Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

2.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66627

⸱

12 Nisan 2024

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Groningen

Bu makalede

Özet

Membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması ve enzimlerin ve diğer suda çözünür bileşenlerin mikrometre altı ve mikrometre boyutundaki lipid veziküllerinde kapsüllenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Saflaştırılmış bileşenler kullanarak entegre membran proteinleri, enzimler ve floresan bazlı sensörleri içeren karmaşık protein ağlarını veziküllere dahil etmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, biyoreaktörlerin tasarımı ve inşası ve karmaşık denge dışı metabolik reaksiyon ağlarının incelenmesi ile ilgilidir. Daha önce geliştirilmiş bir protokole göre (çoklu) membran proteinlerini büyük unilameller veziküllere (LUV'ler) yeniden yapılandırarak başlıyoruz. Daha sonra saflaştırılmış enzimler, metabolitler ve floresan bazlı sensörlerin (floresan proteinler veya boyalar) bir karışımını donma-çözülme-ekstrüzyon yoluyla kapsüllüyoruz ve dahil edilmemiş bileşenleri santrifüjleme ve/veya boyut dışlama kromatografisi ile çıkarıyoruz. Metabolik ağların performansı, floresan okuması ile ATP/ADP oranı, metabolit konsantrasyonu, dahili pH veya diğer parametreler izlenerek gerçek zamanlı olarak ölçülür. 100-400 nm çapındaki membran proteini içeren veziküllerimiz, mevcut ancak optimize edilmiş prosedürler kullanılarak dev-unilamellar veziküllere (GUV'ler) dönüştürülebilir. Yaklaşım, çözünür bileşenlerin (enzimler, metabolitler, sensörler) mikrometre boyutundaki veziküllere dahil edilmesini sağlar, böylece biyoreaktörlerin hacmini büyüklük sırasına göre yükseltir. GUV'leri içeren metabolik ağ, optik mikroskopi ile analiz edilmek üzere mikroakışkan cihazlarda tutulur.

Giriş

Aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji alanı, biyoteknolojik 3,4 veya biyomedikal amaçlar 5,6,7,8 için (minimal) hücreler 1,2 ve metabolik biyoreaktörler oluşturmaya odaklanır. Sentetik hücrelerin inşası, araştırmacıların, doğal ortamların proteinlerini taklit eden iyi tanımlanmış koşullarda proteinleri (zar) incelemelerine olanak tanıyan, proteinlerin ve reaksiyon ağlarının ortaya çıkan özelliklerinin ve gizli biyokimyasal işlevlerinin keşfedilmesini sağlayan benzersiz bir platform sağlar9. Otonom olarak işleyen bir sentetik hücreye doğru bir ara adım olarak, canlı hücrelerin metabolik enerji korunumu, protein ve lipid sentezi ve homeostaz gibi temel özelliklerini yakalayan modüller geliştirilmiştir. Bu tür modüller sadece yaşam anlayışımızı geliştirmekle kalmaz, aynı zamanda tıp8 ve biyoteknoloji10 alanlarında da potansiyel uygulamalara sahiptir.

Transmembran proteinler, molekülleri hücrenin içine veya dışına taşıdıkları, sinyal verdikleri ve çevrenin kalitesine yanıt verdikleri ve çok sayıda biyosentetik rol oynadıkları için hemen hemen her metabolik ağın merkezinde yer alır. Bu nedenle, sentetik hücrelerdeki metabolik modüllerin mühendisliği, çoğu durumda integral ve/veya periferik membran proteinlerinin, spesifik lipitlerden ve yüksek bütünlükten (düşük geçirgenlik) oluşan bir membran çift tabakasına yeniden yapılandırılmasını gerektirir. Bu zar proteinlerinin kullanımı zordur ve özel bilgi ve deneysel beceriler gerektirir.

Fosfolipid veziküller içindeki zar proteinlerini yeniden oluşturmak için, çoğunlukla spesifik bir proteinin fonksiyon11,12, regülasyon13, kinetik özellikler14,15, lipid bağımlılığı15,16 ve/veya stabilite17'yi incelemek amacıyla çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler, deterjanla çözündürülmüş proteininlipitlerin 18 varlığında sulu ortama hızlı bir şekilde seyreltilmesini, deterjanla çözündürülmüş proteinin deterjanla destabilize edilmiş lipid vezikülleri ile inkübe edilmesiyle deterjanların uzaklaştırılmasını ve deterjan(lar)ın polistiren boncuklar19 üzerine emilmesini veya deterjanların diyaliz veya boyut dışlama kromatografisi20 ile uzaklaştırılmasını içerir. Organik çözücüler, örneğin yağ-su interfazlarının21 oluşumu yoluyla lipid vezikülleri oluşturmak için kullanılmıştır, ancak integral membran proteinlerinin çoğu, bu tür çözücülere maruz kaldıklarında inaktive edilir.

Laboratuvarımızda, büyük unilameller veziküller (LUV'ler) oluşturmak için çoğunlukla membran proteinlerini deterjan emme yöntemiyle yeniden sulandırıyoruz19. Bu yöntem, çoklu zar proteinlerinin birlikte sulandırılmasına ve enzimlerin, metabolitlerin ve probların vezikül lümeninde kapsüllenmesine izin verir22,23. Membran proteini içeren LUV'ler, elektroformasyon24 veya jel destekli şişme25 ve membran proteinlerinin26 bütünlüğünü korumak için özel koşullar kullanılarak, suda çözünür bileşenlerin kapsüllenmesi ile / kapsüllenmemesi ile dev unilamellar veziküllere (GUV'ler) dönüştürülebilir.

Bu makale, L-arginin'in L-ornitin27'ye parçalanması yoluyla ATP'yi yeniden üreten denge dışı bir metabolik ağın LUV'lerinde sulandırılması için bir protokol sunmaktadır. ATP oluşumu, fosfolipid sentezi için önemli bir yapı taşı olan gliserol-3-fosfat (G3P) üretimi ile birleştirilir22,28. Metabolik yol, bir arginin/ornitin (ArcD) ve bir G3P/Pi antiporter (GlpT) olmak üzere iki integral membran proteininden oluşur. Ek olarak, ATP'nin geri dönüşümü için üç çözünür enzim (ArcA, ArcB, ArcC) gereklidir ve GlpK, L-arginin'in parçalanmasından elde edilen ATP'yi kullanarak gliserolü gliserol 3-fosfata dönüştürmek için kullanılır, yolun şematik bir genel bakışı için Şekil 1'e bakın. Bu protokol, lipitlerin veya proteinlerin sentezi veya hücrelerin bölünmesi için daha da karmaşık reaksiyon ağlarının gelecekteki inşası için iyi bir başlangıç noktasını temsil eder. Veziküllerin lipid bileşimi, çok çeşitli integral membran proteinlerinin aktivitesini destekler ve çeşitli moleküllerin veziküllerin içine veya dışına taşınması için optimize edilmiştir 27,29,30.

figure-introduction-1
Şekil 1: ATP üretimi ve gliserol 3-fosfat sentezi ve atılımı için yola genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kısacası, saflaştırılmış zar proteinleri (dodesil-β-D-maltosit, DDM içinde çözündürülmüş), proteinlerin zara yerleştirilmesine izin veren Triton X-100 ile destabilize edilmiş önceden oluşturulmuş lipid veziküllerine eklenir. Deterjan molekülleri daha sonra (yavaşça) aktive edilmiş polistiren boncukların eklenmesiyle uzaklaştırılır ve bu da iyi kapatılmış proteolipozomların oluşumuna neden olur. Çözünür bileşenler daha sonra veziküllere eklenebilir ve molekülleri membran füzyonu sürecinde yakalayan donma-çözülme döngüleri yoluyla kapsüllenebilir. Elde edilen veziküller oldukça heterojendir ve çoğu çok lamelli boyalıdır. Daha sonra, daha düzgün boyutta veziküller veren 400, 200 veya 100 nm gözenek boyutuna sahip bir polikarbonat filtreden ekstrüde edilirler; Gözenek boyutu ne kadar küçükse, veziküller o kadar homojen ve tek tiptir, ancak daha küçük bir iç hacim pahasına. Dahil edilmemiş proteinler ve küçük moleküller, boyut dışlama kromatografisi ile harici çözeltiden uzaklaştırılır. ProteoLUV'lar, jel destekli şişme ile mikrometre boyutunda veziküllere dönüştürülebilir ve bu proteoGUV'lar daha sonra toplanır ve mikroskobik karakterizasyon ve manipülasyon için bir mikroakışkan çip içinde tutulur. Şekil 2 , tam protokolün şematik bir genel bakışını göstermektedir.

figure-introduction-2
Şekil 2: Mikrometre altı (LUV'ler) ve mikrometre boyutundaki (GUV'ler) lipid veziküllerinde membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması ve enzimlerin ve suda çözünür bileşenlerin kapsüllenmesi için protokole genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sulandırma ve kapsülleme protokolleri iyi çalışır ve proteinlerin işlevselliği korunur, ancak proteoLUV'lar ve proteoGUV'lar boyut olarak heterojendir. Mikroakışkan yaklaşımlar 31,32, boyut olarak daha homojen olan mikrometre boyutunda veziküllerin oluşumuna izin verir, ancak zar proteinlerinin işlevsel olarak yeniden yapılandırılması genellikle mümkün değildir, çünkü çift tabakadaki artık çözücü proteinleri inaktive eder. ProteoLUV'lerin boyutları 100 ila 400 nm arasında değişir ve düşük enzim konsantrasyonlarında, kapsülleme eksik metabolik yollara sahip veziküllere yol açabilir (stokastik etkiler; bkz. Şekil 3). LUV'ler, ATP ve G3P gibi yapı taşlarının üretimi için burada gösterildiği gibi belirli metabolik modüller oluşturmak için idealdir. Bu tür proteoLUV'lar potansiyel olarak GUV'lerde kapsüllenebilir ve konakçı veziküller için organel benzeri bölmeler olarak hizmet edebilir.

figure-introduction-3
Şekil 3: Çapı 100, 200 veya 400 nm olan vezikül başına molekül sayısı. (A) Kapsüllenmiş proteinler (enzimler, problar) 1-10 μM aralığında olduğunda. (B) Sulandırma, lipid başına 1 ila 1.000, 1 ila 10.000 ve 1 ila 100.000 membran proteini (mol / mol) arasında yapılır. Moleküllerin belirtilen konsantrasyonlarda kapsüllendiği ve bu protein-lipit oranlarında zara dahil edildiği varsayımını yapıyoruz. Bazı enzimler için, zarlara bağlandıklarını gördük, bu da veziküllerdeki görünür konsantrasyonlarını artırabilir. Kısaltma: LPR = Lipid-Protein-Oranı Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Genel hazırlık

  1. Kimyasal
    1. Önceden oluşturulmuş lipozomlar yapmak için lipitleri (toz halinde) CHCl3 içinde 25 mg / mL'ye çözün.
      NOT: Taze lipid stoklarının hazırlanması tercih edilir, ancak stok çözeltileri -20 °C'de birkaç hafta saklanabilir. Toz halindeki lipitlerle çalışmak, CHCl3'te zaten çözünmüş olan lipitleri kullanmaktan daha doğrudur. CHCl3 , cam pipetler ve/veya şırıngalar kullanılarak kullanılmalı ve CHCl3 plastikleri çözdüğü için cam kaplarda saklanmalıdır.
    2. Kapsülleme prosedürü için küçük molekülleri (nükleotidler, amino asitler, floresan probları) 50 mM KPi'de (Tampon A, bkz. Tablo 1) çözün ve pH'ı 7.00 ± 0.01'e ayarlayın. Magnezyum fosfat çökeltilerinin oluşumunu önlemek içinMgCl2'yi deiyonize suda çözün.
      NOT: Stok çözeltileri, deney günü taze olarak hazırlanan DTT hariç, birkaç hafta boyunca -20 °C'de saklanabilir.
    3. İyonoforları (ör., valinomisin, nigericin) DMSO veya EtOH içinde 100-500 μM'lik bir stok konsantrasyonunda çözün. -20 ° C'de birkaç hafta saklayın; buharlaşmayı önleyin.
      NOT: DMSO uçucu değildir ve bu nedenle EtOH'ye göre tercih edilir. İyonoforların şişelerin yüzeyine yapışmasını önlemek için plastik şişeler yerine cam kullanın.
  2. Arabellek
    1. Deney günü taze tamponlar hazırlayın (Tablo 1). 24 saatten daha uzun süre saklamayın.
  3. Çözünür proteinlerin saflaştırılması
    1. Daha önceaçıklandığı gibi Express ArcA, ArcB, ArcC (ArcC1 adlı belirli bir varyant kullanıyoruz), PercevalHR ve GlpK 27,28,33. Proteinlerin stabilitesini artıran hücre lizis tamponuna v/v gliserol eklediğinizden emin olun. Çözünür proteinleri 27,28,33 ve bundan kısa bir süre sonra bildirildiği gibi saflaştırın.
    2. 10 mL hücre lizatını (~ 5 g ıslak ağırlık) buzlu su banyosunda çözdürün. Bu arada, 2 mL (1 CV) Ni2 + - Sefaroz reçinesini, yıkamak için deiyonize su (12 CV) ve Tampon B (4 CV) ile bir yerçekimi akış kolonuna (20 mL kapasite) uygulayın. Çözülmüş lizatı buza aktarın; Aksi belirtilmedikçe buz üzerinde çalışın.
    3. Çözülmüş lizata 10 mM'lik bir nihai konsantrasyona imidazol ekleyin, ardından çözeltiyi yerçekimi akış kolonuna dökün. Nazik nütasyon ile 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.
    4. 1 saat sonra, akışı atın ve reçineyi Tampon C (20 CV) ile yıkayın.
    5. İlk elüsyon adımı için% 60 CV kullanın, ardından% 40 CV'lerin% 4-6 adımını kullanın.
    6. Protein konsantrasyonunu belirleyin ve 5 mM'lik bir nihai konsantrasyona Na-EDTA ekleyin.
    7. Saflaştırılmış proteini soğutulmuş bir masa üstü santrifüjde döndürün (maksimum hız, 10 dakika, 4 °C). Tampon E kullanarak boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırın. Elüsyon fraksiyonlarını bir araya getirin ve bunları 30 kDa'lık bir kesme ile konsantre bir filtre ile ~ 10 mg / mL'ye konsantre edin. Uygun boyutta (~ 20 μL) alikotlar hazırlayın, sıvı nitrojen ile hızlı dondurun ve daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.
      NOT: Kapsülleme için gereken hacmi en aza indirmek için enzimleri 50-100 μM'ye konsantre etmek önemlidir.
  4. Membran proteinlerinin saflaştırılması
    1. Daha önce açıklandığı gibi ArcD ve GlpT'yi aşırı ekspreseedin 22,27,33. Hücre lizis tamponuna% 10 v / v gliserol eklediğinizden emin olun; ArcD'nin saflaştırılması için, tampona 2 mM indirgeyici ajan (örn., DTT) ekleyin. Afinite etiketli proteinleri Ni2 + -Sefaroz kromatografisi ile saflaştırın.
      1. Bir buzlu su banyosunda ham zar veziküllerinin (10-20 mg toplam zar proteini) bir kısmını çözün.
        NOT: Çözüldükten sonra, aksi belirtilmedikçe daima buz üzerinde çalışın. Bu bölümde kullanılan arabellekler için Tablo 1'e bakın.
      2. Membran veziküllerini Tampon F'ye (ArcD) veya Tampon G'ye (GlpT) 6 mL'lik bir son hacme ekleyin. Numuneyi hafif nütasyon ile 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.
      3. Çözünmüş membran proteinlerini ultrasantrifüjleme (337.000 × g, 30 dk, 4 °C) ile membran kalıntılarından ayırın. Bu arada, 0.25 mL (1 CV) Ni2 + - Sefaroz reçinesini, deiyonize su (40 CV) ve 20 CV Tampon H (ArcD) veya Tampon I (GlpT) ile bir yerçekimi akış kolonuna (10 mL kapasite) uygulayın.
      4. Çözündürülmüş proteini yerçekimi akış kolonuna dökün ve 10 mM'lik bir nihai konsantrasyona imidazol ekleyin. Nazik nümentasyon ile 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.
      5. 1 saat sonra, akışı atın ve reçineyi 20 CV Tampon J (ArcD) veya Tampon K (GlpT) ile yıkayın.
      6. Membran proteinini Tampon L (ArcD) veya Tampon M (GlpT) ile ` CV (1st) ve @ CV (2nd-6 th) adımlarında elute edin.
      7. Protein konsantrasyonunu belirleyin ve bölüm 2.2'ye devam edin. membran sulandırması için.
        NOT: Membran sulandırması benzer bir saflaştırma sağladığından, boyut dışlama saflaştırması mutlaka membran proteinleri için gerçekleştirilmez. Adım 1.4 ve 2.2 1 günlük çalışmada gerçekleştirilebilir. Sabahları protein saflaştırması (adım 1.4) ile başlayın ve öğleden sonra sulandırma (adım 2.2) ile devam edin. Sulandırma ertesi gün sona erer (ayrıntılar için bkz. bölüm 2.2). DURMA NOKTASI: Saflaştırılmış ve DDM ile çözünmüş ArcD ve GlpT daha sonra kullanılmak üzere -80 oC'de saklanabilir, ancak bu tüm zar proteinleri için geçerli değildir. Uygun boyutta (50-200 μL) alikotlar hazırlayın, sıvı nitrojen ile hızlı dondurun ve daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın. Bu proteinler -80 °C'de v/v gliserol varlığında saklandığında birkaç ay boyunca aktiftir.
  5. Pasivasyon amaçlı β-kazeinin hazırlanması
    1. 100 mg β-kazeini 20 mL deiyonize suda yeniden süspanse edin ve β-kazein tamamen eriyene kadar 1 M NaOH ile titre edin. Ardından, pH'ı 7.0'a ayarlamak için 1 M asetik asit ekleyin ve hacmi 50 mL'ye kadar deiyonize su ile doldurun. Çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün ve 500 μL'lik alikotlar yapın.
      NOT: β-kazein -20 °C'de 6 ay saklanabilir. β-kazein agregalarının mikroakışkan çipi tıkamasını önlemek için kullanmadan önce β-kazeinin tekrar filtrelenmesi önerilir.

ArabellekKompozisyon
Tampon A50 mM KPi pH 7.0
Tampon B50 mM KPi, 100 mM KCl, v/v gliserol, 10 mM imidazol, pH 7.5
Tampon C50 mM KPi, 100 mM KCl, v/v gliserol, 50 mM imidazol, pH 7.5
Tampon D50 mM KPi, 100 mM KCl, v/v gliserol, 500 mM imidazol, pH 7.5
Tampon E50 mM KPi, 100 mM KCl, v/v gliserol, pH 7.0
Tampon F50 mM KPi, 100 mM KCl, %0,5 w/v DDM, v/v gliserol, 2 mM β-merkaptoetanol, pH 7,5
Tampon G50 mM Tris-HCl, %0,5 w/v DDM, v/v gliserol, pH 8
Tampon H50 mM KPi, 100 mM KCl, %0,02 w/v DDM, v/v gliserol, 2 mM β-merkaptoetanol, 10 mM imidazol, pH 7,5
Tampon I50 mM Tris-HCl, %0,04 w/v DDM, v/v gliserol, 10 mM imidazol, pH 8,0
Tampon J50 mM KPi, 200 mM KCl, %0,02 w/v DDM, v/v gliserol, 2 mM β-merkaptoetanol, 50 mM imidazol, pH 7,5
Tampon K50 mM Tris-HCl, %0,04 w/v DDM, v/v gliserol, 50 mM imidazol, pH 8
Tampon L50 mM KPi, 200 mM KCl, %0,02 w/v DDM, v/v gliserol, 2 mM β-merkaptoetanol, 500 mM imidazol, pH 7,5
Tampon M50 mM Tris-HCl, %0,04 w/v DDM, v/v gliserol, 500 mM imidazol, pH 8
Tampon N50 mM KPi, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7.0
Tampon O50 mM KPi, 0.5 mM L-ornitin, 10 mM Na-ADP, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, pH 7.0
Tampon P50 mM KPi pH 7.0, 2 mM DTT, x mM glikoz (x, dış ve iç ortamın ozmolaritesine uyacak şekilde değişir)
Tampon Q50 mM KPi pH 7.0, 0.5 mM Sükroz, 2 mM DTT
Tampon R50 mM KPi pH 7.0, 2 mM DTT, 10 mM L-arginin, x mM glikoz

Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tamponlar.

2. Proteolipozomlar: saflaştırılmış zar proteinlerinin önceden oluşturulmuş lipid veziküllerine yeniden yapılandırılması

  1. 1. Gün
    1. Önceden oluşturulmuş lipid veziküllerin hazırlanması
      1. Membran proteinlerinin gereksinimlerine dayanarak lipit bileşimini (örneğin, sentetik fosfolipitler, E. coli polar lipidleri) seçin.
        NOT: DOPE, DOPG ve DOPC karışımı (%:25:50 mol) iyi bir başlangıç noktasıdır, ancak bazı proteinler için steroller veya kardiyolipin gerekebilir; Maya plazma zarı proteinleri için, dioleoil30 yerine palmitoil-oleoil lipidlerini dahil ediyoruz. ArcD ve GlpT'nin sulandırılması için bir DOPE, DOPG ve DOPC (%:25:50 mol) karışımı yeterlidir.
      2. İstenen lipitleri (CHCl3 içinde çözündürülmüş) karıştırın ve CHCl3'ü bir lipit filmi oluşana kadar döner bir buharlaştırıcıda buharlaştırın. CHCl3 ile eşit hacimde dietil eter ekleyerek lipitleri yıkayın. Dietil eteri buharlaştırın ve kuru bir lipit filmi elde edin.
      3. Lipid filmi sulu ortamda (Tampon A) 20 mg / mL toplam lipidlere yeniden süspanse edin. Toplam hacmin yarısı ile başlayın ve hafifçe sallayın; Ardından, lipitleri dikkatlice temiz bir tüpe veya yeterli büyüklükte bir şişeye aktarın. Şişeye taze Tampon A ekleyin ve kalan lipitleri çözmek ve bunları yeni bir kaba aktarmak için prosedürü tekrarlayın. 20 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için ek Tampon A ekleyin.
      4. Bir prob sonikatörü kullanarak yeniden askıya alınan lipitleri sonikleştirin. 6 mm çapında bir sonikatör ucu için aşağıdaki parametreleri kullanın: 4 μm yoğunluk,% 70 genlik, 5 s açık, 45 s kapalı, 16 döngü. Sonikasyon ile aşırı ısınmayı önlemek için lipitleri EtOH içeren bir buzlu su banyosuna daldırın.
      5. Sonikasyonlu numuneyi (50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 40 mL hacim) sıvı nitrojen içinde flaş dondurun ve numuneyi oda sıcaklığında bir su banyosunda çözün. Bir kez tekrarlayın; daha sonra, lipozomları istenen hacimlerde alikotlayın (ör., 1.5 mL'lik bir plastik tüpte 1 mL veya 20 mg toplam lipit).
        DURMA NOKTASI: Bu noktada işlem durdurulabilir. Her bir alikotu bir kez daha (üçüncü döngü) hızlı dondurun ve birkaç aya kadar sıvı nitrojen içinde saklayın. Sıvı nitrojenin hızlı bir şekilde kaynaması üzerine tüpün patlamasını önlemek için tüp kapaklarını bir iğne ile iki kez delmeye dikkat edin.
  2. 2. Gün
    1. Saflaştırılmış membran proteinlerinin önceden oluşturulmuş lipozomlara yeniden yapılandırılması
      1. Oda sıcaklığında bir su banyosunda bir lipozom alikotunu (20 mg toplam lipit) çözün. Bu arada, tercih edilen bir filtre uygulayarak bir ekstrüder hazırlayın (örneğin, polikarbonat, gözenek çapı 400 nm); ekstrüderi Tampon A ile önceden dengeleyin; ve çözülmüş lipozomları ('sütlü çözelti") ekstrüdere yükleyin ve filtreden 13 kez geçirin. Ekstrüde lipozomları toplayın (şimdi büyük unilamellar veziküller; "opak çözelti") yeterli boyutta (örneğin, 15 mL) bir cam veya plastik kapta. Lipozomları 2 mM DTT ile desteklenmiş Tampon A ile 4 mg / mL'ye seyreltin.
      2. 1 mL 4 mg / mL lipozomu 1 mL şeffaf küvete aktarın. Bir spektrofotometrede, ilk optik yoğunluğu 540 nm'de ölçün. Ölçülen numuneyi geri dökün ve lipozomlara 50 μL v/v Triton X-100 ekleyin.
        NOT: 50 μL'lik Triton-X100'lük bir titrasyon hacmi, 5 mL'lik bir hacimde 20 mg lipit için uygundur; Triton X-100 ilavesi lipitleri ~% 5 oranında seyreltecektir. Farklı miktarlarda lipozomlarla çalışırken titrasyon hacmini ayarlayın. Kararlı optik yoğunluk sinyalleri için, lipozomları oda sıcaklığında Triton X-100 ile titre edin.
      3. Adım 2.2.1.2'yi tekrarlayın ve maksimum optik yoğunluğa ne zaman ulaşıldığını not edin (Rsat). Yaklaşık ` Rsat optik yoğunluğa ulaşılana kadar titrasyona devam edin (Şekil 4). Deterjanla dengesizleştirilmiş vezikülleri cam/plastik tüpe geri dökün (nihai hacim şimdi yaklaşık 5,2 mL'dir), numuneyi buza aktarın ve soğumaya bırakın.
      4. İstenen bir lipit-protein oranına (a/a) ulaşmak için saflaştırılmış zar proteinlerini destabilize lipozomlara ekleyin. 400:1 ile 100:1 w/w arasında bir oran kullanın; hem ArcD hem de GlpT ~55 kDa'lık moleküler ağırlığa sahip olduğundan, 400:1 w/w'lik bir lipit-protein oranı, protein başına ~30.000 lipide ve 400 nm çapındaki veziküller başına ~ 50 molekül ArcD ve GlpT'ye karşılık gelir.
        NOT: Burada, 20 mg lipid başına her proteinin 50 μg'ına karşılık gelen 400:1 w/w kullanıyoruz.
      5. Membran proteinlerinin kararsız lipozomal membrana girmesine izin vermek için numuneleri 4 ° C'de 15 dakika boyunca nutate edin.
      6. Deterjanı çıkarmak için, üreticinin talimatlarına göre hazırlanmış 200 mg kuru polistiren boncuk ekleyin. 4 °C'de 15 dakika daha nutatlayın.
        NOT: 20 mg kuru boncuk miktarı 20 mg lipid için uygundur ancak farklı bir numune boyutu kullanıldığında ayarlanmalıdır.
      7. Toplam üç polistiren boncuk ilavesi için 2.2.1.6 2x adımını tekrarlayın. Ardından, hafif nutasyon ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  3. 3. Gün
    1. Adım 2.2.1.6'yı tekrarlayın; ancak bu sefer 4 °C'de 1 saat nutat yapın.
    2. Buz üzerinde boş bir 10 mL ultrasantrifüj tüpünün üzerine boş bir yerçekimi akış sütununu (6.5 mL kapasite) sabitleyin. Numuneyi kolona dökün ve proteolipozomları ultrasantrifüj tüpünde toplayın (boncuklar kolonda tutulur).
    3. Boncukları 2 mM DTT ile desteklenmiş 0,5 mL tampon A ile yıkayın ve süzüntüyü ultrasantrifüj tüpünde toplayın.
    4. Proteolipozomları ultrasantrifüjleme ile konsantre edin (337.000 × g, 30 dakika, 4 oC). Proteolipozomları, 2 mM DTT ile desteklenmiş Tampon A'da toplam 200 μL (100 mg lipid / mL) hacimde yeniden süspanse edin; santrifüjlemeden sonra veziküllerin kuru hacmi ~ 40 ila 120 μL'dir27. İstenilen büyüklükte alikotlara bölün (ör., 6.66 mg toplam lipitten oluşan üç alikot).
      NOT: Alikot boyutu isteğe bağlıdır ancak sonraki adımlarda pelet boyutunu etkileyecektir (bkz. adım 3.2.3.1). DURMA NOKTASI: İşlem burada durdurulabilir. Her bir alikotu hızlı dondurun ve birkaç haftaya kadar sıvı nitrojen içinde saklayın. Sıvı nitrojenin hızlı bir şekilde kaynaması üzerine tüpün patlamasını önlemek için tüp kapaklarını bir iğne ile iki kez delmeye dikkat edin.

figure-protocol-1
Şekil 4: Önceden oluşturulmuş lipozomların Triton X-100 ile titrasyonu. 5 mg lipid / mL'deki lipozomlar, 50 mM KPi'de (pH 7.0) bir polikarbonat filtreden (400 nm) ekstrüde edilir ve daha sonra Triton X-100 (protokol adımı 2.2.1.2) ile titre edilir. Veziküllerin bulanıklığı A540'ta ölçülür. Ok, 19'da tarif edildiği gibi zar proteinlerinin kendiliğinden yerleştirilmesi için veziküllerin yeterince dengesizleştirildiği TritonX-100 konsantrasyonunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Mikron altı boyutlu veziküllerde ATP geri dönüşümü ve gliserol 3-P sentezi için bir metabolik ağın kapsüllenmesi

  1. 1. Gün
    1. Bileşenlerin karıştırılması
      1. Standart bir kapsülleme için, 200 μL'lik (33.33 mg / mL toplam lipid) son hacimde 66.6 μL proteolipozom kullanın. İstenilen konsantrasyona ulaşmak için gereken her bir bileşenin (enzim, kofaktör) hacmini hesaplayın, bu bileşenleri proteolipozomlara ekleyin ve Tampon A ile hacmi 200 μL'ye ayarlayın (Tablo 2).
        NOT: Protein konsantrasyonu deney düzeneğine göre ayarlanabilir. Bununla birlikte, istenmeyen stokastik etkilerden kaçınmak için vezikül başına ortalama olarak her enzimin birkaç kopyasının (>10) mevcut olmasına dikkat edilmelidir. 1 μM'> konsantrasyonlar genellikle güvenlidir; 400 nm çapındaki bir vezikülde 1 μM, yaklaşık 20 kopyaya karşılık gelir (Şekil 3).
      2. Tampon A'yı 1,5 mL'lik boş bir tüpe pipetleyin ve DTT, Na-ADP, MgCl2, L-ornitin (ve dahili pH ölçümleri için gerekirse piranin) ekleyin. Sonra, enzimleri ekleyin ve hafifçe karıştırın. Çözeltiyi önceden oluşturulmuş proteolipozomların üzerine ekleyin ve kısa bir süre düşük hızda girdaplayın.
        NOT: İstenmeyen magnezyum fosfat çökeltilerinin oluşumunu önlemek için MgCl2'den önce Na-ADP eklemek önemlidir. Viskoz çözeltinin uygun şekilde karıştırılması için girdaplama gereklidir; Bununla birlikte, proteinlere mekanik hasar vermemek için süreyi ve hızı en aza indirin. PercevalHR ve piranin, spektrumları örtüştüğü için birlikte kapsüllenemez.
    2. İç ozmolalite tayini
      1. Adım 3.1.1.1'de açıklandığı gibi proteolipozomlar içermeyen 50 μL'lik bir çözelti hazırlayın ve ozmolaliteyi bir donma noktası ozmometresi ile ölçün.
      2. Tampon (50 mM KPi pH 7.0) ve değişen konsantrasyonlarda tuz (örn. NaCl veya NaCl) veya şeker kullanarak bir kalibrasyon eğrisi hazırlayın. İç ozmolalite (Tampon N) ile eşleşen ozmolit konsantrasyonunu belirleyin.
        NOT: Membran geçirgen bileşenler (örn. gliserol) iç ozmolaliteye uyacak şekilde kullanılamaz. Gliserol içeren tamponda (örneğin, Tampon E) çözündürülen proteinler için, aynı tampon gliserol olmadan kullanılmalıdır. İzo-ozmotik bir dış tamponun hazırlanması için seçilen ozmolit, zar geçirimsiz olmalı ve metabolik ağa müdahale etmemelidir.
    3. Donma-çözülme
      1. Proteolipozomları çözünür bileşenlerle birlikte hızlı dondurun (sıvı nitrojen içinde) ve yaklaşık 10 ° C'de bir su-buz banyosunda çözdürün.
      2. 3.1.3.1 adımını toplam 5 kez tekrarlayın.
        DURMA NOKTASI: İşlem burada durdurulabilir. Son çözdürme adımını atlayın ve donmuş numuneyi 1-3 gün sıvı nitrojen içinde saklayın. Sıvı nitrojenin hızlı bir şekilde kaynaması üzerine tüpün patlamasını önlemek için tüp kapaklarını 2 kez bir iğne ile delmeye dikkat edin. Lipid oksidasyonunu en aza indirmek için -80 °C'nin üzerinde sıvı nitrojen içinde depolama tercih edilir.
  2. 2. Gün
    1. Ekstrüzyon
      NOT: Gaz geçirmez şırıngalar aksi takdirde sızıntı yapacağından, tüm ekstrüzyon adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
      1. Tercih edilen bir filtre uygulayarak bir ekstrüder hazırlayın (örneğin, polikarbonat, gözenek çapı 400 nm). Ekstrüderi, veziküllerin kapsüllenmesi için kullanılan aynı tamponu ve metabolitleri içeren bir çözelti ile yıkayın (örneğin, Tampon O artı 0.1 mM piranin).
        NOT: Boya ekstrüder yüzeyine yapıştığından ve daha sonraki numunelerde kontaminasyona neden olabileceğinden, proteolipozomların piran ile yüklenmesi için özel bir ekstrüder kullanın.
      2. Kapsülleme karışımını ekstrüdere yükleyin ve filtreden 13x geçirin. Ekstrüde edilmiş çözeltiyi 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın.
    2. Boyut dışlama kromatografisi (isteğe bağlı)
      NOT: Bu adım, boyut dışlama kromatografisi ile piran gibi boyalar gibi harici molekülleri uzaklaştırmak için gerçekleştirilir. Sistemde boyalar yoksa ve diğer bileşenler düşük konsantrasyonlarda müdahale etmiyorsa (veziküllerin daha sonra ultrasantrifüjleme ile de yıkandığına dikkat edin), o zaman adım 3.2.2. atlanabilir.
      1. Sephadex G-75 reçinesini yeniden sulandırın ve bir cam sütuna (22 cm uzunluğunda, 1,5 cm genişliğinde) dökün. Reçineyi fazla miktarda harici tampon ile dengeleyin (örneğin, Tampon N).
      2. Adım 3.2.1.2'den ekstrüde edilmiş proteolipozomları önceden dengelenmiş boyut dışlama kromatografi kolonuna yükleyin ve harici tamponun yerçekimi akışını uygulayın. Boş hacmi atın (yaklaşık 7 mL); daha sonra on adet 1 mL alikot toplayın. Bir UV lambasına kısa süre maruz bırakarak proteolipozom içeren alikotları görselleştirin. Proteolipozomların çoğunu (2-4 mL) içeren fraksiyonları toplayın.
    3. Yıkama ve yeniden süspansiyon
      1. Ekstrüde edilmiş proteolipozomları ultrasantrifüjleme ile yıkayın. 6.5 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpünü 5.8 mL Tampon N ile doldurun ve ekstrüde edilmiş numuneyi üstüne uygulayın. Boyut dışlama kromatografisi yapıldıysa, tüpü havuzlanmış elüsyon numuneleri (2-4 mL) ile doldurun ve 6 mL'lik bir son hacme Tampon N ekleyin.
      2. 337.000 × g, 30 dakika, 4 °C'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve pelete dokunmamaya dikkat ederek ultrasantrifüj tüpünü tozsuz bir doku ile iyice kurulayın. Peleti küçük bir hacimde Tampon N (200 μL) içinde yeniden süspanse edin. Pelet tamamen yeniden süspanse edildiğinde, tüpü 6 mL'ye kadar Tampon N ile doldurun.
        NOT: peletin yeniden askıya alınması zaman alacaktır ve dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
      3. Boyut dışlama kromatografisi yapılmadıkça (bu durumda bir santrifüj adımı yeterlidir) toplam üç yıkama için 3.2.3.1-3.2.3.2 adımlarını 2 kez tekrarlayın. Son olarak, peleti istenen bir konsantrasyona (örneğin, 5.55 mg / mL toplam lipit) uygun bir hacimde Tampon N ekleyerek yeniden süspanse edin.
        DURMA NOKTASI: Proteolipozomlar hemen kullanılabilir veya en az 48 saat boyunca 4 °C'de saklanabilir. Ultrasantrifüj tüplerinin boyutu, numune boyutuna göre seçilmelidir. 6.66 mg toplam lipitten oluşan bir pelet için 6.5 mL'lik bir tüp uygundur. 200 μL proteolipozomun (toplamda 33.33 mg lipid/mL; kuru pelet hacmi ~ 40 μL)28 3 x 6 mL tampon için yıkanması, harici bileşenleri her yıkama adımı için 100 kat seyreltir. Farklı boyutlarda tüpler kullanılıyorsa, yıkama sayısının buna göre ayarlanması arzu edilir.
  3. 3. Gün
    1. Floresan ile ATP sentezinin tespiti
      1. Reaksiyon bileşenlerini, 3 x 5 mm'lik bir pencereye ve minimum 100 μL'lik bir iç hacme sahip siyah bir kuvars küvette 120 μL'lik bir nihai hacme (Tablo 3) karıştırın.
        NOT: Elektrokimyasal iyon gradyanlarını dağıtmak için iyonoforlar eklenebilir. Valinomisin ve nigerisin karışımı (her biri 1 μM), herhangi bir proton ve potasyum gradyanını etkili bir şekilde dağıtır.
      2. Numuneyi 30 °C'ye ayarlanmış bir florometrede önceden ısıtın ve PercevalHR'nin uyarma spektrumlarını elde edin (uyarma 400-520 nm, bant genişliği 5 nm; emisyon 550 nm, bant genişliği 5 nm). Prob sinyali sabit olduğunda, ATP'nin geri dönüşümü gliserol 3-fosfat sentezine bağlandığında fazla miktarda L-arginin (5-10 mM) ve gliserol (400 μM) ilavesiyle metabolik ağı başlatın. Zaman içindeki reaksiyonu takip edin.
    2. Veri analizi
      1. F500/F430 oranını, ATP/ADP oranının nitel bir göstergesi olan zamanın bir fonksiyonu olarak çizin. ATP oluşumunun daha kantitatif bir değerlendirmesi için, proteolipozomlarda bir kalibrasyon eğrisi oluşturun veya tamamlayıcı bir yaklaşım kullanın (örneğin, kemilüminesans28 ile ATP miktar tayini).
ParçaSon konsantrasyon
Tampon A50 mM KPi pH 7.0
DTT (Türkçe)2 milyon
Na-ADP10 milyon
MgCl210 milyon
L-ornitin0,5 milyon
Floresan prob (PercevalHR veya piranin)Sırasıyla 5,8 μM veya 0,1 mM
ArcA (Arginin deiminaz)1 μM
ArcB (Ornitin karbamoiltransferaz)2 μM
ArcC1 (Karbamat kinaz)5 μM
GlpK (Gliserol kinaz)1,6 μM
Proteolipozomlar33.33 mg / mL toplam lipit

Tablo 2: Kapsülleme bileşenleri. Bileşenler eklenme sırasına göre listelenir. Çözünür proteinler Tampon E'dedir; diğer tüm bileşenler (deiyonize sudaki MgCl2 hariç) Tampon A'dadır.

ParçaSon konsantrasyon
Tampon K50 mM KPi pH 7.0, 58 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7.0
Proteolipozomlar (5.55 mg/mL lipit)2.7 mg / mL lipit
İyonoforlar (valinomycin, nigericin)Her biri 1 μM

Tablo 3: Deney koşulları. Bileşenler eklenme sırasına göre listelenir. Proteolipozomlar Tampon N'de, iyonoforlar DMSO veya EtOH'dedir.

4. Mikrometre büyüklüğündeki veziküller için metabolik bir ağın yükseltilmesi

  1. 1. Gün
    1. Mikroakışkan çip hazırlama
      NOT: Bu deney, Robinson ve ark.34 tarafından geliştirilen bir mikroakışkan cihaz kullanır. Mikroakışkan çiplerin diğer tasarımları35,36,37 mevcuttur ve bu protokolde kolayca uygulanabilir.
      1. 200 μL'lik bir pipet ucunu alttan üçte bir oranında kesin ve ucun alt kısmını önceden hazırlanmış bir mikroakışkan yakalama cihazına yerleştirin.
      2. Çipin giriş haznesine 400 μL β-kazein çözeltisi (2 mg / mL; bkz. adım 1.5) ekleyin ve bu adımda hava girmesini önlemeye dikkat edin. 96 oyuklu bir plaka kovası yerleştirin ve masa üstü konik tüp santrifüjüne bir laboratuvar dokusu ekleyin. Çipi dokunun üzerine yerleştirin ve mikroakışkan çipin pasivasyonuna izin vermek için 900 × g'da 6 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme adımından sonra, sıvı seviyesi giriş haznesi ve mikroakışkan çipin çıkış ucu üzerinde eşit olmalıdır; Çipte sızıntı olup olmadığını kontrol edin. β-kazein çözeltisini mikroakışkan çipte en az 30 dakika inkübe edin.
      3. Pasivasyon çözeltisinin çoğunu hava vermeden çıkarın ve 400 μl yıkama tamponu (tampon P) ekleyin. Çipi 96 oyuklu plaka kovasına yerleştirin ve 6 dakika boyunca 900 × g'da santrifüjleyin. Çipi kullanana kadar (en fazla 4 saat) yıkama solüsyonunda bırakın.
  2. Proteo-GUV'lerin yapımı için jel hazırlama
    NOT: Aşağıdaki açıklama 25,38'den alınmış ve uyarlanmıştır.
    1. Çözeltiyi mikrodalgada ısıtarak düşük jelleşme sıcaklığına sahip (LGT) agarozun %0,5'ini (a/a) deiyonize suda çözün; Agarozun tamamen çözüldüğünden emin olun ve çözeltiyi kaynatmaktan kaçının. Agarozu daha fazla kullanana kadar 50 °C'de tutun.
      NOT: Çözünmüş agaroz oda sıcaklığında birkaç hafta saklanabilir. Agarozu yeniden kullanmak için, jeli bir mikrodalga kullanarak eritmeniz yeterlidir.
    2. İki objektif slayt alın ve ara parçanın ana hatlarını slaytların üzerine çizin. 1 dakika boyunca yüksek oksijenli plazma kullanarak plazma temizliği ile slaytları hidrofilik hale getirin.
    3. Tamamen agaroz (~ 500 μL) ile kaplanana kadar slaydın üstüne LGT agaroz ekleyin; Ardından, slaytı 90 ° 'lik bir açıyla eğin ve fazla agarozu bir doku üzerine boşaltın. Slaytları 50 °C'de 30 dakika bekletin.
    4. Sıvı nitrojen (bölüm 3) içinde saklanan proteolipozomları alın ve buz üzerinde çözdürün. Tampon Q kullanarak vezikülleri 5 mg / mL lipitlere seyreltin.
      NOT: Bölüm 3'te hazırlanan proteolipozomlar çözünür proteinler içermez ve sıvı nitrojen içinde saklanırsa çok önceden hazırlanabilir. ProteoGUV'larla çalışırken, mikroakışkan cihazın tıkanmasını önlemek için çalışma solüsyonlarını her zaman filtrelediğinizden emin olun.
    5. 1 mm'lik bir prob ile elde tutulan bir prob sonikatörü kullanarak proteo-lipozomları sonikleştirin. % 70 genlikte 0,5 sn açık ve 0,5 s kapalı 10 döngü için sonikat. Bundan sonra proteoSUV olarak anılacak olan vezikülleri 30 saniye boyunca buzda tutun ve sonikasyon işlemini 5x tekrarlayın.
    6. 100 μL'lik bir şırıngayı (el tipi bir LCP Dispenserinde) proteo-SUV süspansiyonu ile doldurun. Önceden hazırlanmış agaroz jeli üzerine 0.5 μL proteo-SUV damlacıkları biriktirin; Agaroz tabakasını rahatsız etmemeye ve damlacıkların kaynaşmasını önlemek için yeterli mesafeyi korumaya dikkat edin.
      NOT Elde tutulan bir LCP Dispenseri kullanmak, damlacıkların tekrarlanabilir bir şekilde birikmesine izin verir, ancak alternatif pipetleme sistemleri de kullanılabilir. Cam kılcal damar ile lekelenme, kurutulmuş agaroz jeli bozduğu için daha az uygundur.
    7. Lipitlerin oksitlenme olasılığını azaltmak için basınçlı hava yerine nitrojen akışı kullanarak SUV damlacıklarını ~ 10 dakika içinde kurutun.
    8. Tampon A'da 1 mL 1.25x konsantre tampon O (Tablo 4) hazırlayın ve 0.2 μm'lik bir selüloz asetat filtresinden geçirin. 1.25x konsantre çözeltinin 800 μL'sini alın ve çözünür enzimleri ve probları Tablo 4'te belirtildiği gibi bir konsantrasyona ekleyin. Son hacmi 1 mL yapmak için filtrelenmiş deiyonize su kullanın.
    9. Proteinler ve gliserol hariç, Tablo 4'ün tüm bileşenlerini içeren 100 μL şişme çözeltisi hazırlayın. 3 noktalı kalibre edilmiş donma noktası ozmometresi kullanarak şişme çözeltisinin ozmolalitesini ölçün.
      NOT: Bu çözeltinin ozmolalitesini doğru bir şekilde belirlemek için protein ve gliserol içermeyen 100 μL şişme çözeltisi hazırlayın. Protein çözeltisinde bulunan gliserol, ozmolaliteyi etkiler, ancak GUV'lerde gliserol zar boyunca hızla yayılır ve yalnızca geçici ozmotik farklılıklara yol açar.
    10. Aralarında 1.5 veya 3.0 mm kalınlığında bir Teflon ara parçası bulunan jel ve kurutulmuş SUV'ları içeren iki objektif camdan oluşan bir sandviç yaparak GUV şişme odasını monte edin. Ardından, bir şırınga ve iğne kullanarak yandaki küçük delikten haznedeki şişme solüsyonunu ekleyin.
      NOT: Şişme çözeltisinin hacmi, ara parçalar 1.5 ila 3.0 mm arasında değiştirilerek ayarlanabilir.
  3. Veziküllerin şişmesi ve GUV'lerin toplanması
    1. Hazneyi en az 30 dakika boyunca 22 ° C'ye koyarak veziküllerin şişmesine izin verin.
      NOT: Proteinler veya lipitler floresan olarak etiketlenmişse, veziküllerin şişmesini ışık mikroskobu (örneğin, bir masa üstü faz kontrast mikroskobu veya geniş alanlı floresan mikroskobu) takip edebilir.
    2. Hazneyi katı bir yüzeye (örn. laboratuvar tezgahı) vurarak hafif fiziksel çalkalama uygulayarak GUV'leri jelden hasat edin; hacmin üçte birini çıkarın ve elde edilen hava kabarcığını kalan sıvıya nazikçe hareket ettirmek için kullanın, böylece GUV'leri jelden ayırın.
    3. GUV'ler şişerken, tampon P hazırlayın ve glikoz konsantrasyonunu ayarlayarak ozmolaliteyi şişme çözeltisiyle eşleştirin. Tamponu 0,2 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün.
      NOT: Genel olarak, yıkama ve alt tabaka çözeltisi ± 5 mosmol / kg içinde tutulmalıdır. Kirleticiler kanalları tıkayabileceğinden, çipten geçen herhangi bir çözelti çok temiz olmalıdır. Her seferinde yeni tamponlar yapın veya hazırlanan tamponları -20 °C'de saklayın ve kullanmadan önce süzün.
  4. Mikroskopi deneyleri için GUV'lerin yakalanması
    1. Pasifleştirilmiş mikroakışkan çipi mikroskobun numune aşamasına monte edin. Olası kusurları kontrol edin (örn. sızıntılar, sıkışmış hava, tıkalı kanallar).
      NOT: Çipin kontrol edilmesi, kullanılmadan önce iyi bir şekilde yapılabilir, böylece gerekirse yeni bir çip hazırlanabilir.
    2. Hortumu bükülmüş bir iğne kullanarak rezervuarın çıkışına bağlayın ve diğer ucunu 1 mL'lik bir şırıngaya bağlayın. Şırıngayı bir pompaya monte edin ve akış hızını maksimum 10 μL/dk'ya ayarlayın.
    3. Yıkama tamponunu hazneden çıkarın (adım 4.1.1.3) ve yeni ortamla (tampon P) değiştirin. Şırınga ile 1-10 μL / dk'da infüze ederek çip boyunca tampon akışını başlatın. En az 80 μL ozmotik olarak dengelenmiş yıkama tamponu (Buffer P) ile yıkayın.
    4. Fazla yıkama tamponunu rezervuardan çıkarın ve (proteo)GUV'leri rezervuara ekleyin. GUV'lerin çipten akmasına izin vermek için akış hızını 0.1-1 μL/dk'ya ayarlayın. Çip içinde yeterli GUV sıkışana kadar çipi zaman içinde izleyin.
      NOT: Fosfatidilgliserol (PG), fosfatidil serin (PS) veya fosfatidik asit (PA) gibi nispeten büyük miktarlarda (%>20 mol) yüklü lipidler veya fosfatidiletanolamin (PE) gibi çift tabaka oluşturmayan lipidler içeren veziküller, patlamayı önlemek için çip boyunca daha düşük bir akış hızında sokulur. Saf fosfatidilkolinden (PC) oluşan veziküller daha kararlı olma eğilimindedir.
    5. Fazla GUV çözeltisini çıkarın ve dış ortamı değiştirmek için 0.1-1 μL / dak'lık sabit bir akış kullanarak yıkama tamponu P ekleyin ve kapsüllenmemiş bileşikleri uzaklaştırmak ve bir florofor kapsüllendiğinde arka plan floresansını azaltmak için sıkışan GUV'leri en az 1 saat yıkayın. Zaman içinde arka plan floresansını izleyin; Arka plan floresansı azalmazsa, çip tıkanmış olabilir.
    6. Yeterli miktarda vezikül içeren tuzakları lokalize edin ve konumlarını kaydedin. Mikroskoptaki ayarları uygulayın (örneğin, lazer yoğunluğu, kazanç, dalga boyu) ve bir zaman serisi deneyine başlayın.
    7. Rezervuara ozmotik olarak dengelenmiş substrat çözeltisi (tampon R) ekleyin ve 0,5 μL/dk'lık bir akış hızı başlatın.

Tampon L bileşenleri
Parça1.25 x konsantrasyonÇalışma konsantrasyonu
Tampon A62,5 mM KPi pH 7,050 mM KPi pH 7.0
Sakaroz125 milyon100 milyon
DTT (Türkçe)2,5 milyon2 milyon
Na-ADP12,5 milyon10 milyon
MgCl212,5 milyon10 milyon
L-ornitin0,625 milyon0,5 milyon
Kapsülleme bileşenleri
Piranin veya PercevalHR1 mM veya 20 μM
ArcA (Arginin deiminaz)1 μM
ArcB (Ornitin karbamoiltransferaz)2 μM
ArcC1 (Karbamat kinaz)5 μM

Tablo 4: Tampon O ve kapsülleme bileşenleri. Bileşenler eklenme sırasına göre listelenir. Tüm bileşenler (deiyonize sudaki MgCl2 hariç) Tampon A'dadır. Kapsülleme bileşenleri ekleme sırasına göre listelenmiştir. Suda çözünür tüm proteinler Tampon E'de bulunur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Lipozomlarda çözünmüş zar proteinlerinin sulandırılması, önceden oluşturulmuş veziküllerin dengesizleştirilmesini gerektirir. Düşük miktarlarda Triton X-100 ilavesi, başlangıçta veziküllerin şişmesiyle ışık saçılımındaki artışa bağlı olarak 540 nm'de (A540) bir absorbans artışı ile sonuçlanır (Şekil 4). Maksimum A540 değeri, lipozomların deterjanla (Rsat) doyurulduğu noktadır, bundan sonra herhangi bir Triton X-100 ilavesi, veziküllerin kısmen çözünm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mikrometre altı boyutta lipid veziküller (proteoLUV'ler) içeren (membran) proteinin sentezi ve proteoLUV'lerin dev-unilamellar veziküllere (proteoGUV'lar) dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz. Protokol, diğer membran proteinlerinin 13,19,30,40 sulandırılması ve burada sunulan L-arginin parçalanması ve gliserol 3-fosfat sentez yolları dışındaki metabolik ağların kapsüllenmesi için uygulanabilir olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden hiçbir finansal çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, pBAD-PercevalHR geninin klonlanması için Aditya Iyer'e ve protein üretimi ve saflaştırılmasına yardımcı olduğu için Gea Schuurman-Wolters'a teşekkür eder. Araştırma, NWO Yerçekimi programı "Sentetik Bir Hücre İnşa Etmek" (BaSyC) tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgaroseSigma AldrichA9414-25g
Amicon kesme filtresiSigma AldrichMilipore santrifüj filtre üniteleri Amicon Ultra 
BioBeadsBioRad152-3920
CHCl3Macron İnce KimyasallarMFCD00000826
D (+) - GlikozFormedium-D
(+) - SükrozFormedium-DDM
GlyconD97002 -C
Dietil EterBiosolve52805
DMSOSigma-Aldrich276855-100ml
DOPCAvanti850375P-1g
DOPEAvanti850725P-1g
DOPGAvanti840475P-1g
DTTFormedium DTT005
EtOHJ.T.Baker AvantorMFCD00003568
EkstruderAvestin IncLF-1
FlorimetreJascoSpektroflorometre FP-8300
GliserolBOOM51171608
Yerçekimi akış sütunuBio-Rad732-1010
Hamilton şırınga 100 ve mikro; LHamilton7656-01
Hamilton şırınga 1000 ve mikro; LHamilton81320
El LCP dağıtıcıArt Robbins Instruments620-411-00
El SonikatörHielscher Ultrason TeknolojisiUP50H
HClBOOMx76021889.1000
İmidazolRothX998.4-250g
K2< / sub>HPO4< / sub>Supelco1.05099.1000
KClBOM76028270.1
KH2PO4Supelco1.04873.1000
KimwipeKimtech Science7552
Büyük Falcon tüp santrifüjEppendorfSantrifüj 5810 R
L-ArgininSigma-AldrichA5006-100G
Işık mikroskobuLeicaDM LS2
L-OrnitinRothT204.1
LSM Lazer Tarama Konfokal MikroskopZeissLSM 710 ConfoCor 3
MgCl2Sigma-AldrichM2670-1KG
Mikroakışkan çipEv yapımı PDMS tabanlıDOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADPSigma-AldrichA2754-1G
NaClSupelco1.06404.1000
Nanodrop Spektrometresiİzojen Yaşam BilimleriND-1000 spektrofotometre NanoDrop
NaOHSupelco1.06498.1000
GUV'ler için İğnelerHenke-Ject14-1457527 G x 3/4 '' 0.4 x 20 mm
Mikroakışkanlar için İğnelerHenke-Ject14-1553818 G x 1 1/2 '' 1.2 x 40 mm
Ni2< / sub> + < / sup> SepharoseCytiva17526802
NijercinSigma-AldrichN7143-5MG
NutatorVWR83007-210
Ozmolalite ölçerGonotec SalmenkippOsmomat 3000 temel donma noktası ozmometresi
PlasmacleanerPlazma AşındırmaPE-Avenger
Polikarbonat filtreCytiva WhatmanNuclepor Track-Etch Membran Ürün: 104171040.4 ve mikro; m
Polikarbonat ultrasantrifüj tüpüBeckman Coulter355647
PyranineAcros OrganicsH1529-1G
Kuvars küvet (siyah)Hellma Analytics108B-10-40
Sephadex G-75 reçinesi GE Sağlık17-0050-01
SonicatorSonics Sonics & Malzemeler: INCSonics, vibrasyon hücresi
Şırınga filtresiSarstedt,Filtropur S plus, 0.20.2 & m
Şırınga pompasıHarvard AparatıA-42467
Masaüstü santrifüjEppendorfsantrifüj 5418
Teflon ara parçasıEv yapımı Teflon bazlı45 x 26 x 1.5 veya 45 x 26 x 3 veya 20 x 20 x 3 mm
TrisPanReac AppliChemA1086.1000
Triton X-100Sigma AldrichT8787-100 ml
UltrasantrifüjBeckman CoulterOptima Max-E
UV lambasıSpektrolineENB-280C/FE
UV/VIS SpektrometresiJascoV730 spektrofotometre
ValinomisinSigma-AldrichV0627-10MG
Geniş alan floresan mikroskobuZeissAxioObserver
ve beta;-KazeinSigma AldrichC5890-500g
, , , ,

Kaynaklar

  1. Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
  2. Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
  3. Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
  4. Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
  5. Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168(2020).
  6. Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
  7. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
  8. Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
  9. Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
  10. Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).
  11. Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
  12. Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
  13. Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697(2020).
  14. Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
  15. Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
  16. Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
  17. Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
  18. Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
  19. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  20. Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
  21. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  22. Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023).
  23. Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
  24. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , Elsevier. 161-176 (2009).
  25. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281(2015).
  26. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  27. Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239(2019).
  28. Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
  29. Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
  30. Van'T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
  31. Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
  32. Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
  33. Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
  34. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  35. Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459 (2019).
  36. Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064(2020).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105(2013).
  38. Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
  39. Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550(2013).
  40. Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389(2020).
  41. Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
  42. Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Sentetik VeziküllerMembran Proteini RekonstitüsyonuBüyük Unilameller VeziküllerDev Unilameller VeziküllerMikroakışkan YakalamaFloresans SensörleriATP ÜretimiBoyut Dışlama Kromatografisi
Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.