Yöntem makalesi

Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

DOI:

10.3791/66613

⸱

24 Mayıs 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center, West Virginia University Health Sciences Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, 7-9 günlük yenidoğan fare kemik iliği hücrelerini izole etmek ve granülosit koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak L929 hücrelerinin bir süpernatantını kullanarak farklılaşmış makrofajlar oluşturmak için enzimatik olmayan ve basit bir yöntemi tanımlar. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, yüzey antijenleri F4/80, CD206, CD11b ve fonksiyonel yeterlilik açısından daha fazla analiz edildi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yetişkin farelerden kemik iliğini izole etmek için çeşitli teknikler iyi bilinmektedir. Bununla birlikte, yenidoğan farelerinden kemik iliğini izole etmek zor ve zaman alıcıdır, ancak bazı modeller için translasyonel olarak ilgili ve gereklidir. Bu protokol, 7-9 günlük yavrulardan kemik iliği hücrelerini hazırlamak için etkili ve basit bir yöntemi tanımlar. Bu hücreler daha sonra daha fazla izole edilebilir veya ilgilenilen spesifik hücre tiplerine farklılaştırılabilir. Makrofajlar, iltihaplanma ve enfeksiyonda önemli bir rol oynayan çok önemli bağışıklık hücreleridir. Gelişim sırasında, neonatal makrofajlar dokunun yeniden şekillenmesine önemli ölçüde katkıda bulunur. Ayrıca, neonatal makrofajların fenotipi ve işlevleri yetişkin meslektaşlarından farklıdır. Bu protokol aynı zamanda L929 şartlandırılmış besiyerinin varlığında neonatal makrofajların izole kemik iliği hücrelerinden farklılaşmasını da ana hatlarıyla belirtir. Diferansiye neonatal makrofajlar için yüzey belirteçleri akış sitometrik analizi kullanılarak değerlendirildi. İşlevselliği göstermek için, fagositik verimlilik ayrıca pH'a duyarlı boya konjuge Escherichia coli kullanılarak test edildi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik iliği, kendi kendini yenileyebilen ve çeşitli hücre soylarına farklılaşabilen hem hematopoetik hem de mezenkimal kök hücre popülasyonlarını kapsar. Kemik iliğindeki hematopoetik kök hücreler miyeloid ve lenfoid soylara yol açar1. Mezenkimal kök hücreler osteoblastlar (kemik), adipositler (yağ) veya kondrositler (kıkırdak) üretir2. Bu hücrelerin, gen terapisi 3,4 dahil olmak üzere hücre biyolojisi ve doku mühendisliği alanında birçok uygulaması vardır. Kemik iliğinde bulunan progenitör hücreler, soya özgü büyüme faktörlerinin varlığında spesifik hücre tiplerine farklılaşır. Eritropoietin, eritroid progenitör hücrelerin proliferasyonunu teşvik eder, granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF), nötrofil kolonilerinin büyümesini uyarır ve trombopoietin, soya özgü büyüme faktörlerinin birkaç örneği olarak trombosit üretimini düzenler5. FACS ve manyetik ile aktive edilmiş hücre sınıflandırma (MACS) işaretli hücre yüzeyi antijeni, spesifik kemik iliği türevli hücre tiplerininizolasyonu ve saflaştırılması için iyi bilinen yöntemlerdir 6.

Yenidoğan çalışmaları, yenidoğan ölümlerinin nedenlerini bulmaya ve prematüre doğumlar sırasındaki komplikasyonları ele almaya doğru ilerlemesine rağmen, doğrudan terapötik gelişim karşılanmamış bir tıbbi ihtiyaç olmaya devam etmektedir. Smith ve Davis, "Pediatrik hastalar terapötik yetimler olmaya devam ediyor" dedi7. Yenidoğanların klinik çalışmalarında küçük örnekler, sonucun yaşam boyu etkileri ve onam almada etik sorunlar gibi çeşitli zorluklar vardır8. Bu nedenle, translasyonel alaka düzeyini elde etmek için yenidoğanlara özgü in vivo ve in vitro çalışma modellerine yüksek talep vardır. Anatomik ve doku seviyeleri, kısa gebelik süreleri ve altlık boyutları arasındaki benzerlikler nedeniyle, kemirgenler en çok çalışılan memeli model sistemidir.

Burada, 7-9 günlük fare yavrularından kemik iliğini izole etmek ve makrofajlara farklılaşma yeteneklerini belirlemek için ayrıntılı, oldukça uygulanabilir ve tekrarlanabilir bir prosedürü açıklıyoruz. Bununla birlikte, farklı farklılaşma sinyallerinin kullanılmasıyla çeşitli hücre soyları elde edilebilir. Ayrıca hücre yüzey belirteçlerinin varlığını ve kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM'ler) için beklenen in vitro fagositik aktivitenin varlığını da gösteriyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedürler Batı Virginia Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı ve Ulusal Araştırma Konseyi tarafından Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun tavsiyelerine göre gerçekleştirildi. Bu çalışma için C57BL/6J fare yavruları kullanıldı. Kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Medya hazırlığı

  1. 5 mL'lik bir santrifüj tüpünde% 10 FBS, 2 mM glutamin, 25 mM HEPES ve penisilin (100 U / mL) / streptomisin (100 μg / mL) ile desteklenmiş 3 mL MEM kültür ortamı hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
  2. Kemik iliği progenitörlerini sıvı nitrojen içinde saklamak için gerekirse,% 10 DMEM,% 80 FBS ve% 10 DMSO içeren dondurma ortamı hazırlayın.
  3. Tam DMEM için,% 10 FBS, 2 mM glutamin, 25 mM HEPES ve penisilin (100 U / mL) / streptomisin (100 μg / mL) ile desteklenmiş DMEM hazırlayın.
  4. Makrofaj farklılaşması için,% 10 FBS, 2 mM glutamin, penisilin (100 U / mL) / streptomisin (100 μg / mL) ve% 10 L929 hücreli süpernatant 9,10,11 ile desteklenmiş DMEM hazırlayın.

2. L929 hücreli süpernatan hazırlığı

  1. Sıvı nitrojen içinde depolanan L929 hücrelerini çözün ve 5 mL tam DMEM içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin.
  2. Hücreleri 5 mL tam DMEM ortamında yeniden süspanse edin ve bunları 2×105 hücre yoğunluğunda bir T25 doku kültürü şişesine tohumlayın. % 0.4 tripan mavisi kullanarak otomatik bir hücre sayacı ile hücreleri sayın. 37 ° C'de% 5 CO2 ile% 70 birleşme noktasına ulaşana kadar inkübe edin.
  3. Hücreleri ayırmak için önce 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 2.5 mL% 0.05 tripsin-EDTA ile değiştirin.
  4. 37 ° C'de% 5 CO2 ile 5 dakika inkübe edin ve 5 mL tam DMEM ekleyin.
  5. Hücreleri toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin.
  6. Hücre peletini 15 mL tam DMEM ortamında yeniden süspanse edin ve bir T75 şişesine aktarın.
  7. Hücreler% 90 birleşmeye ulaşana kadar% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin ve daha sonra ortamı toplayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. M-CSF içeren ortamı 0,45 μm'lik bir filtreden süzün ve -80 °C'de 5 mL'lik alikotlarda dondurun.

3. Hayvan hazırlama

  1. Bir biyogüvenlik kabini altında, 7-9 günlük C57BL/6J fare yavrularını (6 yavrudan oluşan bir çöp) barajdan dikkatlice ayırın ve ayrı bir kafese koyun.
  2. Bir pamuğu 2 mL veterinerlik sınıfı izofluran içinde bir çan kavanozuna veya başka bir muhafaza odasına batırın.
  3. Hazneye bir yavru yerleştirin ve kapağı kapatın. Hareketsiz ve bilinçsiz hale geldiğinden emin olmak için yenidoğanı yaklaşık 90 saniye izleyin.
  4. Yavru bilincini geri kazanmadan önce yavruyu hızla çıkarın ve keskin bir makasla (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) kafasını kesin.
    NOT: Yenidoğanlar, tek başına izofluran inhalasyonu ile ötenazi için yeterince derin nefes almazlar.
  5. Her yavru çıkarıldıktan sonra kabın kapağını kapattığınızdan emin olun. Aynı pamuk topu 5-7 yavru için de kullanılabilir.

4. Yenidoğan kemik iliği izolasyonu

  1. Yenidoğanın vücudunu% 70 etanol ile sterilize edin.
  2. "Forseps ve ince uçlu cerrahi makas kullanarak, aralarına bir kesi yapın.
    karın ve arka bacaklar. Arka bacakların ayağına doğru çekerek cildi çıkarın.
  3. Keskin kenarlı forseps kullanarak kemiklere bağlı bağ dokusunu ve kasları kazıyın.
  4. Tibia ve uyluk kemiğini Şekil 1'de gösterildiği gibi ayırmak ve çıkarmak için makasla kesin. Forseps kullanarak, bu kemikleri buz üzerindeki medya tüpüne yerleştirin. Her yavru için işlemi tekrarlayın.
  5. Kemikleri forseps yardımıyla toplama tüpü olan 40 μm'lik bir süzgecin içine aktarın. Kemikleri ezin ve süzgecin üzerine 3 mL'lik bir şırınga pistonu ile bastırarak iliği serbest bırakın.
  6. Hücre süspansiyonunu 350 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı aspire edin ve eritrositlerin parçalanması için hipotonik bir çözelti olan% 0.2 NaCl'de hafifçe pipetleme yaparak hücreleri yeniden süspanse edin. Çözeltiyi izotonik hale getirmek için hemen% 1.6 NaCl eşit hacimde ekleyin.
  8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin ve lizis çözeltisini çıkarın.
  9. Hemen kullanım için tam DMEM'de yeniden askıya alın veya depolama için dondurma ortamı ve bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
    NOT: Bu çalışmada bu yöntemle 6.55 (± 1.44) × 106 kemik iliği hücresi/yavru elde edilmiştir (Şekil 1E).
  10. Hücreleri -80 °C'de dondurucu ortamda saklayın veya aşağıda açıklandığı gibi hemen kullanın.
    NOT: Yaş nedeniyle, kemikler içlerinden iliği görselleştirecek kadar şeffaf ve berraktır. Kemikleri çekerken dikkatli olmak önemlidir çünkü üzerlerine hafif bir baskı uygulamak iliği serbest bırakmak için yeterli olabilir. Yenidoğan kemiklerindeki ilik, yetişkin kemiklerinde bulunan sağlam bir iplikten ziyade sıvı formundadır. Kemiklerin toplanması sırasında kaçarsa iliği toplamak zordur.

5. Neonatal kemik iliği kaynaklı makrofajların farklılaşması

  1. M-CSF kaynağı olarak% 10 L929 hücreli süpernatant (2.5 mL) içeren 10 mL tam DMEM'de T75 şişesi başına 2 ×10 7 kemik iliği hücresi tohumu. Kültür kaplarını 37 °C'de% 5 CO2 ile 5 gün boyunca inkübe edin. Farklılaşmanın 3. gününde 2 mL L929 şartlandırılmış ortam ekleyin.
  2. Ters çevrilmiş bir mikroskop ve 20x büyütmeli görüntüleme sistemi kullanarak hücreleri günlük olarak mikroskop altında gözlemleyin. Farklılaşma üzerine, makrofajlar yapışık, uzamış ve heterojen görünmelidir (Şekil 2).
  3. Aşağı akış tahlilleri için makrofajları hasat etmek için, farklılaşma ortamını aspire edin.
  4. Yapışmayan hücreleri ve ayrılmaya müdahale edecek serum proteinlerini çıkarmak için hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin.
  5. Şişeye 5 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri hasat edin. Kültür şişesini 5 dakika boyunca% 5 CO2 inkübatörü ile 37 ° C'ye yerleştirin ve 5 mL DMEM ekleyin.
  6. Hücreleri ayırmak için pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin.
  7. Hücre peletini 1 mL tam DMEM'de ayırın ve tripan mavisi kullanarak hücre canlılığını sayın ve kontrol edin. Bu yöntem kullanılarak izole edilen BMDM'ler 7.05 (± 2.52) ×105 hücre/yavrudur (Şekil 1E).
    NOT: Farklılaşmanın ikinci gününde ortaya çıkmaya başlayan mil şeklindeki hücrelerin varlığını gözlemleyin (Şekil 1B, kırmızı oklar). Ortamın rengi sararır ve harcandığını gösterirse, farklılaştırmanın 4. gününde daha fazla L929 koşullu ortam ekleyin; Ortamın tamamen değiştirilmesi önerilmez.

6. İmmünoetiketleme ve akış sitometrik analizi

  1. 100 μL/etiket akış sitometrisi tamponu (2 mM EDTA ve% 0.5 sığır serum albümini ile desteklenmiş PBS) hacminde üretici tavsiyelerine göre 10 μL /10 7 hücreli FcR bloke edici reaktif ile muamele ederek BMDM'lerin spesifik olmayan antikor etiketlemesini (2x105 / etiket) bloke edin. 10 dakika buz üzerinde tutun.
    NOT: Hücreler toplu olarak veya tek tek kuyucuklarda veya tüplerde bloke edilebilir. Sonraki tüm adımlar, 100 μL'lik bir nihai hacimde tek tek hücre işaretleyici etiketi başına miktarları ve hacimleri gösterir.
  2. 200 μL akış sitometrisi tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 525 x g'da santrifüjleyin.
  3. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri, oyuk başına 5 × 105 hücre yoğunluğunda U-tabanlı 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın. 100 μL akış sitometrisi tamponunda 3.000 kat ve 0.625 μL BV786-CD11b, PE-F4/80 ve AlexaFluor488-CD206'ya seyreltilmiş FVS780-Canlı / Ölü hücre sayma boyasını tek tek veya kombinasyon halinde ekleyerek hücreleri boyayın 12,13,14,15. Hücreleri folyo ile kaplı buz üzerinde 45 dakika inkübe edin.
  4. 100 μL akış sitometrisi tamponu ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 525 x g'da santrifüjleyerek yıkayın.
  5. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini nazikçe girdaplayın. Her oyuğa 100 μL% 0.4 paraformaldehit ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  6. 100 μL akış sitometrisi tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 525 x g'da santrifüjleme ile pelet yapın.
  7. Hücreleri 400 μL akış sitometrisi tamponunda yeniden süspanse edin ve bir akış sitometresi kullanarak analiz edin.

7. Yenidoğan kemik iliği kaynaklı makrofajların fagositik etkinliğini değerlendirmek için in vitro test

  1. BMDM'leri fenol kırmızısı veya antibiyotik olmadan tam DMEM'de yeniden süspanse edin ve 500 μL hacminde 35 mm'lik bir dörtlü tabakta 2 ×10 5 / kadran yoğunluğunda tohumlayın.
  2. Bakteriyel inokulumu 25 ° C'lik bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) veya istenen başka bir MOI'de hazırlamak için, -80 ° C'de saklanan önceden hesaplanmış bir Escherichia coli O1: K1: H7 stoğunu çıkarın.
  3. İstenilen bakteri hacmini 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Toplam 1 mL hacme PBS ekleyerek bakterileri yıkayın. Bakterileri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyerek peletleyin. Yıkama adımını tekrarlayın.
  4. Bakteri peletini 50 μL PBS içinde yeniden süspanse edin ve 500 μM'lik bir nihai konsantrasyona yeşil floresan pH'a duyarlı boya ekleyin. Bu, nötr pH'ta floresan sinyali olmayan pH'a duyarlı bir boyadır ve fagositoz işlemi sırasında asitlenmiş fagozomlar gibi asidik ortamlarda parlak bir şekilde floresan verir.
  5. Boya konjugasyonu için bakteri hücrelerini karanlıkta 20 dakika inkübe edin.
  6. Bakterileri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 × g'da santrifüjleme ile 1 mL PBS ile dört kez yıkayın.
  7. Bakterileri fenol kırmızısı olmadan 500 μL tam DMEM'de yeniden süspanse edin ve BMDM kültürlerine ekleyin.
  8. BMDM'leri 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde 4 saat inkübe edin ve ardından lizozomları lekeleyen 200 ng hücre geçirgen kırmızı floresan boya ekleyin.
    NOT: Fagositik bakteriler floresan mikroskobu ile görüntülenebilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada özetlenen yöntemi kullanarak, 25 ila 37 milyon kemik iliği hücresi, beş C57BL / 6 fare yavrusunun çöp boyutundan başarılı bir şekilde izole edilebilir. Bu yöntem, 5 ila 7 yavru arasında değişen çöp boyutları ile doğrulanmıştır. Deneylerimizde minimum izolasyon yaşı 7 gündür. Çöp boyutuna ve deney için gereken hücre sayısının bir milyondan az olmasına bağlı olarak, araştırmacılar bu protokolü 7 günlükten küçük fareler için deneyebilirler. M-CSF kaynağı olarak L929 hücreli süpernatan varlığında, kemik iliği hücreleri 5 gün içinde makrofajlara farklılaştı (Şekil 2). Farklılaşmanın ikinci gününde iğ şeklinde hücrelerin oluşumu gözlendi (Şekil 2B), hücrelerin yaklaşık yarısı üçüncü günde bir iğ şekli gösterdi (Şekil 2C) ve hücrelerin çoğu farklılaşmanın beşinci gününde yapıştı ve uzun iğ şekilleri oluşturdu (Şekil 2D). Bu yöntemle kemik iliği kaynaklı makrofajların (BMDM) verimi, 7 günlük 5 yavrudan 2,5-5 milyon hücre idi.

Diferansiye BMDM'leri fenotipik olarak karakterize etmek için, 5 günlük kültürlerden alınan hücreler CD11b, CD206 ve F4 / 80 için immüno-etiketlendi. İleri/yan saçılma ve tek işaretli geçit şemaları Ek Şekil 1'de görülebilir. Akış sitometri analizinden elde edilen sonuçlar, BMDM'lerin v.4'ünün hem CD11b hem de F4/80 için pozitif olduğunu göstermiştir (Şekil 3A). F480-CD11b + popülasyonu, CD206 için pozitif olan yaklaşık hücre sayısı ile tutarlıdır (Şekil 3B). Sonuncusu genellikle M2 benzeri makrofajlarla tutarlı bir belirteç olarak kabul edilir ve CD206 etiketlemesinin bolluğu iki kat daha fazla değişebilirken, F4/80 etiketlemesinin daha yüksek bir oranı, M-CSF'nin M1 benzeri bir fenotipefarklılaşmayı teşvik etme yeteneği ile tutarlıdır 16,17 (Şekil 3).

Diferansiye neonatal KMY'lerin bakterileri fagositoz etme ve fonksiyonel bir önlem olarak asitleştirilmiş bölmelere aktarma yeteneklerini daha da değerlendirdik. PH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiş bakteriler, yalnızca fagosite edildiğinde ve asitleştirilmiş bölmelere kaçırıldığında yeşil floresan almalıdır. Enfeksiyonu takiben BMDM'lerin içinde bol miktarda yeşil floresan bakteri fagosite edildi (Şekil 4A). Yeşil floresan ayrıca asitlenmiş lizozomların göstergesi olan kırmızı floresan ile lokalize olur (Şekil 4B,C). Fagositoz ve yeşil pH'a duyarlı boya pozitif neonatal BMDM'lerin görünümü de 4 saatlik enfeksiyon boyunca gözlenmiştir (Şekil 4D ve Ek video). Burada görüntülenen fonksiyonel aktivite, M1 benzeri inflamatuar makrofaj aktivitesi ile tutarlıdır.

figure-results-1
Şekil 1: 7 günlük C57BL/6J fare yavrularının kemik iliği izolasyonu. (A) 100 mm'lik bir tabakta 7 günlük yavruların arka bacak kemikleri. (B) Deri ve deri altı dokusu çıkarıldıktan sonra 7 günlük bir yavrunun arka uzuvları; Siyah noktalı çizgiler kemik iliği ekstraksiyonu için kesilecek yeri gösterir. (C) Yenidoğan arka uzuv, ezilmeden önce kemikleri ilikle işledi. (D) Yenidoğan arka uzuv, bir süzgeçte bir şırınga pistonu kullanılarak ezildikten sonra kemikleri işledi. (E) Üç bağımsız deneyden elde edilen kemik iliği (BM) ve kemik iliği türevi makrofaj hücrelerinin ortalama ± standart hatası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: BMDM'lerin 7 günlük yenidoğan kemik iliği hücrelerinden farklılaşması. 1. gün (A), 2. gün (B), 3. gün (C) ve farklılaşmanın 5. gününde (D) kemik iliği hücreleri. Panel B'deki kırmızı oklar, farklılaşmanın 2. gününde iğ şeklinde yapışık hücreleri gösterir. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Akış sitometrik analizi kullanılarak murin makrofaj belirteçlerinin tespiti. F4/80 ve CD11b (A) veya CD206 ve CD11b (B) yüzey antijenlerinin ekspresyonunu gösteren farklılaşmış neonatal kemik iliği kaynaklı makrofajlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Yenidoğan BMDM'leri tarafından pH'a duyarlı boya etiketli E. coli'nin fagositozu. (A) Enfeksiyondan 4 saat sonra fagositozlu pH'a duyarlı boya etiketli (yeşil) E. coli'yi gösteren kemik iliği kaynaklı makrofajlar. (B) Asitlenmiş lizozomlar (kırmızı) için leke ile etiketlenmiş BMDM'ler. (C) (A) ve (B) panellerinin birleştirilmiş görüntüsü. Ölçek çubukları: 20 μm. (D) Faz kontrastında gösterilen makrofajlar üzerinde yeşil floresan bakteri katmanı. (D)'deki büyütme, (A)'daki büyütme ile aynıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek video. Şekil 4 panel A'daki gibi yenidoğan BMDM'leri ile yeşil floresan bakterilerin canlı hücre görüntülemesinin 4 saatlik bir videosu. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: BMDM'lerin akış sitometrisi analizi. (A) BMDM'ler ilk olarak döküntüleri ve çiftleri çıkarmak için FSC ve SSC'ye bağlandı. F4/80 (B), CD11b (C) ve CD206 (D)'nin tek boyanması gösterilmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yenidoğan fare modellerini içeren araştırmalar bir takım zorluklar ortaya çıkarabilir. Yenidoğanlar, yetişkinlere kıyasla benzersiz olan gelişmekte olan bir bağışıklık sistemine sahiptir8. Bu nedenle, yetişkin hayvan modellerinden elde edilen verilerin yenidoğanlar için geçerli olduğu varsayılmamalıdır ve yayınlanmış birkaç çalışma bu fikri iyi bir şekilde ifade etmiştir18,19. Bu nedenle, erken yaşam bağışıklık tepkisinin karmaşıklıklarını incelemek için yenidoğana özgü modeller ve hücre kaynakları gereklidir. Bununla birlikte, yenidoğan farelerin boyutu, hassasiyeti ve hassas doğası nedeniyle, biyolojik örneklerin miktarı sınırlı olabilir ve toplama işlemi zaman alıcı olabilir. Bu protokol, yenidoğan farelerden kemik iliği çıkarmak için basit ve zaman açısından verimli bir prosedür oluşturur.

Yetişkin fare kemikleri, bir iğne sokacak ve iliği kolayca dışarı atacak kadar büyüktür. Tersine, yenidoğan kemik iliğine iğne ile erişmek, büyüklüğü ve kırılganlığı nedeniyle zordur. Bazı çalışmalarda kollajenaz tip II ve dispas20 ile enzimatik sindirim kullanılmıştır. Burada, yenidoğan kemiklerinin yumuşak ve minik doğası nedeniyle, kemik iliğini serbest bırakmak için bir kırma yöntemi benimsedik. Saflaştırmadan sonra, ilgilenilen araştırma uygulamasına bağlı olarak, bu hücreler spesifik hücre tiplerine farklılaştırılabilir.

Yenidoğanlar farklı fenotipik makrofaj popülasyonları sergiler21. Bu çalışma, BMDM'lerin 7-9. gün yaşlı yavruların kemik iliği hücrelerinden enzim kullanmadan farklılaşmasını aydınlattı. Metodolojide yer alan kritik adımlar arasında yenidoğan fare yavrularının genel hassas doğası, küçük kemiklerin kemik iliğinin salınmasına izin vermeyecek şekilde toplanması ve makas kesimleri yapmak için tibia ve uyluk kemiğinde uygun yerin bulunması yer almaktadır. Neonatal KMY'lerin kültürlemede erişkin KMY'lere göre daha duyarlı olduğunu ve kemik iliğinin yenidoğanlardan daha uzun süre izole edilmesinin farklılaşma yeteneklerini kısıtladığını gözlemledik. Bu nedenle, bir seferde 7'den fazla yavrudan ekstraksiyon önerilmemektedir. Ek olarak, farklılaşmanın ikinci gününde BMDM farklılaşma ortamının eklenmesi de zayıf farklılaşma ve daha düşük canlılık gibi kötü sonuçlara neden oldu.

Bu protokol, kemik iliği hücrelerinin makrofajlara farklılaşması için M-CSF kaynağı olarak L929 hücre süpernatantını kullandı. L929 hücreleri, yüksek miktarda M-CSF10 ürettiği bilinen murin fibroblastlarıdır. Makrofajların, M-CSF ile birlikte L929 süpernatanında salgılanan diğer maddelere maruz kalması beklenmektedir. Ticari saflaştırılmış M-CSF, makrofaj farklılaşması için de kullanılabilir; bununla birlikte, L929 kültür süpernatantının kullanımı ile doğrudan karşılaştırmadık. L de Brito Monteiro ve ark. L929 ve ticari M-CSF22 kullanılarak üretilen makrofajlar arasında farklı metabolik profiller gözlemledi.

Bu yöntem, herhangi bir sindirim enzimi kullanılmadan zaman kazandıran, ekonomik bir yaklaşım oluşturdu. Teknik, neonatal kemik iliğinin güvenilir bir şekilde izole edilmesini sağladı ve bu da neonatal BMDM'lerin net bir şekilde farklılaşmasına neden oldu. İzole neonatal BMDM'ler, çeşitli enfeksiyonlar sırasında neonatal makrofaj dinamiklerini ve bu hücreler tarafından inflamasyonun düzenlenmesini incelemek için daha fazla kullanılabilir. Yöntemin sınırlamaları arasında, küçük kemiklerin çekme işlemine ilk kuruluş ve adaptasyon için bir öğrenme eğrisi bulunur, bu da sonunda deneyimle gelişir ve hücrelerin canlılığının artmasıyla sürecin süresini en aza indirir. Yavruların altlık boyutları, deneysel ihtiyaca bağlı olarak ayırt edilebilen makrofaj sayısı için ek bir husustur.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların bu makaleyle ilgili herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri [R01 AI163333] tarafından CMR'ye desteklenmiştir. West Virginia Üniversitesi Akış Sitometrisi ve Tek Hücreli Çekirdek Tesisine aşağıdaki hibelerle sağlanan ek finansman desteğini kabul ediyoruz: WV CTSI hibe GM104942, Tümör Mikroçevre CoBRE hibe GM121322 ve NIH hibe OD016165.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
40 ve mikro; m süzgeçGreiner542040Hücre kültürü
96 kuyulu yuvarlak (U) alt plakaThermo Scientific12-565-65Hücre kültürü
Anti-fare CD11b-BV786BD Biosciences740861FACS analizi
Anti-fare CD206-Alexa Fluor488BD Biosciences141709FACS analizi
Anti-fare F4 / 80-PEBD Biosciences565410FACS analizi
Countess3Thermo ScientificTSI-C3ACCOtomatik hücre sayacı
DMEMHycloneSH30022.01Hücre kültürü
DMSOVWRWN182Hücre kültürü
DPBS, 1xCorning21-031-CVHücre kültürü
Escherichia coli O1:K1:H7ATCC11775Enfeksiyonu
EVOS FL Invitrogen12-563-649Hücre Görüntüleme Sistemi 
FBSAvantor 76419-584Hücre kültürü
FluoroBright BMDMThermo fisher BilimselA1896701Boyasız kültür ortamı
GlutaminCytivaSH30034.01Hücre kültürü
HEPESCytivaSH30237.01Hücre kültürü
L-929ATCCFarklılaşması
LSRFortessaBecton DickinsonFlowcytometer
Lysotracker kırmızı DND 99InvitrogenL7528Floresan boya
MEMCorning15-010-CVHücre kültürü
Penisilin / streptomisin ve nbsp;Hücrekültürü
pHrodo yeşil STP esteri SV30010 hiklon ;InvitrogenP35369Floresan boya
T75 şişesiHücre yıldızı658170Hücre kültürü
Tripsin-EDTAGibco25300120Hücre kültürü
Zeiss 710  ZeissP20GM103434Konfokal

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
  2. Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).
  3. Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
  4. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  5. Kaushansky, K. Lineage-specific hematopoietic growth factors. N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).
  6. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).
  7. Smith, A. M., Davis, J. M. Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates. Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).
  8. Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. Challenges in clinical trials for children and young people. Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).
  9. Heap, R. E., et al. Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation. Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957(2021).
  10. Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, pub prot5080 (2008).
  11. Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice. J Vis Exp. (196), e64566(2023).
  12. Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
  13. Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody. Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).
  14. Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).
  15. Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury. PLoS One. 7 (10), e42654(2012).
  16. Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Front Immunol. 10, 792(2019).
  17. Lu, L., et al. Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands. Sci Rep. 12 (1), 931(2022).
  18. Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease. Front Immunol. 9, 1077(2018).
  19. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  20. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358(2022).
  21. Winterberg, T., et al. Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages). Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).
  22. de Brito Monteiro, L., et al. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology. 225 (3), 151935(2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Neonatal Bone MarrowBone Marrow IsolationBone Marrow Derived MacrophagesMacrophage DifferentiationFlow CytometryPhagocytosis AssayL929 Conditioned MediumHypotonic SolutionEscherichia Coli InfectionCell Counter

İlgili makaleler