Yöntem makalesi

Temel Kayıt: Drosophila'da Tat Nöronlarının Tepkilerini Analiz Etmek İçin Bir Teknik

DOI:

10.3791/66665

⸱

1 Mart 2024

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University, 2Department of Entomology, The Connecticut Agricultural Experiment Station

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nadiren kullanılan bir elektrofizyolojik kayıt yöntemi olan temel kayıt, geleneksel kayıt yöntemleriyle incelenemeyen tat kodlama özelliklerinin analizine olanak tanır. Temel kayıt, geleneksel elektrofizyolojik yöntemler kullanılarak incelenemeyen hidrofobik uyaranlara verilen tat tepkilerinin analizine de izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böcekler, uçlarında gözenekler bulunan tat tüyleri veya sensilla yoluyla dış dünyanın tadına bakarlar. Bir sensillum potansiyel bir besin kaynağı ile temas ettiğinde, besin kaynağından gelen bileşikler gözenekten girer ve içindeki nöronları aktive eder. 50 yılı aşkın bir süredir, bu yanıtlar ipucu kaydı adı verilen bir teknik kullanılarak kaydedilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemin, uyaran temasından önce veya sonra nöral aktivitenin ölçülememesi ve tatların sulu çözeltilerde çözünür olması gerekliliği dahil olmak üzere önemli sınırlamaları vardır. Burada, bu sınırlamaların üstesinden gelen temel kayıt dediğimiz bir tekniği açıklıyoruz. Temel kayıt, uyaran öncesinde, sırasında ve sonrasında tat nöron aktivitesinin ölçülmesine izin verir. Böylece, bir tat uyaranından sonra ortaya çıkan OFF tepkilerinin kapsamlı bir şekilde analiz edilmesini sağlar. Suda çözünürlüğü çok düşük olan uzun zincirli feromonlar gibi hidrofobik bileşikleri incelemek için kullanılabilir. Özetle, temel kayıt, nöronal aktiviteyi ölçmenin bir yolu olarak tek sensillum elektrofizyolojisinin avantajlarını sunar - genetik araçlara ihtiyaç duymadan yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük - ve geleneksel uç kayıt tekniğinin temel sınırlamalarının üstesinden gelir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophilid sinekleri de dahil olmak üzere böcekler, çevrelerinden karmaşık kimyasal bilgiler çıkarmalarını sağlayan sofistike bir tat sistemine sahiptir. Bu sistem, besleyici ve zararlı olanları ayırt ederek çeşitli maddelerin kimyasal bileşimini ayırt etmelerini sağlar 1,2.

Bu sistemin merkezinde, stratejik olarak çeşitli vücut kısımlarına yerleştirilmiş, tat kılları veya sensilla olarak bilinen özel yapılar bulunur. Drosophilid sineklerinde, bu sensillalar, sinek başının 1,2,3,4 ana tat organı olan labellum üzerinde, ayrıca bacaklarda ve kanatlarda 1,2,5,6 bulunur. Labellum, hortumun ucunda bulunur ve iki lob 4,7,8 içerir. Her lob kısa, uzun ve orta 4,7,8 olarak kategorize edilen 31 tat duyusu ile kaplıdır. Bu duyuların her biri 2-4 tat nöronları 1,2,9,10. Bu tat nöronları, Tat reseptörü (Gr), İyonotropik reseptör (Ir), Yankesici (Ppk) ve Geçici reseptör potansiyeli (Trp) genleri 1,2,11,12,13 olmak üzere en az dört farklı gen ailesinin üyelerini eksprese eder . Bu reseptör ve kanal çeşitliliği, böcekleri hem uçucu olmayan hem de uçucu ipuçları 1,2,14 dahil olmak üzere çok çeşitli kimyasal bileşikleri tanıma yeteneği ile donatır.

50 yılı aşkın bir süredir, bilim adamları tat nöronlarının ve reseptörlerinin tepkisini, 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Ancak, bu yöntemin büyük sınırlamaları vardır. İlk olarak, nöral aktivite sadece uyaranla temas sırasında ölçülebilir, temastan önce veya sonra değil. Bu sınırlama, spontan spiking aktivitesinin ölçümünü engeller ve OFF yanıtlarının ölçümünü engeller. İkincisi, sadece sulu çözeltilerde çözünen tatlar test edilebilir.

Bu sınırlamalar, "temel kayıt" adı verilen nadiren kullanılan alternatif bir elektrofizyolojik teknikle aşılabilir. Burada, Marion-Poll ve meslektaşları24 tarafından kullanılan bir yöntemden uyarladığımız bu tekniği açıklıyoruz ve artık rahatça ölçebildiği önemli tat kodlama özelliklerinigösteriyoruz 14.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki protokol, Yale Üniversitesi'nin tüm hayvan bakımı yönergelerine uygundur.

1. Sinekler

  1. Yeni çıkan 10-15 sineği 25 ° C'de ve% 60 bağıl nemde 12:12 saat aydınlık-karanlık döngüsünde taze standart kültür şişelerine yerleştirin.
  2. 3-7 günlükken sinek kullanın.

2. Kemosensoriyel uyaranlar

  1. Mevcut en yüksek saflıkta kemosensoriyel uyaranlar elde edin. Kullanana kadar satıcı tarafından tavsiye edildiği şekilde saklayın.
  2. Kemosensoriyel uyaranları çözün ve su veya parafin yağı gibi arzu edilen, toksik olmayan başka bir çözücü içinde istenen konsantrasyonlara seyreltin. Çözünmüş katı bileşikler durumunda hazırlanan çözeltileri en az 1 saat karıştırın.

3. Cam uyaran kılcal damar

  1. Bir pipet çektirme aleti kullanarak uyaranı bir borosilikat cam kılcaldan (100 mm uzunluk, 1 mm dış çap, 0.58 mm iç çap) tutmak için bir cam kılcal damar çekin. 3 μm ile 10 μm arasında bir uç çapı elde etmeyi hedefleyin.
  2. Bir mikro yükleyici pipet ucu kullanarak cam kılcal damarı tercih edilen uyaran solüsyonla doldurun. Hafifçe vurarak çıkarılabilen kabarcıklardan kaçınmaya dikkat edin.
  3. Uyaran uçta kristalleşirse, cam uyaran kılcal damarını temizleyin veya değiştirin.

4. Referans ve kayıt elektrotları

  1. Hem referans hem de kayıt elektrotları için tungsten çubuklar (127 μm çap ve 76,2 mm uzunluk) kullanın. Referans ve kayıt elektrotlarını uçta yaklaşık 1 μm çapa kadar keskinleştirin (bu elektrotların şekilleri Delventhal ve ark.36) % 10 KNO3 (~ 1 M) çözeltisine veya% 10 KOH (1.8 M) çözeltisine birkaç saniye boyunca tekrar tekrar daldırarak.
    NOT: Bu çözüm, bu işlemi kolaylaştırmak için akım (0.3-3 mA) gerektirir.

5. Temel kayıt için sineğin hazırlanması

  1. Şişeden bir aspiratöre tek bir sinek çekin. Aspiratörü geri çekin ve parmağınızı ucunun üzerine koyarak hayvanı tuzağa düşürün.
  2. Sineği 200 μL'lik bir plastik pipet ucuna boşaltın. Aspiratörün ucunu pipet ucunda tutarak, sineği pipet ucunun dar ucuna doğru baş üstü ileri itmek için ucunu kullanın.
  3. Pipet ucunu bir tıraş bıçağı kullanarak her iki ucundan (yani hayvanın önünde ve arkasında) kesin.
  4. Başın yarısı kesilmiş pipet ucunun ucundan dışarı çıkana kadar sineği daha da ileri itmek için kil veya küçük bir parça pamuk kullanın. Başın önündeki etiket açığa çıkana kadar hafifçe itmek için forseps kullanın.
  5. Kesilmiş pipet ucunu kil kullanarak bir cam mikroskop lamına sabitleyin (Şekil 1).
  6. Stereomikroskop altında, labellumu bir kapak fişi üzerine yanal olarak yerleştirin, böylece bir lob, 31 tat sensillası ile birlikte açığa çıkar (Şekil 1). Kapak kayması, etiketi yerinde tutar.

6. Elektrofizyoloji teçhizatı

  1. Makine kurulumu için sabit sıcaklık ve bağıl neme (%<70) sahip ve buzdolapları ve santrifüjler gibi elektriksel ve mekanik gürültü kaynaklarından izole edilmiş bir oda seçin.
  2. Mikroskobu bir titreşim önleyici masanın ortasına yerleştirin.
  3. Titreşim önleyici masaya manuel bir mikromanipülatör sabitleyin (Şekil 2).
  4. Tungsten referans elektrodunu tutan paslanmaz çelik bir şaftı manuel mikromanipülatöre takın (Şekil 2).
  5. Motorlu manipülatörleri - biri kayıt elektrot probu için bir tutucu ve ikincisi cam uyaran kılcal damarı için paslanmaz çelik bir şafta bağlı bir tutucu ile - standları kullanarak aynı masaya bağlayın (Şekil 2).
  6. Kayıt elektrot probunu bir Akıllı Veri Toplama Denetleyicisi (IDAC) sistemine veya başka bir amplifikatör/sayısallaştırıcı sisteme bağlayın.
  7. Bu IDAC sistemini iş istasyonundaki bilgisayara bağlayın.
  8. Manuel ve motorlu manipülatörleri teçhizat içinde aynı yere topraklayın.
  9. Bilgisayara IDAC sistemi için uygun edinme yazılımını yükleyin. Dijital edinme sürücülerinin bilgisayardaki işletim sistemiyle (örneğin, Windows XP-7, -8 veya -10) uyumlu olduğundan emin olun.

7. Tat sensillasından kayıt

  1. Hazırlık slaytını, düşük büyütmeli (örn. 10x) bir objektif ile mikroskop tablasına yerleştirin. Labellum hem düşük büyütmeli hem de yüksek büyütmeli (ör. 50x) hedeflerde görüş alanının merkezinde netleme olana kadar sahneyi hareket ettirin.
  2. Düşük büyütme objektifini kullanarak referans elektrodu göze yerleştirin. Referans elektrodu yerleştirmek için, gözü, kayıt elektrodunun bulunduğu tarafın karşısındaki sineğin tarafına hedefleyin, örneğinample, kayıt elektrodu sağdan yaklaşıyorsa, referans elektrodu sol göze yerleştirin. Hassas yerleştirme için manuel bir mikromanipülatör kullanın.
  3. Motorlu bir mikromanipülatör kullanarak cam uyaran kılıcının ucunu hem düşük büyütmeli hem de yüksek büyütmeli objektiflerin görüş alanının merkezinde odak haline getirin (Şekil 3).
  4. Düşük büyütme altında, ikinci bir motorlu mikromanipülatör kullanarak kayıt elektrodunu etikete yaklaştırın.
  5. Yüksek büyütme altında, IDAC sisteminin ses çıkışından gelen nöronal ateşleme aktivitesinin sesi duyulana kadar kayıt elektrodunu motorlu mikromanipülatör kullanarak bir tat duyusunun tabanına yerleştirin.
  6. Kararlı bir sinyal oluşturulduktan sonra, IDAC sistemiyle birlikte gelen yazılımı kullanarak sinyali kaydetmeye başlayın (Şekil 4A-D). Kaydı başlatmak için Kaydı başlat düğmesine basın.
  7. Motorlu manipülatörü kullanarak tat duyusunun ucunu kaplamak için uyaran cam kılcalının ucunu getirin.
  8. Uyaranı sonlandırmak için, motorlu manipülatörü kullanarak cam uyaran kılcalını sensillumdan çıkarın.
  9. Bir pedal kullanarak stimülasyonun başlangıcını ve bitişini manuel olarak işaretleyin. Pedal IDAC'a bağlanır ve uyaranın başlangıcını/bitişini işaretlemek için IDAC aracılığıyla yazılımla iletişimi kolaylaştırılır.

8. Analiz

  1. Ani popülasyonları genliğe göre sıralamak (mümkün olduğunda) ve yanıt dinamiklerini analiz etmek için IDAC sistemiyle birlikte gelen yazılımın farklı işlevlerini kullanın.
    1. Ani artışları saymak için, ilgilenilen kayda sol tıklayın ve aralarından seçim yapabileceğiniz bir pencere açın. Ani Artışlar'ı seçerek Dalgaları ani artışlara dönüştür adlı başka bir pencere başlatın. Yeni alanına bir ad girin ve OK düğmesine basın.
    2. Adım 8.1.1'deki Yeni alanına ad girildiğinde Genlik Histogramı görünümü elde edilir. Sayılacak genliği seçin, sonra bu görüntüyü kapatın. Sayaç eklemek için sol tıklayın.
    3. Yazılımla yapılan analize dayalı sonuçları doğrulamak için ani artışları manuel olarak inceleyin.
      NOT: Yazılım ayrıca daha fazla analiz için verilerin farklı formatlarda dışa aktarılmasına da izin verir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 4A, bir sensillumdan kaynaklanan spontan sivri uçları göstermektedir. Genliğe dayalı olarak iki sınıfa ayrılırlar, daha büyük sivri uçlar acı bileşiklere duyarlı nörondan ve şekerlere yanıt veren nörondan daha küçük sivri uçlar türetilir. Spike genliği ve fonksiyonel özgüllük arasındaki ilişki, genetik deneyler 4,14,37,38,39 ile doğrulanmıştır.

Şekil 4B , S5 sensillum'un acıya duyarlı nöronunun DEET kokusuna tepkisini göstermektedir; bu yanıt, DEET çözeltisi ile sensillum arasında herhangi bir temas olmadan gerçekleşti. Bir sivri uç orta genlikli gibi görünmektedir ve biri şeker nöronundan ve diğeri mekanosensoriyel nörondan olmak üzere iki küçük sivri ucun üst üste binmesinden kaynaklanabilir.

Şekil 4C , acı bir uyaran ile I1 sensillum arasındaki temasın ardından ortaya çıkan ON yanıtını ve ardından temasın sonlandırılmasını takiben ortaya çıkan bir KAPALI yanıtı göstermektedir. Ani artışlar/sn cinsinden ölçülen KAPALI yanıtının büyüklüğü, AÇIK yanıtından daha büyük değildir.

Şekil 4D , başka bir sinek türü olan Drosophila virilis'in bir I1 sensillumundan gelen acı bileşik berberine bir AÇIK ve bir KAPALI yanıtı göstermektedir. Bu tekniğin avantajlarından biri, sivrisinekler de dahil olmak üzere diğer türler üzerinde, onlara herhangi bir transgen sokulmasına gerek kalmadan gerçekleştirilebilmesidir.

Şekil 4E , kayıt sırasında oluşabilecek iki sorunu göstermektedir. İlk olarak, labellum düzgün bir şekilde sabitlenmezse, sensillumun mekanosensoriyel nöronundan ani yükselmeler üreterek hareket edebilir. İkincisi, kayıt elektrodu, genellikle labellumun hareketinin bir sonucu olarak sensillumdan yerinden çıkabilir. Bu durumda, temas kaybolur ve ani yükselmeleri kaydetmek için elektrotun yeniden takılması gerekir.

figure-results-1
Şekil 1: Temel kayıt için sinek hazırlığı. Etiketi bir cam lamel üzerine güvenli bir şekilde yerleştirilmiş bir dişi sinek içeren kesilmiş bir pipet ucu. (A) Hem pipet ucu hem de lamel kil yığınları üzerinde güvenli bir şekilde tutulur. (B) Bir lamel üzerinde duran labellum'un daha yüksek büyütmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Elektrofizyoloji teçhizatı kurulumu. (A) Referans elektrot için manuel bir mikromanipülatörün, cam uyaran kılcal damarı için motorlu bir mikromanipülatörün ve kayıt elektrodu için motorlu bir mikromanipülatörün konumlarını gösteren bir genel bakış. (B) Referans elektrodu, cam uyaran kılcal damarı ve kayıt elektrodu için tutucuları gösteren genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Labellum ve sensilla. (A) Ters mikroskop altında labellum. Labellumun bir lobunun tat sensillasını gösteren labellumun yakın çekimi. Ayrıca, L2 (Büyük tip 2) olarak bilinen büyük sensillalardan birine yakın uyaran cam kılcal damarı ve bu sensillumun tabanındaki bir kayıt elektrodunu gösterir. (B) Etiketlerin erişilebilirliği, sensilla. Temel kayıt için kolayca erişilebilen sensilla'yı ve genellikle kullandığımız hazırlıktaki konumları nedeniyle daha az erişilebilir olan sensilla'yı gösteren labellum. Kısaltmalar: A = ön; M = medial; P = arka; L = yanal. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Spontan sivri uçların, acı nöron tepkilerinin ve suboptimal kaydın örnek izleri. (A) Spontan sivri uçların örnek izi. Sivri uçlar, bir I1 sensillumunda acıya duyarlı bir nörondan (kırmızı noktalar) ve şekere duyarlı bir nörondan (yeşil noktalar) gelir. Sensillum'un çiziminde, acı, şeker ve mekanosensoriyel nöronlar sırasıyla kırmızı, yeşil ve siyah renktedir. (B) Bir S5 sensillumdaki acı nöronun (kırmızı noktalar) 1 mM DEET buharına verdiği tepkinin örnek izi. Küçük genlik artışlarının, bu örnekte izlerin genlikle ayırt edilmesi zor olan şeker nöronu ve mekanosensoriyel nöronlardan geldiğine dikkat edin. Kısaltma: DEET = N,N-dietil-meta-toluamid. (C) I1 sensilla'daki acı bir nörondan 1 mM denatonyum benzoata ON ve OFF yanıtlarının örnek izi. Ani yükselmeler, uyaranla temastan önce (spontan ateşleme), sırasında (AÇIK yanıtı) ve sonrasında (KAPALI yanıtı) gözlenir. Kısaltma: DEN = denatonyum benzoat. (D) D. virilis'in I1 sensillasındaki acı bir nörondan 0.5 mM berberin klorüre kadar AÇIK ve KAPALI yanıtlarının örnek izi. Temas öncesinde, sırasında ve sonrasında ani yükselmeler gözlenir. Kısaltma: BER = berberin klorür. (E) Optimal olmayan bir kaydın örnek izi. Labellumun hareketi nedeniyle deneyin ortasında temas kayboldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bazı sensilla türlerinden elde edilen kayıtlarda, farklı nöronların sivri uçlarını ayırt etmek zor olabilir. Örneğin, S ve I sensilla'nın şeker nöronları ve mekanosensoriyel nöronları, benzer genliklerde sivri uçlar üretirve bu da onları ayırt etmeyi zorlaştırır 4,14. Çok keskin bir tungsten kayıt elektrodunun kullanılmasının, kayıt elektrodunun akıllıca yerleştirilmesi gibi, mekanosensoriyel nöronun ateşlenmesini azalttığını bulduk. Kayıt elektrodunun sensillum soketinin bileziğine (yani tabana, ancak derine değil) sokulması genellikle mekanosensoriyel stimülasyonun azalmasına neden olur. Ek olarak, bir kaydın mekanosensoriyel nöronun yüksek düzeyde ateşlenmesi durumunda, kayıt elektrodunu geri çekmenin ve onu sensilluma göre farklı bir konuma yerleştirmenin genellikle daha düşük bir ateşleme seviyesine yol açtığını bulduk.

Deneyler boyunca kayıt elektrodunun stabilitesini sağlamak bir diğer kritik konudur (bkz. Şekil 4E). Elektrot konumundaki mekanik bozukluklar veya kaymalar kayıtların kalitesini olumsuz etkileyebilir. Yukarıda açıklanan protokolde belirtildiği gibi kapsamlı bir hazırlık için zaman ve çaba harcamak, labellum hareketinden kaynaklanabilecek hayal kırıklığını önlemenin anahtarıdır.

I-a sınıf14'ün I sensillasından hem AÇIK hem de KAPALI yanıtlar üreten bazı bileşiklerde gözlemlediğimiz başka bir soruna dikkat çekiyoruz. Bazen, bir uyaranın ikinci bir iletimi KAPALI'yı ortaya çıkarır, ancak AÇIK yanıtını ortaya çıkarmaz. ON yanıtındaki bu azalmanın nedeni bilinmemektedir.

Temel kayıtta karşılaşılan bir diğer zorluk, etiket üzerindeki konumları nedeniyle tüm sensilla'lara kayıt için kolayca erişilememesidir. 31 labellar sensilla'dan sadece 26'sı kayıt yapmak için uygundur ve Şekil 3B'de gösterildiği gibi tekniğe bir sınırlama getirir. Bununla birlikte, prensip olarak, bu sensillalar (I8, I9, I10, L9 ve S10), Olympus mikroskobu mekanik XY aşamasının döndürülmesiyle erişilebilir hale getirilebilir.

Son olarak, sinek hazırlığına çaba harcamanın önemini vurguluyoruz. İyi hazırlanmış bir sineğin, deney boyunca güvenilir ve yüksek kaliteli kayıtlar vermesi çok daha olasıdır. Ek olarak, sükroz kayıt kalitesini sağlamak için pozitif bir kontrol olarak kullanılabilir; Tüm etiketlerden bir yanıt alır Sensilla.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Destek için Zina Berman'a, el yazması hakkındaki yorumları için Lisa Baik'e ve tartışma için Carlson laboratuvarının diğer üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, H.K.M.D.'ye DC020145 NIH hibesi K01 tarafından desteklenmiştir; ve NIH, JRC'ye R01 DC02174, R01 DC04729 ve R01 DC011697 verir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MikroskopOlympusBX51WI, 50X objektif (LMPLFLN 50X, Olympus) ve 10X göz mercekleri ile donatılmıştır.
Titreşim Önleyici MasaTMC63-7590E
motorlu MikromanipülatörlerHarvard Aparatı ve Mä rzhä kullanıcı MikromanipülatörlerMikromanipülatör PM 10 Piezo Mikromanipülatör
manuel MikromanipülatörlerMä rzhä kullanıcı MikromanipülatörlerMM33 Mikromanipülatör
Manyetik standlarENCOModel #625-0930
Referans  ve kayıt Elektrot TutucuOckenfels Syntech GmbH
Uyarıcı cam kılcal TutucuOckenfels Syntech GmbH
Üniversal Tek Uçlu ProbOckenfels Syntech GmbH
4 KANALLI USB TOPLAMA DENETLEYICISI, IDAC-4Ockenfels Syntech GmbH
Uyaran Kontrol CihazlarıOckenfels Syntech GmbHUyaran Kontrol Cihazı CS 55
Kişisel BilgisayarDellVostroDijital toplama sistemi ve yazılımı ile uyumluluğu kontrol edin
Tungsten ÇubukA-M Sistemleri Kedi# 716000
Alüminyum Folyo ve / veya Faraday KafesiElektromanyetik gürültü kalkanı
Borosilikat Cam KılcalDamarlar Dünya Hassas Aletler1B100F-4
Pipet ÇektirmeSutter Aleti ŞirketModeli P-97 Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme
StereomikroskopOlympusVMZ 1x-4xSinek hazırlama için
p200 Pipet UçlarıJenerik
Mikro yükleyici ipuçları EppendorfE5242956003
1 ml ŞırıngaJenerik
Timsah klipsleri
Güç TransformatörleriSTACO ENERJI ÜRÜNLERISTACO 3PN221BP1000 pipet uçları, esnek plastik boru ve ağdan monte edilmiştir
Modelleme KilJenerik
ForsepsJenerik
Plastik BoruSaint GobainTygon S3 & trade; E-3603
Standart kültür şişeleriArchon ScientificDar 1 oz polistiren vailler, her biri 10 mL glikoz ortamına sahip, selüloz asetat tapaları ile önceden yüklenmiş
Berberin klorür (BER)Sigma-AldrichCat# Y0001149
Denatonium benzoat (DEN)Sigma-AldrichCat# D5765
N,N-Dietil-m-toluamid (DEET)Sigma-AldrichCat# 36542

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
  2. Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Genetics. 217 (1), 1-34 (2021).
  3. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).
  4. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  5. He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor. PLoS Biol. 17 (5), e2006619(2019).
  6. Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
  7. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
  8. Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).
  9. Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).
  10. Siddiqi, O., Rodrigues, V. Genetic analysis of a complex chemoreceptor. Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).
  11. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  12. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
  13. Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nat Commun. 9 (1), 4252(2018).
  14. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila. Sci Adv. 9 (46), (2023).
  15. Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 2 14526-14530 (2003).
  16. Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).
  17. Delventhal, R., Carlson, J. R. Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons. Elife. 5, e11181(2016).
  18. Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila. Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).
  19. Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).
  20. Jeong, Y. T., et al. An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals. Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).
  21. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  22. Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila. Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).
  23. Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
  24. Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2 (7), e661(2007).
  25. Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).
  26. Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).
  27. Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).
  28. Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation. Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).
  29. Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).
  30. Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).
  31. Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).
  32. Rimal, S., et al. Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila. Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).
  33. Shim, J., et al. The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound. Nat Commun. 6, 8867(2015).
  34. Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119(2022).
  35. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  36. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355(2014).
  37. Marella, S., et al. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior. Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).
  38. Thorne, N., Amrein, H. Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons. J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).
  39. Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila SensillaTek Sensillum ElektrofizyolojisiTip KaydN ronal Aktivite l mHidrofobik Bile iklerFeromon Alg lamaCam K lcal ElektrotAc Hassasiyetli N ron

İlgili makaleler