Yöntem makalesi

Trombositlerde Süperoksit Anyon Oluşumunun Tespiti için Alternatif Yöntemler

DOI:

10.3791/66647

⸱

29 Mart 2024

 ,  ,  , 
1Medicines and Healthcare Regulatory Agency, South Mimms laboratories, 2Hull York Medical School, University of Hull

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Süperoksit anyonunun oluşumu, trombositlerin uyarılması için gereklidir ve düzensiz ise trombotik hastalıklar için kritik öneme sahiptir. Burada, süperoksit anyonlarının seçici tespiti ve redoksa bağımlı trombosit regülasyonunun incelenmesi için üç protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reaktif oksijen türleri (ROS), oldukça kararsız oksijen içeren moleküllerdir. Kimyasal kararsızlıkları onları son derece reaktif hale getirir ve onlara proteinler, nükleik asitler ve lipitler gibi önemli biyolojik moleküllerle reaksiyona girme yeteneği verir. Süperoksit anyonları, moleküler oksijen indirgenmesinin indirgenmesiyle (yani bir elektronun elde edilmesi) üretilen önemli ROS'lardır. İlk başta yalnızca yaşlanma, dejeneratif ve patojenik süreçlerdeki etkilerine rağmen, önemli fizyolojik tepkilere katılımları son zamanlarda belirgin hale gelmiştir. Vasküler sistemde, süperoksit anyonlarının vasküler düz kas hücrelerinin farklılaşmasını ve fonksiyonunu, anjiyogenezde vasküler endotel hücrelerinin proliferasyonunu ve göçünü, immün yanıtı ve hemostazda trombositlerin aktivasyonunu modüle ettiği gösterilmiştir. Süperoksit anyonlarının rolü, trombositlerin düzensizliğinde ve kanser, enfeksiyon, iltihaplanma, diyabet ve obezite dahil olmak üzere çok sayıda durumla ilişkili kardiyovasküler komplikasyonlarda özellikle önemlidir. Bu nedenle, insan trombositleri tarafından süperoksit anyonlarının oluşumunu etkili bir şekilde ölçebilmek, hemostaz ve tromboz arasındaki dengeyi düzenleyen redoks bağımlı mekanizmaları anlayabilmek ve nihayetinde tromboz ve kardiyovasküler komplikasyonlara yol açan trombosit yanıtlarının modülasyonu için yeni farmakolojik araçları tanımlayabilmek kardiyovasküler araştırmalarda son derece önemli hale gelmiştir. Bu çalışma, trombositlerdeki süperoksit anyonlarının tespiti ve hemostaz ve trombozu düzenleyen redoks bağımlı mekanizmaların incelenmesi için başarıyla benimsenen üç deneysel protokol sunmaktadır: 1) akış sitometrisi ile dihidroetidyum (DHE) bazlı süperoksit anyon tespiti; 2) Tek trombosit görüntüleme ile DHE bazlı süperoksit anyon görselleştirme ve analizi; ve 3) elektron paramanyetik rezonans (EPR) ile trombositlerdeki süperoksit anyon çıkışının spin probu tabanlı miktar tayini.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Süperoksit anyonu (O2 • -), trombositler1'de üretilen işlevsel olarak en ilgili ROS'tur. O2 • - moleküler oksijenin indirgenmesinin ürünü ve birçok farklı ROS 2'nin öncüsüdür. O2 • - 'nin dismutasyonu, sulu çözeltideki spontan reaksiyonlar veya süperoksit dismutazlar (SOD'ler3) tarafından katalize edilen reaksiyonlar yoluyla hidrojen peroksit (H2O2) oluşumuna yol açar. Farklı enzimatik kaynaklar önerilmiş olsa da (örneğin, ksantin oksidaz4, lipoksijenaz5, siklooksijenaz6 ve nitrik oksit sentaz7), mitokondriyal solunum 8,9 ve nikotinamid adenin dinükleotid fosfat-oksidazlar (NOX'ler)10 ökaryotik hücrelerde en belirgin süperoksit anyonu kaynaklarıdır. Bu aynı zamanda, mitokondriyal solunumdan(11,12) elektron sızıntısının ve NOX'lerin13,14 enzimatik aktivitesinin, süperoksit anyon çıkışına ana katkıda bulunanlar olarak tanımlandığı trombositlerde de geçerli gibi görünmektedir.

Her ne kadar birkaç çalışma trombositlerin O2 • - tarafından düzenlenmesine odaklanmış olsa da, sorumlu moleküler mekanizmalar konusunda bir fikir birliği yoktur. Farklı trombosit reseptörleri için doğrudan oksidasyon ve disülfid bağı oluşumu yoluyla yüzey reseptör aktivitesinin modülasyonu önerilmiştir. Sistein kalıntılarının doğrudan oksidasyonu yoluyla integrin αIIbβ3'ün ROS tarafından pozitif regülasyonu önerilmiştir 15,16,17. Benzer şekilde, kollajene trombosit yanıtları, disülfide bağımlı dimerizasyona ve bunun sonucunda glikoprotein VI'nın (GPVI) 18 dimerizasyonuna bağlı olduğundan, deneysel olarak tam olarak kanıtlanmamış olsa da, ROS'a bağlı oksidasyon ile reseptör aktivitesi güçlendirmesi önerilmiştir19. Son olarak, glikoprotein Ib'nin (GPIb) sülfhidril gruplarının ROS ile indüklenen oksidasyonunun, inflamasyon20 sırasında trombosit yapışmasını ve trombosit-lökosit etkileşimini teşvik ettiği gösterilmiştir. Tersine, azalmış sülfhidril grubu oksidasyonu ve reseptör aktivasyonunun olası bir sonucu olarak, hem GPVI hem de GPIb'nin ektodomaininin dökülmesi, koşullarınazaltılmasıyla azalır 21.

Trombosit yüzey reseptörlerinin doğrudan oksidasyonundan bağımsız olarak etki modları da önerilmiştir. O2 • - dahil olmak üzere ROS'un, bu reseptörün22 sinyal kaskadını negatif olarak düzenleyen Src homoloji bölgesi 2 içeren protein tirozin fosfataz 2'nin (SHP-2) aktivitesini zayıflatarak kollajen reseptörü GPVI'yı pozitif olarak modüle ettiği gösterilmiştir. Ayrıca, O2 • - nitrik oksit (NO) ile hızlı reaksiyon yoluyla ONOO- (peroksinitrit) üretebilir, bu da normalde NO'ya duyarlı guanilil siklaz (NO-GC) yoluyla trombositleri inhibe eder ve negatif trombosit düzenleyici siklik GMP'nin (cGMP) oluşumunu engeller23,24. NO seviyelerinde ortaya çıkan azalma trombosit potansiyasyonuna yol açabilir. Alternatif olarak, NOX2 ile O 2 • - oluşumunun, trombosit aktivasyonu ve yapışma25 için gerekli olan lipid peroksidasyonuna ve izoprostan oluşumuna katkıda bulunduğu öne sürülmüştür. Son olarak, mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) hücre dışı sinyal regüle kinaz 5 (ERK5), trombositlerde26 redoks stres sensörü olarak önerilen bir protein kinaz, O2 • - tarafından aktive edilir ve trombositlerde bir prokoagülan fenotipi indükler (fosfatidilserin dışsallaştırmasının akış sitometrisi tabanlı ölçümü ile tahmin edildiği gibi)27.

Trombositlerde O2 • - ve diğer ROS oluşumunun düzensizliği, ateroskleroz, diabetes mellitus, hipertansiyon, obezite ve kanser ile ilişkili trombotik kardiyovasküler komplikasyonlara yol açan abartılı hemostatik yanıt ile ilişkilendirilmiştir28,29. Bu patolojik ortamlarda, trombositler tarafından ROS çıkışı artar, bu da yapışkan ve agregatör yanıtlarının güçlenmesine yol açar. Trombosit yanıtları üzerindeki etkisine ek olarak, trombositlerin serbest radikal çıkışının diğer kan hücreleri ve vasküler yapılar üzerinde sonuçları olabilir, bu da kardiyovasküler sağlığın yeterince anlaşılmamış ve yeterince araştırılmamış bir alanıdır30. Oksidatif stresi trombotik durumlara bağlayan moleküler mekanizmalar hakkındaki sınırlı anlayışımıza rağmen, kardiyovasküler hastalıklara karşı korunmada antioksidanların klinik önemi büyük ilgi görmüştür. Plazma antioksidan seviyelerinin kardiyovasküler rahatsızlıklar geliştirme riski ile ters orantılı olduğu gösterilmiştir ve diyetle antioksidan tüketiminin koroner arter hastalığına karşı koruma sağladığı gösterilmiştir31,32. Sonuç olarak, diyetle alınan antioksidanların kullanımı kardiyovasküler hastalıkların önlenmesi için umut verici bir yaklaşım olarak savunulmuştur 33,34,35. Trombositlerde ROS oluşumunun etkileri arasında, apoptozdaki artışın önemli patofizyolojik etkileri olabilir36,37. Genel olarak, trombositler tarafından O2 • - çıktısını tespit etmek ve ölçmek için güvenilir protokoller kardiyovasküler araştırmalarda giderek daha fazla önem kazanmaktadır.

Şu anda, ROS'un tespiti için mevcut teknikler, özgüllük (yani, tespit edilen oksidan moleküllerinin kimyasal doğası bilinmemektedir) ve güvenilirlik (yani, biyolojik moleküller ve deneysel reaktifler ile istenmeyen etkileşim, önyargılı fizyolojik olmayan sonuçlara yol açmaktadır) önemli sınırlamalara sahiptir38,39. Trombositlerde ROS'un saptanması için en yaygın olarak kullanılan yaklaşım, hücre içi esterazlar tarafından diklorodihidrofloreseine (DCFH) ve sonuç olarak hidroksil radikalleri ve peroksida-H2O2 ara ürünleri dahil olmak üzere hücresel oksidanlar tarafından yüksek floresan diklorofloreseine (DCF) dönüştürülen diklorodihidrofloresein diasetat (DCFDA) kullanımına dayanmaktadır40,41. Geniş kullanımına rağmen, hücre içi ROS38 ölçümü için bu yaklaşımın güvenilirliği ile ilgili ciddi sorular gündeme gelmiştir. DCFH'nin DCF'ye oksidasyonu, aslında, ROS42 yerine geçiş metali iyonları (örneğin, Fe2 +) veya hem içeren enzimler (örneğin, sitokromlar) tarafından indüklenebilir. Ayrıca, DCFDA, hücre peroksidazları tarafından semikinon serbest radikal formuna (DCF • -) dönüştürülür, bu da moleküler oksijen (O2 ) ile reaksiyona girerek DCF'ye oksitlenir ve O2 • - salınımı ile oksidatif reaksiyonların yapay amplifikasyonuna yol açar 41,43,44. Bu nedenle, hücre içi ROS'un DCFDA tarafından saptanması, ilk içgörüleri elde etmek için yararlıdır, ancak dikkatli bir değerlendirme ve kapsamlı deneysel kontroller gerektirir38,39.

Bu çalışma, O2•-1 trombosit fonksiyonunun anahtar düzenleyicisinin tespiti ve ölçümü için üç alternatif teknik sunmaktadır. İlk teknik, DCFDA'ya göre güvenilirlik ve özgüllük avantajları sunan DHE ve akış sitometrisi kullanılarak yapılan tespittir. Burada önerilen ikinci teknik de DHE'yi kullanır, ancak tespit yöntemi, hızlı kinetik ve tek hücre çözünürlüğü ile trombosit sinyalizasyonu üzerine O2 • - oluşumunun incelenmesine izin veren canlı trombosit floresan görüntülemedir. Son olarak, EPR rezonans deneylerinde hidroksilamin spin probu 1-hidroksi-3-metoksikarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirolidin (CMH) kullanımına dayanan bir protokol, trombositler tarafından O2 • - oluşum oranını ölçme ve farklı koşullarda karşılaştırma imkanı sunar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onay veren gönüllülerden periferik kan toplanması yerel Etik Kurul ve Ulusal Sağlık Hizmeti Sağlık Araştırma Kurumu tarafından onaylanmıştır (REC referansı: 21/SC/0215; IRAS Kimliği: 283854).

1. Yöntem 1: Akış sitometrisi ile DHE kullanarak süperoksit anyon tespiti

  1. Önceden ısıtın (37 ° C) sodyum sitrat çözeltisi (% 4 w / h) ve venepunktur sırasında 1: 7 oranında (% 0.5 w / v final) doğrudan kana ekleyerek bir anti-pıhtılaştırıcı olarak kullanın.
  2. Medyan kübital ven venepunkturu ile sağlıklı gönüllülerden periferik insan kanı alın.
  3. 20 dakika boyunca 200 x g'da bir ilk santrifüjleme adımı ile tam kandan trombositten zengin plazma (PRP) elde edin.
  4. PRP'yi geri dönüşümlü trombosit inhibitörleri indometasin (10 μM) ve PGE1 (40 ng/mL) ile 500 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  5. Elde edilen trombosit peletini modifiye Tyrode tamponunda (145 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetan sülfonik asit (HEPES), 1 mM MgCl2, 5 mM glikoz, pH 7.3) (37 ° C) 2 x 108 trombosit/mL yoğunlukta.
  6. İzolasyondan sonra trombositleri 37 °C'de 30 dakika dinlendirin.
  7. DHE'yi dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 5 mM'lik bir stok konsantrasyonunda hazırlayın.
  8. 5 μM nihai konsantrasyonda trombosit süspansiyonuna DHE ekleyin (stok çözeltisini 1 ila 1.000 arasında seyreltin, nihai DMSO konsantrasyonu% 0.1 v / v ile) ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
  9. İstenilen fizyolojik uyaranlar ve konsantrasyonlarla stimülasyondan önce trombositleri 15 dakika boyunca farmakolojik ajanlar ve / veya ROS temizleyicileri ile tedavi edin (ör., 0.1 birim / mL trombin veya 3 μg / mL kollajen).
  10. Stimülasyondan sonra, trombosit süspansiyonlarını buz gibi soğuk modifiye HEPES tamponunda 1 ila 10 arasında seyreltin.
  11. Akış sitometrisi için, sırasıyla 40 mV ve 220 mV'de yan saçılma (SSC) ve ileri saçılma (FSC) kazancını ayarlayın ve süspansiyondaki parçacık popülasyonunu görselleştirmek için logaritmik ölçekli saçılma grafiklerini kullanın ( Şekil 1A'daki örnek).
  12. (İSTEĞE BAĞLI) Trombositlere karşılık gelen olayların popülasyonunu tanımlamak için bir anti-CD41 antikoru kullanarak trombosit süspansiyonunun bir alikotunu immünostain ( Şekil 1B'deki örnek).
  13. Süperoksit anyonuna özgü ürün 2-hidroksi-etidyumu (2OH-Et +) seçici olarak tespit eden 405 nm'de uyarma (mor lazer) ve 580 nm dalga boyunda emisyon kullanarak numuneleri akış sitometrisi ile analiz edin (Şekil 2).
    NOT: Paraformaldehit ile fiksasyon ve uzun süreli numune saklama tavsiye edilmez.

2. Yöntem 2: Tek trombosit floresan görüntüleme ile DHE kullanılarak süperoksit anyon tespiti

  1. Deney gününde 8 oyuklu bir μ-slaytı at tendonlarından (Horm kollajen) 0.1 mg / mL fibriller kollajen I, 0.2 mg / mL fibrinojen veya 1 mg / mL poli-L-lizin (PLL) ile modifiye Tyrode tamponunda 37 ° C'de 2 saat boyunca kaplayın.
  2. Modifiye Tyrode'un tamponu ile iki kez yıkayın (her biri 10 dakika).
  3. Modifiye Tyrode tamponunda ve 5 mg / mL sığır serum albümininde (BSA) inkübasyon yoluyla en az 30 dakika (veya deneye kadar) spesifik olmayan yapışmayı söndürün.
  4. Önceden ısıtın (37 ° C) sodyum sitrat çözeltisi (% 4 w / h) ve venepunktur sırasında 1: 7 oranında (% 0.5 w / v final) doğrudan kana ekleyerek bir anti-pıhtılaştırıcı olarak kullanın.
  5. Medyan kübital ven venepunkturu ile sağlıklı gönüllülerden periferik insan kanı alın.
  6. 20 dakika boyunca 200 x g'da bir ilk santrifüjleme adımı ile tam kandan trombositten zengin plazma (PRP) elde edin.
  7. PRP'yi geri dönüşümlü trombosit inhibitörleri indometasin (10 μM) ve PGE1 (40 ng/mL) ile 500 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  8. Elde edilen trombosit peletini modifiye Tyrode tamponunda (145 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM glikoz, pH 7.3) (37 °C) 4 x 107 trombosit/mL yoğunlukta yeniden süspanse edin.
  9. İzolasyondan sonra trombositleri 37 °C'de 30 dakika dinlendirin.
  10. DHE'yi 10 mM'lik bir stok konsantrasyonunda dimetil sülfoksit (DMSO) içinde hazırlayın.
  11. Trombosit süspansiyonuna 10 μM nihai konsantrasyonda DHE ekleyin (stok çözeltisini 1 ila 1.000 arasında seyreltin, son DMSO konsantrasyonu% 0.1 v / v ile) ve 1 dakika (37 ° C) inkübe edin.
  12. DHE ile 1 dakikalık inkübasyondan sonra, bloke edici çözeltiyi seçilen oyuklardan çıkarın, μ slaytı görüntüleme için hazır mikroskop aşamasına yerleştirin ve trombositleri nazikçe dağıtın.
  13. 10 dakika boyunca ters konfokal görüntüleme ile (405/580 nm ex/em) DHE'nin 2OH-Et + 'ya dönüşümünü izleyin ve görüntüler her 10 saniyede bir 40x yağa daldırma lensi ile toplanır.
  14. (İSTEĞE BAĞLI) PLL ile kaplanmış kuyucuklar için, çözünür bir agoniste yanıt olarak süperoksit anyon oluşumunu izleyin (ör., 0.1 birim / mL trombin veya 3 μg / mL kollajen), trombosit dağıtımından 10 dakika sonra agonisti ekleyerek ve floresan görüntü toplamayı 10 dakika daha ekleyerek, adım 2.13'te açıklandığı gibi.
  15. (İSTEĞE BAĞLI) Gerekirse, süperoksit anyon tutucuları veya seçici inhibitörler (ör., NOX inhibitörü) zaman seyri boyunca kuyu tarafına nazikçe dağıtarak ve 10 dakika daha 2.13'te açıklandığı gibi floresan görüntüleri toplayın.
  16. Temsili tek trombositleri içeren İlgi Bölgesini (ROI) seçerek ve ImageJ 1.53t görüntüleme paketinin Ölçüm aracıyla farklı çerçevelerde floresan yoğunluğunu analiz ederek tek hücreli floresan analizini ölçün.

3. Yöntem 3: Elektron paramanyetik rezonans (EPR) kullanılarak trombositler tarafından süperoksit anyonunun tespiti

  1. Önceden ısıtın (37 ° C) sodyum sitrat çözeltisi (% 4 w / h) ve venepunktur sırasında 1: 7 oranında (% 0.5 w / v final) doğrudan kana ekleyerek bir anti-pıhtılaştırıcı olarak kullanın.
  2. Medyan kübital ven venepunkturu ile sağlıklı gönüllülerden periferik insan kanı alın.
  3. 20 dakika boyunca 200 x g'da bir ilk santrifüjleme adımı ile tam kandan trombositten zengin plazma (PRP) elde edin.
  4. PRP'yi geri dönüşümlü trombosit inhibitörleri indometasin (10 μM) ve PGE1 (40 ng/mL) ile 500 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  5. Elde edilen trombosit peletini modifiye Tyrode tamponunda (145 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM glikoz, pH 7.3) (37 °C) 2 x 108 trombosit/mL yoğunlukta yeniden süspanse edin.
  6. İzolasyondan sonra trombositleri 37 °C'de 30 dakika dinlendirin.
  7. Trombosit süspansiyonuna 5 μM dietilditiokarbamat (DETC) ve 25 μM deferoksamin ekleyin.
  8. İnkübasyon olmadan 200 μM 1-hidroksi-3-metoksikarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirolidin (CMH) ekleyin.
  9. Numuneleri, agregasyon küvetleri (Teflon kaplı karıştırma mıknatısları dahil) içindeki agregometreye yükleyin.
  10. 1 dakika sonra, uyaranları istenen konsantrasyonda ekleyin (ör., 1 birim / mL trombin veya 3 μg / mL kollajen). 10 dakika inkübe edin.
  11. (İSTEĞE BAĞLI) İstenilen zamanda adım 3.12'ye ilerleyerek farklı zaman noktalarında süperoksit anyon üretimi elde edin.
  12. Trombosit süspansiyonunu agregasyon küvetinden bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 saniye boyunca 6.000 x g'da hızlı bir şekilde döndürün.
  13. Kılcal mikropipetlere 50 μL süpernatan yükleyin ve EPR sızdırmazlık mumu ile kapatın.
  14. Numuneleri EPR tarayıcıya aktarın.
  15. EPR tarayıcıyı aşağıdaki gibi ayarlayın: orta alan 3.492,5 G, alan süpürme 60 G, modülasyon genliği 2 G, tarama süresi 10 s, tarama sayısı 10, mikrodalga frekansı 9,39 GHz, mikrodalga gücü 20 mW, dönüştürme süresi 327,68 ms, zaman sabiti 5242,88 ms.
  16. Yukarıdaki parametreler kullanılarak kaydedilen EPR tepe noktalarının eğrisi (AUC) altındaki alan olarak CMH oksidasyonunu CM● 'ye tahmin edin.
  17. Y ekseninde adım 3.16'da açıklandığı gibi ölçülen EPR yoğunluğunu ve x ekseninde ticari olarak mevcut CM● konsantrasyonlarını (örn. 0, 0.3, 1, 3, 10 ve 30 μM) çizen bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
  18. Numunelerdeki CM● konsantrasyonundan, Temsili Sonuçlar bölümünde açıklanan formülleri kullanarak numunelerdeki trombositler tarafından üretilen süperoksit anyon miktarını elde edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DHE floresansının akış sitometrisi tespiti için, dinlenen (Şekil 3A) veya 0.1 birim / mL trombin ile uyarılan (Şekil 3B) trombositler için temsili sonuçlar gösteriyoruz. O2 • - çıkışı, 0.1 birim / mL trombin (Şekil 3C) veya 3 μg / mL kollajen ile ilişkili peptit (CRP) (Şekil 3D) ile stimülasyon için gösterildiği gibi trombosit ortalama floresan yoğunluğu (MFI) olarak ölçüldü. Trombosit stimülasyonunun bir sonucu olarak DHE boyamasında iki / üç kat artış gözlendi. O2 • - ölçüldüğünü doğrulamak için, hücre geçirgen O2 • - çöpçü pegile süperoksit dismutaz (PEG-SOD, 100 birim / mL) kullanılmasını önerirken, O2 • - kaynağını belirlemek için NOX inhibitörü VAS2870 (10 μM) kullandık. Hem kollajen hem de trombin için, PEG-SOD ve VAS2870, trombosit aktivasyonunun neden olduğu DHE floresansındaki artışı ortadan kaldırarak, ölçümün O2 • - için spesifik olduğunu ve bu koşullardaki kaynaklarının NOX enzimleri olduğunu doğruladı.

DHE floresansının görüntüleme tespiti için, kollajen veya fibrinojene yapışma anında (ve takip eden 10 dakikada) O2 • - oluşumunu değerlendiren deneylerden (Şekil 4A) veya trombin ile stimülasyon üzerine daha önce PLL'ye yapışan trombositlerden O2 • - oluşumunu değerlendirmeyi amaçlayan deneylerden elde edilen verileri sunuyoruz (Şekil 4B). Beklendiği gibi, PLL'ye yapışma sağlam bir O2 • - üretimini tetiklemez. Büyük olasılıkla, bu yapışma şekli, herhangi bir sinyalleşme tepkisi45 başlatılmadan elektrostatik etkileşime bağlı olduğundan, bu yaklaşımı, çözünür agonistlerin eklenmesine yanıt olarak O2 • - çıkışını ölçmek için uygun hale getirir. Bu protokolün O2•-'nin saptanmasına izin verdiğini doğrulamak için, çöpçüler veya seçici inhibitörler kullanılabilir. Önceki çalışmalarda, N-asetil-sisteinin (NAC) O2•- temizleyebileceğini ve bu deneylerde trombosit floresansını ortadan kaldırabileceğini göstermiştik46. Burada, seçici NOX inhibitörünün, kollajen veya fibrinojene yapışan (Şekil 4A) veya trombine yanıt veren (Şekil 4B) trombositlerdeki floresanı etkili ve anında azalttığını VAS2870 gösteriyoruz. Bu, NOX'lerin bu deneysel koşullarda O2•- kaynağı olduğunu göstermektedir. Kollajen veya fibrinojene yapışmaya veya PLL'ye yapışan trombositlerin trombin tarafından uyarılmasına yanıt olarak DHE floresansı (405 nm eksitasyon) için temsili filmler sırasıyla Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3 olarak dahil edilir. Dikkat çekici bir şekilde, diğer deney düzeneklerinde O2•- çöpçü olarak başarıyla kullanılan PEG-SOD, bu tür deneylerde etkili değildir. Şu anda bunun için net bir açıklamamız yok. PEG-SOD'un, O2•-'nin görüntülemeye dayalı tahlillerde düşük verimlilik veya yavaş kinetik ile artan floresanı indüklediği hücresel bölmelere ulaştığını varsayabiliriz. Bu noktayı açıklığa kavuşturmak için daha fazla odaklanmış araştırmalar gerekebilir.

Daha önce yayınlanmış farklı çalışmalarda trombositlerde EPR ile O2 • - ölçümünüuyguladık 1,13,47,48,49,50. Bu teknik için çok önemli bir adım, ticari olarak temin edilebilen CM● (yani, spin probu CMH ve O2•- ile EPR ile ölçülen rezonans türleri arasındaki reaksiyonun ürünü) kullanılarak bir kalibrasyon eğrisinin hazırlanmasıdır. CMH ve O2•- reaksiyonu Şekil 5A'da gösterilmiştir ve farklı CM● konsantrasyonları tarafından indüklenen EPR sinyalinin temsili örnekleri Şekil 5B'de gösterilmiştir. Farklı CM● konsantrasyonlarından elde edilen veriler, oksitlenmiş CMH miktarı ile numunelerdeki EPR sinyal yoğunluğu arasındaki doğrusal korelasyonu tanımlayan bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanıldı (Şekil 5C). Aşağıdaki denklem, CM● konsantrasyonu ile EPR sinyal yoğunluğu arasındaki korelasyonu açıklamaktadır ve bu çalışmadaki deneyler için kalibrasyon eğrisinin hesaplanması için başlangıç noktasıdır (Denklem 1):

figure-results-1

Hem CM● konsantrasyonları hem de bunlara karşılık gelen EPR yoğunluğu deneysel olarak elde edildiğinden, kalibrasyon eğrisinin Eğimi ve Y ekseni Kesişimi hesaplanabilir. Şekil 5C'de gösterilen örnekte, Eğim = 1.002.169 ve Kesişim Noktası = 596.383. Bu nedenle, kalibrasyon eğrisi denklemi şu şekilde yeniden yazılabilir:

figure-results-2

Yukarıdaki denklemi yeniden düzenleyerek, EPR yoğunluk değerlerine göre farklı numuneler için CM● konsantrasyonunu hesaplamak mümkündür (Denklem 2):

figure-results-3

Numunelerdeki CM● konsantrasyonu bilindikten sonra, aşağıdaki denklemle trombosit ve zaman birimi başına üretim hızını hesaplamak mümkündür (Denklem 3):

figure-results-4

Denklem 2 kullanılarak, Denklem 3 şu şekilde yeniden yazılabilir (Denklem 4):

figure-results-5

Şekil 5C'de gösterilen örnekte hangisi şu şekilde yeniden yazılabilir:

figure-results-6

CMH oksidasyon hızı, dakikada trombosit başına üretilen CM● attomolleri olarak ifade edilecektir. Bu değer, DHE (veya DCFDA) gibi floresan problarla mümkün olmayan, deneyler ve donörler arasındaki O2•- üretim oranını karşılaştırmak için kullanılabilir. Floresan problar genellikle aynı deney içinde floresan yoğunluğundaki değişiklikler olarak farklı koşulların O2•- üretimi üzerindeki etkisinin bir tahminine izin verir. Bu makalede açıklanan tüm tekniklerde olduğu gibi, tespitin özgüllüğü ROS tutucular (örneğin, PEG-SOD, NAC) veya süperoksit anyonu üreten seçici enzim inhibitörleri (örneğin, NOX'leri inhibe etmek için VAS2870) ile doğrulanmıştır. Burada, trombin (Şekil 6A, C, E) veya kollajen (Şekil 6B, D, F) ile trombosit stimülasyonu (Şekil 6) için veriler sunuyoruz. Her iki agonist için, O2 • - tespit edildiğini doğrulamak için PEG-SOD kullanılırken, pegile edilmiş katalaz (PEG-Cat.) için etki eksikliği, hidrojen peroksitin bu teknikle tespit edilmediğini düşündürmektedir (Şekil 6C, D, sırasıyla). VAS2870, trombin (Şekil 6E) ve kollajen kaynaklı (Şekil 6F) EPR sinyallerini ortadan kaldırır, bu da NOX'lerin her iki agoniste yanıt olarak trombosit O2 •- 'nin ana kaynağı olduğunu düşündürür.

figure-results-7
Şekil 1: trombosit süspansiyonlarının akış sitometrisi analizi. (A) İzole trombositler için ileri (FSC) ve yan saçılma (SSC) grafiklerinin tipik sunumu. (B) Trombosit süspansiyonunun bir anti-CD41 antikoru ile immün boyanması, preparattaki partiküllerin %>98'inin trombosit olduğunu doğrular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 2: DHE'nin süperoksit anyonu ve diğer ROS ile kimyasal reaksiyonu ve ürünlerinin spektral özellikleri. DHE ve iki oksidasyon ürününün yapısı ve spektral özellikleri Süperoksit anyonları ile reaksiyona girerek üretilen 2-hidroksi-etidyum (2OH-Et +) ve diğer ROS türleri (örneğin, hidroksil radikali ve hidrojen peroksit) ile reaksiyonla üretilen etidyum (Et +). Şekilde kesikli mavi bir dikdörtgenle vurgulanan 405 nm'deki uyarma zirvesi, 2OH-Et + için spesifiktir ve bu nedenle O2 • -'yi tespit etmek/ölçmek için kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 3: DHE ve akış sitometrisi ile tespit edilen trombin ve kollajen bağımlı süperoksit anyon oluşumu. (A) istirahat ve (B) trombin ile uyarılan trombositlerin DHE boyaması için temsili histogramlar. Çubuk, istirahat ve trombin ile uyarılan trombositler için sırasıyla p.7 ve .1 olan 500'ün altındaki DHE boyama değerlerini gösterir. Bu teknik, (C) 0.1 ünite/mL trombin ve (D) 3 μg/mL kollajen ile uyarılmış trombositlerde süperoksit anyon oluşumunu tahmin etmek için kullanıldı. Bu deneyde süperoksit anyonlarının ölçüldüğünü doğrulamak için PEG-SOD (100 birim/mL) kullanılırken, süperoksit anyonlarının kaynağı olarak NOX enzimlerini tanımlamak için 10 μM VAS2870 kullanıldı. Her veri noktası, 50.000 trombositten ortalama floresan yoğunluğu (MFI) olarak hesaplandı ve her deney, grafiklerde gösterilen ortalama ± SEM ile beş bağımsız kez (n = 5) tekrarlandı. İstatistiksel anlamlılık, ikili karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi ve Tukey son test ile değerlendirildi (** = p < 0.01, *** = p < 0.001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10
Şekil 4: DHE floresan görüntüleme ile tespit edilen kollajen, fibrinojen ve trombine bağımlı süperoksit anyon oluşumu. (A) Süperoksit anyon üretim kinetiği, kollajen veya fibrinojene yapışan trombositler için değerlendirildi. Trombositler, görüntülemenin başlamasından 1 dakika sonra kaplanmış μ slaytlara dağıtılırken, görüntü toplamanın başlangıcından 5 dakika sonra 10 μM VAS2870 eklendi. (B) Trombin ile stimülasyon üzerine trombositler için süperoksit anyon üretim kinetiği. Trombositlerin, görüntü toplamanın başlamasından önce 10 dakika boyunca PLL kaplı μ slaytlara yapışmasına izin verildi. 2 dakika sonra, 0.1 birim / mL trombin eklendi ve 5 dakika sonra, 10 μM VAS2870 eklendi (ör., görüntülemenin başlangıcından 7 dakika sonra). Deney şeması panellerin üst kısmında sunulurken, panellerin ortasında 0 dakika, 1 dakika, 3 dakika, 6 dakika ve 9 dakikaya ait temsili görüntüler gösterilmektedir. Tek trombosit DHE floresan ölçümü panellerin alt kısmında gösterilir ve ImageJ kullanılarak floresan yoğunluğu analizi ile elde edilir. Veriler, 4 bağımsız deneyde koşul başına 8-12 trombositten ortalama ± SEM'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-11
Şekil 5: Kalibrasyon eğrisi ve CMH oksidasyon hızı hesaplamaları. (A) CMH ve CM'nin kimyasal yapısı ve EPR özellikleri●. (B) Farklı CM● (100 nM ila 10 μM) konsantrasyonları için EPR verilerinin temsili örnekleri. (C) EPR yoğunluğunun CM● konsantrasyonuna karşı kalibrasyon eğrisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-12
Şekil 6: Trombin veya kollajen stimülasyonu üzerine trombositler tarafından süperoksit anyon üretiminin tespiti. Süperoksit anyon çıkışı, (A) 0.1 birim / mL trombin veya (B) 3 μg / mL kollajen ile uyarılan trombositlerde spin probu CMH ile EPR ile ölçüldü. (C, D) Her iki agonist için test edilen koşullara 100 birim / mL süperoksit anyon tutucu PEG-SOD veya 100 birim / mL hidrojen peroksit tutucu pegile katalaz (PEG-Cat.) konsantrasyonu dahil edildi. Süperoksit anyonunun kaynağı, NOX inhibitörü VAS2870 (10 μM) ile birlikte inkübasyon ile araştırıldı. Hem (E) trombin hem de (F) kollajen, süperoksit anyonu oluşumu için NOX aktivitesine bağlıdır. Şekil boyunca, CMH/süperoksit anyon reaksiyon hızı, el yazmasında açıklandığı gibi EPR izlerinden hesaplanmıştır (Denklem 4). Veriler, 5 (C,D) ve 4 bağımsız deneyden (E,F) elde edilen ortalama ± SEM'dir. İstatistiksel anlamlılık, ikili karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi ve Tukey son test ile değerlendirildi (** = p < 0.01, *** = p < 0.001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Kollajen yapışmasına yanıt olarak DHE floresan (405 nm uyarma) için temsili film. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Yapışma fibrinojenine yanıt olarak DHE floresan (405 nm uyarma) için temsili film. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: PLL'ye yapışan trombositlerin trombin ile stimülasyonuna yanıt olarak DHE floresansı (405 nm eksitasyon) için temsili film. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, O2 • -'nin seçici tespiti yoluyla trombosit fonksiyonunun redoksa bağlı regülasyonunu araştırma yeteneğini geliştirme potansiyeline sahip üç farklı teknik sunuyoruz. İlk iki yöntem, kullanılan redoks probu (daha yaygın ancak daha az güvenilir DCFDA yerine DHE) nedeniyle mevcut tekniklerde bir gelişmedir. Bu nedenle, bu tekniklere kolayca erişilebilir ve çoğu laboratuvar, belirli ekipman veya eğitim maliyetleri olmadan bunları etkili bir şekilde benimseyebilir. Üçüncü teknik, spin probu CMH'nin EPR ile oksidasyonunun analizi için özel ekipmanın kullanımına dayanmaktadır. Bu teknik, özel ekipman ve reaktiflerin satın alınmasını ve laboratuvar kullanıcısının özel olarak eğitilmesini gerektirir. Sonuç olarak, özellikle trombositlerde (veya diğer hücrelerde) redoksa bağlı olayların incelenmesine odaklanan laboratuvarlar için uygun görünmektedir.

DHE kullanan teknikler için, uyarma için dalga boyu seçimi,O2 • -'nin spesifik tespitini elde etmek için çok önemlidir. DHE'nin O2 ile reaksiyonu sonucu üretilen 2-hidroksi-etidyum (2OH-Et +) 405 nm'de uyarılırken, DHE'nin ROS (örneğin, hidroksil radikali ve hidrojen peroksit) ile genel reaksiyonu ile üretilen etidyum (Et +) 520 nm civarında bir uyarma zirvesine sahiptir, ancak 405 nm'de uyarılma yoktur (Şekil 1)51. DCFDA yerine DHE'nin kullanılması, bu probun peroksidazlar, diğer hem içeren enzimler ve metal iyonları indirgeyici ajanlar42,43,44 gibi hücresel bileşenlerle doğrudan reaksiyonunun neden olduğu artefaktlardan korur. DHE, hücresel redoks çalışmaları için daha güvenli bir araç olarak önerilmiştir 38,39. Burada, DHE'nin iki farklı okuma tekniği ile kullanılmasını öneriyoruz: 1) akış sitometrisi ve 2) floresan görüntüleme.

Akış sitometrisi genellikle düşük-orta verimle birden fazla numunenin eş zamanlı olarak işlenmesine izin veren bir tekniktir52. Ne yazık ki, bu çalışmada kullanılan yaklaşım numune fiksasyonuna izin vermemektedir. Numunelerin buz gibi soğuk modifiye Tyrode tamponu ile seyreltilmesi, numunelerdeki floresanı 30 dakikaya kadar stabilize etse de, tüm numunelerin analizinin bu zaman diliminde yapılması gerekir. Bu, deney başına numune sayısını önemli ölçüde sınırlar. Aynı gün içinde ve aynı trombosit preparatını kullanarak dahili olarak kontrol edilen birden fazla deney çalışması mümkündür, ancak sonuçlar kontrollere göre normalleştirilmeli ve bağımsız deneyler olarak düşünülmemelidir. Bu teknik, bu makalenin yazarları tarafından farklı agonistlere ve modülatörlere verilen yanıtlarda redoksa bağımlı trombosit modülasyonunun rolünü vurgulamak için kullanılmıştır46,50. Bu yöntem, NOX254'e odaklanan trombosit çalışmaları için kullanılan mitokondrinin (yani Mitosox)53 hedeflenmesine izin veren kimyasal olarak modifiye edilmiş bir DHE versiyonunun kullanılmasıyla değiştirilebilir. Bu, laboratuvarlarımız tarafından henüz takip edilmemiş olan ilginç bir fırsattır.

Burada önerilen DHE'yi kullanan floresan görüntüleme tekniği, yapışma (görüntüleme kuyusunun yüzeyinde emilen agonistler) veya stimülasyon (süspansiyondaki agonistler) üzerine trombositlerde O2 • - oluşumunun zaman seyrini belirleme avantajına sahiptir. Bu, trombosit aktivasyon sürecinin farklı fazlarının etkileşiminin yorumlanmasına ve farklı O2 • - kaynaklarının (örneğin, farklı ROS üreten enzimler, örneğin NOX'ler) katkısının değerlendirilmesine izin verir. Mevcut hiçbir teknik bu tür bir araştırmaya izin vermez. Bu, test edilen her koşulun 30 dakika sürmesiyle (μ slayt kurulumu, odaklama ve alan seçimi, görüntüleme ve veri tasarrufu dahil) tahlil verimi açısından bir maliyete sahiptir. Bu nedenle, bu teknik, iş günü başına az sayıda koşulun test edilmesine izin verir (yani, 10'un altında). Burada gösterilen veriler için konfokal bir mikroskop kullanılmış olsa da, 405 nm uyarma kabiliyetine sahip bir epifloresan mikroskobu ile eşit derecede iyi sonuçlar elde edilebileceğini doğruladık. Bu, pahalı konfokal mikroskopi kurulumlarına olan gereksinimi azaltır ve bu tekniği daha uygun maliyetli hale getirir.

EPR protokolü, farklı hücre tiplerinde yapılan önceki çalışmalara dayanarak geliştirilmiştir55. Bu teknik, ROS oluşumunun incelenmesi vehücrelerde redoksa bağlı olayların araştırılması için en güvenilir araç olarak kabul edilmektedir 38. Hidroksilamin spin problarının oksijensiz radikallerle56 reaksiyonunun özgüllüğü nedeniyle diğer tekniklere kıyasla üstün güvenilirliğe ek olarak, EPR, O2 • - üretim hızının ölçülmesine ve farklı bireyler ve deneyler arasında karşılaştırılmasına izin verir. Bu, yalnızca seçilen koşulların floresan yoğunluğu üzerindeki etkisini tek bir deney ve trombosit hazırlığı içinde tahmin etmemize izin veren floresan bazlı tekniklerle mümkün değildir. Bu EPR protokolü, trombosit aktivasyonunun paralel izlenmesi ve O2•- nesil1 için trombosit agregasyonu ile birleştirilecek bir teknik olarak geliştirilmiş olsa da, bu deneyler agregasyonun paralel analizi olmadan gerçekleştirilebilir. Trombosit agregasyonunun paralel analizi olmasa bile, sürekli karıştırma ile sağlanan kesme stresini gerektiren etkili trombosit stimülasyonunu garanti etmek için inkübasyonun bir agregometrede yapılmasını öneririz. Deneylerin karıştırılmadan 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde yapılması gerekiyorsa, O2 • - üretim seviyeleri önemli ölçüde daha düşüktür. Bu nedenle, bu deneysel yaklaşım seçilirse, CMH inkübasyonunun dönen bir tekerlek üzerinde ve daha yoğun konsantre trombositlerle (yani 1 x 109 / mL) gerçekleştirilmesini öneririz, bu da EPR spektrometresi tarafından tespit için yeterince güçlü bir sinyale yol açar.

Özet olarak, burada trombositlerde O2 • - tespiti için doğrulanmış üç teknik sunuyoruz. Farklı avantajlar sunarlar ve deneysel hedeflere ve önceliklere göre seçilebilirler. DHE'nin akış sitometrisi ile kullanımına dayanan ilk teknik, en az zahmetli ve zaman alıcıdır ve bu nedenle giriş seviyesi bir analiz olarak seçilebilir. Floresan mikroskobu ile DHE kullanımına dayanan ikinci teknik, O2 • - üretiminin hızlı kinetiğinin takdir edilmesine ve farklı sinyal kaskadlarının saniye zaman ölçeğinde oksidatif yanıtı nasıl etkileyebileceğinin incelenmesine izin verir (diğer teknikler yalnızca stimülasyondan birkaç dakika içinde meydana gelen olayların son nokta araştırmasına izin verir). Son olarak, EPR, O2•- üretim hızının ölçülmesine ve deneyler ile bireyler arasında karşılaştırılmasına izin verir. Bu nedenle, ikinci teknik, farklı bireylerden alınan trombositlerdeki oksidatif yanıtı karakterize etmeyi amaçlayan klinik çalışmalar için özellikle yararlıdır (örneğin, hastalar veya hastalar ile sağlıklı kontroller arasında karşılaştırma). Genel olarak, bu üç teknik mevcut yöntemlere göre önemli avantajlar sunar ve trombositlerdeki redoksa bağlı olayları incelemek için elimizdeki deneysel araçlarda önemli bir ilerlemeyi temsil eder.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, İngiliz Kalp Vakfı (PG / 15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) ve Avrupa Araştırma Konseyi (#10102507) tarafından G. Pula'ya verilen hibelerle finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1-hidroksi-3-metoksikarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirolidin (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgEPR için Reaktif (spin probu)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAFlow sitometre
Sığır Serumu AlbüminMerck/SigmaA7030μ-slayt kaplama
için Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH  NOX-E.11-BES EPR spektrometresi
Katalaz– polietilen glikol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Hidrojen peroksit tutucu (özgüllük kontrolü)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radikalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg EPR için reaktif (kalibrasyon kontrolü)
Deferoksamin ve nbsp;Noxygen Science Trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg EPR için reaktif
dietilditiokarbamat (DETC) Noxygen Science Trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g EPR için reaktif
DihidroetidyumThermo Fisher ScientificsD11347Süperoksit anyon probu
Dimetil sülfoksitMerck / Sigma34869Stok çözelti hazırlama için 
EPR sızdırmazlık balmumu plakalarıNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMEPR
EPR sınıfı suNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L EPR için reaktif
İnsan plazmasından elde edilen fibrinojenMerck/SigmaF4883μ-slide kaplama için
FITC anti-insan CD41Antikoru BioLegend303704Akış sitometrisi için trombositlere özgü boyama
Cam küvetler Labmedics/ChronologP/N 312Agregometrede inkübasyon için sarf malzemesi
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385Trombosit stimülasyonu için
ImageJ Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378Trombosit izolasyonu için
Mikropipetler DURAN 50µ lNoxygen Science Trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50 & mikro; LEPR
Poli-L-lizin hidroklorürMerck/SigmaP2658μ-slide kaplama için
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515Trombosit izolasyonu için
Sodyum sitrat (%4/v solüsyon)Merck/SigmaS5770Trombosit izolasyonu için
Karıştırma çubukları (Teflon kaplı)Labmedics/ChronologP/N 313Agregometre Süperoksit dismutazda inkübasyon için sarf malzemesi
; polietilen glikol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Süperoksit anyon tutucu (özgüllük kontrolü)
İnsan plazmasından trombinMerck/SigmaT6884Trombosit stimülasyonu ve μ-slide kaplama
için VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX inhibitörü
Zeiss 510 LSM konfokal mikroskopZeissNAKonfokal mikroskop
için sarf malzemesi için sarf malzemesi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vara, D., Cifuentes-Pagano, E., Pagano, P. J., Pula, G. A novel combinatorial technique for simultaneous quantification of oxygen radicals and aggregation reveals unexpected redox patterns in the activation of platelets by different physiopathological stimuli. Haematologica. 104 (9), 1879-1891 (2019).
  2. Fridovich, I. Superoxide radical: An endogenous toxicant. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 239-257 (1983).
  3. Keele, B. B., Mccord, J. M., Fridovich, I. Superoxide dismutase from Escherichia coli B. A new manganese-containing enzyme. J Biol Chem. 245 (22), 6176-6181 (1970).
  4. Berry, C. E., Hare, J. M. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: Molecular mechanisms and pathophysiological implications. J Physiol. 555, Pt 3 589-606 (2004).
  5. Kim, C., Kim, J. Y., Kim, J. H. Cytosolic phospholipase a(2), lipoxygenase metabolites, and reactive oxygen species. BMB Rep. 41 (2), 555-559 (2008).
  6. Armstead, W. M., Mirro, R., Busija, D. W., Leffler, C. W. Postischemic generation of superoxide anion by newborn pig brain. Am J Physiol. 255 (2), Pt 2 H401-H403 (1988).
  7. Mayer, B., et al. Nitric oxide synthase-catalyzed activation of oxygen and reduction of cytochromes: Reaction mechanisms and possible physiological implications. J Cardiovasc Pharmacol. 20, Suppl 12 S54-S56 (1992).
  8. Du, G., Mouithys-Mickalad, A., Sluse, F. E. Generation of superoxide anion by mitochondria and impairment of their functions during anoxia and reoxygenation in vitro. Free Radic Biol Med. 25 (9), 1066-1074 (1998).
  9. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  10. Jiang, F., Zhang, Y., Dusting, G. J. Nadph oxidase-mediated redox signaling: Roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol Rev. 63 (1), 218-242 (2011).
  11. Wang, Z., et al. The role of mitochondria-derived reactive oxygen species in hyperthermia-induced platelet apoptosis. PLoS One. 8 (9), e75044(2013).
  12. Wachowicz, B., Olas, B., Zbikowska, H. M., Buczynski, A. Generation of reactive oxygen species in blood platelets. Platelets. 13 (3), 175-182 (2002).
  13. Vara, D., et al. Nadph oxidases are required for full platelet activation in vitro and thrombosis in vivo but dispensable for plasma coagulation and hemostasis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 41 (2), 683-697 (2021).
  14. Violi, F., Pignatelli, P. Platelet nox, a novel target for anti-thrombotic treatment. Thromb Haemost. 111 (5), 817-823 (2014).
  15. Begonja, A. J., et al. Platelet NAD(P)H-oxidase-generated ros production regulates alphaiibbeta3-integrin activation independent of the NO/CGMP pathway. Blood. 106 (8), 2757-2760 (2005).
  16. Vara, D. S., et al. Autocrine amplification of integrin αIIbβ3 activation and platelet adhesive responses by deoxyribose-1-phosphate. Thromb Haemost. 109 (6), 1108-1119 (2013).
  17. Essex, D. W. The role of thiols and disulfides in platelet function. Antioxid Redox Signal. 6 (4), 736-746 (2004).
  18. Arthur, J. F., et al. Ligand binding rapidly induces disulfide-dependent dimerization of glycoprotein vi on the platelet plasma membrane. J Biol Chem. 282 (42), 30434-30441 (2007).
  19. Arthur, J. F., Gardiner, E. E., Kenny, D., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet receptor redox regulation. Platelets. 19 (1), 1-8 (2008).
  20. Kim, K., Li, J., Tseng, A., Andrews, R. K., Cho, J. Nox2 is critical for heterotypic neutrophil-platelet interactions during vascular inflammation. Blood. 126 (16), 1952-1964 (2015).
  21. Hosseini, E., Solouki, A., Roudsari, Z. O., Kargar, F., Ghasemzadeh, M. Reducing state attenuates ectodomain shedding of GPVI while restoring adhesion capacities of stored platelets: Evidence addressing the controversy around the effects of redox condition on thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 50 (1), 123-134 (2020).
  22. Jang, J. Y., et al. Reactive oxygen species play a critical role in collagen-induced platelet activation via SHP-2 oxidation. Antioxid Redox Signal. 20 (16), 2528-2540 (2014).
  23. Beckman, J. S., Koppenol, W. H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: The good, the bad, and ugly. Am J Physiol. 271 (5), Pt 1 C1424-C1437 (1996).
  24. Koppenol, W. H., Kissner, R., Beckman, J. S. Syntheses of peroxynitrite: To go with the flow or on solid grounds. Methods Enzymol. 269, 296-302 (1996).
  25. Cammisotto, V., et al. Nox2-mediated platelet activation by glycoprotein (GP) VI: Effect of rivaroxaban alone and in combination with aspirin. Biochem Pharmacol. 163, 111-118 (2019).
  26. Yang, M., et al. Platelet CD36 promotes thrombosis by activating redox sensor ERK5 in hyperlipidemic conditions. Blood. 129 (21), 2917-2927 (2017).
  27. Yang, M., et al. Platelet CD36 signaling through ERK5 promotes caspase-dependent procoagulant activity and fibrin deposition in vivo. Blood Adv. 2 (21), 2848-2861 (2018).
  28. Freedman, J. E. Oxidative stress and platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), s11-s16 (2008).
  29. Masselli, E., et al. ROS in platelet biology: Functional aspects and methodological insights. Int J Mol Sci. 21 (14), 4866(2020).
  30. Madamanchi, N. R., Vendrov, A., Runge, M. S. Oxidative stress and vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (1), 29-38 (2005).
  31. Riemersma, R. A., et al. Risk of angina pectoris and plasma concentrations of vitamins a, c, and e and carotene. Lancet. 337 (8732), 1-5 (1991).
  32. Rimm, E. B., et al. Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl J Med. 328 (20), 1450-1456 (1993).
  33. Zhang, W., Zheng, Y., Yan, F., Dong, M., Ren, Y. Research progress of quercetin in cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 10, 1203713(2023).
  34. Russell, C., Keshavamurthy, S., Saha, S. Nutraceuticals in the management of cardiovascular risk factors: Where is the evidence. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 21 (3), 150-161 (2021).
  35. Rotariu, D., et al. Oxidative stress - complex pathological issues concerning the hallmark of cardiovascular and metabolic disorders. Biomed Pharmacother. 152, 113238(2022).
  36. Hosseini, E., Ghasemzadeh, M., Atashibarg, M., Haghshenas, M. R. O. S. scavenger, n-acetyl-l-cysteine and NOX specific inhibitor, VAS2870 reduce platelets apoptosis while enhancing their viability during storage. Transfusion. 59 (4), 1333-1343 (2019).
  37. Hosseini, E., Nodeh, F. K., Ghasemzadeh, M. Gamma irradiation induces a pro-apoptotic state in longer stored platelets, without progressing to an overt apoptosis by day 7 of storage. Apoptosis. 28 (7-8), 1141-1153 (2023).
  38. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: A scientific statement from the American heart association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  39. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  40. Hempel, S. L., Buettner, G. R., O'malley, Y. Q., Wessels, D. A., Flaherty, D. M. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: Comparison with 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123. Free Radic Biol Med. 27 (1-2), 146-159 (1999).
  41. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: Challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  42. Burkitt, M. J., Wardman, P. Cytochrome c is a potent catalyst of dichlorofluorescin oxidation: Implications for the role of reactive oxygen species in apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 282 (1), 329-333 (2001).
  43. Rota, C., Fann, Y. C., Mason, R. P. Phenoxyl free radical formation during the oxidation of the fluorescent dye 2',7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase. Possible consequences for oxidative stress measurements. J Biol Chem. 274 (40), 28161-28168 (1999).
  44. Rota, C., Chignell, C. F., Mason, R. P. Evidence for free radical formation during the oxidation of 2'-7'-dichlorofluorescin to the fluorescent dye 2'-7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase: Possible implications for oxidative stress measurements. Free Radic Biol Med. 27 (7-8), 873-881 (1999).
  45. Rodig, S. J. Attaching suspension cells to slides for staining. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).
  46. Abubaker, A. A., Vara, D., Eggleston, I., Canobbio, I., Pula, G. A novel flow cytometry assay using dihydroethidium as redox-sensitive probe reveals NADPH oxidase-dependent generation of superoxide anion in human platelets exposed to amyloid peptide beta. Platelets. 30 (2), 181-189 (2019).
  47. Gaspar, R. S., et al. Protein disulphide isomerase and NADPH oxidase 1 cooperate to control platelet function and are associated with cardiometabolic disease risk factors. Antioxidants (Basel). 10 (3), 497(2021).
  48. Gaspar, R. S., Ferreira, P. M., Mitchell, J. L., Pula, G., Gibbins, J. M. Platelet-derived extracellular vesicles express NADPH oxidase-1 (NOX-1), generate superoxide and modulate platelet function. Free Radic Biol Med. 165, 395-400 (2021).
  49. Vara, D., et al. NADPH oxidase 1 is a novel pharmacological target for the development of an antiplatelet drug without bleeding side effects. FASEB J. 34 (10), 13959-13977 (2020).
  50. Lopes-Pires, M. E., et al. Zinc regulates reactive oxygen species generation in platelets. Platelets. 32 (3), 368-377 (2021).
  51. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and mitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: Another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
  52. Linden, M. D. Platelet flow cytometry. Methods Mol Biol. 992, 241-262 (2013).
  53. Kauffman, M. E., et al. MitoSOX-based flow cytometry for detecting mitochondrial ROS. React Oxyg Species (Apex). 2 (5), 361-370 (2016).
  54. Sonkar, V. K., et al. NOX2 NADPH oxidase is dispensable for platelet activation or arterial thrombosis in mice. Blood Adv. 3 (8), 1272-1284 (2019).
  55. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radic Res. 45 (4), 417-430 (2011).
  56. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Superoxide Anion DetectionPlatelet FunctionReactive Oxygen SpeciesFlow CytometryDihydroethidium ImagingElectron Paramagnetic ResonancePlatelet Rich PlasmaSpin Probe QuantificationPlatelet AdhesionNADPH Oxidases

İlgili makaleler