Yöntem makalesi

Doğal Ürün Araştırmalarında Sıvı Kromatografi Tandem Kütle Spektrometresinin Uygulamaları: Bir Vaka Çalışması Olarak Tropan Alkaloidleri

1.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66620

⸱

8 Mart 2024

 ,  , 
1Department of Chemistry, Northern Michigan University

Bu makalede

Özet

Hızlı kütle spektrometresi (MS)/kütle spektrometresi (MS) tabanlı tropan alkaloidlerinin açıklanması ve sınıflandırılması için hem tropan içeren numunelerin ön replikasyonu hem de izolasyon için yeni alkaloidlerin keşfi için yararlı bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Günümüzde kullanılan birçok ilaç sentetik kökenli olmasına rağmen, doğal ürünler hala zengin bir yeni kimyasal çeşitlilik ve biyoaktivite kaynağı sağlamakta ve dirençli veya yeni ortaya çıkan hastalıklar için umut verici ipuçları verebilmektedir. Bununla birlikte, zorluk iki yönlüdür: araştırmacılar sadece doğal ürünler bulmak ve yapılarını aydınlatmak zorunda değil, aynı zamanda neyin izole edilmeye ve tahlil edilmeye değer olduğunu (ve zaten bilinenleri - çoğaltma olarak bilinen bir süreç) belirlemelidirler. Modern analitik enstrümantasyonun ortaya çıkmasıyla birlikte, doğal ürün keşfi ve çoğaltmanın hızı hızlandı. Sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS), kimyasal yapıların tanımlanması ve sınıflandırılması için özellikle değerli bir teknik haline gelmiştir. Tropan alkaloidleri (TA'lar), büyük tıbbi ve toksikolojik öneme sahip bitki türevli bileşiklerdir. Bu çalışmada, TA yapılarını farklı parçalanma modellerine göre açıklamak ve sınıflandırmak için üçlü dört kutuplu (QQQ) kütle spektrometresinde bulunan çoklu MS/MS konfigürasyonlarını kullanarak LC-MS/MS tabanlı bir tarama iş akışı geliştirdik. Veriye bağlı (DD) ürün iyon taramaları, öncü iyon taramaları (PrIS) ve nötr kayıp taramalarının (NLS) bir kombinasyonunu kullanarak, bu yöntemi patlıcangiller Datura stramonium ve Datura metel'in TA açısından zengin özlerine uyguladık.Bu yöntem hızlı, hassastır ve hem karmaşık TA içeren numunelerin ön replikasyonu hem de izolasyon, saflaştırma (ve nihai biyo-tahlil) için yeni bir adayın keşfi için başarıyla kullanılmıştır.

Giriş

Her ne kadar tam sentetik moleküller son yıllarda ilaç keşfinde daha belirgin hale gelmiş olsa da, son 39 yılda onaylanan tüm ilaçların yaklaşık üçte ikisi doğal ürünler veya doğal ürünlerden ilham alan ilaçlardır.1,2  bu da doğal ürün araştırmalarının devam eden öneminin altını çizmektedir. Bazı azot içeren doğal ürünler olan alkaloidler, tıbbi özellikleri nedeniyle özellikle değerlidir. [3.2.1.] içeren tropan alkaloidleri (TA'lar)-bisiklik azot içeren sistem, çoğunlukla Solanaceae (patlıcangilgiller), Erythroxylaceae ve Convolvulaceae familyalarındaki bitkiler tarafından üretilir. Örnekler arasında atropin, skopolamin ve kokain; Klinik olarak çoklu yarı sentetik veya sentetik tropanlar da kullanılmaktadır3. TA'lar ve türevleri birçok durumu tedavi etmek için kullanılmaktadır 3,4 ve bu ilaçların birçoğu DSÖ'nün 2023 Temel İlaçlar Listesi'ndeyer almaktadır 5. Güçlü aktiviteleri nedeniyle, TA'lar rekreasyonel olarak da kullanılır (uyarıcı veya deliriant olarak) ve onları içeren bitkilerin (veya müstahzarların) yutulması üzerine zehirlenmeye neden olabilir 6,7. TA'lar insan ve hayvan gıdalarındaistenmeyen bir durumdur 8 ve çayları, baharatları, tahılları, balı ve bitkisel takviyeleribozabilir 9,10. Hem tıbbi vaatleri hem de zehirleme yetenekleri nedeniyle, yeni TA'ların keşfedilmesine (ve bilinen TA'ların tanımlanmasına) yardımcı olabilecek analitik yöntemler yararlıdır.

Tandem kütle spektrometresinde (MS/MS), "kütle filtreleri" (örneğin, dört kutuplular, uçuş süresi tüpleri) fiziksel olarak ("uzayda") birleştirilir veya bir cihaz ek "zaman içi" reaksiyon / ayırma adımları kullanır. Uzayda MS/MS, farklı kütle filtrelerinde (örneğin, üçlü dört kutuplu veya QQQ cihazının dört kutupluları) farklı iyonları seçmek ve parçalamak için farklı modlar kullanır. Bu farklı modlar, belirli bir iyon tarafından hangi spesifik fragmanların yapıldığını (ürün iyonu taraması), bir numunedeki hangi iyonların belirli fragmanları verdiğini (öncü iyon taraması veya PrIS) veya karakteristik bir kütle kaybına uğradığını (nötr kayıp taraması veya NLS) veya hangi spesifik bileşiklerin hangi spesifik fragmanlara sahip olduğunu (çoklu reaksiyon izleme) belirlemek için kullanılabilir. Bu nedenle MS/MS, yeni bileşikler için yapılar önermek veya mevcut bir bileşiğin varlığını doğrulamak için yararlı olan parçalar sağlar. MS/MS, ilaç keşfi, doğal ürünler kimyası ve metabolomik alanlarda giderek daha fazla kullanılmaktadır11,12 ve alkaloid içeren türlerin profilini çıkarmak (fitokimyasal karakterizasyon veya kemotaksonomik analiz için) ve gıda veya tıbbi bitkilerde spesifik alkaloidleri tespit etmek ve ölçmek için kullanılmıştır 10,13,14,15,16.

Mevcut birçok kütle spektrometresi tekniğine rağmen, yeni alkaloidlerin bulunmasında zorluklar vardır. Taranacak aday bir organizma bulmanın yanı sıra, bir alkaloidin tam bir yapısal doğrulaması, birçok farklı analitik tekniği içerebilen zorlu bir süreçtir. Ek olarak, araştırmacılar zaten bilinen bir bileşiği izole ederek emek, zaman ve kaynakları boşa harcayabilirler. Bu, birçoğu birbiriyle izomerik olan yüzlerce, hatta binlerce TA'nın rapor edildiği TA'lar için özellikle zordur. "Bilinenleri tanımlama ve onları bilinmeyenlerden ayırt etme" süreci replikasyon olarak bilinir. Bu işleme yardımcı olmak için farklı TA'ların ve diğer bileşiklerin alıkonma sürelerinin (rts) ve kütle fragmanlarının veri tabanları yayınlanmaktadır17,18. Bununla birlikte, çoğaltma zahmetlidir; bir numunenin tüm LC-MS/MS kromatogramındaki alkaloidlere yalnızca açıklama eklemek (yani, varsayılan yapıları atamak) zaman alıcıdır. Son zamanlarda, hem moleküler ağ1 9,20 hem de manuel dereplikasyon18,21,22, benzilizokinolin, monoterpen indol ve tropan alkaloidleri için kullanılmıştır ve Pris'ler, pirolizidin ve solanin tipi alkaloidleri tanımlamak için spektrumların "yapısal filtrelemesi" için kullanılmıştır23,24. Bununla birlikte, TA'lar ortak, kolayca tanımlanabilir parçalara sahip olsa da, TA içeren örneklerin hızlı LC-MS/MS tabanlı replikasyonu için belirli yöntemler veya iş akışları yoktur (Şekil 1). Burada açıklanan yöntem, hem mono-, di- ve trisübstitüe tropanlar için farklı parçalanma modellerine (Şekil 1A) hem de bu alkaloidlerde bulunan ortak ester gruplarının kayıplarına (Şekil 1B) dayalı olarak bitkilerdeki TA yapılarını açıklamak ve sınıflandırmak için veriye bağlı (DD) ürün iyon taramaları, PrIS'ler ve NLS'lerin bir kombinasyonunu kullanır. Çalışma organizmaları, patlıcangiller cinsi Datura'daki birkaç türdür. Çeşitli TA'lar için zengin bir kaynak olan Datura, dünya tarihi boyunca tıbbi ve kültürel amaçlar için kullanılmıştır17- ve çok sayıda, yapısal olarak benzer TA'ları nedeniyle kopyalanması zor bir matristir ve bize yöntemimizi test etmek için çekici örnekler sağlar.

Protokol

DİKKAT: Listelenen kimyasalları kullanmadan önce lütfen ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) bakın.

1. Numune hazırlama

DİKKAT: Sıvı nitrojen kriyojen yanıklarına neden olabilir. İyi havalandırılan bir alanda kriyojen eldivenleri ve göz koruması kullanın. Alkaloid içeren bitki örnekleri cildi tahriş edebilir; Onları her zaman eldivenlerle tutun. Metanol toksik ve yanıcıdır ve potansiyel tutuşturucu kaynaklardan uzakta bir çeker ocakta kullanılmalıdır.

NOT: Teorik olarak, ekili veya yabani bitki dokusu kullanılabilir (kurutulmuş veya taze öğütülmüş); Aşağıdaki prosedür sadece yöntem geliştirme sırasında kullanılan prosedürdür.

  1. İlgilenilen bitki dokusu taze ise, polipropilen konik bir tüpe koyarak ve 2-3 dakika sıvı nitrojene batırarak dondurun.
  2. Dondurulmuş bitki dokusunu önceden soğutulmuş bir harca (sıvı nitrojenli bir polistiren soğutucuya) yerleştirin ve önceden soğutulmuş bir havan tokmağı kullanarak dokuyu homojen bir toz haline getirin.
  3. İstenilen miktarda dokuyu önceden soğutulmuş bir spatula kullanarak darası alınmış bir polipropilen mikrosantrifüj tüpüne hızlı bir şekilde tartın ve hemen her 100 mg doku başına 1 mL konsantrasyonda% 20 metanol (oda sıcaklığında [RT]) ekleyin.
    NOT: Metanol (% 20), TA'ları25 çıkarmak için yaygın olarak kullanılır. Bazen,% 0.1 formik asit eklenir, ancak bu yöntemin ve diğerlerinin geliştirilmesi sırasında ekstraksiyon verimliliğinde bir fark gözlenmemiştir.
  4. Kapaklı tüpleri RT'de en az 3 saat boyunca sallanan bir çalkalayıcı (orta hız) üzerine yerleştirin.
  5. Tüpleri 9464 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir LC-MS otomatik numune alma cihazı şişesine pipetleyin veya hala bulanıksa, önce 0,45 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir, ancak işlenmiş taze bitki örnekleri ve özleri, herhangi bir potansiyel alkaloid bozulmasını önlemek için analizden önce -80 ° C'lik bir dondurucuda saklanmalıdır.

2. LC-MS cihaz konfigürasyonu ve veri toplama

DİKKAT: Asetonitril toksik ve yanıcıdır; Ateşleme kaynaklarından uzak tutun ve çeker ocak kullanarak buharları kontrol edin. Formik asit aşındırıcıdır; Cilt ve göz temasından kaçının ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.

  1. Elektrosprey iyonizasyon (ESI) kaynağına ve ters fazlı HPLC sütununa (C18, 4.6 x 100 mm) sahip bir LC-MS cihazı kullanın.
  2. HPLC için, Çözücü A olarak H2O'da% 0.1 formik asit ve Çözücü B olarak asetonitrilde% 0.1 formik asit kullanın; Sütunu %99 A ve %1 B ile dengeleyin. 26 dakika boyunca %1-%50 B'lik 30 dakikalık bir gradyan yapılandırın, 26.01 dakikada %1 B'ye dönün ve 4 dakika boyunca %1 B'de tutun. 45 °C'lik bir sütun fırın sıcaklığı ve 0,5 mL/dak'lık bir akış hızı kullanın.
  3. LC-MS yönteminde, kütle spektrometresi için aşağıdaki çalışma parametrelerini kullanın: arayüz voltajı: 4.0 kV, nebulize gaz akışı: 3 L/dak, ısıtma gazı akışı: 10 L/dak, DL sıcaklığı: 250 °C, ısı bloğu sıcaklığı: 400 °C, arayüz sıcaklığı: 300 °C, kurutma gazı akışı: 10 L/dak ve çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) gazı (argon) basıncı 17 kPa.
  4. ESI pozitif modunda, otomatik izotop dışlama etkinleştirilmiş bir anket olayı (LC yönteminin uzunluğuna ayarlanmış) olarak işlev gören bir Q3 taraması ve bir Q1 taraması (100-1000 Da) içeren bir MS yöntemi oluşturun. Q1 taramasının (DD analizi) bağımlı bir olayı olarak, 50-1000 Da'lık bir kütle penceresi, -20 V'luk bir çarpışma hücresi enerjisi ve <0.2 s'lik bir olay süresi ile bir ürün iyon taramasını dahil edin.
    NOT: Q1'in DD ürün iyon taramasını tetiklemek için sayım eşiği değişken olabilir, ancak tipik olarak 7.000-10.000 sayım seviyesi kullanılır. Yöntemi geliştirmek için kullanılan cihaz gibi bazı cihazlarda, Q3 taraması, Q1'den daha fazla kütle doğruluğu ve hassasiyeti sağlar ve Q1 taramasında gözlemlenen iyonları doğrulamak için dahil edilir, ancak adım 2.4'ten sorunsuz bir şekilde çıkarılabilir.
  5. Yukarıdaki MS yöntemine, -20 V'luk çarpışma hücresi enerjileri ve 0.75 s'lik olay süreleri ile LC yönteminin uzunluğuna eşit pozitif modlu Pris'ler ekleyin. Her durumda, Otomatik İzotop Hariç Tutma veya İzotop Kaldırma işlevlerinin etkinleştirildiğinden emin olun. TA fragmanları için ilgilenilen m/z değerlerinin (Da'da, bkz. Şekil 1A) 124.1 (tek ikameli TA'lar için, 125-1000 Da'lık kütle penceresi), 122.1 ve 140.1 (ikame edilmiş TA'lar için, sırasıyla 123 ve 141 Da'dan başlayan kütle pencereleri) ve 156.1 ve 138.1 (üç ikameli TA'lar için, 157 ve 139 Da'dan başlayan kütle pencereleri, Sırasıyla).
    NOT: Yöntem geliştirme sırasında, PrIS, biri mono- ve disübstitüe TA'lar ve diğeri trisübstitüe TA'lar için olmak üzere iki farklı yönteme bölünmüştür, ancak bunlar herhangi bir şekilde bölünebilir veya birleştirilebilir.
  6. Adım 2.4'teki parametreleri içeren ikinci bir MS yöntemi oluşturun.
    1. Bu MS/MS yöntemine, -20 V'luk çarpışma hücresi enerjileri ve 0,75 s'lik olay süreleri ile LC yönteminin uzunluğuna eşit pozitif modlu NLS ekleyin. Her durumda, Otomatik İzotop Hariç Tutma veya İzotop Kaldırma işlevlerinin etkinleştirildiğinden emin olun.
    2. TA'lar üzerindeki esterler için ilgilenilen nötr kayıp kütlelerinin (Da'da, bkz. Şekil 1B) 100.05 (tiglik asitten türetilen esterler için, 110-1000 Da'lık kütle penceresi), 60.03 (asetil grupları için, 100-1000 Da'lık kütle penceresi) ve 166.06 (fenillaktik veya tropik asit esterleri, 170-1000 Da'lık kütle penceresi) olduğundan emin olun.
  7. LC-MS yöntemini indirin ve ilgilenilen örnekler için veri dosyaları oluşturun. HPLC kolonu 45 ° C'de dengelendikten sonra, ilgilenilen numuneleri farklı türler veya doku türleri arasında uygun ekstraksiyon çözücü boşlukları olan bir parti veya proje dosyasında çalıştırın. Tipik bir enjeksiyon hacmi 10-20 μL'dir.
    NOT: Özellikle yüksek hacimlerde, kütle spektrometresi dedektörü doymuş olabilir. Çok konsantre numuneler çalıştırıyorsanız, ESI kaynağının temizlendiğinden ve cihazın düzenli olarak ayarlandığından emin olun. Tüm veriler toplandıktan sonra protokol burada duraklatılabilir.

3. Veri analizi

  1. Q1 ve Q3 taramalarının (ve DD ürünü iyon taramasının) toplam iyon kromatogramını inceleyin ve TA benzeri özelliklere sahip bol miktarda iyonun ana kütlesini not edin: a) kütle <[M+H]+ iyonu için 500 Da, genellikle eşit kütleli, b) yukarıdaki LC yöntemini kullanarak 2-22 dakika arasında tipik r.t.s ve c) aşağıdaki listeden parçalar: m/z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 veya 128 Da.
  2. m/z 124 için PrIS kromatogramını/kanalını inceleyin ve hangi tepe noktalarının/iyonların hangi r.t.s'de (adım 3.1'de kaydedilmiştir) bu parçayı ürettiğini not edin. Kromatogram boyunca taramaya tıklayın ve özellikle düşük bolluğa sahip türler için DD ürün iyon taramasında elde edilen tam MS / MS spektrumlarını inceleyin.
    NOT: Bu parçayı içeren gerçek bir tür, birden fazla tarama için mevcut olacak ve hem Q1 hem de Q3 taramalarında görünecektir (ikincisi kullanılıyorsa). Ek açıklamalara yardımcı olmak için Destekleyici Bilgilere (Ek Dosya 1) bir elektronik tablo eklenmiştir.
  3. Adım 3.2'yi diğer PrIS kromatogramları ile tekrarlayın. Hem m/z 122 hem de 140, ikame edilmiş TA'ların göstergesi olduğundan ve hem m/z 138 hem de 156, üç ikameli TA'ların göstergesi olduğundan, bu kromatogramları/kanalları birlikte inceleyin.
  4. m/z 100, 60 ve 166 için NLS kromatogramını/kanallarını inceleyin ve hangi rt'lerde (adım 3.1'de kaydedilen) hangi tepe noktalarının/iyonların bu nötr kayıpları ürettiğini not edin. Pris'te olduğu gibi, kromatogramda taramaya tıklayın ve özellikle daha düşük bolluğa sahip türler için DD ürün iyon taramasında elde edilen parçalanma ile karşılaştırın.
  5. DD ürünü iyon tarama sonuçları tarafından desteklenen PrIS ve NLS verilerinin kombinasyonunu kullanarak, en küçük tropan kütlesini (örneğin, 124, 122 veya 138) ve nötr kaybı ekleyerek ve ardından kalan kalan kütleyi hesaba katarak gözlemlenen alkaloidlerin varsayılan açıklamalarını yapın.
    NOT: TA'ların (ve Da'daki kütlelerinin) yerini alan tipik gruplar hidroksil (18), asetil (60), propiyonil (74), izobütiril (88), tigloyl (100), doymuş tigloyl/2-metilbutiril (102) veya fenillaktat/tropik asittir (166).
  6. Hangi TA ikame modellerinin rapor edildiğini (ve hangilerinin potansiyel olarak yeni olduğunu) belirlemek için alkaloidler için ek açıklamaları literatürde17 ve veritabanlarında (örneğin, MoNA)26 bildirilenlerle karşılaştırın. Ek olarak, onay için ticari olarak mevcut olan bazı yaygın tropan alkaloidlerinin (örneğin, atropin, littorin, skopolamin) standartlarını kullanın.
  7. Düşük bolluklu numuneler için ek yapısal bilgi için (PrIS ve NLS, bağımlı olay eşiklerinin altındaki iyonları alabilir), daha konsantre bir numune üzerinde belirli bir ürün iyon taraması (öncü iyon olarak ilgilenilen kütleyi kullanarak) toplayın.
    NOT: Bu yöntem, düşük çözünürlüklü bir QQQ cihazı üzerinde geliştirilmiştir. Tüm varsayılan yeni bileşikler için, doğru kütle spektrumları elde etmek için yüksek çözünürlüklü bir MS cihazı kullanılmalıdır.

Sonuçlar

Yöntemin etkinliğini göstermek için, standart bir TA karışımı (bir asetiltropin / asetilpsödotropin karışımının her biri [tek sübstitüe edilmiş], iki anisodamin izomerinin bir karışımının her biri 10 μg / mL [ikame edilmiş], hiyosiyamin [monosübstitüe edilmiş], littorin [monosübstitüe] ve skopolamin [trisübstitüe] ile birlikte) pozitif bir kontrol olarak analiz edildi (Şekil 2). Tam bir Q1 tarama kromatogramı (temel tepe kromatogramı görünümünde görüntülenir) Şekil 2A'da, TA standart yapıları karşılık gelen tepe noktalarıyla gösterilir. m/z 124 için PrIS (Şekil 2B), monoikame edilmiş TA'lar için kromatogramında tepe noktalarını gösterir; Ergo, asetiltropin / psödotropin karışımı, hiyosiyamin ve littorin görüntülenir. m / z 124 kromatogramında asetiltropin ve psödotropine karşılık gelen pikler küçüktür (muhtemelen diğer standartlardan daha düşük bir konsantrasyonda oldukları ve muhtemelen diğer monoikameli TA'lardan daha az miktarda m / z 124 fragmanı üretebilecekleri için). Bununla birlikte, hem bu kromatogramda hem de karşılık gelen PrIS kanalında hala tespit edilebilirler. Şekil 2C ve Şekil 2D , sırasıyla m/z 122 ve 140 için PrIS kromatogramlarıdır. İkame edilmiş TA fragmanlarını tespit ederek, her ikisi de anizolaminin iki izomerini işaretler ve m/z 140 kanalında daha güçlü bir sinyal görünür. Farklı TA'lar farklı yoğunluklarda fragmanlara sahip olabileceğinden, m/z 122 ve 140 kanalları birlikte incelenmelidir. Son olarak, üç sübstitüe TA'lar için tanı koyan m/z 156 (Şekil 2E) ve m/z 138 (Şekil 2F) kanallarının her ikisi de skopolamin için bir tepe gösterir (standart karışımdaki tek üç ikameli TA).

NLS kromatogramları daha sonra mevcut ester gruplarını atamak için kullanıldı. Şekil 2G , 60 Da (asetat esterlerden asetik asit kaybı) için NLS kromatogramını göstermektedir: iki asetillenmiş monosübstitüe TA izomeri görülebilir. Fenillaktik veya tropik esterleri tanımlamak için tasarlanan 166 Da için NLS kromatogramı (Şekil 2I), bu gruplardan herhangi birini (hiyosiyamin, littorin, iki anisodamin izomeri ve skopolamin) içeren tüm alkaloidleri doğru bir şekilde tanımlar. Son olarak, tahmin edildiği gibi, 100 Da kaybı (tigloyl esterlerin teşhisi) için kromatogram (Şekil 2H), standart alkaloidlerin hiçbiri bu grubu içermediğinden, r.t. 1.75 dk'da küçük bir safsızlık istisnası için boştur.

Yöntem daha sonra yanlış pozitifler için test edildi. Domates (Solanum lycopersicum) yaprağının bir su / metanol özütü negatif kontrol görevi gördü. Patlıcangiller olmasına rağmen, domatesler TA üretmez. Tam bir Q1 tarama tabanı-tepe kromatogramı Şekil 3A'da gösterilmiştir. m/z 124 için PrIS (Şekil 3B) çoğunlukla boştur ve muhtemelen dedektör gürültüsü olan küçük temel dalgalanmalar vardır (Q1 veya Q3 taramalarında bu kütlelerle eşleşen hiçbir sinyal yoktur). 2.6 ve 3.4 dakikalık r.t.'lere sahip iki özellik, bir 124 fragmanı verir, ancak DD ürün-iyon taramasının incelenmesi, bu özelliklerin başka herhangi bir monosübstitüe tropan fragmanı (m/z 93 veya 142) üretmediğini ortaya çıkarır, bu da onların TA olmadığını düşündürür. Bu örnek ayrıca, yanlış pozitifleri ekarte etmek için bu yönteme DD ürünü iyon taramasının dahil edilmesinin faydasını da vurgulamaktadır. Benzer şekilde, ikame edilmiş TA'lar için m/z 122 kanalı (Şekil 3C) da sadece gürültü gösterir. m/z 140, m/z 138 ve m/z 156 için PrIS kromatogramları ve DD taramalarında yalnızca TA olmayan özellikler öneren üç NLS, Ek Şekil 1A-F'de gösterilmiştir.

TA içeren bir numunenin kopyalanmasında bu yöntemin kullanımlarını göstermek için, D. metel var. 'fastuosa' kökü analiz edildi. Kökler, patlıcangillerde TA biyosentezinin ana bölgesidir ve birçok farklı TA'nın mevcut olduğu tahmin edilmiştir. Tam Q1 tarama kromatogramı Şekil 4A'da gösterilmiştir. Beklendiği gibi, m/z 124 (Şekil 4B), m/z 122 (Şekil 4C), m/z 140 (Şekil 4D), m/z 156 (Şekil 4E) ve m/z 138 (Şekil 4F) için Pris'lerde değişen bollukta çok sayıda özellik tespit edildi. Bu TA'ların çoğu, sırasıyla Şekil 4G-I'deki NLS kromatogramlarındaki çok sayıda sinyalle gösterildiği gibi, asetillenmiş veya tigloile edilmiş veya fenillaktik/tropik asitten türetilmiştir.

Bir .xls dosyası olarak sağlanan bir elektronik tablo (okuyucu kullanımı için boş bir sayfa Ek Dosya 1'dir, D. metel kökü Ek Dosya 2'dedir), ilk olarak hangi özelliklerin (kütleler veya r.t.s) TA benzeri göründüğünü belgelemek için kullanıldı (adım 3.1'deki kriterler kullanılarak). Daha sonra, bu özelliklere ait parçalar ve nötr kayıplar not edildi. Yöntem son derece hassastır: PrIS kanalları, karşılık gelen kromatogramlarda görünür pikler vermeyen düşük bolluktaki TA'ları bile kolayca tespit etti. Fragmanlar ve nötr kayıplar kullanılarak, alkaloid için bir yapı daha sonra adım 3.5 izlenerek önerilebilir.

Alkaloidlere açıklama eklemek için spektral verilerin kullanılmasına ilişkin bir örnek Şekil 5'te verilmiştir. D. metel kökü için tam Q1 tarama kromatogramı Şekil 5A'dadır. 14.4 dakikalık bir özellik seçildi; Q1 tarama spektrumu (Şekil 5B), bu tepe için m/z 224'lük bir ana kütleyi gösterir. DD ürünü iyon tarama spektrumu Şekil 5C'de gösterilmiştir. m/z 124 için PrIS kanalı (Şekil 5D), 224 iyonunun bu parçayı ürettiğini gösterir (DD çarpımı iyon taramasında da görülebilir). 100 Da için NLS kanalı (tigloile TA'ları tespit etmek için) ayrıca m/z 224'ü işaretler (DD ürün iyon taraması ile de onaylanır). Nötr kaybı ve en düşük kütleli TA fragmanının (100 + 124 Da) toplanması, ana kütle olan 224'e eşittir ve tigloyl grubunun tek ikame olduğunu doğrular; bu alkaloid için olası bir yapı Şekil 5C'de belirtilmiştir. Di- ve üçlü sübstitüe edilmiş TA'lar için, gözlemlenen nötr kayıp kütleleri en düşük TA kütlesine eklendi ve daha sonra kalan kütleyi hesaba katmak için başka bir ikame önerildi: örneğin, m/z 222, 140 ve 122'lik ikame edilmiş TA fragmanları ve 100 Da'lık nötr kayıpla, artık kütlesi 100'dür (222-122 = 100), ikinci bir tigloyl grubu olması muhtemeldir. Bu iş akışı, eleme işlemi için sezgisel olarak kullanılabilir: tropan parçalarından yoksun bir özelliğin (60, 100 veya 166 Da kaybetse bile) bir TA olması olası değildir. Bu iş akışını kullanarak kapsamlı ve hızlı bir çoğaltma örneğinde, çoklu izomerik bileşikler de dahil olmak üzere D. metel kökünde değişen bolluk ve polariteye sahip 71 farklı TA'lar tanımlanmıştır (Ek Dosya 2). Bu bileşiklerin bazıları, kolayca atanamayan ester gruplarına sahipti ve bazı ek bileşikler potansiyel TA'lar olarak işaretlendi, ancak yüksek güvenle açıklanamadı.

Öğütülmüş D. stramonium tohumlarının bir metanol / su ekstraktı da analiz edildi. D. metel kökü için tam Q1 tarama baz-tepe kromatogramı Şekil 6A'da gösterilmiştir. m/z 124 için PrIS Şekil 6B'de gösterilmiştir ve m/z 122 için PrIS Şekil 6C'de gösterilmiştir; diğer kromatogramlar Ek Şekil 2A-F'de gösterilmiştir. Şekil 6B, bir r.t. = 12.6 dakika, muhtemelen hiyosiyamin'de çok bol miktarda monosübstitüe tropan alkaloidini göstermektedir. Çekirdek TA ek açıklamalarını gösteren elektronik tablo, Ek Dosya 3'te yer almaktadır. Yöntemin performansı bu özel örnekle daha düşük görünüyordu: 8.5 ve 10.2 dakikalık rts'de 259'luk bir m/z ile çok bol olan iki çok bol özellik, 60 ve 100 Da için NLS kromatogramlarında zirveler verdi (Ek Şekil 2 D,E) karşılık gelen spektrumlarda belirtilen m/z 260 (bir M+1 izotopu) kütlesi ile. Bu bileşikler TA değildir, bunun yerine beta-karbolin alkaloidleri27 ile tutarlı fragmanlar oluşturmuştur. Asetillenmezler veya tigloile edilmezler, ancak M + 1 izotoplarından 60 veya 100 kaybederler, bu da bu iki NLS kanalındaki görünümlerini yanlış hale getirir. Ek olarak, skopolamin (rt = 10.5 dk), skopolaminin beklenen m/z 121 parçasının bir izotopu olan m/z 305 M+1 izotop zirvesinden bir m/z 122 fragmanı verdi. Bu yöntemler de-izotop işlevleri kullansa da, bu yüksek numune konsantrasyonlarında bir miktar izotop "sızıntısı" mümkündür. Bu, bu çalışmada veya bu örnekte kullanılan alete özgü bir olay olsa da, kayda değerdir.

Bu yöntem kullanılarak, 162 (heksoz), 146 (deoksiheksoz) veya 132 Da (ksiloz veya benzeri bir şeker) kütlelerini kaybeden, glikosile edilmiş gibi görünen birkaçı da dahil olmak üzere, D. stramonium tohumlarında kırk TA açıklandı. Merremia (Convolvulaceae)28, Duboisia29 ve Atropa25'te heksoz içeren TA'lar bildirilmiş olsa da, bu deoksiheksoz veya ksiloz içeren TA'ların ilk raporudur. Bir TA'nın r.t. 13.8 dk (Şekil 7A) ve kütlesi m/z 436 ( Şekil 7B'de Q1 taraması) idi. Bu özellik, m/z 124 kanalında monoikame edilmiş bir TA'yı gösteren bir sinyal üretti (Şekil 7D), ancak başka herhangi bir PrIS veya NLS kanalında sinyal üretmedi. DD ürün iyon taraması (Şekil 7C), ana iyondan 312 Da, muhtemelen 166 + 146 Da'lık bir kayıp olan beklenen m/z 124'ü gösterdi. Yüksek çözünürlüklü MS/MS, dört kutuplu bir uçuş süresi aletinde ( Şekil 7E'deki spektrum) elde edildi, bu da bir m/z 290 fragmanını gösterdi, bu da hamnoz veya benzer bir şeker ile ester hidroksil kısmı üzerinde hiyosilamin veya littorin glikosile edildiğini düşündürdü; ölçülen doğru kütle aynı zamanda ramnosil-hiyosiyamin veya littorin için hesaplanan tam kütleye çok yakındı ( Şekil 7E'deki yapı). Eşi benzeri görülmemiş yapısı ve bolluğu nedeniyle, bu alkaloid, bu yöntemin yeni alkaloid keşfinde kullanıldığını gösteren bir örnek olan D. stramonium tohumlarından izolasyonu hak ediyor.

figure-results-1
Şekil 1: TA'ların MS'inde gözlenen ilgili fragmanlar ve kayıplar. (A) Monosübstitüe edilmiş, ikame edilmiş ve trisübstitüe edilmiş TA'lardan oluşan karakteristik fragmanlar (ve bunların tanısal kütleleri) ve ayrıca her sınıftaki alkaloidlerin temsili örnekleri. (B) TA'lardaki ester gruplarından (ve tanısal kütlelerinden) gözlenen yaygın nötr kayıplar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Pozitif kontrol öncü iyonu ve nötr kayıp taramaları. Tüm kromatogramlar için, X ekseni tutma süresidir ve Y ekseni sayımdır (iyon bolluğu). (A) Alkaloid standart karışımının taban-tepe kromatogramı görünümündeki toplam iyon kromatogramı. Standartların yapıları belirtilmiştir; Karşılık gelen tepeler kırmızı oklarla gösterilir. (B-F), (B) M/Z 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 ve (F) 138 için PrIS kromatogramlarıdır. (G-I) 60 Da (asetil, G), 100 Da (tigloyl, H) ve 166 Da (fenillaktik / tropik asit, I) için NLS kromatogramları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Negatif kontrol öncü iyonu ve nötr kayıp taramaları. Tüm kromatogramlar için, X ekseni tutma süresidir ve Y ekseni sayımdır (iyon bolluğu). (A) S. lycopersicum yaprağının bir metanol/su ekstraktının baz-tepe kromatogram görünümündeki toplam iyon kromatogramı. (B) m/z 124 için PrIS kromatogramı, rt 2.6 ve 3.4 dk'da yalnızca iki tropan olmayan özellik gösteriyor. (C) m/z 122 için PrIS kromatogramı, dedektör gürültüsü dışında boş. Şekil 2'deki ile aynı şekilde kullanılan ölçekler; kalan kromatogramlar Ek Şekil 1'dedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: MS/MS yönteminin D. metel var. 'fastuosa' köklerine uygulanması. Tüm kromatogramlar için, X ekseni tutma süresidir ve Y ekseni sayımdır (iyon bolluğu). (A) D. metel var. 'fastuosa' köklerinin bir metanol/su ekstraktının baz-tepe kromatogramı görünümündeki toplam iyon kromatogramı. (BF), m/z (B) 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 ve (F) 138 için PrIS kromatogramlarıdır. (GI), 60 Da (asetil, G), 100 Da (tigloyl, H) ve 166 Da (fenillaktik/tropik asit, I) için NLS kromatogramlarıdır. Çok sayıda TA'ya karşılık gelen her kromatogramdaki bol miktarda sinyale dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Bir TA için yapı önermek için birleşik DD ürünü iyon taraması, öncü iyon taraması ve nötr kayıp tarama yönteminin uygulanması. (A) D. metel var. 'fastuosa' köklerinin bir metanol/su ekstraktının baz-tepe kromatogram görünümündeki toplam iyon kromatogramı. RT = 14.4 dk'da bir tepe kırmızı bir okla gösterilir. (B) Bu tepe için bol miktarda m/z 224 kütlesi olan Q1 (anket taraması). Tüm spektrumlar için, X ekseni kütledir ve Y ekseni yoğunluktur. (C) m/z 224 iyonunun parçalanmasını gösteren, 100 Da'lık bir kaybı ve bir m/z 124 parçasını gösteren DD çarpımı iyon taraması (kırmızı oklar). Bu bileşik, hem (D) m/z 124 PrIS kanalında hem de (E) 100 Da NLS kanalında görülür, bu da hem monosübstitüe hem de tigloile olduğunu gösterir (panel C'deki yapı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: MS/MS yönteminin D. stramonium tohumlarına uygulanması. Tüm kromatogramlar için, X ekseni tutma süresidir ve Y ekseni sayımdır (iyon bolluğu). (A) D. stramonium tohumlarının bir metanol/su ekstraktının baz-tepe kromatogram görünümündeki toplam iyon kromatogramı. (B) m/z 124 için PrIS kromatogramı; (C) m/z 140 için PrIS kromatogramını gösterir. Kalan kromatogramlar Ek Şekil 2'dedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: D. stramonium tohumlarında yeni bir alkaloidin açıklanması. Tüm kromatogramlar için, X ekseni tutma süresidir ve Y ekseni sayımdır (iyon bolluğu). (A) D. stramonium tohumlarının bir metanol/su ekstraktının baz-tepe kromatogram görünümündeki toplam iyon kromatogramı.r.t. = 13.7 dk'da bir özellik gösterilir. (B) Bu tepe için m/z 436'lık bir kütle gösteren Q1 (anket taraması). Tüm spektrumlar için, X ekseni kütledir ve Y ekseni yoğunluktur. (C) m/z 436 iyonunun parçalanmasını gösteren DD ürünü iyon taraması. (D) Bu monoikameli TA bileşiği, m/z 124 PrIS kanalında görünür. (E) Bu yeni TA için yüksek çözünürlüklü MS/MS spektrumu, önerilen yapılar ve tam kütle ile birlikte. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Ek negatif kontrol öncü iyonu ve nötr kayıp taramaları. (A-C) m/z (A) 140, (B) 156 ve (C) 138 için PrIS kromatogramları. (D-F) 60 Da (asetil, D), 100 Da (tigloyl, E) ve 166 Da (fenillaktik / tropik asit, F) için NLS kromatogramları. Kullanılan ölçekler Şekil 2'deki ile aynıdır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: MS/MS yönteminin D. stramonium tohumlarına uygulanması; ek kromatogramlar. (AC), m/z (A) 140, (B) 156 ve (C) 138 için PrIS kromatogramlarıdır. (D-F) 60 Da (asetil, D), 100 Da (tigloyl, E) ve 166 Da (fenillaktik / tropik asit, F) için NLS kromatogramları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Alkaloid ek açıklamaları için kullanılan boş elektronik tablo. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: D. metel var. 'fastuosa' kökleri için alkaloid ek açıklamaları ve yapılarının elektronik tablosu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: D. stramonium tohumları için alkaloid ek açıklamaları ve yapılarının elektronik tablosu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Protokolde sağlanan cihaz parametreleri tatmin edici bir performansa izin verse de, bu yöntemin başarılı bir şekilde kullanılması, birkaç kritik adımın dikkatli bir şekilde ele alınmasını veya optimize edilmesini gerektirebilir. Adım 2.2'de sağlanan HPLC çözücü gradyanı genellikle tropan alkaloidleri için uygun olsa da, incelenen numunenin veya bitki türünün tropan alkaloid profiline bağlı olarak modifiye edilmesi gerekebilir. Numune enjeksiyon hacmi, cihazın hassasiyetine ve yöntemin nasıl kullanıldığına bağlı olarak da değiştirilebilir. "Derin" metabolik profilleme veya dereplikasyon daha büyük bir enjeksiyon hacmi kullanmalıdır (bu çalışmada 15-20 μL kullanılmıştır), alkaloidlerin basit tespiti ise daha küçük hacimler kullanabilir. (a) İyon kaynağını düzenli olarak temiz tutmak, (b) HPLC kolonunu basınç değişiklikleri veya tıkanmalar açısından izlemek (her zaman uygun bir koruyucu kolon kullanılmalıdır), (c) numuneler arasında taşınmayı önlemek ve (d) yukarıda açıklandığı gibi kromatogramları potansiyel "izotop sızıntısı" açısından incelemek için büyük numune hacimleri kullanılırken dikkatli olunmalıdır. Arayüz sıcaklıkları ve voltajları, erken kaynak içi parçalanmayı önlemek için yöntemde belirtilenlerden önemli ölçüde değiştirilmemelidir. Ek olarak, 20 V'luk bir çarpışma hücresi voltajı önerilmesine rağmen, tüm TA'lar için optimum kromatogram sinyali (veya tanısal DD ürünü iyon tarama parçaları) sağlayamayabilir. Bazı MS cihazları ve fonksiyonları, "çarpışma enerjisi rampası" özelliğine veya çoklu veya optimize edilmiş çarpışma enerjilerinde taramaları toplama yeteneğine sahiptir, bu da bunun gibi bir yöntemde fayda bulabilir30.

Bu MS yönteminin kendisi de kolayca değiştirilebilir: tiglik, asetik ve fenillaktik/tropik asit esterleri Datura türlerinde yaygın olsa da, TA ester ikame modelleri diğer bitkilerde veya örneklerde farklı olabilir. NLS kütleleri, diğer ester gruplarını (örneğin, propiyonik esterler için 74 Da'lık bir kayıp) veya potansiyel olarak glikozilasyonları (örneğin, heksozlar için 162 Da'lık bir kayıp) tespit etmek için değiştirilebilir. PrIS kütleleri de değiştirilebilir. Örneğin, her iki Datura örneğindeki bir TA (r.t. = 12.5 dakika; Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2'ye bakınız), DD ürünü iyon tarama parçalarına (m/z 110 ve 93) dayalı olarak norhiossiyamin veya norlittorin (hiyosiyamin/littorin eksi tropan N-metil grubu) olarak açıklandı ve literatür spektrumları31 ile eşleşti; bu TA, tropan fragmanı PrIS kanallarının hiçbirinde görünmedi. Bu iki kütle için nortropanları tespit etmek için bir kanal eklenebilir. m/z 93 fragmanı, çoğu monosübstitüe TA'dada bulunur 17; bu kanalın eklenmesi, monoikame edilmiş bir TA'nın varlığı için ek onay sağlayabilir ve yanlış pozitiflerin azaltılmasına yardımcı olabilir.

Farklı TA türleri için uyarlanabilirliğine ek olarak, bu protokolün (mevcut alkaloid açıklama yöntemlerine göre) önemli bir avantajı hızıdır. MS yönteminin nasıl yapılandırıldığına (ve kullanılan HPLC çalışma süresine) bağlı olarak, bir numune için tüm MS/MS verileri 60-90 dakika içinde toplanabilir. Örneğin, çalışmalarımız sırasında, mono ve di-ikameli TA PrIS'ler bir yönteme yerleştirildi, üç ikameli TA PrIS'ler başka bir yöntemde ve NLS'ler üçte bir (tüm yöntemler DD ürünü iyon taramasını içeriyordu), her biri otuz dakikada toplam üç enjeksiyon için. Birleştirilmiş MS/MS verilerini kullanarak numunenin tam olarak açıklanması, her tepe noktasının manuel olarak incelenmesinden veya çok sayıda ilgi noktası için tek tek ürün iyon taramalarının toplanmasından çok daha hızlıdır. Bu yöntem, ürün iyon taraması, PrIS ve NLS modlarına sahip herhangi bir cihazda gerçekleştirilebilir ve hızlı kalitatif değerlendirme (yani, TA'lar var mı yoksa yok mu?), farklı bitki cinslerini, türlerini, çeşitlerini veya çeşitlerini, organlarını veya büyüme aşamalarını ayırt etmek veya "parmak izi" almak ve gözlemlenen TA'ları rapor edilenlerle karşılaştırmak için (çoğaltma iş akışının bir parçası olarak) kullanılabilir. Gösterildiği gibi, protokol aynı zamanda izolasyon, saflaştırma veya biyo-tahlil için kurşun olarak yeni TA'ların keşfi ve ayrıca bunları izole etmek için aday türlerin ve dokuların tanımlanması için de kullanılabilir. Bu yöntem, bitki biyokimyasının anlaşılmasına yardımcı olmak ve erken aşama ilaç keşif araştırmaları da dahil olmak üzere doğal ürünler ve metabolomik alanlarda kullanılabilir. Gıda güvenliği veya adli tıpta ek uygulamalar bulunabilir (örneğin, gıda, takviyeler veya biyosıvılardaki TA'ların tespiti).

Yöntemin tartışmayı garanti eden birkaç dezavantajı vardır. İlk olarak, kullanılan alete ve protokolün kullanılma amacına bağlı olarak, büyük bir numune enjeksiyon hacmi gerekebilir, bu da cihaz performans sorunlarına ve bazı durumlarda (yukarıda açıklandığı gibi) yanlış pozitifler potansiyeline neden olabilir. İkincisi, bu yöntem düşük çözünürlüklü bir QQQ cihazı üzerinde geliştirilmiştir ve yanlış pozitifler düşük çözünürlükten kaynaklanabilir (örneğin, negatif kontrolde TA olmayan bir m/z 124 fragmanı içeren özellik). Daha yüksek çözünürlüklü bir cihaz daha iyi tanı yeteneği sağlayacaktır ve önerilen herhangi bir yeni alkaloid için doğru kütle MS / MS spektrumları elde edilmelidir. Bu yöntemin ek dezavantajları, bir bütün olarak MS/MS analizinin dezavantajlarıdır. MS/MS, yapıları önermek için yararlı olsa da (Metabolomik Standartlar Girişimi32 tarafından belirlenen "ek açıklama"), moleküler bağlantının somut atamalarını ("tanımlama") sağlamaz. Örneğin, her iki Datura örneğinde de, hem m/z 124 hem de m/z 140 fragmanlarına sahip gibi görünen bir m/z 306 TA'nın birkaç izomerini bulduk (Ek Dosya 2), bu nedenle ikame modelinin kesin olarak atanmasını zorlaştırdı. Bu, henüz keşfedilmemiş bir parçalanma mekanizmasını temsil edebilir ve başka bir teknik (nükleer manyetik rezonans spektroskopisi gibi) belirsizliklerin çözülmesinde yardımcı olabilir. MS/MS tabanlı yöntemler sıklıkla izomerizm ile mücadele eder: fenillaktik asit ester littorinin (veya türevleri) hiyosiyamin'den (tropik asit esteri) ayırt edilmesi zordur ve diğer Solanlı bitkiler, izomerik tigloyl, senecioyl ve angeloil grupları ile ikame edilmiş TA'lar içerir33,34; Standartların yokluğunda, bu bileşiklerin birbirinden ayrılması imkansız olmasa da zor olabilir. Yöntem ayrıca enantiyomerleri (örneğin, 3,6- ve 3,7-dihidroksitropan; numaralandırma için Şekil 1'e bakınız) veya regioizomerleri (örneğin, 3-asetil'i bir standart olmadan 7-asetilden ayırt etme) ayırt etmeyecektir. Monosübstitüe tropanların çoğunu, Datura ve diğer Solanlı bitkiler 17,35'te bildirilen önceki modellere dayanarak 3-ikameli olarak atadık. Bu nedenle, incelenen organizma hakkında (varsa) herhangi bir biyokimyasal bilgi veya literatüre her zaman herhangi bir araçsal analizin yanı sıra danışılmalıdır.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, bir Fakülte Araştırma Bursu (Kuzey Michigan Üniversitesi, MAC'ye verildi), bir lisans araştırma bursu (Kuzey Michigan Üniversitesi, JC'ye verildi) ve Kimya Bölümü tarafından finanse edildi. Yazarlar, bitki dokusu hazırlama konusunda yardım için John Berger'e (NMU), LC-MS bakım ve sorun giderme yardımı için Hannah Hawkins'e (NMU) ve asetiltropin karışımını hazırladıkları için Dr. Ryan Fornwald ve CH 495 (Doğal Ürünler Sentezi) öğrencilerine teşekkür etmek isterler. Yazarlar ayrıca Dr. Daniel Jones'a (Michigan State Üniversitesi) yüksek çözünürlüklü MS/MS spektrumları elde ettiği için teşekkür etmek isterler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetonitril, UHPLC için, kütle spektometresi için uygunSigma-Aldrich900667HPLC çözücü
Argon gazıAirGasAR UHP300CID gazı
Formik asit, analiz için %99Thermo ScientificAC270480010HPLC katkı maddesi
Koruma kolon tutucusuRestek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58HPLC sütunu
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Kütle spektrometresi; Shimadzu cihazları için standart olan LabSolutions yazılımını çalıştırdık
Sıvı nitrojenAirGasNI 180LT22
Metanol, HPLC / UHPLC / LCMSVWRBDH 85800.400Ekstraksiyon çözücüsü yapmak için
Mikrosantrifüj ve nbsp;VWR2400-37
Mikrosantrifüj tüpleri, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Harç Fisher ScientificFB961CBitki dokularını öğütmek için
HavaneliFisher ScientificFB961MBitki dokularını öğütmek için
Pipet 1000 mLGilson 
Pipet ucu 1000 mLFisher scientific02-707-404
Bitki dokularıÇeşitli kaynaklarN/AYabani veya ekili herhangi bir şey olabilir
Polipropilen konik tüpler, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Polistiren soğutucuULINES-18312Moleküler biyoloji için reaktiflerin sevk edildiği soğutucu tipi
uygun Roc C18 3 & mikro; m, 100 mm x 4,6 mmRestek9534315HPLC kolonu
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210Koruma sütunu
Sallanan çalkalayıcıThemo Scientific11-676-680
Vida dişi flakon kolaylık kiti (9 mm)Fisher scientific13-622-190LCMS otomatik numune alma cihazı
şişeleri Şırınga, 3 mLFisher Scientific03-377-27
Şırınga filtresi 0.45 ve mikro; m Avantor/VWR76479-008
Su, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresinde kullanım içinJT Baker9831-03Ekstraksiyon çözücüsü yapmak için
Su çözeltisi, %0,1 v/v formik asit içerir, UHPLC için, kütle spektometrisi için uygunSigma-Aldrich900687-1LHPLC çözücü
için F144059M

Kaynaklar

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
  2. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).
  3. Kohnen-Johannsen, K., Kayser, O. Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology, biosynthesis and production. Molecules. 24 (4), 796(2019).
  4. Shim, K. H., Kang, M. J., Sharma, N., An, S. S. A. Beauty of the beast: anticholinergic tropane alkaloids in therapeutics. Nat Prod Bioprospect. 12 (1), 33(2022).
  5. Web Annex A. World Health Organization Model List of Essential Medicines - 23rd List, 2023. The Selection and Use of Essential Medicines 2023: Executive Summary of the Report of the 24th WHO Expert Committee on the Selection and Use of Essential Medicines. , World Health Organization. Geneva. 24-28 (2023).
  6. Kerchner, A., Farkas, A. Worldwide poisoning potential of Brugmansia and Datura. Forensic Toxicol. 38, 30-41 (2020).
  7. Hanna, J. P., Schmidley, J. W., Braselton, W. E. Datura delirium. Clin Neuropharmacol. 15, 109-113 (1992).
  8. Alexander, J., et al. Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on tropane alkaloids (from Datura sp.) as undesirable substances in animal feed. EFSA J. 691, 1-55 (2008).
  9. González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pérez-Quintanilla, D., Sierra, I. Occurrence and chemistry of Tropane alkaloids in foods, with a focus on sample analysis methods: A review on recent trends and technological advances. Foods. 11 (3), 407(2022).
  10. Cirlini, M., Cappucci, V., Galaverna, G., Dall'Asta, C., Bruni, R. A sensitive UHPLC-ESI-MS/MS method for the determination of tropane alkaloids in herbal teas and extracts. Food Control. 105, 285-291 (2019).
  11. Amorim Madiera, P. J., Florencio, M. H. Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Structural Analysis to Fundamental Studies. Tandem Mass Spectrometry - Applications and Principles. Prasain, J. , InTech. London. (2012).
  12. Xing, J., Xie, C., Lou, H. Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry in natural products bioanalysis. J Pharm Biomed Anal. 44 (2), 368-378 (2007).
  13. Negrin, A., Long, C., Motley, T. J., Kennelly, E. J. LC-MS metabolomics and chemotaxonomy of caffeine-containing holly (Ilex) species and related taxa in the Aquifoliaceae. J. Agric. Food Chem. 67 (19), 5687-5699 (2019).
  14. Och, A., Szewczyk, K., Pecio, L., Stochmal, A., Zaluski, D., Bogucka-Kocka, A. UPLC-MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papaveraceae families. Oxid Med Cell Longevity. 2017, 9369872(2017).
  15. Li, Y., Pang, T., Shi, J., Liu, X., Deng, J., Lin, Q. Simultaneous determination of alkaloids and their related tobacco-specific nitrosamines in tobacco leaves using LC-MS-MS. J Chromatogr Sci. 53 (10), 1730-1736 (2015).
  16. González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pereira, J. A. M., Câmara, J. S., Sierra, I. Improved analytical approach for determination of tropane alkaloids in leafy vegetables based on µ-QuEChERS combined with HPLC-MS/MS. Toxins. 14 (10), 650(2022).
  17. Cinelli, M. A., Jones, A. D. Alkaloids of the Genus Datura: Review of a rich resource for natural product discovery. Molecules. 26, 2629(2021).
  18. Gonçalves Dantas, C., et al. Dereplication of tropane alkaloids from four Erythroxylum species using liquid chromatography coupled with ESI-MSn and HRESIMS. Rapid Commun Mass Spectrom. 37 (21), e9629(2023).
  19. Santos, C. L. G., et al. Molecular networking-based dereplication of strictosidine-derived monoterpene indole alkaloids from the curare ingredient Strychnos peckii. Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (3), e8683(2020).
  20. Qin, G. F., et al. MS/MS-based molecular networking: An efficient approach for natural products dereplication. Molecules. 28, 157(2023).
  21. Du, N., Zhou, W., Jin, H., Liu, Y., Zhou, H., Liang, X. Characterization of tropane and cinnamamide alkaloids from Scopolia tangutica by high-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J Sep Sci. 42 (6), 1163-1173 (2019).
  22. Agnes, S. A., et al. Implementation of a MS/MS database for isoquinoline alkaloids and other annonaceous metabolites. Sci Data. 9 (1), 270(2022).
  23. Sixto, A., Pérez-Parada, A., Niell, S., Heinzen, H. GC-MS and LC-MS/MS workflows for the identification and quantitation of pyrrolizidine alkaloids in plant extracts, a case study: Echium plantagineum. Rev Bras Farmacog. 29 (4), 500-503 (2019).
  24. Wang, H., Xu, X., Wang, X., Guo, W., Jia, W., Zhang, F. An analytical strategy for discovering structural analogues of alkaloids in plant food using characteristic structural fragments extraction by high resolution orbitrap mass spectrometry. LWT- Sci Technol. 154, 112329(2022).
  25. Parks, H. M., et al. Redirecting tropane alkaloid metabolism reveals pyrrolidine alkaloid diversity in Atropa belladonna. New Phytol. 237 (5), 1810-1825 (2023).
  26. MassBank of North America. , Available from: https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu (2024).
  27. Maier, I., et al. Fluorodaturatin und Homofluorodaturatin - zwei neue β-carbolinderivate in Samen von Datura stramonium L. var. stramonium. Monatsh Chem. 112, 1425-1439 (1981).
  28. Jennett-Siems, K., et al. Chemotaxonomy of the pantropical genus Merremia (Convolvulaceae) based on the distribution of tropane alkaloids. Phytochemistry. 66, 1448-1464 (2005).
  29. Kohnen, K. L., Sezgin, S., Spiteller, M., Hagels, H., Kayser, O. Localization and organization of scopolamine biosynthesis in Duboisia myoporoides R. Br. Plant Cell Physiol. 59 (1), 107-118 (2018).
  30. Guan, P., et al. Full collision energy ramp-MS2 spectrum in structural analysis relying on MS/MS. Anal Chem. 93 (46), 15381-15389 (2021).
  31. Al Balkhi, M. H., Schlitz, S., Lesur, D., Lanoue, A., Wadouachi, M., Boitel-Conti, M. Norlittorine and norhyoscyamine identified as products of littorine and hyoscyamine metabolism by 13C-labeling in Datura innoxia hairy roots. Phytochemistry. 74, 105-114 (2012).
  32. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3, 211-221 (2007).
  33. Gambaro, V., Labbe, C., Castillo, M. Angeloyl, Tigloyl and Senecioyloxytropane Alkaloids from Schizanthus hookerii. Phytochemistry. 22 (8), 1838-1839 (1983).
  34. Christen, P., Cretton, S., Humam, M., Bieri, S., Muñoz, O., Joseph-Nathan, P. Chemistry and biological activity of alkaloids from the genus Schizanthus. Phytochem Rev. 19, 615-641 (2020).
  35. Lounasmaa, M., Tamminen, T. The Tropane Alkaloids. The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology. , Academic Press. New York, NY. (1993).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

LC MS MSnc l yon TaramasN tr Kay p Taramasr n yon TaramasDatura StramoniumDatura Metel
Doğal Ürün Araştırmalarında Sıvı Kromatografi Tandem Kütle Spektrometresinin Uygulamaları: Bir Vaka Çalışması Olarak Tropan Alkaloidleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.