Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası

1.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66657

⸱

26 Nisan 2024

 ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, National Institute of Science Education and Research, 2Homi Bhabha National Institutes

Bu makalede

Özet

Fisyon mayası burada, polimerizasyonlarını görselleştirmek için GFP ile translasyonel füzyon proteinleri olarak FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese etmek için heterolog bir konakçı olarak kullanılır. Ayrıca, polimerizasyonu etkileyen bileşikler, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme ile tanımlanır.

Özet

FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinleri, hücre bölünmesi ve hücre şeklinin korunması gibi temel işlevleri yerine getirir. Ayrıca, FtsZ ve MreB, yeni antimikrobiyal keşifler için önemli hedefler olarak ortaya çıkmıştır. Bu hücre iskeleti proteinlerinin nükleotid bağlanmasını ve polimerizasyonunu hedefleyen bileşikleri tanımlamak için, esas olarak FtsZ'ye odaklanan çeşitli testler geliştirilmiştir. Dahası, tahlillerin çoğu ya zahmetli ya da maliyet yoğundur ve bu proteinlerin ilacın hücresel hedefi olup olmadığını belirlemek genellikle birden fazla yöntem gerektirir. Son olarak, ilaçların ökaryotik hücrelere toksisitesi de bir sorun teşkil etmektedir. Burada, bakteri hücre iskeletini hedef alan yeni molekülleri keşfetmek ve ökaryotik hücreler için potansiyel olarak toksik olabilecek isabetleri en aza indirmek için tek adımlı hücre bazlı bir tahlili açıklıyoruz. Fisyon mayası, mikroskopiye dayalı yüksek verimli ekranlara uygundur ve görsel bir ekran, FtsZ veya MreB'nin polimerizasyonunu değiştiren herhangi bir molekülü kolayca tanımlayabilir. Testimiz standart 96 oyuklu plakayı kullanır ve bakteriyel hücre iskeleti proteinlerinin fisyon mayası gibi ökaryotik bir hücrede polimerize olma yeteneğine dayanır. Burada tarif edilen protokoller fisyon mayası için olsa da ve Staphylococcus aureus'tan FtsZ ve Escherichia coli'den MreB'yi kullanırken, herhangi bir ökaryotik ekspresyon konakçısında polimerlere kolayca birleşen diğer bakteriyel hücre iskeleti proteinlerine kolayca uyarlanabilirler. Burada açıklanan yöntem, bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan yeni antimikrobiyallerin daha fazla keşfedilmesini kolaylaştırmaya yardımcı olacaktır.

Giriş

Bakteriyel enfeksiyonlarla mücadele etmek için şu anda kullanılan hemen hemen tüm antibiyotiklere karşı yaygın direnç, yeni antibiyotik kategorileri için acil bir gereklilik yaratmıştır. 2019 tarihli bir rapor, antibiyotiğe dirençli enfeksiyonların 1,27 milyon can kaybına yol açtığını ve dirençli bakteriyel enfeksiyonlardan kaynaklanan komplikasyonlar göz önüne alındığında toplam 4,95 milyon ölüme katkıda bulunduğunu belirtti1. Klinik uygulamada hala etkili olsa da, mevcut antibiyotik cephaneliği ağırlıklı olarak hücre duvarı, DNA ve protein sentezine odaklanan dar bir hücresel süreç spektrumunu hedeflemektedir. Son yarım yüzyıl boyunca, 30'dan az protein, yeni anti-bakteriyellerin geliştirilmesi için hedef olarak ticari olarak kullanılmıştır 2,3. Bu sınırlı uygulanabilir hedef yelpazesi, antibiyotiğe dirençli bakterilerle mücadele için yeni antibiyotiklerin veya türevlerinin keşfedilmesinde önemli ölçüde kısıtlamalar yaratır. Bu nedenle, ortaya çıkan antibiyotik direnci sorununun üstesinden gelmek için, yeni hedefleri ve etki mekanizmaları olan yeni antibiyotiklerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır.

Bir antibakteriyel hedef ideal olarak bakteriyel hücre büyümesinin önemli bir bileşeni olmalı, filogenetik olarak çeşitli türler boyunca korunmalı, en az ökaryotik homoloji göstermeli ve antibiyotikler için erişilebilir olmalıdır4. Hücre bölünmesi ve hücre şeklinin korunmasında rol oynayan bakteriyel hücre iskeleti proteinlerinin keşfinden bu yana, antibakteriyel bileşiklerin geliştirilmesi için umut verici bir odak noktası olarak ortaya çıkmıştır5. Bu proteinler bakteri canlılığı için gereklidir ve ökaryotik hücrelerdeki hücre iskeletine benzer şekilde hücre şeklinin (MreB, CreS), bölünmenin (FtsZ, FtsA) ve DNA ayrışmasının (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA) korunmasında çok önemli bir rol oynar. Özellikle, FtsZ, çok çeşitli prokaryotik organizmalarda oldukça yüksek bir koruma seviyesi sergilerken, MreB neredeyse tüm çubuk şeklindeki bakterilerde bulunur. Hücre canlılığındaki bu kadar geniş dağılım ve alaka düzeyi, bu proteinleri antibiyotik araştırmalarında büyüleyici bir hedef haline getirmektedir 5,6,7.

Potansiyel bir inhibitörün7 birincil hedefi olarak bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini kapsamlı bir şekilde doğrulamak için in vivo gözlemleri, in vitro etkileşimleri ve enzimatik deneyleri birleştiren çok yönlü bir yaklaşım benimsemek çok önemlidir. Zahmetli prosedürler veya önemli maliyet etkileri, bu amaç için mevcut birçok tahlili zorunlu kılar. Bunlar, bakteri hücre iskeletini etkileyebilecek kurşun bileşiklerinin taranmasında yaygın olarak kullanılmalarının önündeki dikkate değer engellerdir. Bunlar arasında mikroskopi, hücre morfolojisindeki değişiklikleri doğrudan inceleyerek bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için son derece verimli ve hızlı bir yöntem olarak öne çıkıyor. Yine de, hedef proteinin diğer hücre iskeleti kompleksleri ile hetero-ilişkisi, hedef dışı bağlanma ve zar potansiyelindeki değişikliklerden kaynaklanan dolaylı etkiler, hücreye verimli bir şekilde nüfuz etmedeki zorluk ve özellikle Gram-negatif bakterilerde akış pompalarının varlığı, bakteriyel hücre deformasyonunun kesin nedenini belirlemek için toplu olarak karmaşık hale getirir 8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe veya yaygın olarak bilinen adıyla fisyon mayası, çubuk şeklinde tek hücreli ökaryotik bir organizmadır. Fisyon mayası, hücre döngüsü ve bölünmesi, hücresel organizasyon ve insanlar da dahil olmak üzere daha yüksek ökaryotlarla kromozom replikasyonu gibi hücresel süreçlerdeki olağanüstü koruma nedeniyle hücresel ve moleküler biyolojide model organizma olarak yaygın olarak kullanılmaktadır11,12. Ayrıca, Errington ve meslektaşları, DivIVA'nın negatif kavisli yüzeylerde biriktiğini göstermek için fisyon mayasında kutup lokalize bir bakteriyel hücre iskeleti proteini DivIVA'yı ifade ettiler13. Yine Balasubramanian ve grubu, MreB14 ve tubulin homologu FtsZ15 gibi E. coli aktin hücre iskeleti proteininin mekanizması, montajı ve dinamiği hakkında yeni bilgiler getirmek için hücresel bir model sistem olarak fisyon mayasını ilk kez kurmuştu. Ayrıca, A22'nin, maya14'te eksprese edildiğinde epifloresan mikroskobu yoluyla MreB'nin polimerizasyonunu verimli bir şekilde engelleme yeteneğini de gösterirler. Bunu takiben, diğer gruplar da kloroplast FtsZ1 ve FtsZ2 proteinlerinin16 montaj özelliklerini incelemek için fisyon mayasını başarıyla kullandılar. Daha yakın zamanlarda, bilinen üç FtsZ inhibitörünün-sanguinarin, berberin ve PC190723 FtsZ proteinlerinin etkisinin kapsamlı bir değerlendirmesini yaparak, bakteriyel hücre iskeleti inhibitörlerini spesifik olarak taramak için hücresel bir platform olarak fisyon mayasının kullanımının uygulanabilirliğine dair bir kavram kanıtı oluşturduk . Ek olarak, bu tek adımlı hücre bazlı tahlil, ökaryotik hücreler için potansiyel olarak toksik olabilecek bileşikleri tanımlama riskini en aza indirmede etkili olduğunu kanıtlamaktadır.

Bu raporda, fisyon mayası sistemini kullanarak, Staphylococcus aureus'tan FtsZ'yi ve Escherichia coli'den MreB'yi hedefleyen küçük molekül inhibitörlerinin etkisinin yarı otomatik taraması ve nicelleştirilmesi için standart 96 oyuklu plakayı kullanarak sistematik bir iş akışı öneriyoruz. Burada, özellikle FtsZ ve MreB'yi hedefleyen yerleşik inhibitörler PC190723 ve A22'yi kullanarak yarı otomatik iş akışını kuruyor ve optimize ediyoruz. Bu iş akışı, mevcut standardizasyonu iyileştirmek için motorlu yüksek hassasiyetli bir aşama ve standart 96 oyuklu bir plakada otomatik görüntü toplama ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu kullanır. Bu nedenle, sentetik kimyasal kütüphanelerin orta ve yüksek verimli ekranlarına uygulanabilir ve yukarıda listelenen zorlukların bazılarını aşar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. S. pombe'de GFP etiketli bakteriyel hücre iskeleti proteinlerinin ekspresyonu

NOT: Burada kullanılan tüm plazmitler ve suşlar hakkında bilgi için lütfen Tablo 1'e bakın. Tüm medya kompozisyonları için lütfen Tablo 2'ye bakın.

  1. E. coli MreB'nin bir N-terminal GFP füzyonu (GFP-MreB) ile klonlamasını ve S. aureus FtsZ'nin bir C-terminal GFP'yi (SaFtsZ-GFP) S. pombe ekspresyon vektörüne, pREP42'ye orta kuvvette tiamin ile bastırılabilir bir promotör ile klonlamasını gerçekleştirin, nmt4118,19 daha önce tarif edildiği gibi14,15. Plazmitleri 20,21'de tarif edildiği gibi E. coli suşlarından (DH10β) koruyun, amplifiye edin ve izole edin.
    NOT: DH5α, XL1Blue, TOP10 vb. gibi diğer E. coli suşları veya moleküler klonlama için rutin olarak kullanılan ticari olarak temin edilebilen diğer yetkin hücreler de kullanılabilir.
  2. Plazmitler pREP42-GFP-EcMreB ve pREP42-SaFtsZ-GFP'nin S. pombe'ye dönüşümü
    1. PCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) ve pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) plazmitlerini S. pombe suşuna (h-leu1-32 ura4-D18) lityum asetat yöntemini22 kullanarak dönüştürün, aşağıdaki adımlarda belirtildiği gibi.
    2. 1. Gün - Birincil kültür: 3 mL otoklavlanmış maya özü ve takviyeleri (YES) et suyunda bir döngü dolusu taze çizgili S. pombe kültürünü aşılayın. Gece boyunca 30 °C'de (O/N) bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin.
    3. 2. Gün:
      1. İkincil kültür: 30 mL otoklavlanmış YES suyuna yaklaşık 500 μL birincil kültür ekleyin. 30 ° C'de 3 - 4 saat boyunca OD600 0,4 - 0,6'ya ulaşana kadar çalkalayarak inkübe edin.
        NOT: Her dönüşüm için 30 mL kullanılır.
      2. 30 mL kültürü oda sıcaklığında 6-8 dakika boyunca 2.500 x g'da peletleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 50 mL steril damıtılmış su (D / W) ile yıkayın. Tekrar pelet yapın ve süpernatanı atın. Hücreleri 1 mL steril D / W içinde yeniden süspanse edin ve 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Yukarıdaki gibi santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
      3. 1 mL 0.1 M lityum asetat, Tris-EDTA (LiAc-TE) çözeltisi ekleyin ve yukarıdaki gibi santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve 1 mL 0.1 M LiAc-TE içinde yeniden süspanse edin. Süpernatanı santrifüjleyin ve atın, geride 100 μL çözelti bırakın.
      4. 10 - 20 μg taşıyıcı DNA (Somon sperm DNA'sı; denatüre ve buz üzerinde flaş soğutmalı) ve dönüştürülmesi gereken 2 - 3 μg plazmit DNA'sı ekleyin. Yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
      5. 260 μL %40 PEG/LiAc-TE ekleyin; Yavaşça karıştırın. Hafifçe karıştırarak çalkalayıcıda veya bir termomikserde 30 ° C'de 60 dakika inkübe edin. 43 μL DMSO ekleyin; Yavaşça karıştırın.
      6. Termomikserde 10 dakika boyunca 42 °C'de ısı şoku. 6-8 dakika boyunca 2.500 x g'da pelet ve süpernatanı atın. Peleti 1x 1 mL steril D/W ile yıkayın.
      7. Pelet, süpernatanı atın ve peleti 200 μL steril D / W. 5 μg / mL tiamin ( nmt41 promotörünü baskılamak için) ve amino asit takviyeleri adenin (0.225 mg / mL), histidin (0.225 mg / mL) ve lösin (0.225 mg / mL) içeren Edinburgh minimal orta (EMM) plakalarında 100 μL plaka, ancak urasil (pREP42 plazmidi için seçim işaretçisi) içermez.
        NOT: Alternatif olarak, 70 μL ve 130 μL'yi iki farklı plakada plakalayın. İki farklı hacim (70 μL ve 130 μL), deneyden deneye değişebilen dönüşüm verimlerine bağlı olarak plakalardan en az biri üzerinde izole koloniler elde etmek için kaplanır.
      8. Plakaları 30 ° C'de koloniler görünene kadar 2-3 gün inkübe edin. Tek bir koloniyi 100 μL steril D / W ile karıştırın ve yukarıda tarif edildiği gibi tiamin içeren ancak urasil içermeyen taze bir EMM plakasına yayın.
      9. Tam bir çim görünene kadar 30 ° C'de 2-3 gün inkübe edin. Büyüyen hücre çimlerini bir aşılama halkası kullanarak kazıyın ve bir kriyo-şişede% 30 gliserol içeren 1 mL YES ortamına yeniden süspanse edin.
      10. Kriyo-şişeyi sıvı nitrojen içinde dondurun ve donmuş maya stoklarını korumak için -80 ° C'de saklayın.
  3. Fisyon mayasında bakteriyel hücre iskeleti proteinlerinin ekspresyonu
    1. Daha fazla deney için yeterli kültür elde etmek için gliserol stoğundan taze mayaya özgü bir plaka üzerine aseptik olarak bir yama çizin.
      NOT: pREP42 durumunda, adenin, histidin ve lösin içeren bir EMM agar plakası (minimal ortam) kullandık ( S. pombe suşu (h-leu1-32 ura4-D18)) urasil olmadan (urasil pREP42'de bir seçim belirteci olarak bulunur). Plaka üzerinde büyürken ilgilenilen genin ekspresyonunu baskılamak için agar plakalarına (pREP42 tiamin bastırılabilir nmt41 promotörüne sahip olduğundan) 15 - 20 μM tiamin ekleriz.
    2. Çizgili yamadan küçük bir halka dolusu aşılamayı tiamin içermeyen 5 mL mayaya özgü EMM ortamına aşılayın ve 30 ° C'de 10-12 saat inkübe edin.
      NOT: S. pombe'deki nmt41 promotörü altındaki farklı türlerden FtsZ ve MreB'nin ekspresyonu, tipik olarak 16 ila 30 saat arasında değişebilir. S. pombe'de GFP-EcMreB ve SaFtsZ-GFP'nin protein ekspresyonu için en uygun zaman, tiamin olmadan 30 ° C'de sırasıyla 20 - 24 saat ve 16 - 20 saattir.

2. GFP etiketli bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese eden S. pombe kültürlerinin tedavisi

NOT: Bir dizi farklı ilaç molekülü, 96 oyuklu bir plakada gece boyunca yetiştirilen maya kültürü üzerinde test edilir.

  1. Yarı otomatik, 96 kuyulu çok kanallı pipetleme cihazını kullanarak 150 μL taze maya EMM ortamı içeren 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 μL gece boyunca kültür aktararak taze bir kültürü aşılayın.
  2. Yarı otomatik, 96 oyuklu çok kanallı bir pipet kullanarak uygun karıştırma için içeri ve dışarı pipetleme yaparken, her biri Şekil 1'deki şemada gösterildiği gibi üç nüsha halinde yapılan farklı artan konsantrasyonlarda ilaçları büyüyen kültüre yavaşça ekleyin.
  3. Pozitif bir kontrol olarak, (S. aureus FtsZ) ve A22 ( E. coli MreB için) için PC190723 bilinen ilaçları iki kez kullanın.
    NOT: Daha önce bildirildiği gibi, PC190723 ve A22 sırasıyla 56.2 μM17 ve 72.6 μM 14,17 konsantrasyonda kullanılmıştır. Bu arada, SaFtsZ'nin A22 tedavisi ve EcMreB'nin PC190723 tedavisi sırasıyla negatif kontroller olarak görev yaptı.
  4. DMSO'yu en düşük ve en yüksek ilaç konsantrasyonlarına göre üç farklı konsantrasyonda çözücü kontrolü olarak kullanın.
    NOT: İlaçların çözündürüldüğü çözücü, çözücü kontrolü olarak kullanılır.
  5. Kontrol ve muamele edilmiş kültürleri 30 ° C'de 6-10 saat inkübe edin (hücreler bakteriyel floresan proteinlerinin ekspresyonunu gösterene kadar) ve ardından epifloresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin.

3. Polimerlerin görselleştirilmesi

  1. Optik olarak şeffaf alt 96 oyuklu plakanın (floresan görüntüleme için siyah duvarlı) her bir oyuğuna 20 μL 1 mg / mL concanavalin A kaplaması uygulayın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Sıvıyı aspire edin ve 10 dakika kurumaya bırakın.
  2. Kültür plakasından 20 μL hücreyi her bir kuyucuğa aktarın ve 10 dakika bekletin. Hücreyi steril EMM ortamı ile 3x-4x yıkayın.
  3. Kullanılacak objektif lens yerindeyken (bkz. adım 3.6), 96 oyuklu plaka hizalaması ve kuyu kapsama alanı için görüntü elde etme yazılımının alım panelindeki gezgin modunu kullanın. Navigatörün iyi kenarlarını hizalayın.
  4. Ardından, kuyudaki ilgili bölgenin çok konumlu seçimini içeren kuyu kapsama parametrelerini seçin ve görüntüleme sırasında numuneyi odakta tutmak için isteğe bağlı modla uyarlanabilir otomatik odaklama kontrolünü kullanın.
  5. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ve floresan kullanarak görüntüler elde edin. Mayada eksprese edilen GFP etiketli bakteri proteinlerini görüntülemek için sırasıyla 475/28 nm ve 525/48 nm'lik uyarma ve emisyon filtrelerini ayarlayın. Maya hücrelerinin kalınlığı (5 μm) boyunca 0.2 μm'lik bir adım boyutunda Z-yığınları elde edin.
  6. 100x, 1.4-NA yağa daldırma objektifi ve 2.000 x 2.000 sCMOS kamera (6,5 μm x 6,5 μm piksel boyutu) ile donatılmış ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobu kullanarak görüntü yakalayın. Floroforun uyarılması için bir LED aydınlatma sistemi kullanın.
    NOT: Hassas çok noktalı konumlandırmaya sahip 96 oyuklu bir plaka için motorlu bir aşamaya sahip herhangi bir epifloresan mikroskop sistemi uygun olmalıdır. Deney değişkenlerini en aza indirmek ve tutarlılığı korumak için 1 x 1'lik bir gruplamada benzer bir maruz kalma süresinde (genellikle 0,3 - 0,5 s aralığında) ve %15 - 20'lik bir aydınlatmada kontrol ve ilaçla tedavi edilen tüm hücre görüntülerini elde edin.

4. ImageJ kullanılarak görüntülerin nicelleştirilmesi

  1. Hücre görüntülerini işleyin ve FtsZ17 için hücre başına nokta sayısını ve yoğunluğu ölçün. MreB durumunda, yoğunluğu ve anizotropiyi23 ölçün ve Fiji (v2.0.0-rc-69 / 1.52p)24 kullanarak kontrol ve tedavi edilen hücreler arasında karşılaştırın.
  2. DIC kanalındaki görüntüleri kullanarak, önce serbest çizim aracını kullanarak tek tek maya hücrelerini ana hatlarıyla belirtin ve ROI yöneticisinde bir ilgi alanı (ROI) olarak kaydedin. Bu adım henüz otomatikleştirilmemiştir, ancak makine öğrenimi25,26 kullanılarak yakın zamanda geliştirilen araçlar yakın gelecekte denenebilir ve dahil edilebilir.
  3. Hücrenin dış alanını maskeleyin ve27'de anlatıldığı gibi siyah doldurun.
  4. Nokta sayısını 24 saymak için Fiji'de yerleşik bir özellik olan OPS eşiği IJ1 analiz makrosunu kullanın.
  5. Otomatik eşikleme için otsu yöntemini kullanın ve segmentlere ayrılmış parçacıkları maskeleyin. Eklentiyi çalıştırın ve bir makro kullanarak parçacıkları analiz edin.
  6. Polimer yoğunluğunu (bir hücredeki birim alan başına düşen hücre iskeleti miktarı) ölçmek için, maskeleme ve iskeletleştirme adımları27,28 dahil olmak üzere görüntüleri açıklandığı gibi işleyin. Görüntüleri iskeletleştirmek için lpx eklentisinde Lpx 2Dfilter kullanın.
  7. Ayrıntılar için, bu son yayınabakın 17. Daha önce 23'te belirtildiği gibi EcMreB polimer miktar tayini gerçekleştirin, daha önce 23'te açıklandığı gibi FibrilTool29 kullanarak uzamsal organizasyonu ölçmek için anizotropi kullanın.
    NOT: Bu analiz yöntemleri, ilaçlar tarafından tedavi edilen veya tedavi edilmeyen diğer bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini ölçmek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İlaçların taranması için 96 oyuklu plakanın kurulması
Orta kuvvetli tiamin bastırılabilir promotör nmt41içeren bir vektörden (pREP42) S. aureus FtsZ etiketli bir C-terminal GFP'yi ifade etmek için S. pombe'nin kullanımı daha önce kurulmuştur17 ve benzer şekilde, N-terminal GFP ile etiketlenmiş E. coli MreB de S. pombe14'te ifade edilmiştir. Ayrıca, SaFtsZ'nin spesifik bir inhibitörü olan PC190723 ve bir MreB i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Antimikrobiyal direnç (AMR) ciddi bir küresel sağlık tehdididir ve yeni hedefleri olan yeni antibiyotiklere acil ihtiyaç vardır. Bakteri hücre iskeleti, halihazırda Faz-I klinik çalışmalarda30 olan TXA709 gibi hücre bölünmesi proteini FtsZ'nin küçük moleküllü inhibitörleri ile yeni antibiyotikler geliştirmek için çekici bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. FtsZ polimerizasyonunun inhibitörlerini tanımlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir 7,31

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmez.

Teşekkürler

SMP, SR ve AKS, Ulusal Bilim Eğitimi ve Araştırma Enstitüsü, Atom Enerjisi Bölümü'nden alınan bursları kabul eder. RS, Atom Enerjisi Bölümü'nden okul içi finansman desteğini kabul eder ve bu çalışma, Biyoteknoloji Bölümü'nden (DBT) RS'ye (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) bir araştırma hibesi yoluyla desteklenir. Yazarlar ayrıca protokolün geliştirilmesi boyunca yorumları, önerileri ve tartışmaları için V Badireenath Konkimalla'ya teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 Kuyulu CC2 Optik CVG Steril, Kapaklı. SiyahTermo Bilim ve Ticaret;
96 oyuklu plakaCorning  
A22 HidroklorürSigma SML0471225
DOC0229AdeninFormediumTMçözülür 
Concanavalin A Sigma C5275-5MG
DMSOSigma 
Edinburg minimal medium (EMM Agar veya EMM Broth)FormediumTMPMD0210Kompozisyon için aşağıya bakınız
EDTA Sigma EDS-500G
epMotion® 96, 2 konumlu kaydırıcıEppendorf5069000101
HistidineFormediumTMDOC0144225 mg/L ortam 
Leica DMi8 ters floresan mikroskobuLeica MicrosystemsAlman şirketi
LeucineFormediumTMDOC0157225 mg/L besiyeri 
Lityum asetat ve nbsp;Sigma 517992-100G
PC190723Merck 344580DMSO
Polietilen glikol (PEG) 
TiaminSigmaT4625Filtre sterilize edilmiş
Tris-HidroklorürMP194855
UrasilFormediumTMDOC0214225 mg / L ortam, Çözeltiyi 36 ° C'de saklayın; C
YES (Maya özü + takviyeleri) AgarFormediumTMPCM0410Bileşim için aşağıya bakın
YES (Maya özü + takviyeleri) BrothFormediumTMPCM0310Bileşim için aşağıya bakın
Maya (S. pombe) media  < / güçlü >
< >< güçlü > Maya özü + takviyeleri (EVET) < / güçlü >< / em >
< güçlü > Kompozisyon< / güçlü >< güçlü >g / L < / güçlü >
Maya özü5
Dekstroz30
Agar17
Adenin0.05
L-Histidin0.05
L-Lösin0.05
L-Lizin HCl0.05
Urasil0.05
< güçlü > Edinburg minimal orta (EMM) < / güçlü >< / em >
< güçlü> Bileşim< / güçlü >< güçlü > g / L < / güçlü >< güçlü > konsantrasyon< / güçlü >
potasyum hidrojen ftalat ve nbsp;314.7mM
Na2HPO4 2.215.5 mM
NH4Cl 593.5 mM
glikoz%2 (a/h) veya 20 g/L  111 mM
Tuzlar (stok x 50)20 mL/L (h/v)
Vitaminler (stok x 1000)1 mL/L (h/v)
Mineraller (Stok x 10.000)0.1 mL/L (h/h)
Tuzlar x 50  52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) 52.50.26 M
0.735 mg / l CaCl2.2H20 (4.99 mM) 0,0007354,99 mM
50 g/l KCl (0,67 M) 500,67 M
2 g/l Na2SO4 (14,l mM)214,1 mM
Vitaminler x 1000  1 g/l Pantotenik Asit 14.20 mM
10 g/l nikotinik asit 1081.2 mM
10 g/l inositol 1055.5 mM
10 mg/l biotin 0.0140.8 ve mikro; M
Mineraller x 10.000  borik asit580.9 mM
MnSO4   423.7 mM
ZnSO4.7H2O413.9 mM
FeCl2.6H2O   27.40 mM
molibdik asit 0.42.47 mM
KI 16.02 mM
CuSO4.5H2O 0.41.60 mM
sitrik asit 1047.6 mM
Suşlar/ Plazmitler
SuşlarAçıklamaReferans
CCD190Escherichia coli DH10 ve beta;  Invitrogen
CCDY4 MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreBSrinivasan ve diğerleri, 2007
CCDY340CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFPSharma ve diğerleri, 2023
CCDY346MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plazmitler
pCCD3pREP42-GFP-EcMreBSrinivasan ve diğerleri, 2007
pCCD713pREP42-SaFtsZ-GFPSharma ve diğerleri, 2023
160376CLS3370mg / L ortam DMSO içinde 317275 Sigma içinde çözünmüş202398

Kaynaklar

  1. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  2. Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
  3. Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
  4. Sanchez, S., Demain, A. L. Antibiotics: current innovations and future trends. , Caister Academic Press. (2015).
  5. Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
  6. Vollmer, W. Targeting the bacterial Z-ring. Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).
  7. Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
  8. Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
  9. Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69(2020).
  10. Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
  11. Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
  12. Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151(2021).
  13. Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
  14. Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
  15. Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
  16. TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
  17. Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16(2023).
  18. Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
  19. Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Caring for Escherichia coli. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  21. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  22. Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  23. Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092(2022).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26(2022).
  26. Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
  27. Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
  28. Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
  29. Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
  30. Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
  31. Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825(2022).
  32. Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754(2020).
  33. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  34. Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364(2010).
  35. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  36. Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
  37. Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Fisyon Mayası TaramalarıAntibakteriyel İlaç KeşfiFtsZ PolimerizasyonuMreB PolimerizasyonuHücre Bazlı AnalizYüksek Kapasiteli TaramaFloresan Mikroskobu96 Kuyucuklu PlakaÖkaryotik Ekspresyon Sistemi
Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.