Mevcut protokol, serebral damarların anatomik yapısını hasara neden olmadan koruyan bir orta serebral arter oklüzyonu/reperfüzyonu sıçan modelini tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Serebral damarların anatomik yapısına zarar vermeden orta serebral arter tıkanıklığı/reperfüzyonunun bir sıçan modeli
Bu makalede
Özet
Özet
İskemik inme, dünya çapında yetişkinler arasında uzun süreli sakatlık ve mortalitenin birincil nedeni olarak durmaktadır. İskemik inmenin hayvan modelleri, patolojik mekanizmalarını anlamamıza ve potansiyel tedavilerin geliştirilmesine önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Şu anda, serebral iskeminin hayvan modellerini indüklemek için filament (endovasküler sütür) tekniklerini içeren iki yaygın yöntem vardır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin beyne kan perfüzyonunun azalması, dış karotis arter sisteminde hasar, bozulmuş gıda ve/veya su alımı ve yüzün duyusal işlev bozukluğu gibi doğal sınırlamaları vardır. Bu makale, serebral vasküler anatomiden ödün vermeden bir sıçan iskemik inme modelini indüklemek için yeni bir yöntem sunmaktadır. Bu çalışmada, Sprague-Dawley sıçanlarının ortak karotis arteri (CCA) ortaya çıkarıldı ve bir insizyon yapıldı. Daha sonra orta serebral arteri tıkamak için insizyondan internal karotid artere bir filament yerleştirildi. 1.5 saatlik indüklenmiş iskemi sonrasında, tıkayıcı filament hem internal karotis arterden hem de CCA'dan tamamen çıkarıldı. CCA'daki insizyon daha sonra mikroskop altında 11-0 mikrocerrahi sütürler kullanılarak dikildi (büyütme 4x). CCA'yı onarmak için mikrocerrahi tekniklerin kullanılmasıyla, bu çalışma, serebral kan damarlarının anatomik bütünlüğünü korurken sıçanlarda iskemik inme modelini indüklemek için başarılı bir şekilde benzersiz bir yöntem geliştirdi.
Giriş
Dünya çapında erişkinlerde önde gelen ölüm ve uzun süreli nörolojik disfonksiyon nedeni olan inme, iskemik inme vakaların yaklaşık %81,9'unu oluştururken, serebral kanama ve subaraknoid kanama sırasıyla %14,9 ve %3,1'i oluşturur1. İskemik inme sıklıkla orta serebral arterin (MCA) ateroskleroz veya tıkanmasından kaynaklanır ve bu da lokal serebral kan akışının azalmasına ve ardından beyin hasarına yol açar. İskemik hücrelere besin tedarikindeki bu azalma, enerji tükenmesini tetikleyerek zar bütünlük kaybına, hücre şişmesine ve nihayetinde lizise neden olur. Ek olarak, hücre içi kalsiyumun artması, uyarıcı amino asit salınımı, artmış serbest radikal üretimi ve inflamatuar hücre aktivasyonu gibi faktörler, inme sonrası beyin dokusu hasarına katkıda bulunur2.
İskemik inme için tedavi hedefleri çok yönlüdür: devam eden nörolojik hasarı azaltmak ve mortaliteyi ve uzun vadeli sakatlığı azaltmak; hareketsizlik ve nörolojik disfonksiyondan kaynaklanan komplikasyonları önlemek; ve inme tekrarlama riskini en aza indirmek. İskemik inme patofizyolojisinin karmaşıklığı göz önüne alındığında, iskemik inmeyi hedefleyen tedavilerin araştırılması ve geliştirilmesi için sağlam bir inme modeli gereklidir.
Şu anda, orta serebral arter tıkanıklığı (MCAo), iskemik inmenin yaygın bir hayvan modelidir3. MCAo tipik olarak, orta serebral arterin (MCA) kökenine ulaşana kadar servikal damarlardan silikon uçlu veya alevle körelmiş bir monofilament yerleştirilerek gerçekleştirilir. 1986'da Koizumi ve meslektaşları, ortak karotis arterdeki (CCA) bir kesiden silikon uçlu bir monofilamentin yerleştirilmesini içeren bir teknik geliştirdiler, bu da MCA'nın girişine ulaşmasına ve kan akışını engellemesine izin verdi4. 1989'da Longa'nın grubu, dış karotis arterde (ECA) bir kesi yoluyla bir monofilament sokulmasını içeren başka bir MCAo yöntemi bildirdi. Monofilament daha sonra MCA5'in başlangıç noktasına ulaşmadan önce internal karotis arter (ICA) ve ECA'nın çatallanmasını geçer.
MCAo'yu indüklemek için mevcut iki yöntemin sınırlamaları açıktır. Koizumi'nin yöntemi, ipsilateral CCA'nın kalıcı olarak bloke edilmesini gerektirir ve reperfüzyon yalnızca Willis4 çemberine dayandığından, MCA perfüzyonunun azalmasına yol açar. Tersine, Longa'nın yöntemi, ECA'nın kesilmesini içerir, bu da ECA sistemine zarar verir ve ardından yüz kası fonksiyonunun bozulmasına neden olur5. Bu hasar, yiyecek ve su alımını etkilemenin yanı sıra yüzün duyusal işlev bozukluğuna neden olabilir, rehabilitasyonu ve iskemik inme sonrası nörolojik fonksiyonun değerlendirilmesini etkileyebilir6.
Mevcut protokol, serebral damarların anatomik yapısına zarar vermeden iskemik inme modelini indüklemek için yeni bir yöntem geliştirerek bu sınırlamaları ele almayı amaçlamaktadır. Bu yeni yaklaşım, CCA'yı onarmak için mikrocerrahi teknikleri kullanır ve böylece önceki yöntemlerle ilişkili dezavantajlardan kaçınır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneysel prosedür, Yantai Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nden (Onay Numarası: YTDX20230410) onay aldı ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Yönergelerine bağlı kaldı. Bu çalışma için ağırlıkları 300-350 g arasında değişen erkek Sprague-Dawley sıçanları kullanıldı. Kullanılan hayvanların, reaktiflerin ve ekipmanların kapsamlı bir listesi Malzeme Tablosunda verilmiştir.
1. Hayvan hazırlama
- Hayvanları 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsünü, kontrollü sıcaklığı ve nemi koruyan bir ortamda barındırın. Yiyecek ve suya sınırsız erişimleri olduğundan emin olun.
2. Anestezi
- Sıçanları ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (20 mg / kg) içeren bir karışım ile intraperitoneal enjeksiyon yoluyla anestezik hale getirin><. NOT: Farelerin başını ve gövdesini aşağı doğru eğin. Enjeksiyon bölgesi, hayvanın karnının sağ alt çeyreğindedir. Enjekte etmeden önce pistonu geri çekin. Ortalama enjeksiyon hacmi 0.4 mL'dir.
- Arka pençenin geri çekilme refleksini ve yanıp sönme refleksini değerlendirerek anestezi indüksiyonunu onaylayın. Yeterli anestezi derinliği elde edilemezse, cerrahi işlem sırasında izofluran ile takviye edin.
3. İskemik modelleme prosedürü
- Cerrahi aletleri bir otoklav kullanarak sterilize edin. Ameliyat masalarını ve ilgili ekipmanları %70 etanol ile dezenfekte edin.
- Beklenen kesi yerinin etrafındaki kürkü tıraş ederek ameliyat bölgesini hazırlayın. Cerrahi bölgedeki cildi betadin ve% 70 etanol ile üç kez dezenfekte edin.
- Ventral tarafta yaklaşık 1,5 cm uzunluğunda orta hat kesisi yapın ve yüzeysel fasyayı açın.
- Dış karotis arteri (ECA), iç karotis arteri (ICA) ve ortak karotis arteri (CCA) daha önce açıklanan yönteme göre ortaya çıkarmak için keskin ve künt diseksiyon yapın<: sup class="xref">7.
- CCA'nın etrafına üç adet 4-0 ipek sütür yerleştirin ve ECA'dan ICA çatallanmasının yakınına başka bir ipek sütür yerleştirin. Proksimal CCA'ya serbest bırakılabilir bir kayma düğümü bağlayın. Kan akışını engellemek için bir hemostat kullanarak distal CCA'daki dikişi sıkın. Damarın tıkanmadığından emin olmak için dikiş sırasında CCA'nın etrafına gevşek bir şekilde başka bir kayma düğümü atın.
NOT: Kayma düğümünün aşırı sıkı olmadığından, vasküler dikiş sırasında serbest bırakılması gerekeceğinden, yalnızca kan akışını engellemeye yetecek kadar olduğundan emin olun. - CCA üzerinde proksimal ipek sütür ile orta sütür arasında makas kullanarak 0,5 mm'lik bir kesi yapın.
NOT: Kesi işleminin filamentin (silikon kaplı uç) CCA'ya girmesine izin verdiğinden emin olun. - CCA'ya 3 cm uzunluğunda 4-0 filament (silikon kaplı uç) yerleştirin. İntraluminal filamenti sabitlemek ve kanamayı önlemek için CCA'nın etrafındaki ipek dikişleri sıkın; daha sonra dikişi distal CCA'dan çıkarın.
- Filamentin ECA'ya girmediğinden emin olmak için ECA'nın etrafındaki dikişleri kontrol ederek filamenti MCA'nın lümenine yerleştirmeye devam edin. Yerleştirme uzunluğu tipik olarak 18 mm ila 20 mm'dir.
- Bir zamanlayıcı başlatın ve oklüzyonun başladığı zamanı kaydedin. Boyun kesisini 3-0 ipek dikişlerle dikin ve hayvanı dikkatlice bir kurtarma kafesine yerleştirin. İntraperitoral olarak 0.5 mL normal salin uygulayın.
4. CCA'nın mikrocerrahi dikilmesi
- İskemi sonrası sıçanı 1.5 saat sonra yeniden uyuşturun. Kesi bölgesini %70 etanol ile üç kez dezenfekte edin ve kesiyi tekrar açın.
- CCA insizyonunun yakınında beyaz uç net bir şekilde görünene kadar tıkayıcı filamenti yavaşça geri çekin. CCA çatallanmasının yakınındaki güvenli intraluminal sütür düğümüne yatay olarak yakın bir mikro kelepçe yerleştirin.
NOT: Silikon dekolmanı ve ardından trombozu önlemek için beyaz filament ucunu sıkıştırmaktan kaçının. - Güvenli intraluminal sütür düğümünü serbest bırakın ve filamenti tamamen çıkarın.
- Proksimal CCA düğümünün kalp ucu tarafına yakın başka bir mikro kelepçe yerleştirin. Daha sonra, proksimal CCA.
etrafındaki dikiş düğümünü çıkarın NOT: Mikrovasküler sütürlemeyi kolaylaştırmak için sonraki adımlarda sabit damarları yükseltmek için kelepçelerin uygun şekilde yerleştirilmesi çok önemlidir. Kaymayı önlemek için kelepçeleri çevredeki kasların üzerine yatay olarak yerleştirin. - Kesi bölgesini normal tuzlu su ile durulayın ve kanı çıkarmak ve net bir cerrahi alan elde etmek için alanı steril bir pamuk topuyla kurulayın.
- Mikroskop altında (4x büyütme), CCA insizyonunu 11-0 mikrocerrahi sütürler kullanarak kesintili bir düzende dikin, tipik olarak insizyon boyutuna bağlı olarak iki dikiş gerektirir.
- Dikişten sonra, kan akışını eski haline getirmek için CCA'nın her iki ucundan mikro kelepçeleri çıkarın.
- Steril bir pamuk top ile CCA dikiş bölgesine 30 saniye boyunca baskı uygulayın. Kanama olmadığından emin olmak için CCA'yı 2 dakika boyunca gözlemleyin. Sıçanın boynu kesisini dikin ve hayvanı kafese geri göndermeden önce anestezi iyileşmesi için 35 °C'lik bir bakım kutusuna koyun.
NOT: Postoperatif analjezi için intraperitoneal olarak meloksikam ile 2 mg / kg'lık bir dozda uygulayın.
5. 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) ile boyama
- İskemi-reperfüzyondan üç gün sonra, hayvanlara% 4 izofluran ve servikal çıkık ile derin anestezi altında ötenazi yapın.
- Beyinleri çıkarın ve bir neşter bıçağı8 kullanarak 2 mm kalınlığında koronal bölümler halinde kesin.
- Beyin bölümlerini 37 ° C'de 20 dakika boyunca% 2 TTC ile inkübe edin.
- Beyin bölümlerini iki kez% 10 formalin ile durulayın, daha sonra% 10 formalin ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sabitleyin.
- Ardışık dilimlerin dijital fotoğraflarını çekin ve Image J yazılımını kullanarak enfarktüs alanlarını kantitatif olarak ölçün.
6. Nörolojik fonksiyon testi
NOT: Nörolojik fonksiyon, önceki bir raporun ardından Garcia testi kullanılarak değerlendirildi9.
- Spontan aktiviteyi, dört uzuvun tümünün hareketindeki simetriyi, ön pençe uzanmasını, tırmanmayı, vücut propriyosepsiyonunu ve vibrissae dokunuşuna yanıtı değerlendirin. Garcia test kriterlerine göre puanlar atayın ve normal nörolojik fonksiyonu gösteren maksimum 18 puan alın.
7. İstatistiksel analiz
- Öğrencinin t-testini kullanarak istatistiksel analiz yapmak için GraphPad Prism'i kullanın. Verileri ortalama ± standart sapma olarak ifade edin. P < 0.05 ise istatistiksel olarak anlamlı ortalamalar arasındaki farkları göz önünde bulundurun.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Mikrosütur süreci
Beyaz flaman ucu görünene kadar, flaman CCA insizyonu yakınından geri çekildi (Şekil 1A). Ardından CCA üzerine mikro klempler yerleştirildi (Şekil 1B). 4x büyütmede bir mikroskop altında, CCA insizyonu mikrocerrahi süturlar kullanılarak kesikli dikiş modeliyle dikildi (Şekil 1C). Sonrasında mikro klempler CCA'dan çıkarılarak anatomik yapı ve kan akışı yeniden sağlandı (Şeki...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
MCAo, iskemi10,11,12'den sonra kan akışını eski haline getirerek hastalarda gözlemlenen inme sürecini etkili bir şekilde kopyalayan, inmenin hayvan modellerini oluşturmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Laboratuvarımız, ECA'ya zarar vermeden CCA'dan reperfüzyon sağlayan bir iskemik inme modeli geliştirmiştir. İskemi indüksiyonunu takiben CCA'nın mikrocerrahi onarımı yapılır. CCA kan akışının doğrudan ölçümü yapılmam...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek herhangi bir potansiyel çatışan çıkarları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, 2023'te Hebei Eyaleti Yabancı İstihbaratın Tanıtılması Projesi tarafından desteklenmiştir. Liwen Bianji'den (Edanz) (www.liwenbianji.cn) Dr. Lisa Kreiner'e, bu el yazmasının bir taslağının İngilizce metnini düzenlediği için teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 10 formalin | Pekin Labgic Technology Co., Ltd. | BL913A | |
| 11-0 mikrocerrahi sütürler | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 3/8 1& kez; | |
| 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) | SIGMA | T8877 | |
| 3-0 ipek sütür | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 3-0 | |
| %4 izofluran | Tianjin Ringpu Biyo-Teknoloji Co, Ltd | ||
| 6-0 ipek sütür | Ningbo Tıbbi Sütür İğnesi Co., Ltd. | 6-0 | |
| %70 etanol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Filament | Xinong Teknolojileri Co Ltd. | 2838-A5 | |
| Ketamin ve nbsp; | Jiangsu Hengrui İlaç Co., Ltd. | 230613BL | |
| Erkek Sprague Dawley sıçanları | Jinan Pengyue Deneysel Hayvan Yetiştiriciliği Co., Ltd. | SCXK (Lu) 20190003 | |
| Mikroklipsler | Şangay Jinzhong Tıbbi Cihaz Fabrikası | W40150 | |
| Mikroskop | ZEISS | S100 OPMI pico | |
| Hemşirelik kutusu | Beijing Fuyi Electrical Appliance Co., Ltd. | FYL-YS-100L | |
| Ksilazin | SIGMA PHR3263 |
Kaynaklar
- Tu, W. J., et al. China stroke surveillance report 2021. Mil Med Res. 10 (1), 33(2023).
- Wu, L., et al. Targeting oxidative stress and inflammation to prevent ischemia-reperfusion injury. Front in Mol Neurosci. 13, 28(2020).
- Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. E. Experimental studies of ischemic brain edema: A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jap J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: Impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).
- Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser Doppler flowmetry guidance in mice. J Vis Exp. (51), e2879(2011).
- Yu, Z., et al. Icaritin inhibits neuroinflammation in a rat cerebral ischemia model by regulating microglial polarization through the GPER-ERK-NF-κB signaling pathway. Mol Med. 28 (1), 142(2022).
- Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. Neurological Deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 26 (4), 627-634 (1995).
- Bracko, O., et al. 3-Nitropropionic acid-induced ischemia tolerance in the rat brain is mediated by reduced metabolic activity and cerebral blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (9), 1522-1530 (2014).
- Goldmacher, G. V., et al. Tracking transplanted bone marrow stem cells and their effects in the rat MCAO stroke model. PLoS One. 8 (3), e60049(2013).
- Lee, H. J., et al. The therapeutic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 481 (1), 30-35 (2010).
- Connolly, E. S., Winfree, C. J., Solomon, R. A. Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
- Virtanen, T., Jolkkonen, J., Sivenius, J. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2004).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
