllerin boyut, yük ve hidrasyon katmanındaki değişiklikleri tespit ederek biyomoleküler etkileşimleri analiz etmek için kullanılan bir tekniktir. Lazer açılmadan önce, sırasında ve sonrasında numunenin içindeki bir kızılötesi lazer tarafından ışınlanan bölgedeki floresan değişikliklerini kaydeder ve nispeten hızlı belirlemelere olanak tanır21. Biyo-katman interferometrisi (BLI), interferometri spektrumundaki yer değiştirme değişikliklerini izleyerek sensör yüzey reaksiyonlarını ölçer. BLI deneylerinde, bir molekül, kendisine bağlanabilen başka bir molekülü tespit etmek için dalgıç bir sensörün yüzeyinde hareketsiz hale getirilir. Bağlanma etkileşimi, girişim yer değiştirmesini indükler ve bu yer değiştirme değişikliğinin gerçek zamanlı izlenmesi, bağlanma eğrisini22 verir. İzotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC), biyomoleküler bağlanma sırasında salınan veya emilen ısıyı doğrudan ölçerek biyomoleküler etkileşimleri ölçer. Moleküler etkileşimler hakkında kapsamlı termodinamik bilgi sağlar23. Bu moleküler etkileşim teknolojileriyle karşılaştırıldığında, DSF'nin aletler, sarf malzemeleri ve çalıştırma teknikleri için daha düşük gereksinimleri vardır. Çoğu laboratuvarda bileşikler ve proteinler arasındaki etkileşimleri verimli bir şekilde tespit edebilir.

DSF teknolojisinin operasyonel prosedürü nispeten basittir. Başlangıçta, beyaz madde numuneleri, reaksiyon tamponları, floresan boyalar ve aday ligandlar bir reaksiyon sisteminde birleştirilir. Bu sistem daha sonra floresan tayini için ısıtma ve algılama koşullarının ayarlandığı bir floresan PCR cihazına aktarılır24,25. DSF için en yaygın olarak kullanılan protein boyası şu anda turuncu boyadır ve tespit cihazı tipik olarak bir floresan kantitatif PCR cihazıdır26. Bununla birlikte, turuncu boyanın uyarma dalga boyunun 470 nm ve emisyon dalga boyunun 570 nm olması nedeniyle, piyasadaki tüm floresan kantitatif PCR cihazları mükemmel bir eşleşme değildir. Bu nedenle, bu çalışma, protein-ligand etkileşimlerini keşfetmek için yeni bir tespit aracı olarak bir floresan mikroplaka okuyucuyu benimsemektedir.

Bu yaklaşım, floresan kantitatif bir PCR cihazı kullanan DSF'ye göre iki ana avantaj sunar. İlk olarak, floresan enzim işaretleyicisinin dalga boyu aralığı özelleştirilebilir, bu da onu boyanın dalga boyu aralığıyla daha uyumlu hale getirir ve daha doğru floresan tespiti sağlar. İkinci olarak, bir floresan kantitatif PCR cihazının programı bir kez başlatıldıktan sonra durdurulamaz, bu da ısıtma işlemi sırasında herhangi bir sorunu gidermeyi zorlaştırır. Buna karşılık, bir floresan mikroplaka okuyucu, algılama işlemi boyunca sistem oranını ve algılama koşullarını yinelemeli olarak değiştirerek parazitin ortadan kaldırılmasına izin verir. Bununla birlikte, DSF için bir floresan mikroplaka okuyucunun kullanılması, özellikle geleneksel DSF tipik olarak 20-25 μL numune kullanırken, tipik olarak 50-200 μL arasında değişen nispeten büyük miktarda numune gibi bazı dezavantajlarla birlikte gelir.

Bu makalede, 5-20 μg/mL konsantrasyon aralığında CD40 proteini ve umbelliferon kullanılarak Tm'yi tespit etmek için floresan mikroplaka okuyucuya dayalı DSF'nin validasyonu yapılmıştır. Sonuçlar, yöntemin yüksek özgüllüğünü ve doğruluğunu göstererek, Tm tespiti için uygunluğunu doğruladı. Farklı numune konsantrasyonlarında Tm tespit sonuçlarının daha sonraki karşılaştırılması, konsantrasyon arttıkça CD40 proteininin Tm değerinde bir azalma eğilimi ortaya çıkardı ve bu da Tm tespiti üzerinde potansiyel bir konsantrasyon etkisini düşündürdü (Şekil 3). Ayrıca, çalışma, sisteme umbelliferon ilavesinden sonra CD40 proteininin Tm değerinde, ilaveden öncesine kıyasla bir artış tespit etti. Bu, umbelliferonun CD40 proteinine bağlanma yeteneğine sahip olduğunu ve kombinasyonları üzerine CD40 proteininin termal stabilitesinde bir artışa yol açtığını gösterir (Şekil 3).

Protokoldeki kritik adımlar, 2.7 ila 2.16 arasındaki adımlar olarak tanımlandı ve bunların başarılı bir şekilde tamamlanması, protein floresansının sonraki tespitini doğrudan etkiledi. Özetle, bu çalışma, örnek olarak CD40 proteini ve umbelliferon kullanarak, DSF teknolojisi ilkelerine dayalı yeni bir DSF tespit yöntemi oluşturmuştur. Yöntem, bir floresan mikroplaka okuyucu kullanarak proteinler ve ligandlar arasındaki bağlanma kuvvetini etkili bir şekilde analiz etti. Ayrıca, bu teknik, protein stabilitesinin analizi ve protein yapısının araştırılması için genişletilebilir, bu da hücre sinyal yollarının incelenmesinde ve hastalık patogenezinin araştırılmasında DSF teknolojisinin uygulanmasını derinleştirir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tibet Tıbbı Üniversitesi'nin 14. Beş Yıllık Planının (2022ZYYGH12) Çağrışım İnşaatı Projesi'nden, Tibet Tıbbı Üniversitesi Eğitim Bakanlığı'nın Temel Laboratuvarı'nın 2022 Açık Konularından (ZYYJC-22-04), Ningxia'nın Temel Araştırma ve Geliştirme Programından (2023BEG02012) alınan mali destek için içten takdirlerimizi ifade ederiz, ve Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'nin (XKTD2022013) Xinglin Scholar Araştırma Teşvik Projesi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CD40 proteiniMedChemExpressHY-P75408
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
FlexStation 3 çok fonksiyonlu mikroplaka okuyucuShanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTDFlexStation 3
OriginPro 8 yazılımıOriginLab Corporationv8.0724 (B724)
Fosfat tamponlu salin ( 1x)Gibco8120485
SoftMax Pro 7.1Şangay Meigu Moleküler Aletler A.Ş., LTDSoftMax Pro 7.1
SSYPRO turuncu boyaSigmaS5942
UmbelliferoneŞangay Yuanye Biyoteknoloji A.Ş.B21854
(İngilizce)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cairang, N. Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine "five roots". Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136(2022).
  2. Li, L., et al. Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide. Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).
  3. Lu, H., et al. Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice. J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).
  4. Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui. Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).
  5. Lu, Z., Zhang, L. Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice. Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).
  6. Vonderheide, R. H. CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).
  7. Grewal, I. S., Flavell, R. A. CD40 and CD154 in cell-mediated immunity. Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).
  8. Long, K. B., et al. IFNγ and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma. Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).
  9. He, Y., et al. The roles of regulatory B cells in cancer. J Immunol Res. 2014, 215471(2014).
  10. Eliopoulos, A. G., et al. CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily. Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).
  11. Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
  12. Rosa, N., et al. Meltdown: A Tool to help in the interpretation of thermal melt curves acquired by differential scanning fluorimetry. J Biomol Screen. 20 (7), 898-905 (2015).
  13. Hellman, L. M., et al. Differential scanning fluorimetry based assessments of the thermal and kinetic stability of peptide-MHC complexes. J Immunol Methods. 432, 95-101 (2016).
  14. Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
  15. Gorny, H., et al. Combining nano-differential scanning fluorimetry and microscale thermophoresis to investigate VDAC1 interaction with small molecules. J EnzymeInhib Med Chem. 38 (1), 2121821(2023).
  16. Freire, E. Thermal denaturation methods in the study of protein folding. Methods Enzymol. 259, 144-168 (1995).
  17. Phiri, M. J., Mofokeng, J. P., Phiri, M. M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites. Heliyon. 9 (11), 21238(2023).
  18. Zhou, C., Yu, M., Li, W. Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein. Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).
  19. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  20. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  21. Magnez, R., Bailly, C., Thuru, X. Microscale thermophoresis as a tool to study protein interactions and their implication in human diseases. Int J Mol Sci. 23 (14), 7672(2022).
  22. Kamat, V., Rafique, A. Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions. Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).
  23. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
  24. Sharma, R., et al. Atosiban and Rutin exhibit anti-mycobacterial activity - An integrated computational and biophysical insight toward drug repurposing strategy against Mycobacterium tuberculosis targeting its essential enzyme HemD. Int J Biol Macromol. 253, 127208(2023).
  25. Grädler, U., et al. Biophysical and structural characterization of the impacts of MET phosphorylation on tepotinib binding. J Biol Chem. 299 (11), 105328(2023).
  26. Xu, Y., et al. Differential scanning fluorimetry and its application in the study of protein. Chemistry of Life. 38 (03), 351-357 (2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein Termal StabilitesiFloresan Mikroplaka OkuyucuProtein Ligand Etkile imiProtein Erime NoktasFloresan Boya Analizimm n Yan t ProteiniK k Molek l Ba lanmas

İlgili makaleler