Yöntem makalesi

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

3.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66651

⸱

14 Haziran 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Biotecnología y Biomedicina (BIOTECMED), Departamento de Biología Celular, Biología Funcional y Antropología Física, Universitat de València

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, erişkin murin subventriküler bölgesinden izole edilen genişletilmiş nöral kök hücrelerde (NSC'ler) gen iletim verimliliğini artırmak için tasarlanmış bir nükleofeksiyon sistemini açıklıyoruz. Bulgular, bu yöntemin NSC'lerde gen bozulmasını önemli ölçüde iyileştirdiğini, geleneksel transfeksiyon protokollerinin etkinliğini aştığını ve hücre sağkalım oranını artırdığını göstermektedir.

Özet

Nöral kök hücrelerin (NSC'ler) yetişkin fare beyninin subventriküler bölgesinden (SVZ) izolasyonu ve genişlemesi, mitojenler olarak bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve epidermal büyüme faktörü (EGF) ile desteklenmiş bir ortamda gerçekleştirilebilir ve nörosferler olarak bilinen klonal agregatlar üretebilir. Bu in vitro sistem, NSC potansiyelini incelemek için değerli bir araçtır. Plazmitlerde taşınan siRNA'ların veya genlerin transfeksiyonu, gen ekspresyonunda bozulmaları indüklemek ve NSC biyolojisini incelemek için kullanılabilir. Bununla birlikte, NSC kültürlerine eksojen nükleik asit iletimi, merkezi sinir sistemi (CNS) hücrelerinin transfeksiyonunun düşük verimliliği nedeniyle zordur. Burada, yetişkin murin SVZ'den genişletilmiş NSC'lerde gen iletiminde yüksek verimlilik sağlayan gelişmiş bir nükleofeksiyon sistemi sunuyoruz. Bu nispeten basit yöntemin, yetişkin NSC'lerde gen bozulmasını artırdığını ve sağkalım oranlarının %80'i aşan geleneksel transfeksiyon protokollerini aştığını gösteriyoruz. Ayrıca, bu yöntem aynı zamanda birincil izole NSC'lerde de uygulanabilir ve nörosfer kültürlerinde knockdown veya aşırı ekspresyon yoluyla gen ekspresyonu manipülasyonu yoluyla gen fonksiyonu çalışmalarında çok önemli bir ilerleme sağlar.

Giriş

Nöral kök hücreler (NSC'ler) beyinde bulunan multipotent kök hücrelerdir. Bu hücreler kendi kendini yenileme ve üç nöral soya farklılaşma yeteneğine sahiptir: astrositler, oligodendrositler ve nöronlar1. Sonuç olarak, NSC'ler, beyinde yeni nöronların üretildiği bir süreç olan memelilerde yetişkin nörogenezinde çok önemli bir rol oynar2. NSC'ler ağırlıklı olarak yetişkin beyninde nörojenik nişler olarak adlandırılan iki bölgede bulunur: lateral ventriküllerin duvarları boyunca subventriküler bölge (SVZ) ve hipokampusun dentat girusu içindeki subgranüler bölge (SGZ) 3,4. Yetişkin faredeki en aktif nörojenik niş olan SVZ'deki NSC'ler (B hücreleri olarak da bilinir), kendi kendini yeniler ve daha sonra nöroblastlara (A hücreleri) farklılaşan transit amplifiye edici progenitörler (TAP'ler veya C hücreleri) üretir. Bu nöroblastlar, rostral göç akımı (RMS) yoluyla koku alma ampullerine (OB) göç eder, burada internöronlara tam farklılaşma geçirirler ve önceden var olan devre 3,4,5,6'ya entegre olurlar.

Bu nişler içindeki NSC'leri düzenleyen moleküler ipuçlarının ve sinyallerin karmaşık etkileşimini anlamak, terapötik uygulamalar için potansiyellerinden yararlanmak için önemlidir. Bu amaçla, bu hücre popülasyonunu incelemek için, NSC'lerin seçici birincil kültüründen,yüzey belirteçleri 7,8,9,10 kullanılarak hücre seçimine kadar çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu el yazması, SVZ NSC'lerin in vitro olarak her iki mitojeni de içeren serumsuz seçici bir ortam kullanılarak izolasyonunu ve kültürlenmesini detaylandırmaktadır: temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve epidermal büyüme faktörü (EGF). Bu besiyeri, hücre proliferasyonunu kolaylaştırır ve nörosferler 9 olarak bilinen in vitro klonal, üç boyutlu, yapışık olmayan agregalar oluşturan yetişkin fare beyinlerinin SVZ'sinden elde edilenNSC'lerin kökünü korur. Nörosfer kültürleri, NSC proliferasyonunu, kendini yenilemeyi, farklılaşmayı ve hayatta kalmayı etkileyen moleküler mekanizmaları ve faktörleri manipüle etmek ve incelemek için kontrollü bir platform görevi görür11. Özellikle, kültürde oluşan birincil nörosferlerin sayısı, SVZ'de in vivo olarak bulunan NSC'lerin sayısının tahmin edilmesine izin vererek, onu farklı koşulların yetişkin NSC havuzu üzerindeki etkilerini incelemek için güçlü bir araç haline getirir12,13. Ayrıca, birincil kültür kurulduktan sonra, NSC'ler proliferasyon koşulları altında simetrik bölünmelerden geçtikten sonra yeni agregalar (ikincil nöroküreler) üretebilir14. Bu nedenle, bu kültürlerin kendini yenileme oranını değerlendirmek için ikincil nörosfer hücrelerinin düşük yoğunluklu tohumlanması (klonal test) kullanılabilir 4,15,16,17.

Nörosferlerin NSC düzenlemesini yöneten mekanizmaları ortaya çıkarma potansiyeline rağmen, bazı araştırmacılar in vitro bulguların geçerliliğini sorguluyor ve hücrelerin büyüdüğü yapay koşulların, nörojenik nişlerin karmaşık in vivo mikro ortamını aslına uygun olarak kopyalayamayabileceğini savunuyor 18,19,20,21,22. Bir başka tartışmalı nokta, nörosferlerde gözlemlenen heterojenlik etrafında dönmektedir. Bununla birlikte, bu değişkenliğin, NSC'lerin in vivo olarak doğal olarak meydana gelen simetrik ve asimetrik bölünmelerini yansıttığına inanılmaktadır 23,24. Ayrıca, son doğrulama, in vivo SVZ nörojenik niş içinde çalışan mekanizmaları tahmin etmek için NSC kültürlerinin kullanımını desteklemiştir ve birkaç çalışma, in vitro kültürlenen NSC'lerin in vivo olarak gözlemlenen transkriptomik profili doğru bir şekilde koruduğunu göstermiştir 11,25.

Bu nedenle, nörosfer kültürleri sadece NSC proliferasyonu ve farklılaşma yeteneklerini keşfetmek için bir yöntem olarak hizmet etmekle kalmaz, aynı zamanda NSC biyolojisini yöneten genlerin etkisini incelemek için bir sistem sunar. NSC'lerde gen fonksiyonunu araştırmak için çok önemli bir teknik, gen ekspresyonu pertürbasyonudur. Plazmitler yoluyla iletilen siRNA'lar veya genler, hücre kültürlerine transfekte edilebilir, bu da hedef genin yıkılmasına veya yukarı regülasyonuna neden olur. Bu çok yönlü yaklaşım, koşullu nakavt fareler kullanarak kültürler oluşturmaya kıyasla zaman ve maliyeti önemli ölçüde azaltır ve nörogenezin genetik temellerini çözmek ve terapötik olasılıkları keşfetmek için umut verici bir yol sunar. NSC'lerde belirli genlerin ekspresyonunu değiştirmek, davranışlarının modülasyonunu sağlayarak çoğalma, farklılaşma ve göç gibi önemli biyolojik süreçleri etkiler. Bununla birlikte, özellikle fare nörosferleri içinde NSC'leri transfekte etme olasılığı, dikkate değer zorluklar ortaya koymaktadır. Nörosferlerin üç boyutlu yapısı, transfeksiyonun verimliliğini tehlikeye atar ve genellikle genetik manipülasyonun kapsamını sınırlayan düşük başarılı eksojen nükleik asit iletimi oranlarıyla sonuçlanır26,27. Ek olarak, transfeksiyon prosedürleri hücre canlılığını ve işlevselliğini zararlı bir şekilde etkileyebilir27. Bu bağlamda, nükleofeksiyon sistemini, hücre hasarını azaltmak, yüksek bir sağkalım oranı elde etmek ve NSC kültürlerini bozmak için kullanılan gen iletim testlerinde daha yüksek etkinlik sağlamak için bir yöntem olarak sunuyoruz.

Bu el yazması, nörosfer kültür sistemini kullanarak genleri bozmak için yetişkin SVZ nörojenik nişinden NSC'leri izole etme, genişletme ve nükleofecting prosedürünü göstermeyi amaçlamaktadır. Bu yöntem, geleneksel transfeksiyon protokollerinin etkinliğini aşarak, hedeflenen hücreler arasında önemli ölçüde daha yüksek hayatta kalma oranları ve gelişmiş gen iletim verimliliği sunar.

Protokol

Hayvanlarla yapılan tüm deneyler daha önce Valensiya Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Conselleria de Agricultura, Ganadería y Pesca, Generalitat Valenciana (İspanya) tarafından yetkilendirilmiştir.

1. Nörosferlerin birincil kültürü

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    1. Deiyonize suda Dulbecco'nun Fosfat Tuzlu Tamponundan (DPBS) bir tampon çözeltisi hazırlayın ve otoklavlayarak sterilize edin. Alternatif olarak, deiyonize suya 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 ve 1.8 mM KH2PO4 çözeltisi ekleyerek 0.1 M PBS pH 7.4 hazırlayın.
    2. İki adet 12 oyuklu plakayı önceden soğutulmuş DPBS ile doldurun ve bunları buz üzerinde tutun: biri diseksiyondan önce tüm beyni korumak için kullanılacak, diğeri ise doku işlemeye kadar disseke SVZ'leri koruyacaktır.
    3. Papain içeren enzimatik karışımı aşağıda anlatıldığı gibi hazırlayın.
      1. Earl'ün Dengeli Tuz Çözeltisinde (EBSS) EDTA / L-sistein ayrışma çözeltisini her biri 0.2 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona hazırlayın. Tam çözünme elde etmek için, tüpü 37 ° C'de bir su banyosunda inkübe edin.
      2. 12 U / mL papain'i EDTA / L-sistein çözeltisi içinde çözün. Beyin başına 500 μL enzimatik çözelti kullanılacağını düşünün.
      3. Enzim tamamen eriyene kadar papain solüsyonunu 37 ° C'lik bir su banyosunda yaklaşık 20 dakika boyunca uygulayın.
      4. Enzimatik karışımı bir şırınga ve 0,22 μm gözenekli bir filtre ile filtreyle sterilize edin ve kullanana kadar 4 °C'de tutun.
        NOT: Papain, 37 °C'de 30 dakika sonra aktif hale gelir ve 4 °C'de 12 saat saklanabilir.
    4. Tablo 1'e göre hormon karışım solüsyonunu ekleyerek kontrol kültürü ortamını hazırlayın ve nitroselüloz 0.22 μm gözenekli filtreler kullanarak filtreyle sterilize edin. Ortamı 4 °C'de tutun ve kullanmadan önce 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
    5. Tablo 1'e göre kullanmadan hemen önce kontrol ortamını EGF ve bFGF ile destekleyerek tüm ortamı hazırlayın. Filtreleme ile mitojenler kaybolabileceğinden tüm ortamı filtrelemeyin.
  2. Beyin ekstraksiyonu ve SVZ diseksiyonu
    NOT: Farelerin ötenaziden önce yiyecek ve suya ücretsiz erişimine izin verilir. 8 ila 16 haftalık C57BL / 6 fareler kullanılır. Her iki cinsiyet de hazırlıkta gözle görülür farklılıklar olmadan kullanılır.
    1. Ameliyattan önce diseksiyon aletlerini otoklavlayarak sterilize edin. Ardından neşterleri, cımbızları, makasları ve spatulaları %70 etanol ile doldurulmuş bir behere batırın. Her çalışma yüzeyini %70 etanol ile iyice temizleyin.
    2. Fareyi CO2 doz aşımı ile feda edin ve servikal çıkık ile onaylayın. Beyin dokusu kontaminasyonu olasılığını en aza indirmek için kafaya% 70 etanol püskürtün.
    3. Makas kullanarak farenin başını vücudun geri kalanından ayırın. Kafatası tamamen ortaya çıkana kadar rostro-kaudal eksen boyunca küçük bir makasla kafatasının üzerindeki cildi kesin.
    4. Başlangıçta kafatasını sagital sütür boyunca küçük bir makasla keserek beyni açığa çıkarın ve ardından ince cımbız kullanarak kemikleri çıkarın. Bu adım sırasında kafatasının altındaki beyin dokusuna herhangi bir zarar vermemeye dikkat edin.
    5. Bir spatula kullanarak beyni kafatasından dikkatlice çıkarın ve soğuk DPBS içeren 12 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Diseksiyon tamamlanana kadar plakayı buz üzerinde tutun.
    6. Tüm beyni, diseksiyonun yapılacağı silikon pedin üzerine aktarın ve beynin üzerine birkaç damla soğuk DPBS uygulayın (Şekil 1A).
    7. Beynin rostral ucunda bulunan OB'yi ve kaudal kısımda bulunan beyinciği çıkarmak için bir neşter kullanın ve beynin her iki lateral ventrikülü içeren merkezi kısmını koruyun (Şekil 1B).
    8. Beyni uzunlamasına fissür boyunca iki hemisfere bölün ve ardından her iki hemisferin diseksiyonuna ayrı ayrı devam edin (Şekil 1C).
    9. Bir yarım küre ile çalışarak, medial alan yukarı bakacak şekilde yeniden yönlendirin. Beyni korpus kallozum hattı boyunca açın, korteks ve striatumu hipokampus, septum ve diensefalondan ayırın, böylece lateral ventrikülleri açığa çıkarın (Şekil 1D).
      NOT: SVZ, ventrikül boşluğu ile striatum arasında yer alır, bu nedenle sonraki adımlar, SVZ'yi çevreleyen dokudan mümkün olduğunca doğru bir şekilde izole etmeyi amaçlar.
    10. Ventriküllerin ventral sınırını takip eden hipokampus, septum ve diensefalonu çıkarın (Şekil 1E,F), SVZ'nin rostral ve kaudal uçlarının ötesindeki dokuyu (Şekil 1G) ve korpus kallozumdan sonraki korteksi çıkarın (Şekil 1H,I).
    11. Dokuyu, SVZ yana bakacak şekilde eğin (Şekil 1J), SVZ'nin altındaki striatal dokunun çıkarılmasına izin verin (Şekil 1K) ve NSC'leri içeren ince bir doku parçası elde edin (Şekil 1L).
    12. Aynı fareden alınan her iki disseke SVZ'yi, doku işleme başlayana kadar soğuk, steril DPBS içeren 12 oyuklu bir plakada saklayın.
      NOT: Her iki SVZ'nin bir beyinden diseksiyonu 10 dakika sürmelidir. Daha uzun süre hücre canlılığını etkileyebilir. Kültürlerin veriminin artması gerekiyorsa, aynı yaş, cinsiyet, genetik arka plan ve genotipe sahip birden fazla fareden alınan SVZ'ler bir araya getirilebilir.
  3. NSC'lerin izolasyonu ve tohumlanması
    1. Dokunun ayrışmasını kolaylaştırmak için her SVZ'yi 4-5 küçük parçaya bölün.
      NOT: Bu adımdan itibaren, tüm prosedür steril koşullarda laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir.
    2. Doğranmış SVZ'leri steril bir plastik Pasteur pipeti kullanarak 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Plakada parça kalmadığından emin olun.
    3. Tüpün dibindeki doku tortusuna izin verin ve kalan DPBS'yi çıkarın.
    4. Beyin başına 500 μL filtrelenmiş papain içeren enzimatik karışım (2 SVZ) ekleyin ve tüpleri 37 ° C'de 30 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin.
    5. İnkübasyondan sonra, her numuneye 37 °C'de önceden ısıtılmış 5 mL kontrol ortamı ekleyin.
    6. Numuneleri 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, bir mikropipet veya vakum pompası kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın.
    7. 1 mL kontrol ortamı ekleyin ve homojen bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar ateşle parlatılmış bir Pasteur cam pipet kullanarak peleti 10x ila 20x yukarı ve aşağı pipetleyerek dikkatlice mekanik olarak ayırın.
      DİKKAT: Bu, protokoldeki en kritik adımlardan biridir, çünkü aşırı veya yetersiz ayrıştırma kültürlerin verimini olumsuz yönde etkileyecektir.
    8. 4 mL kontrol ortamı ekleyin ve hücreleri yıkamak için ters çevirerek karıştırın. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın.
    9. 1 mL tam ortam ekleyin ve hücre süspansiyonunu homojenize etmek için 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin.
    10. Hücre süspansiyonunun 1/2'sini tripan mavisi ile seyrelttikten sonra mikroskop altında bir Neubauer odası kullanarak hücre süspansiyonunu sayın veya otomatik bir hücre sayacı kullanın. Kültürlerin tek hücre düzeyinde ayrıştırıldığından emin olun.
    11. Hücre süspansiyonu hazırlandıktan sonra, elde edilen hücreleri, 500 μL tam ortamın nihai hacminde 48 oyuklu bir plakanın 8 oyuğuna eşit olarak tohumlayın.
      NOT: Genellikle iki SVZ'den 20.000 hücre elde ederiz, bu da kültürlerde maksimum verimi elde etmek için yaklaşık 2.500 hücre/mL'lik bir nihai tohumlama yoğunluğu ile sonuçlanır.
  4. Nöroküre oluşumu
    1. Hücreleri 5 ila 7 gün boyunca in vitro (DIV) nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin. Bu koşullar altında, farklılaşmış hücreler ölürken, NSC'ler ve progenitörler mitojenik stimülasyona yanıt olarak çoğalır ve birincil nörosferler olarak tanınan klonal agregatlar oluşturur.
      NOT: Nörosfer oluşumunu indüklemek için EGF veya bFGF kullanılabilir. Bununla birlikte, bu iki büyüme faktörü tamamen ikame edilemez.
    2. Ters mikroskopla birleştirilmiş bir kamera kullanarak nörosferlerin boyutunu kontrol edin ve nörosferler 50 ila 100 μm'lik bir boyut aralığına ulaştığında, kuyuda oluşan tüm birincil nöroküreleri 10x büyütmede sayın. Oluşan toplam birincil nörosfer sayısı, SVZ nişinde bulunan NSC'lerin sayısının bir tahmini olarak hizmet eder.
    3. 10 günlük bir süre sonra, geçmeye başlamak için kültür ortamını her kuyucuktan toplayın. 5 ila 7 DIV'den sonra müteakip geçiş yapın, ancak birincil kürelerin alt kültürleme için ideal boyuta (yaklaşık 100 μm) ulaşmak için biraz daha uzun bir süre gerektirebileceğini belirtmekte fayda var.

Tablo 1: Kültür ortamı çözümleri. Kontrol ortamının tarifi açıklanmıştır. Önceden karıştırılmış bir hormon karışımı çözeltisi yapılır. Stok hormon çözeltileri belirtildiği gibi önceden hazırlanabilir ve -20 ° C'de saklanabilir. Hücre kültüründen önce, tam ortam hazırlamak için kontrol ortamını EGF ve bFGF ile destekleyin. Her bileşen için depolama özellikleri, stoklar ve çalışma konsantrasyonları sağlanmıştır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Nörosfer kültürlerinin genişlemesi

  1. Nörosferlerin geçişi
    1. Nörosferleri içeren ortamı çok kuyulu plakalardan toplayın ve bunları 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Kuyuları birkaç mililitre DPBS ile durulayarak mümkün olduğunca çok hücrenin geri kazanılmasını sağlayın.
    2. Nöroküreleri 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın.
    3. Peletin içine 200 μL enzimatik çözelti ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve yerinden çıkarmak için tüpün altına hafifçe vurun. Nörosferlerin ayrışmasını kolaylaştırmak için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    4. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için 1 mL kontrol ortamı ekleyin ve nörosferleri bir P1000 mikropipet ile 10 ila 20 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik olarak ayırın.
    5. Kontrol ortamından 4 mL'lik ek bir hacim ekleyin ve hücreleri yıkamak için ters çevirerek karıştırın.
    6. Hücreleri 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın.
    7. 1 mL tam ortam ekleyin ve 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek hücresel süspansiyonu homojenize etmek için peleti yeniden süspanse edin.
      NOT: Nörokürelerin orijinal sayısı ve boyutu çok yüksekse, güvenilir bir hücre sayımı sağlamak için hücre süspansiyonunu seyreltmek için daha fazla tam ortam ekleyin.
    8. Hücre süspansiyonunun 1/2'sini tripan mavisi ile seyrelttikten sonra bir Neubauer odası kullanarak hücre süspansiyonunu sayın veya otomatik bir hücre sayacı kullanın.
    9. Hücre kültürünü genişletmek için, uygun bir kültür plakasında veya şişede tam ortam kullanarak 10.000 hücre /cm2 yoğunlukta tohum hücreleri (bkz. Tablo 2).
    10. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de ve her geçiş için% 5 CO2'de 5 ila 7 DIV için inkübe edin.
      NOT: Nörosfer kültürleri, proliferasyon kapasitelerini değiştirmeden, 10 pasajı aşmayacak şekilde tekrarlanan alt kültürleme yoluyla tutarlı bir şekilde genişletilebilir ve çoğaltılabilir. Kültür için EGF veya bFGF kullanılabilir; bununla birlikte, kültürlerin uzun vadeli genişlemesi ancak EGF'nin varlığında sağlanabilir.
  2. Kendini yenileme testi
    1. Nörosfer kültürlerini geçtikten sonra, 96 oyuklu bir plakada 1.000 ayrı hücreyi plakalayın, tam ortam ile 200 μL'lik bir nihai hacme kadar tamamlayın, bu da 5 hücre / μL'lik kültürlerin nihai hücre yoğunluğu ile sonuçlanır.
      NOT: Tohumlanan hücre sayısı mümkün olduğunca doğru olmalıdır. Gerekirse, kaplamadan önce güvenilir bir hücre süspansiyon hacmi sağlamak için ara seyreltmeler hazırlayın. Ayrıca, teknik değişkenliği azaltmak için koşul başına 4 ila 5 kopya plakalanması önerilir.
    2. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C ve% 5 CO2'de 5 gün boyunca veya nörosferler yeterli bir boyuta (60 ila 100 μm) ulaşana kadar inkübe edin. Nörosfer toplanmasını önlemek için çok kuyulu plakayı hareket ettirmekten veya sallamaktan kaçının.
    3. Nörosfer oluşumundan sonra, bağlı bir kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir faz kontrast mikroskobu kullanarak her bir kuyucukta oluşan nörosferlerin sayısını sayın. Kendini yenileme testi, EGF veya bFGF ayrı ayrı kullanılarak gerçekleştirilebilir.
  3. NSC kültürlerinin dondurularak saklanması
    NOT: Nörosfer kültürleri, gereken fare sayısını en aza indirerek ileride kullanılmak üzere dondurularak saklanabilir. Hücrelerin 10. pasaja kadar korunmasını öneririz.
    1. Hücreleri kriyoprezervasyon yapmak için, hücre süspansiyonunun 1 mL'sini tam ortamda uygun şekilde etiketlenmiş bir kriyotüpe aktarın.
    2. Hücre süspansiyonuna %10'luk bir nihai konsantrasyona kadar dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve tüpleri ters çevirerek hafifçe karıştırın.
      NOT: DMSO bir kriyoprotektan görevi görür ancak hücreler için toksik olabilir, bu nedenle bu adım hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir.
    3. Tüpleri, 80 °C/dk'da kademeli bir sıcaklık düşüşü sağlayan bir dondurma kabı kullanarak -1 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin. Bu kademeli dondurma işlemi, kriyoprezervasyon sırasında buz kristallerinin oluşumundan kaynaklanan hücre hasarını önler. Uzun süreli depolama için tüpleri -196 °C'de sıvı nitrojen tankında tutun.
  4. NSC kültürlerinin çözülmesi
    NOT: Gerektiğinde, hücreler çözülebilir ve kültürler deneyler için yeniden genişletilebilir.
    1. Donmuş NSC'ler içeren kriyotüpleri sıvı nitrojen depolama tankından çıkarın ve hemen 37 °C'lik bir su banyosuna tamamen çözülene kadar, yaklaşık 5 dakika yerleştirin.
      DİKKAT: DMSO toksik olduğundan ve hücre canlılığını etkileyebileceğinden banyo süresini en aza indirmek çok önemlidir.
    2. Çözülmüş hücreleri, 5 mL önceden ısıtılmış kontrol ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne hızla aktarın.
    3. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. 1 mL tam ortam ekleyin ve tohumlamadan önce hücresel süspansiyonu homojenize etmek için 10 kat yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin.
      NOT: Çözülme hücre canlılığını etkileyebilir; Bu nedenle, yeni deneyler için tohumlamadan önce hücrelerin en az bir kez geçirilmesi önerilir.
  5. Mikoplazma testi
    NOT: Mikoplazma kontaminasyonu, büyüme oranlarını etkileyerek hücre sağlığını tehlikeye atabilir. Bu nedenle, mikoplazma testi, deneylerin bütünlüğünü ve güvenilirliğini sağlamak için çok önemlidir.
    1. DNA ekstraksiyonu
      1. DNA ekstraksiyonu için en az 100 μL hücre kültürü toplayın. DNA ekstraksiyonu için hem süpernatan hem de hücre peleti kullanılabilir. Bu alikotu ekstraksiyona kadar -20 ° C'de saklayın.
      2. Tüp kapağını delin ve alikotu bir termoblok kullanarak 99 °C'de 15 dakika kaynatın.
        NOT: Tüp kapaklarının delinmesi, yüksek sıcaklıklarda kaynatma sırasında tüplerin açılmasını önler.
      3. 16.900 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. DNA'yı içeren süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. PCR testine kadar tüpü DNA ile birlikte -20 °C'de saklayın.
    2. Mikoplazma tespiti için PCR
      1. Aşağıdaki bileşenleri kullanarak PCR karışımını hazırlayın: 8.9 μL nükleaz içermeyen su, 3 μL 5x reaksiyon tamponu, 1.2 μL 25 mM MgCl2, 0.25 μL 2.5 mM dNTP, 0.15 μL Taq polimeraz ve 0.25 μL 10 μM konsantrasyonda her bir mikoplazmaya özgü primer (İleri, Fw: 5'GATGTTTAGCCGGGTCGAGAG3' ve Ters, Rv: 5'GATGTCAAGAGTGGGTAAGGTT3').
      2. 1 μL genomik ekstrakte edilmiş DNA ekleyin. DNA kontaminasyonunu önlemek için PCR karışımını laminer bir akış başlığında hazırlayın.
      3. Reaksiyonu bir termal döngüleyicide aşağıdaki gibi inkübe edin: 95 ° C'de 5 dakika boyunca ilk denatürasyon, ardından 30 saniye boyunca 95 ° C'de 35 döngü denatürasyon, 53 ° C'de 1 dakika tavlama, 72 ° C'de 30 saniye uzatma ve 72 ° C'de 5 dakika boyunca son bir uzatma.
      4. Elde edilen bandın boyutunu (yaklaşık 500 bp) belirlemek için, 3 μL 6x yükleme boyası çözeltisi ile karıştırılmış 15 μL DNA PCR ürününü %2'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin ve elektroforezi 100 V'ta 40 ila 50 dakika çalıştırın.

Tablo 2: Kültür için kullanılan plakalar ve şişeler. En yaygın olarak kullanılan tohumlama plakalarının ve şişelerinin boyutları ve hacimleri verilmiştir. Tablo, genişleme koşulları altında (10.000 hücre/cm2) tohumlanacak NSC sayısının bir örneği ile birlikte her bir gemi için kullanılan çapı, büyüme alanını ve orta hacmi içerir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Nörosfer kültürlerinin nükleofeksiyonu

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    1. DNA hazırlığı
      1. Transformasyon için 1.5 mL'lik bir tüpte 25 μL yetkin E. coli DH5α hücresi hazırlayın.
      2. Hücrelere 1 μL ilgilenilen plazmid (100 ila 200 ng / μL'de) ekleyin ve bunları 45 s boyunca 42 ° C'de bir termal şoka maruz bırakın. Burada, Snrpn ekspresyonunu susturmak için kısa bir firkete (sh)RNA içeren bir plazmit ve bir kontrol plazmidi shSCRAMBLE kullanılır.
        NOT: Transformasyon etkinliğini korumak için prosedür boyunca yetkin hücreleri buz üzerinde tutun.
      3. Dönüştürülmüş hücreleri uygun antibiyotik ile LB agar plakaları üzerine yerleştirin ve 37 ° C'de 18 saat inkübe edin. Bakteri kolonilerini rahatsız edebilecek yoğuşma nedeniyle damlacık oluşumunu önlemek için Petri kaplarını ters çevirin.
        NOT: Yalnızca dönüştürülmüş bakterilerin büyümesine izin vermek için LB kültür ortamına uygun antibiyotikler ekleyin.
      4. Steril bir pipet ucu kullanarak, tek tek bakteri kolonilerini seçin ve sıvı bir kültür başlatmak için bunları daha önce 250 mL LB ile doldurulmuş bir Erlenmeyer şişesine aktarın. İstenen plazmidi içermemiş olabilecekleri için, daha büyük hedef kolonilerin etrafına yerleştirilmiş küçük uydu kolonilerini seçmekten kaçının.
      5. Gece boyunca 37 °C'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde kuvvetlice çalkalarken şişeyi inkübe edin.
      6. Endotoksin içermeyen bir maxiprep kiti kullanın ve üreticinin talimatlarını izleyerek bakteri kültürlerinden saf plazmit DNA'sını çıkarın. 1 ila 2 μg/μL'lik bir plazmit konsantrasyonu elde etmek için DNA'yı uygun hacimde endotoksin içermeyen suda sulandırın.
        NOT: Maxiprep verimi, kültür büyümesine bağlıdır. Genellikle, plazmit DNA peletinin 200 μL'lik bir hacimde yeniden askıya alınması, istenen DNA konsantrasyonu ile sonuçlanacaktır.
      7. Tüpü plazmid DNA ile birlikte kullanana kadar -20 °C'de saklayın. Nükleofeksiyon için amaçlanan 2 ila 6 μg plazmit DNA içeren 5 μL'lik bir nihai hacme sahip 1.5 mL'lik bir tüp hazırlayın.
    2. Malzeme hazırlama
      1. Nükleofeksiyon çözeltisini hazırlayın. Önerilen kiti kullanıyorsanız (Malzeme Tablosuna bakınız), istenen her nükleofeksiyon için 1,5 mL'lik bir tüpte 95 μL nükleofeksiyon solüsyonu hazırlayın. Pipetler ve küvetler genellikle kite dahildir. Her nükleofeksiyon koşulu için her birinden bir tane hazırlayın.
      2. Her koşulda 25 mL önceden ısıtılmış tam ortam ile doldurulmuş bir T4 şişesi hazırlayın ve kullanana kadar inkübatörde tutun.
  2. NSC'lerin nükleofeksiyonu
    1. Değerlendirme için koşul başına 1 ila 2 x 106 ayrı hücre kullanın. Hücreleri 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın.
    2. 1 mL DPBS ekleyin ve homojen bir hücresel süspansiyon sağlamak için peleti 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
    3. İkinci bir yıkama için santrifüjlemeyi (adım 2.1.6) tekrarlayın ve son olarak peleti 95 μL nükleofeksiyon çözeltisinde yeniden süspanse edin.
      NOT: Yıkama adımları, antibiyotikleri kontrol ortamından uzaklaştırmak ve etkili nükleofeksiyonu sağlamak için çok önemlidir.
    4. 95 μL hücreyi, nükleofeksiyon için seçilen her bir plazmitten (toplam 2 μg) 5 μL içeren önceden karıştırılmış bir çözelti ile birleştirin.
    5. Bir P200 mikropipet kullanarak bu çözeltiyi bir küvete aktarın ve nükleofektör cihazına yerleştirin.
    6. Nükleofektör sisteminin optimize edilmiş NSC programını kullanarak hücreleri istenen plazmitlerle çekirdeklendirin.
    7. Elektroporasyonu tamamladıktan sonra, kitte verilen Pasteur pipetlerini kullanarak küvete sıcak komple ortamı dikkatlice yerleştirin. Daha sonra, küvetin içeriğini önceden ısıtılmış tam ortam içeren önceden hazırlanmış bir T25 şişesine aktarın. Elektroporasyondan sonra hücre ölümü, DNA çökelmesi ve viskoz bir agrega oluşumu olabilir. Hücre sağkalımını azaltabileceğinden bunu T25 şişesine aktarmaktan kaçının.
      NOT: Bu adım çok önemlidir ve yüksek bir nükleofeksiyon verimi ve ardından kültür sağkalımı sağlamak için mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirilmelidir.
    8. Nükleofected hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 3 ila 5 gün inkübe edin.
  3. Nükleofecte hücrelerin seçimi
    1. Strateji A: Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile akış sitometrisi seçimi
      1. 3 ila 5 günlük nükleofeksiyondan sonra, adım 2.1'i izleyerek nükleofected kültürleri geçin ve elde edilen tüm bireyselleştirilmiş hücreleri toplayın.
      2. Hücre agregalarını çıkarmak için numuneleri 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve bunları hücre sıralayıcı akış sitometresi ile analiz edin.
        NOT: Karşılaştırmalı sonuçlar elde etmek için her koşulda aynı sayıda hücreyi sıralamak çok önemlidir.
      3. Sitometrenin yazılımını kullanarak, iki ölçüme dayalı olarak canlı hücreleri kapılayın: hücre boyutuna karşılık gelen ileri dağınık ışık (FSC-A) ve hücre içi karmaşıklığa karşılık gelen yandan dağınık ışık (SSC-A). Yüksek FSC-A ve yüksek SSC-A ile karakterize edilen canlı hücre popülasyonunu seçin.
        NOT: İsteğe bağlı olarak, sıralamadan önce hücre süspansiyonuna 0.1 μg / mL 4 ", 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin. Bu, ölü hücrelerin ve apoptotik cisimlerin kapıdan atılmasına izin verecektir.
      4. FSC-A'ya karşı FSC-H parametrelerini çizerek hücre çiftlerini ve üçlülerini atın. Tekli öğeleri temsil eden arsanın köşegeninde yer alan olayları seçin.
        NOT: Hücreler lazerden geçtiğinde, sitometre zamanla voltaj değişikliklerini algılar. FSC-A sinyal alanını temsil eder ve FSC-H tepe yüksekliğini ifade eder. Tekliler, FSC-A ve FSC-H (grafiğin köşegeninde bulunur) arasında orantılı bir ilişki gösterirken, hücre agregaları, daha uzun bir sinyal nedeniyle FSC-H'ye göre daha büyük bir FSC-A gösterir.
      5. Kullanılan plazmit tarafından kodlanan raportör genin floresan yoğunluğuna dayalı olarak çekirdekli hücreleri seçin. Örneğin, GFP + kullanılırken, hücreler SSC-A grafiğine karşı FITC-A floresan seviyelerine göre seçilebilir.
      6. Her koşul için istenen sayıda hedef hücreyi izole edin ve bunları doğrudan tam ortamla doldurulmuş bir toplama tüpünde toplayın.
      7. 10.000 hücre/cm2 yoğunlukta tohum çekirdekli NSC'ler. Sıralanan hücre kültürlerini nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
    2. Strateji B: Plazmidde kodlanmış antibiyotik direnci kullanılarak seçim
      1. 48 saatlik nükleofeksasyondan sonra, dirençli hücreleri seçmek için uygun antibiyotik konsantrasyonunu ekleyin.
        NOT: Başlamadan önce, nükleofected olmayan hücreler üzerinde antibiyotiğin çoklu konsantrasyonlarının test edilmesi önerilir. Optimal antibiyotik konsantrasyonu, tüm dirençli olmayan hücrelerin elimine edildiği en düşük miktardır. Örneğin, NSC kültürleri için optimal bir 4 μg/mL antibiyotik blasticidin konsantrasyonu belirledik.
      2. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 48 saat inkübe edin.
      3. 48 saatlik antibiyotik tedavisinden sonra, nükleofekte edilmiş hücreleri adım 2.1'e göre alt kültüre alın. Nöroküreler küçük kalırsa, antibiyotiği 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme ile kültür ortamından çıkarın. Hücreleri yeniden süspanse edin ve sadece tam ortam kullanarak bir şişede kültürleyin. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde adım 2.1'i izleyerek genişleyene kadar inkübe edin.

Sonuçlar

Optimal kültür koşulları, yetişkin SVZ'den türetilen NSC'lerin in vitro olarak izole edilmesini ve genişletilmesini sağlar
Yetişkin SVZ'den türetilen NSC kültürleri, NSC'leri kendi spesifik mikro ortamlarında düzenleyen moleküler mekanizmaları ve niş sinyalleri araştırmak için değerli bir in vitro yöntem olarak hizmet etmiştir. Bu el yazmasında özetlenen nörosfer testi, yetişkin SVZ içindeki NSC sayısını incelemek için kullanıldı. SVZ dokusu, 3 aylık farelerin beyinlerinden izole edildi, ayrıştırıldı ve hem EGF hem de bFGF ile veya her biri ayrı ayrı desteklenmiş tam NSC ortamında kültürlendi. 10 gün sonra in vitro (DIV), bu üç farklı kültür koşulu altında oluşan birincil kürelerin toplam sayısı, faz kontrast mikroskobu kullanılarak ölçüldü (Şekil 2A, B). Dikkat çekici bir şekilde, bulgularımız, EGF'nin varlığının, yalnızca bFGF içeren kültürlerde gözlenen birincil küre sayısının azalmasından açıkça görülen maksimum birincil küre oluşumuna yol açtığını göstermektedir (Şekil 2A, B). NSC'lerin çeşitli ortam koşulları altında kendi kendini yenileme kapasitesini değerlendirmek için, hücreler alt kültüre alındı ve yukarıda belirtilen mitojen kombinasyonları ile desteklenmiş ortamda düşük yoğunlukta (5 hücre / μL) kaplandı. İkincil kürelerin miktar tayini, SVZ NSC'lerin verimli bir şekilde kendini yenilemek için en azından EGF'ye ihtiyaç duyduğunu ve hem EGF hem de bFGF kombinasyonunun hücrelerin kendi kendini yenileme kapasitesini iyileştirdiğini ortaya koymuştur (Şekil 2B). Ayrıca, çeşitli ortam koşullarında büyüme dinamiklerinin ayrıntılı bir analizi için, 7 geçiş boyunca tohumlanan ve elde edilen hücre sayısı kaydedildi. Farklı ortam koşullarından elde edilen büyüme eğrileri, tek başına EGF ile takviye edilen veya bFGF ile kombinasyon halinde takviye edilen kültürlerin, sadece bFGF ile takviye edilen kültürlere kıyasla daha iyi büyüme dinamikleri sergilediğini doğrulamıştır (Şekil 2C). Toplu olarak, bu bulgular hem EGF hem de bFGF'nin eşzamanlı kullanımının in vitro olarak NSC kültür verimini artırdığını doğrulamaktadır.

Farklı doğum sonrası yaşlarda SVZ içindeki NSC sayısını araştırmak ve farelerin yaşlanmasının nörosfer kültür etkinliği üzerindeki etkisini değerlendirmek için, 1 aylıktan 12 aya kadar olan farelerden alınan SVZ dokusu diseke edildi. Özellikle, bulgularımız, artan yaşla birlikte birincil kürelerin sayısında önemli bir düşüş olduğunu ortaya koydu ve yaklaşık 2 ila 4 aylıkken küre sayısında maksimum verimliliği gösterdi (Şekil 2D). Ek olarak, subkültürleme sırasında NSC'lerin kendi kendini yenileme kapasitesini değerlendirmek için, 2 ila 4 aylık farelerden elde edilen NSC'ler alt kültüre alındı ve tam ortamda klonal yoğunlukta (5 hücre / μL) tohumlandı. Sonraki pasajlar boyunca ikincil kürelerin sayısının ölçülmesi, pasajlar üzerinde kültür verimliliğinde önemli bir azalma olduğunu göstermiştir (Şekil 2E). Tüm bu gözlemlere dayanarak, NSC kültür koşullarını daha da optimize etmek için erken geçişler sırasında kendi kendini yenileme testlerinin yapılması önerilir.

Nükleofeksiyon, yetişkin NSC'lerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için oldukça etkili bir tekniktir
NSC'lerin gen ekspresyonunu manipüle etmek için kolayca transfekte edilemediği göz önüne alındığında, burada viral transdüksiyon kullanmaya gerek kalmadan daha yüksek bir başarılı gen iletimi oranına sahip bir nükleofeksiyon protokolü sunuyoruz. 2 ila 4 aylık farelerden alınan bireysel SVZ'lerin diseksiyonu ve kültürünün ardından, NSC'ler tarif edildiği gibi GFP taşıyan bir plazmit ile nükleofete edildi (Şekil 3A). Nükleofeksiyondan 2 gün sonra GFP pozitif hücrelerin tespiti, önceki literatür28 ile tutarlı olarak% 30 ila% 50 arasında değişen bir verimlilik ortaya çıkardı. Başarılı bir şekilde nükleofete edilmiş NSC'leri spesifik olarak izole etmek için hücreler, nükleofeksiyondan 3 ila 5 gün sonra GFP floresan yoğunluğuna dayalı olarak FACS ile sıralandı (Şekil 3A-C). FACS öncesi analiz edilen hücrelerin yaklaşık% 40'ı yüksek GFP floresan seviyeleri sergiledi ve daha sonra sıralama ile seçildi (Şekil 3C). Sıralanmış GFP + NSC'lerin yeniden tohumlanması, tüm hücrelerin GFP pozitif olduğunu gösterdi ve nükleofeksiyon tabanlı hücre izolasyon yöntemini doğruladı (Şekil 3D). Özellikle, nükleofected NSC'ler, yetişkin NSC'ler için nükleofeksiyon fizibilitesini doğrulayarak, sonraki geçişler boyunca canlılığını korudu. Bu sonuçlar, modifiye edilmiş NSC'lerin saf bir kültürünü oluşturmak için nükleofeksiyon ve FACS'yi birleştirmenin etkinliğini vurgulamaktadır.

Yetişkin NSC'lerde gen modülasyonunun bir örneği olarak, kısa firkete (sh) RNA nükleofeksiyonu yoluyla gen zayıflaması kullanıldı. Spesifik olarak, bir CAG-GFP raportörü (shSNRPN) taşıyan Küçük nükleer ribonükleoprotein polipeptit N (Snrpn) genini hedefleyen bir shRNA, 2 aylık farelerden türetilen NSC kültürlerinde nükleofeke edildi. Snrpn'nin aşağı regülasyonu, shSNRPN plazmidi ile nükleofete edilmiş hücrelerde qPCR ve immünositokimya ile doğrulandı, ancak kontrol shSCRAMBLE plazmidi için doğrulanmadı (Şekil 3E, F)29. Snrpn aşağı regülasyonunun NSC'nin kendini yenileme kapasitesi üzerindeki etkilerini aydınlatmak için, nükleofected hücrelerde düşük yoğunluklu bir test yapıldı (Şekil 3F, G). Nükleofected kültürlerde sekonder nörosferlerin miktar tayini, Snrpn aşağı regülasyonu üzerine nörosfer oluşum kapasitesinin arttığını ortaya çıkarmıştır (Şekil 3G). Bu tahlil, yetişkin NSC'lerde gen ekspresyonunu manipüle etmek için nükleofeksiyon kapasitesinin altını çizer ve daha spesifik olarak, Snrpn'nin yetişkin NSC'lerde saplılığı korumadaki rolünü tanımlar.

figure-results-1
Şekil 1: SVZ diseksiyonunun ayrıntılı açıklaması. (A) Fare beyni çıkarıldıktan sonra, tüm beyin DPBS ile diseksiyon için silikon bir pede aktarılır. (B) OB ve beyincik bir neşter kullanılarak beyinden çıkarılır. (C) Beyin, diseksiyona ayrı ayrı devam etmek için iki yarım küreye bölünür. (D) Beyin, korpus kallozum hattı boyunca açılır, korteks ve striatumu hipokampus, septum ve diensefalondan ayırır ve böylece lateral ventrikülleri açığa çıkarır. (E-F) Hipokampus, septum ve diensefalon, ventriküllerin ventral sınırını takiben çıkarılır. (G-I) SVZ'nin rostral ve kaudal uçlarının ve korteksin ötesindeki doku, korpus kallozum'u takiben çıkarılır. (J-K) Doku, SVZ yana bakacak şekilde eğilir ve SVZ'nin altındaki striatal dokunun çıkarılmasına izin verir. (L) SVZ içeren ince bir doku parçası elde edilir. Siyah kesikli çizgiler kesim bölgesini gösterir. Siyah noktalı çizgiler, her adımda SVZ'nin konumunu gösterir. Kısaltmalar: OB = koku ampulü; CB = beyincik. AH cinsinden ölçek çubuğu: 5 mm; I-L içinde: 3 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Hem mitojen EGF hem de bFGF, NSC'lerin in vitro optimal kültürü ve genişlemesi için gereklidir. (A) Hem EGF hem de bFGF veya her bir mitojen ile ayrı ayrı desteklenmiş NSC ortamındaki birincil ve ikincil nörosfer kültürlerinin faz kontrast mikroskobu görüntüleri. (B) Kültür ortamının mitojen bileşimine bağlı olarak fare başına ve kuyu başına elde edilen birincil kürelerin sayısı: mitojen yok (gri, n = 9), EGF + bFGF (mavi, n = 33), sadece EGF (yeşil, n = 20) veya sadece bFGF (pembe, n = 19; sol panel). Kültür ortamının mitojen bileşimine bağlı olarak oyuk başına düşük yoğunlukta (5 hücre/μL) oluşan ikincil nörokürelerin sayısı: mitojen yok (gri, n=11), bFGF (pembe, n=18), EGF (yeşil, n=18) veya EGF+bFGF (mavi, n=37; sağ panel). Kruskal-Wallis testi ile Dunn'ın post hoc analizi kullanıldı. (C) Kültür ortamında bulunan mitojenlere göre farklı nörosfer kültürlerinde 8 geçişten sonra oluşan toplam hücre sayısını gösteren büyüme eğrileri: bFGF (pembe, n=5), EGF (yeşil, n=5) veya EGF+bFGF (mavi, n=10). Çalışmada doğrusal regresyon analizi kullanılmıştır. (D) Çeşitli doğum sonrası gelişim aşamalarında hayvanlardan ayrılan ve ayrıştırılan bireysel farelerden türetilen birincil nörosferlerin sayısı. Çalışmada doğrusal regresyon analizi kullanılmıştır. n parantez içinde gösterilir. (E) Kendini yenileme kapasitelerini değerlendirmek için in vitro sonraki geçişler yoluyla düşük yoğunlukta (5 hücre / μL) oluşan ikincil nörokürelerin sayısı. Kruskal-Wallis testi kullanıldı ve p değerleri dahil edildi: *: p<0.05; **: sayfa <0.01; : p<0.001; : sayfa <0.0001. N.S: Önemli değil. Hata çubukları SEM'i temsil eder. A'daki ölçek çubuğu 100 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Nükleofeksiyon sürecinin şeması ve nükleofected hücrelerin FACS tabanlı hücre seçimi. (A) Nükleofeksiyon sürecine ve nükleofected hücrelerin FACS tabanlı hücre seçimine genel bakış. 1) Plazmid DNA çözeltisi nükleofeksiyon çözeltisi ile birleştirilir ve hücrelere eklenir. Bu karışım daha sonra nükleofeksiyon için bir küvete aktarılır. 2) DNA ve hücreleri içeren küvet, bir elektrik şokunun uygulandığı nükleofektöre yerleştirilir. Yetişkin SVZ'den izole edilen nörosfer kültürleri için A-031 NSC programını kullanmanızı öneririz. 3) Nükleofesyondan sonra hücreler, EGF ve bFGF ile desteklenmiş tam ortam içeren bir şişeye aktarılır. 4) Hücreler, plazmit DNA'sında bulunan raportörün ifadesine dayalı olarak FACS ile sıralanır. 5) Sıralanan hücreler, sonraki deneyler için daha fazla kültüre tabi tutulur. (B) Nükleer NSC'ler için FACS'a dayalı seçim stratejisi ve geçitleme. İlk olarak, canlı hücreler yüksek FSC-A ve yüksek SSC-A'ya (soldaki grafik) dayalı olarak seçilir ve daha sonra FSC-A'ya karşı FSC-H parametreleri (sağdaki grafik) analiz edilerek hücre çiftleri ve üçlüleri elimine edilir. (C) GFP ekspresyonlarına (SSC-A'ya karşı FITC-A floresansı) dayalı olarak nükleofected hücreler için FACS geçidi. (D) FACS seçiminden önce (n = 3) ve sonra (n = 4) nükleofected NSC'lerin faz kontrast mikroskobu ve GFP floresan görüntüleri (sol panel). Nükleofede edilmiş GFP+ hücrelerinin yüzdesi, FACS seçiminden önce ve sonra gösterilir (sağ panel). Çalışmada t-testi kullanıldı. (E) Snrpn'ye özgü shRNA ile nükleofete edilmiş proliferatif NSC'lerde Snrpn ekspresyonunun kantitatif PCR (qPCR) analizi (n=4). Bir shRNA SCRAMBLE kullanılarak nükleofeksiyon kontrol görevi gördü (n = 4). Çalışmada t-testi kullanıldı. (F) ShRNA nükleofeksiyonundan (dış paneller) 7 gün sonra NSC'lerde SNRPN'yi (kırmızı renkte) gösteren immünositokimya görüntüleri. DAPI, DNA'yı lekelemek için kullanıldı. ShSNRPN ve shSCRAMBLE koşulları altında NSC'lerden türetilen nörosferleri gösteren temsili görüntüler (orta paneller). (G) shSNRPN (n = 8) veya shSCRAMBLE (n = 8) ile nükleofeksiyondan sonra NSC kültürlerinde oluşan nöroküre sayısının ölçülmesi. Çalışmada t-testi kullanıldı. p değerleri dahildir: *: p<0.05; **: sayfa <0.01; : p<0.001; : sayfa <0.0001. N.S: Önemli değil. Hata çubukları SEM'i temsil eder. D, 10 μm cinsinden ölçek çubuğu; F, 100 μm (F, 7 μm'de yüksek büyütmeli görüntüler). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

NSC popülasyonunu in vivo olarak tanımlamak için kesin belirteçlerin bulunmaması nedeniyle, NSC'lerin analizi öncelikle ex vivo koşullarda nörojenik nişlerden izole edilen hücrelerin davranışlarının gözlemlenmesine dayanmaktadır. Reynolds ve Weiss'ın öncü çalışmaları, genç yetişkin (2 aylık) fare SVZ dokusundan tek tek hücrelerin yapışkan olmayan koşullar altında izolasyonunu ve genişlemesini sağlayan hassas kültür koşulları oluşturarak zemin hazırladı. Bu hücreler genellikle EGF ve bFGF içeren serumsuz bir ortamda çoğaltılır, bu da proliferasyonu teşvik ederken nöronlara ve glialara farklılaşmayı tamamen önleyen koşullardır. Gerçekten de, bu kültür koşulları9 altında, çoğu hücre kültürdeki ilk günlerde ölür, ancak küçük bir alt küme bölünmeye başlar ve öncelikle yüzen nörosferleroluşturur 9. Bu hücre agregatlarının enzimatik ayrışması ve alt kültürü, kültür yayılımını kolaylaştırarak bu kültürlerin kendini yenileme kapasitesini gösterir.

Özellikle, nörosfer kültürleri sadece EGF ilavesiyle genişleme potansiyeli gösterirken, sadece bFGF içeren bir ortamda yetiştirilen NSC'ler uzun süreli hücre proliferasyonu göstermez30. Her iki kanıt da EGF'yi birincil NSC kendini yenileyen mitojen olarak göstermektedir. Bununla birlikte, kültür ortamında hem EGF hem de bFGF'nin varlığı, NSC'lerin31 kendini yenileme kapasitesini geliştirir ve ayrıca astrositlere, nöronlara ve oligodendrositlere 32,33,34,35 farklılaşma potansiyelinin dengelenmesine katkıda bulunur. Ayrıca, besiyerini desteklemek için ticari alternatifler yerine tanımlanmış bir hormon ve faktör karışımının kullanılması, NSC kültürlerinin yüksek kalitesini ve tekrarlanabilirliğini sağlar. Bu koşullar altında, fare NSC kültürleri ölümsüzleşmeye uğramadan kararlı hücre hatları olarak devam edebilir. Bununla birlikte, nörosfer kültürlerinde bir endişe, proliferatif hücre popülasyonlarının genetik dönüşümlere uğrama, hücre döngüsü düzenleyici mekanizmalarını atlama ve ölümsüzleştirilmiş bir fenotipe yol açma potansiyelidir. Bu nedenle, nörosfer kültürleri oldukça genişletilebilir olmasına rağmen, 10 in vitro pasajın ötesindeki kültürler, replikatif yaşlanmaya maruz kalabilecekleri ve anormal kromozomal içeriğe veya düzensiz büyüme dinamiklerine sahip hücrelerin ortaya çıkabileceği için genellikle çalışmalar için atılır. Ayrıca, uzun süreli yerleşik nörosfer kültürlerinin kullanımı sürekli olarak izlenmelidir. Nörosfer kültürleri ayrıca, in vivo'dan daha doğru bir şekilde modüle edilebilen ve izlenebilen daha kesin ve ayarlanabilir bir ortam sağlayarak, kontrollü bir ortamda özelliklerini ve potansiyellerini inceleme fırsatı sunar. İn vitro klonojenik veya popülasyon analizleri yoluyla, bu hücrelerin kendini yenileme ve çoğalma kapasitelerini ölçmek ve bu özellikleri yöneten altta yatan mekanizmaların tanımlanmasını kolaylaştırmak mümkündür.

Bununla birlikte, NSC'lerle in vitro olarak çalışmanın çok sayıda avantajına rağmen, bu kültür protokolünün doğası ve NSC'lerin inceliği bu alanda bir zorluk teşkil etmektedir. Örneğin, tipik bir diseksiyon sırasında üretilen birincil nörokürelerin sayısı, deneycinin becerisine ve hassasiyetine bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir. Birincil nörosfer sonuçları, 500 ila 3000 nörosfer arasında değişen 2 aylık farelerin SVZ'sinden elde edilen birincil nörosferlerin sayısındaki bu değişkenliği göstermektedir. Bu değişkenliğe çeşitli faktörler katkıda bulunabilir. İlk olarak, diseksiyonun hassasiyeti, primer küre oluşumunu engelleyen istenmeyen parankimal dokuyu en aza indirir. İkincisi, küçük SVZ doku parçaları üretmek, verimli enzimatik sindirim ve öğütmeye izin verir, böylece hücre kaybını azaltır. Bu, diseksiyon protokolünün yeterli ön uygulamasına ve nörosfer kültürlerinin kurulması sırasında doku işlemenin ince ayarlı bir şekilde geliştirilmesine olan ihtiyacı vurgulamaktadır.

Bu kültürlerin bir başka sınırlaması, nörosferlerin hem NSC'leri hem de progenitör hücreleri içerebilmesi gerçeğinde yatmaktadır, bu da birincil kültürler içinde bu iki popülasyon arasında ayrım yapmayı zorlaştırmaktadır. GFAP, Nestin, Musashi ve SOX2 gibi çeşitli belirteçlerin NSC8 tarafından ifade edildiği bildirilmiş olsa da, bunların hiçbiri yalnızca NSC'lerle ilişkili değildir. Hücre yüzeyi antijen ekspresyonuna dayanan yeni ortaya çıkan FACS teknikleri, NSC'lerin ve soylarının izolasyonunu sağlamıştır. Bu çalışmalar, transit amplifiye edici progenitörlerin geçiş sırasında nöroküre oluşturamadıklarını göstermiştir25,36. Bu nedenle, SVZ hücreleri ve nörosfer başlatan hücreler arasındaki ilişki daha fazla iyileştirme gerektirirken 18,19,20,21,22,23, nörosferlerin uzun bir süre boyunca seri olarak geçirilebilme yeteneği, kültürlerdeki NSC'lerin varlığını yansıtabilir.

Bu nörosfer kültür sistemi, NSC'nin kendini yenileme kapasitesinin sürdürülmesinde sinyal yolaklarının ve gen ekspresyonunun etkisini araştırmak için sağlam bir model olarak hizmet etmiştir in vitro15,29. Bu yönleri araştırmak için bir yaklaşım, belirli genleri aşırı eksprese etmek veya yıkmak için NSC'leri transfekte etmeyi içerir. Bu, viral ve viral olmayan yöntemler dahil olmak üzere çeşitli tekniklerle gerçekleştirilebilir. Viral vektörler genellikle yüksek gen transfer verimliliği elde ederken, yüksek güvenlik gereksinimleri ve zaman alıcı vektör üretimi gibi önemli sınırlamaları vardır26. Tersine, lipofeksiyon ve elektroporasyon gibi klasik transfeksiyon yöntemleri çok düşük transfeksiyon oranlarına ulaşır ve bu da onları transfekte edilmesi zor hücreler için olanaksız hale getirir. Nükleofeksiyon teknolojisi, hücre tipine özgü nükleofeksiyon solüsyonlarını her hücre tipi için benzersiz elektriksel parametrelerle birleştirerek kullanıcı dostu bir yaklaşım sunar37,38. Bu, DNA'nın doğrudan hücre çekirdeğine39 aktarılmasını sağlar ve DNA'nın hücre döngüsünden bağımsız bir şekilde dahil edilmesine izin verir. Sonuç olarak, nükleofeksiyon, fare NSC'leri28,40 gibi transfekte edilmesi zor hücrelerin transfekte edilmesi için uygun bir teknik olarak ortaya çıkmaktadır.

Bu yöntemin bir sınırlaması, her nükleofeksiyon için en az 2 x 106 hücrenin önerilmesi ve gerekli olmasıdır, ancak optimal koşullarda, tek nükleofeksiyon başına daha az sayıda hücre kullanılabilir (yani, 5 × 105 hücre). Yöntemin bir başka dezavantajı, nükleofeksiyon için kullanılan DNA'nın kalitesi ve konsantrasyonunun gen transfer verimliliğini önemli ölçüde etkilemesidir. Endotoksin varlığına bağlı yüksek hücre mortalitesini önlemek için endotoksin içermeyen hazırlanmış DNA'nın kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Ek olarak, nükleofeksiyon için 6 μg'dan fazla toplam DNA kullanmak, hem gen transfer verimliliğini hem de hücre canlılığını önemli ölçüde azaltabilir. Son olarak, elektrik darbesi uygulaması, nükleofecte edilmiş hücrelerin hayatta kalması için de kritik öneme sahiptir.

Bu çalışmada, epizomal plazmitler kullanılarak ekspresyonunun aşağı regülasyonunu içeren bir strateji kullanarak Snrpn gen ekspresyonunun manipülasyonunu örnekledik. Bu plazmitler hücrelerin genomuna entegre değildir ve NSC'ler in vitro olarak çoğalmaya devam ettikçe, sokulan DNA daha sonra hücre bölünmesi boyunca seyreltilecek ve böylece genetik manipülasyonun etkisini kaybedecektir. Bu nedenle, bu strateji, kısa bir süre içinde akut bir değişikliğin etkisini incelemek veya in vitro olarak hücrelerin doğum tarihini incelemek için değerlidir. Gen pertürbasyonunun daha uzun süreli bir etkisini değerlendirmek için bazı alternatifler mevcuttur. Örneğin, transpozon tabanlı piggyBAC gibi bütünleştirici bir sistem kullanılabilir. Bu sistem, transpoze edilebilir dizilerle çevrili plazmitte bulunan istenen kodlama dizisinin tanıtılmasından ve hücrelerin, transpozaz41 enzimi için diziyi içeren bir plazmit ile birlikte nükleofect edilmesinden oluşur. Alternatif olarak, transpozonlar veya CRISPR / Cas sistemleri kullanılabilir.

Transfekte edici teknolojilerin daha da geliştirilmesi, farklı genlerin yetişkin nöral kök hücre fizyolojisi üzerindeki rolünü değerlendirmek için yüksek verimli tahlillere doğru önemli bir adım olacaktır. Giderek daha karmaşık saflaştırma ve genişletme yöntemleriyle birlikte, bu çalışmalar yetişkin NSC'lerin in vitro biyolojisinin anlaşılmasını ve yüzen nörosferler ile NSC'ler arasındaki biyolojik farklılıkların in vivo olarak karşılaştırılmasını sağlayacaktır.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ministerio de Ciencia e Innovación ve Agencia Estatal de Investigación (MCIN/AEI) (PID2019-110045GB-I00; PID2022-142734OB-I00 ve EUR2023-143479) SRF'ye. EJV (FPU20/00795) ve DSL (FPU22/03797), İspanyol Formación de Profesorado Universitario burs programı (FPU) tarafından finanse edilmektedir. LLC (PRE2020-094137) ve JDM (PREP2022-000680), İspanyol Formación de Personal Investigador (FPI) burs programı tarafından finanse edilmektedir. CMM (CIACIF/2022/366), Generalitat Valenciana tarafından finanse edilmektedir. MIL (CPI-22-481), Programa INVESTIGO bursu (Yeni Nesil AB) tarafından finanse edilmektedir. Ministerio de Ciencia e Innovación tarafından sağlanan Açık Erişim finansmanı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 μ m gözenekli filtre şişeleri (250 mL)VWR514-0330P
0.22 &; m gözenekli filtre şişeleri (500 mL)VWR514-0332P
12 oyuklu plakalıLabClinicsPLC30012
15 mL tüpFisher10738771
24 oyuklu plakalıLabClinicsPLC30024
4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)BioWestL0180-100
4′,6- diamidino-2-fenilindol (DAPI)SigmaD9542
48 oyuklu plakaThermoFisher150687
6 oyuklu plakaLabClinicsPLC30006
96 oyuklu plakaLabclinicsPLC30096
Accutase solüsyonuSigmaA6964-100MLEnzimatik çözelti olarak adlandırılır
Amaxa Fare Nöral Kök Hücre Nükleofektörü KitLonzaVPG-1004
Amaxa Nükleofektör IibLonza10700807
Antibiyotik/Antimitotik (A/A)SigmaA5955
Apo-t-TransferrinSigmaT2252-1G
Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF)SigmaF0291
BlasticidinSigma203350
Sığır Serum Albümini (BSA)SigmaB4287-25MG
Hücre süzgeci 40 & mu; mLabClinicsPLC93040
Deoksinükleotid trifosfat (dNTP'ler)NZYTechMB08701
Dimetil sülfoksit (DMSO)SigmaD8418
Dulbecco' s Fosfat Tuzlu Tampon (DPBS)Gibco14080-055
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) F12 1: 1Gibco11320-074
E. coli DH5 ve alfa; Yetkili HücrelerThermoFisherEC0112
Earles'ın Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS)Gibco24010-043
Epidermal Büyüme Faktörü - İnsan rekombinant (EGF)Gibco53003-018
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)SigmaE-6511
İnce ForsepsGüzel Bilim Araçları11274-20
İnce Makas KeskinGüzel Bilim Araçları14060-09
GlikozSigmaG-7021
GoTaq G2 Flexi DNA PolimerazPromegaM7805Kit, PCR
HeparinSigmaH-3149
InsulineSigmaI6634
LB agar (Lennox)LabKemAGLB-00P-500
LB et suyu (Lennox)LabKemLBBR-00P-500
L-SisteinSigmaC-8277
L-GlutaminGibco25030-024
Neubauer odasıBlaubrandBR718620
Nükleaz içermeyen suLabboxWATR-00A-10K
NZYMaxiprep Endotoksin İçermeyen KitNZYTechMB39901
Papain LiyofilizeWorthingtonLS003119
ProgesteronSigmaP-6149
PutrescineSigmaP-7505
NeşterGüzel Bilim Araçları10316-14
shSCRAMBLEMisyonu (Sigma)SHC003
shSNRPNMisyonu (Sigma)TRCN0000109285
Sodyum SelenitSigmaS-9133
SpatulaGüzel Bilim Araçları10090-17
Steril PES Şırınga Filtreleri (0.22 & mu; m gözenek filtresi)EpicaSFPE-22E-050
T12,5 cm2 FlaskBiofilTCF012025
T25 cm2 FlaskLabClinicsPLC70025
T75 cm2 FlaskLabClinicsPLC70075
CımbızGüzel Bilim Araçları91150-20
için reaktifler içerir

Kaynaklar

  1. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
  2. Ming, G., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Ann Rev Neurosci. 28 (1), 223-250 (2005).
  3. Doetsch, F., Caillé, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
  4. Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
  5. Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proc Natl Acad Sci. 96 (20), 11619-11624 (1999).
  6. Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. J Neurosci. 17 (13), 5046-5061 (1997).
  7. Mamber, C., Kozareva, D. A., Kamphuis, W., Hol, E. M. Shades of gray: The delineation of marker expression within the adult rodent subventricular zone. Prog Neurobiol. 111, 1-16 (2013).
  8. Cebrian-Silla, A., et al. Single-cell analysis of the ventricular-subventricular zone reveals signatures of dorsal and ventral adult neurogenesis. eLife. 10, e67436(2021).
  9. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), New York, N.Y. 1707-1710 (1992).
  10. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393(2010).
  11. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
  12. Ferrón, S. R., et al. Postnatal loss of Dlk1 imprinting in stem cells and niche astrocytes regulates neurogenesis. Nature. 475 (7356), 381-385 (2011).
  13. Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: A review of the neurosphere assay. Anat Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
  14. Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), 156059(2019).
  15. Ferrón, S. R., et al. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Prot. 2 (4), 849-859 (2007).
  16. Ferron, S., et al. Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells. Development. 131 (16), 4059-4070 (2004).
  17. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Meth. 3 (10), 801-806 (2006).
  18. Santa-Olalla, J., Baizabal, J., Fregoso, M., Cárdenas, M. D. C., Covarrubias, L. The in vivo positional identity gene expression code is not preserved in neural stem cells grown in culture. Eur J Neurosci. 18 (5), 1073-1084 (2003).
  19. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: A critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
  20. Wan, F., et al. The utility and limitations of neurosphere assay, CD133 immunophenotyping and side population assay in Glioma stem cell research. Brain Pathol. 20 (5), 877-889 (2010).
  21. Deleyrolle, L. P., Rietze, R. L., Reynolds, B. A. The neurosphere assay, a method under scrutiny. Acta Neuropsych. 20 (1), 2-8 (2008).
  22. Campos, L. S. Neurospheres: Insights into neural stem cell biology. Neurosci Res. 78 (6), 761-769 (2004).
  23. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres—re-evaluating the relationship. Nat Meth. 2 (5), 333-336 (2005).
  24. Parker, M. A. Expression profile of an operationally-defined neural stem cell clone. Exp Neurol. 194 (2), 320-332 (2005).
  25. Belenguer, G., et al. Adult neural stem cells are alerted by systemic inflammation through TNF-α receptor signaling. Cell Stem Cell. 28 (2), 285-299 (2021).
  26. Cruz, M. T. G., Simões, S., Lima, M. C. P. de Improving lipoplex-mediated gene transfer into C6 glioma cells and primary neurons. Exp Neurol. 187 (1), 65-75 (2004).
  27. Hagemann, C., et al. High efficiency transfection of glioma cell lines and primary cells for overexpression and RNAi experiments. J Neurosci Meth. 156 (12), 194-202 (2006).
  28. Moritz, S., Lehmann, S., Faissner, A., Holst, A. von An induction gene trap screen in neural stem cells reveals an instructive function of the niche and identifies the splicing regulator Sam68 as a Tenascin-C-regulated target gene. Stem Cells. 26 (9), 2321-2331 (2008).
  29. Montalbán-Loro, R., et al. TET3 prevents terminal differentiation of adult NSCs by a non-catalytic action at Snrpn. Nat Comm. 10 (1), 1726(2019).
  30. Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. J Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).
  31. Nieto-Estévez, V., Pignatelli, J., Araúzo-Bravo, M. J., Hurtado-Chong, A., Vicario-Abejón, C. A global transcriptome analysis reveals molecular hallmarks of neural stem cell death, survival, and differentiation in response to partial FGF-2 and EGF deprivation. PLoS One. 8 (1), 53594(2013).
  32. Vergaño-Vera, E., Méndez-Gómez, H. R., Hurtado-Chong, A., Cigudosa, J. C., Vicario-Abejón, C. Fibroblast growth factor-2 increases the expression of neurogenic genes and promotes the migration and differentiation of neurons derived from transplanted neural stem/progenitor cells. Neuroscience. 162 (1), 39-54 (2009).
  33. Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40 (3), 485-499 (2003).
  34. Hack, M. A., Sugimori, M., Lundberg, C., Nakafuku, M., Götz, M. Regionalization and fate specification in neurospheres: the role of Olig2 and Pax6. Mol Cell Neurosci. 25 (4), 664-678 (2004).
  35. Bithell, A., Finch, S. E., Hornby, M. F., Williams, B. P. Fibroblast growth factor 2 maintains the neurogenic capacity of embryonic neural progenitor cells in vitro but changes their neuronal subtype specification. Stem Cells. 26 (6), 1565-1574 (2008).
  36. Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci. 106 (15), 6387-6392 (2009).
  37. Kobayashi, N., et al. Gene delivery to embryonic stem cells. Birth Def Res C. 75 (1), 10-18 (2005).
  38. Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Meth Mol Biol. 801, 65-74 (2011).
  39. Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J Immunol Meth. 284 (1-2), 133-140 (2004).
  40. von Holst, A., Egbers, U., Prochiantz, A., Faissner, A. Neural stem/progenitor cells express 20 tenascin C isoforms that are differentially regulated by Pax6. J Biol Chem. 282 (12), 9172-9181 (2007).
  41. Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trend Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Nörosfer KültürüErişkin Fare BeyniHücre NukleofeksiyonuGen İfade PertürbasyonuHücre İzolasyonuHücre EkspansiyonuPlazmit TransfeksiyonuElektroporasyon Tekniği
Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.